JPH08214874A - ニコチン酸アナログ耐性微生物およびビオチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高いビオチン生産能を有する微生物、および
それを用いるビオチンの製造法の提供。 【解決手段】 ビオチンオペロンの一部ないし全部を含
むプラスミドを有し、ニコチン酸アナログ耐性を示す微
生物；およびこの微生物を培地で培養し、培養物中にビ
オチンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
するビオチンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規ニコチン酸アナ
ログ耐性微生物およびこれを利用するビオチンの製造法
に関する。本発明により得られるビオチンは、医薬品、
化粧品の原料、飼料添加物等として用いられる。

【０００２】

【従来の技術】ビオチン(ビタミンＨ)はビタミンＢ群の
一種で、カルボキシル化酵素の補酵素として脂肪酸合成
や糖代謝に関与している。このビオチンは、医薬品、化
粧品の原料または飼料添加物等として化学合成法によ
り、年間約１０トン製造されているが、その工程が複雑
なことから、かなり高価である。一方、発酵法によるビ
オチンの生産は古くから研究されているが、生産性が低
いため実用化されていない。そこで遺伝子組換え技術を
用いてビオチンを製造し、安価なビオチンを提供する方
法が期待されている。これらの製造方法に用いられる遺
伝子工学的に改良した微生物としては、エシェリヒア(E
scherichia)属に属するものとしてα−デヒドロビオチ
ン耐性株(例、特開昭６１−１４９０９１号公報等)など
が知られている。これらエシェリヒア属に属する微生物
以外のものとして以下の微生物が知られている。例えば
バチルス(Bacillus)属に属するものとしては、バチルス
・スフェリカスを形質転換し、ついでテノイルトリフル
オロアセトン耐性を付与した微生物(特開平４−１１８
９４号公報)が、あるいは、セラチア(Serratia)属に属
するものとしては、セラチア・マルッセンスＳＢ４１１
にエチオニン耐性を付与し、次いでＳ−アミノエチルシ
ステイン耐性を付与し、その後ビオチン遺伝子断片を含
む組換えプラスミドで形質転換させた微生物(特開平５
−１９９８６７号公報)が、同様にビオチン構造類似物
質であるアクチチアジン酸または５−(２−チエニル)−
n−吉草酸耐性を付与した形質転換体(特開平２−２７９
８０号公報)が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ビオチンの生産方法では、ビオチンの工業的製造には不
十分なため、ビオチンの生産性をさらに向上させる生産
方法が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ビオチン
生合成の最終段階であるデスチオビオチンからビオチン
への反応に還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸
(ＮＡＤＰＨ)が必要である[バイオサイエンス・バイオ
テクノロジー・バイオケミカル(Biosci. Biotech. Bioc
hem.,)５６巻、１７８０頁(１９９２)等]ことに着目
し、ビオチン生産菌のＮＡＤＰＨの生成能を強化するこ
とによりビオチン蓄積量が向上すると予想した。そこ
で、ビオチン生産菌からニコチン酸アナログ耐性株を分
離し、ビオチン蓄積量が著しく増大した株を取得した。
この知見に基づきさらに鋭意検討した結果、本発明を完
成した。すなわち本発明は、(１)ビオチンオペロンの一
部ないし全部を含むプラスミドを有し、ニコチン酸アナ
ログ耐性を示す微生物、(２)微生物が、エシェリヒア(E
scherichia)属、バチルス(Bacillus)属、またはセラチア
(Serratia)属に属する微生物である上記(１)記載の微生
物、(３)ニコチン酸アナログが、６−アミノニコチンア
ミドである上記(１)記載の微生物、および(４)上記(１)
記載の微生物を培地で培養し、培養物中にビオチンを生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするビオチ
ンの製造法を提供するものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】ニコチン酸アナログとしては、例
えば６−アミノニコチンアミド、イソニコチン酸ヒドラ
ジド、３−ピリジンスルホン酸、３−ピリジル酢酸、２
−ヒドロキシニコチン酸、ピラジンカルボン酸、ニコチ
ン酸メチル、３−アミノベンザミド、６−メチルニコチ
ンアミド、ピラジンアミド、６−アミノニコチン酸等が
挙げられる。このうち好ましくは６−アミノニコチンア
ミドである。ビオチンオペロンとしては、例えばエシェ
リヒア属、バチルス属、セラチア属由来のビオチンオペ
ロン等が挙げられる。エシェリヒア属由来としてはエシ
ェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来のビオチンオペ
ロン(特開昭６１−２０２６８６号等)が挙げられる。該
ビオチンオペロンには、ビオチン生合成に関与するbio
Ａ、bioＢ、bioＦ、bioＣ、bioＤの５つの遺伝子がコー
ドされている。また、これらのビオチンオペロンの一部
を改変したものも本発明では用いることができ、例え
ば、エシェリヒア・コリのビオチンオペロンの制御領域
およびbioＢ開始コドン近傍のいずれかの塩基配列が野
性型に比べて少なくもと１塩基対変異しているもの等が
挙げられる。ここでビオチンオペロンの制御領域とは、
bioＡとbioＢの間に存在するr鎖を示す配列表の配列番
号１、およびより詳細には図１に示す塩基配列のうちbi
oＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として−１番目の塩基対
から−８６番目の塩基対までの領域をいい、bioＢ開始
コドン近傍とは、bioＢ開始コドンＡＴＧのＡを１とし
て１番目の塩基対から６番目の塩基対までの領域をい
う。さらに具体的には、bioＢ開始コドンＡＴＧのＡを
１として上流−５３番目、−５番目、下流４番目の少な
くともいずれかひとつのＧＣ対がＡＴ対に変異されたも
の等が挙げられる(特開平５−２１９９５６号)。

【０００６】本発明で用いるプラスミドとしては、例え
ばエシェリヒア属、バチルス属またはセラチア属に属す
る微生物に保持され、かつ遺伝子が発現できるものが挙
げられる。好ましくはエシェリヒア属に属する微生物に
保持されているプラスミドである。該プラスミドとして
は、例えばpＸＢＡ３１２(エシェリヒア・コリＤＲＫ−
３３２３[pＸＢＡ３１２](ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１７)
由来、特開平２−５０２０６５号公報)、pＸＢＲＰ３１
９(エシェリヒア・コリＭＭ４４／pＸＢＲＰ３１９(Ｉ
ＦＯ １５７２１, ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２４)]由来、
後述の実施例１参照]、およびそれらの誘導体等が挙げ
られる。本発明の微生物としては、ビオチン生成蓄積能
を有する微生物であればよく、例えばエシェリヒア(Esc
herichia)属、バチルス(Bacillus)属またはセラチア(Se
rratia)属などに属する微生物が挙げられる。このうち
エシェリヒア属に属する微生物が好ましい。該微生物と
しては、例えばエシェリヒア・コリ(Escherichiacoli)
などが挙げられ、好ましい例としては後述の実施例１で
得られたエシェリヒア・コリＡＮＡ９１／pＸＢＲＰ３
１９(ＩＦＯ １５７７１, ＦＥＲＭ ＢＰ−４９２８)
等が挙げられる。

【０００７】本発明のニコチン酸アナログ耐性およびビ
オチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを有
する微生物としては、好ましくはニコチン酸アナログ耐
性およびビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラ
スミドで形質転換された微生物である。本発明の微生物
は、例えば親株となる微生物にニコチン酸アナログ耐性
を付与し、得られたニコチン酸アナログ耐性株にビオチ
ンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを導入す
る、あるいは、親株となる微生物にビオチンオペロンの
一部ないし全部を含むプラスミドを導入し、得られた微
生物にニコチン酸アナログ耐性を付与する、またはビオ
チンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを保持
している親株となる微生物にニコチン酸アナログ耐性を
付与することにより得られる。本発明で用いる親株とな
る微生物としては、ビオチン生成蓄積能を有する微生物
であればいずれでもよく、例えばエシェリヒア(Escheri
chia)属、バチルス(Bacillus)属またはセラチア(Serrat
ia)属に属する微生物等が挙げられる。エシェリヒア属
に属する微生物としては、例えばエシェリヒア・コリ(E
scherichia coli)に属する微生物などが挙げられ、具体
的にはエシェリヒア・コリ ＩＦＯ １４４１０、エシ
ェリヒア・コリ Ｗ−３１１０(ＩＦＯ １２７１３)お
よびその由来株エシェリヒア・コリ ＤＲ−８５(特開
昭６１−２０２６８６号)、エシェリヒア・コリ ＤＲ
−３３２(特開昭６２−１５５０８１号)、エシェリヒア
・コリＤＲＫ−３３２３(特表平２−５０２０６５号)、
エシェリヒア・コリ ＢＭ４０６２(特表昭６４−５０
００８１号)、後述の実施例１で得られたエシェリヒア
・コリ ＭＳ１０／pＸＢＲＰ３１９(ＩＦＯ １５５７
０, ＦＥＲＭ ＢＰ−４９２７)などが挙げられる。上
記のエシェリヒア・コリ ＩＦＯ １４４１０およびエ
シェリヒア・コリ ＩＦＯ １２７１３は、リスト・オ
ブ・カルチャーズ(List of Cultures)第９版、１９９２
年(ＩＦＯ発行)にそれぞれ収載されている公知株であ
り、財団法人発酵研究所から入手することができる。

【０００８】バチルス属に属する微生物としては、例え
ばバチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に属
する微生物などが挙げられ、より具体的にはバチルス・
スフェリカスＩＦＯ ３５２５およびその由来株バチル
ス・スフェリカスＮＺ−８８０２(特開平４−１１８９
４号)など挙げられる。上記のバチルス・スフェリカス
ＩＦＯ ３５２５は、リスト・オブ・カルチャーズ(Lis
t of Cultures)第９版、１９９２年(ＩＦＯ発行)に収載
されている公知株であり、財団法人発酵研究所から入手
できる。セラチア属に属する微生物としては、例えばセ
ラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)に属す
る微生物などが挙げられ、具体例としてはセラチア・マ
ルセッセンスＳn ４１およびその由来株セラチア・マル
セッセンスＴＡ５０２４(特開平２−２７９８０号)、セ
ラチア・マルセッセンスＳＢ４１１およびその由来株セ
ラチア・マルセッセンスＥＴ２、セラチア・マルセッセ
ンスＥＴＡ２３(特開平５−１９９８６７号)などが挙げ
られる。上記した微生物は、そのまま用いてもよいが、
さらにこれらの変異株を用いてもよい。これらの微生物
の中で、ビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラ
スミドを保持しないものは、必要に応じ、後工程で、ビ
オチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを導
入すればよい。

【０００９】ニコチン酸アナログ耐性株を得る方法とし
ては、自体公知の方法、例えばＮ−メチル−Ｎ'−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(Ｎ−methyl−Ｎ'−nitro
−Ｎ−nitrosoguanidine, 以下、ＮＴＧと略すこともあ
る)などの薬剤で処理する方法、紫外線で照射する方法
などが挙げられる。次に変異処理した菌体の懸濁液を適
当な濃度、例えば親株が生育できない濃度のニコチン酸
アナログを含む培地(例、寒天平板培地)にまき、生育す
るコロニーを分離することによりニコチン酸アナログ耐
性株を得ることができる。上記の方法で得られたニコチ
ン酸アナログ耐性株を培養し、培養上清中のビオチンを
定量することによりビオチンの蓄積量が向上した菌を選
ぶことができる。ビオチンオペロンの一部ないし全部を
含むプラスミドを導入する方法としては、自体公知の方
法に従って行えばよい。まず、ビオチンオペロンの一部
ないし全部を含むプラスミドを構築する方法としては自
体公知の方法、例えば、制限酵素によるＤＮＡの切断、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの結合などを行い、目
的とするプラスミドを構築する方法[モレキュラー・ク
ローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル・コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Molecular Clo
nig, A Laboratory Manual, ColdSpring Habor Laborat
ory)１９８２]等が挙げられる。上記のプラスミドを用
いて宿主細菌を形質転換する方法としては、自体公知の
方法、例えばエシェリヒア属に属する細菌を宿主とする
場合は、上記のモレキュラー・クローニング，ア・ラボ
ラトリー・マニュアル・コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー(Molecular Cloning A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Habor Laboratory), １９８２に記
載されている方法等が挙げられる。

【００１０】上記の方法により得られた本発明の微生物
を培地で培養し、ビオチンを培地に生成させる。本発明
の培養に用いられる培地は、用いられる微生物が利用し
得る栄養源を含むものなら、液状でも固状でもよいが、
大量に処理するとこには液体培地を用いるのがより適当
である。培地には同化し得る炭素源、消化し得る窒素
源、無機物質、微量栄養素等が適宜配合される。炭素源
としては、例えばブドウ糖、乳糖、ショ糖、麦芽糖、デ
キストリン、澱粉、マンニトール、ソルビトール、グリ
セロール、油脂類(例、大豆油、オリーブ油、ヌカ油、
ごま油、ラード油、チキン油など)、各種脂肪酸(例、ラ
ウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、オレイン酸など)等が用いられる。窒素源として
は、例えば肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、
脱脂大豆粉、コーン・スチープ・リカー、ペプトン、綿
実粉、癈糖蜜、尿素、チオ尿素、アンモニア、アンモニ
ウム塩類(例、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど)等が用いら
れる。さらにナトリウム、カリウム、カルシウム、マグ
ネシウムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜鉛、コバル
ト、ニッケルなどの金属塩類、リン酸、ホウ酸などの塩
類、酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類が適宜用い
られる。さらに、アミノ酸(例、グルタミン酸、アスパ
ラギン酸、アラニン、リジン、バリン、メチオニン、プ
ロリン等)、ペプチド(例、ジペプチド、トリペプチド
等)、ビタミン類(例、Ｂ₁、Ｂ₂、ニコチン酸、Ｂ₁₂、Ｃ
等)、核酸類(例、プリン、ピリミジンおよびその誘導
体)等を用いてもよい。培地のpＨを調節する目的で無機
または有機の酸、アルカリ類等を加えてもよく、あるい
は消泡の目的で油脂類、表面活性剤等の適量が使用され
る。培地のpＨは約４〜１０が好ましく、特にpＨ約６〜
９が好ましい。

【００１１】培養の手段としては静置培養、振とう培
養、通気撹拌培養のいずれでもよい。大量の培養の際は
通気撹拌培養が好ましい。培養の温度は約１５〜３７
℃、好ましくは約３０〜３７℃である。培養時間は培養
条件によって適宜選択されるが約１〜１０日、好ましく
は約２〜４日である。培養方法としては自体公知の方
法、例えばバッチ培養、フィード培養などが挙げられ
る。得られた培養液を遠心分離し、その上清に蓄積され
たビオチンを定量する。ビオチンの定量方法としては、
自体公知の方法に従えばよく、例えば、ラクトバチルス
・プランタルム(Lactobacillus plantarum)を定量菌と
するバイオアッセイ法(「ザ・ビタミンズ」(The Vitamin
s), 第７巻、３０３頁(１９６７)、「ビタミン学、実験
法[ＩＩ]」４７５頁、日本ビタミン学会編(１９８５年)
等)等が挙げられる。上記の方法で微生物を培養し、培
養物中にビオチンを生成蓄積させ、次のこの培養物から
ビオチンを採取する。生成したビオチンは主として培養
濾液中に存在するので、培養液を自体公知の方法(例、
濾過、遠心分離等)により濾液と菌体を分離し、得られ
た濾液からビオチンを分離、精製するのが有利である。
また、培養液から直接に精製してもよい。上記の分離、
精製する方法としては、例えば、適当な溶媒に対する溶
解性および溶解度の差、溶液からの析出法および析出速
度の差、種々の吸収親和力の差、イオン交換体によるイ
オン交換クロマトグラフィーあるいは減圧濃縮、凍結乾
燥、結晶化、再結晶、乾燥などの手段が単独あるいは任
意の順序に組み合わせて、または反復して利用される。
本発明で得られるビオチンは、医薬品や化粧品の原料、
飼料添加物等として使用しうる。

【００１２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。培地中の％はＷ／Ｖ％を示す。下記実施例
で得られたエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＭＳ
１０／pＸＢＲＰ３１９およびエシェリヒア・コリ(Esch
erichia coli)ＡＮＡ９１／pＸＢＲＰ３１９は、１９９
４年１２月２日より各々受託番号ＩＦＯ １５７７０お
よびＩＦＯ １５７７１として財団法人発酵研究所(Ｉ
ＦＯ)に寄託され、また１９９４年１２月１２日よりブ
タペスト条約下受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４９２７お
よびＦＥＲＭ ＢＰ−４９２８として通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ寄託されてい
る。

【００１３】実施例１ (１)エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２３／pＸＢＡ３
１２(ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１７)(特表平２−５０２０
６５号)から単離したプラスミドpＸＢＡ３１２(図２参
照)を制限酵素ＥcoＲＩで切断した後、ＰstＩで部分分
解し、アガロースゲル電気泳動、電気溶出法により完全
長のビオチンオペロンを含むＥcoＲＩ−ＰstＩ断片(６.
０Ｋbp)を単離した。得られたpＸＢＡ３１２のＥcoＲＩ
−ＰstＩ断片とプラスミドpＢＲ３２２のＥcoＲＩ−Ｐs
tＩ断片(３.６Ｋbp)とを連結してプラスミドpＸＢＡ３
１９を得た。プラスミドpＭＷ１１９(ニッポンジーン、
日本)を制限酵素ＡatＩＩとＡvaＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動と電気溶出法により、ＡatＩＩ−ＡvaＩ
断片(０.４Ｋbp)を得、次いでブランティングキット(宝
酒造、日本)を用いて、ＡatＩＩ−ＡvaＩ断片の両端を
平滑化した。得られた断片をpＸＢＲ３１９のＳmaＩ部
位に連結することによりプラスミドpＸＢＲＰ３１９を
得た。 (２)エシェリヒア・コリ ＩＦＯ １４４１０[(財)発
酵研究所より入手]をＮＴＧで変異処理して得られた優
良株に上記(１)で得られたプラスミドpＸＢＲＰ３１９
を導入し、さらにＮＴＧで変異処理したのち各種の薬剤
耐性株を分離した。この中からビオチン蓄積量が多い菌
株を選び、エシェリヒア・コリＭＭ４４／pＸＢＲＰ３
１９(ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２４)を得た。 (３)上記(２)で得られたエシェリヒア・コリＭＭ４４／
pＸＢＲＰ３１９を２０mlの２xＹＴ培地(酵母エキス１
０g／Ｌ、ペプトン１６g／Ｌおよび塩化ナトリウム５g
／Ｌ含有)に接種し、３７℃で１６時間振とう培養し
た。得られた培養液の０.２mlを２０mlの２xＹＴ培地に
移し、３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液
を遠心分離し、集められた菌体をＴＭ緩衝液(マレイン
酸５.０８g／Ｌ、トリス６.０５g／Ｌ、pＨ６.０)で２
回洗浄した。この洗浄菌体を２００μg／mlのＮＴＧを
含むＴＭ緩衝液に懸濁し、３７℃で２５分間処理した。
遠心分離して処理菌体を集め、ＴＭ緩衝液で２回洗浄し
たのち、同じ緩衝液に懸濁した。得られた懸濁液を、１
mg／mlβ−クロロ−Ｄ−アラニン、４μg／mlチアミン
塩酸塩および２０μg／mlカザミノ酸を含むＭ９最少培
地の寒天平板にまき、３７℃で５日間放置することによ
ってβ−クロロ−Ｄ−アラニン耐性株のコロニーが出現
し、このうち１株を選び、エシェリヒア・コリＢＤ１０
／pＸＢＲＰ３１９(ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２５)を得
た。 (４)上記(３)で得られたエシェリヒア・コリ ＢＤ１０
／pＸＢＲＰ３１９(ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２５)をＮＴ
Ｇで変異処理したのち各種の薬剤耐性株を分離した。こ
の中からビオチン蓄積量が多い菌株を選び、エシェリヒ
ア・コリＭＳ１０／pＸＢＲＰ３１９を得た。 (５)上記(４)で得られたエシェリヒア・コリＭＳ１０／
pＸＢＲＰ３１９を２０mlの２xＹＴ培地(酵母エキス１
０g／Ｌ、ペプトン１６g／Ｌおよび塩化ナトリウム５g
／Ｌ含有)に接種し、３７℃で１６時間振とう培養し
た。得られた培養液の０.２mlを２０mlの２xＹＴ培地に
移し、３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液
を遠心分離し、集められた菌体をＴＭ緩衝液(マレイン
酸５.０８g／Ｌ、トリス６.０５g／Ｌ、pＨ６.０)で２
回洗浄した。この洗浄菌体を２００μg／mlのＮＴＧを
含むＴＭ緩衝液に懸濁し、３７℃で２５分間処理した。
遠心分離して処理菌体を集め、ＴＭ緩衝液で２回洗浄し
たのち、同じ緩衝液に懸濁した。得られた懸濁液を、３
０μg／ml６−アミノニコチンアミド、４μg／mlチアミ
ン塩酸塩および２０μg／mlカザミノ酸を含むＭ９最少
培地の寒天平板にまき、３７℃で５日間放置することに
よって６−アミノニコチンアミド耐性株のコロニーが出
現した。このうち１株を選び、エシェリヒア・コリＡＮ
Ａ９１／pＸＢＲＰ３１９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９２
８）と命名した。

【００１４】実施例２ 実施例１で得られたエシェリヒア・コリＡＮＡ９１／p
ＸＢＲＰ３１９をグルコース２％、炭酸カルシウム１
％、コーン・スチープ・リカー４％、硫安０.４％、Ｋ
Ｈ₂ＰＯ₄ ０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％およびＭgＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ ０.０１％からなる種培地(pＨ７.１)３０ml
を含む２００ml容ひだ付フラスコで３７℃で１６時間振
とう培養した。得られた培養液の０.６mlをグルコース
５％、コーン・スチープ・リカー５％、硫安０.２％、
ＤＬ−アラニン０.３％、ＫＨ₂ＰＯ₄０.１％、Ｋ₂ＨＰ
Ｏ₄ ０.２％、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.０１％、ＦeＳＯ
₄・７Ｈ₂Ｏ ０.００１％、ＭnＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ
０.００１％およびチアミン塩酸塩０.００２％からなる
種培地(pＨ７.１)３０mlを含む２００ml容ひだ付フラス
コに移し、３７℃で３０時間振とう(２２０回転／分)培
養した。培養後の培養液を遠心分離し、培養上清中のビ
オチンを定量したところ、１６０mg／mlのビオチンが蓄
積していることがわかった。

【００１５】実施例３ 実施例１で得られたエシェリヒア・コリＡＮＡ９１／p
ＸＢＲＰ３１９をグルコース２％、炭酸カルシウム１
％、コーン・スチープ・リカー４％、硫安０.４％、Ｋ
Ｈ₂ＰＯ₄ ０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％、ＭgＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ０.０１％、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.０５％、チ
アミン塩酸塩０.００２％およびテトラサイクリン塩酸
塩０.００１２％からなる種培地(pＨ７.１)１２５mlを
含む５００ml容ひだ付フラスコで３７℃、２１０回転／
分で１６時間振とう培養した。得られた培養液全量をグ
ルコース３％、コーン・スチープ・リカー６％、硫安
０.２％、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％、
ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.０２％、ＤＬ−アラニン０.３
％、ＭnＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ０.００３％、ＦeＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ ０.００３％、Ｆe₂(ＳＯ₄)₃・nＨ₂Ｏ ０.０
２％、チアミン塩酸塩０.００２％、２５％アンモニア
水１.６ml／Ｌおよびアクトコール(武田薬品工業(株)
製、消泡剤)０.０２％からなる主培地(pＨ７.１)２.５
Ｌに移し、５Ｌ容ジャーファーメンタ中で３７℃、通気
量２.５Ｌ／分で培養した。撹拌数は、菌体量に比例し
て、５５０回転から８５０回転まで上昇していき、ま
た、グルコース濃度は、０.１から０.５％の範囲になる
ように６６.７％グルコース水溶液を連続添加した。培
養中は、pＨが６.５から７.０の範囲になるように２５
％アンモニア水で制御し、また、泡がたたないように随
時、アクトコールを添加した。このようにして、７２時
間培養した結果、ビオチン５５０mg／Ｌを含む培養液を
得た。

【００１６】

【発明の効果】本発明の微生物は優れたビオチン生産能
を有しており、この微生物を培養することにより、ビオ
チンを大量に生産することができる。

【００１７】

【配列表】

配列番号:１ 配列の長さ:１１４ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ 起源 生物名:エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 配列 CGTCCGTTGT CATAATCGAC TTGTAAACCA AATTGAAAAG ATTTAGGTTT ACAAGTCTAC 60 ACCGAATTAA CAACAAAAAA CACGTTTTGG AGAAGCCCCA TGGCTCACCG CCCA 114

【図面の簡単な説明】

【図１】 ビオチンオペロンの制御領域およびbioＢ開
始コドン近傍の塩基配列を示す。

【図２】 プラスミドpＸＢＡ３１２のＤＮＡを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:43） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 中濱 一雄 京都府長岡京市梅が丘１丁目16番地の２ (72)発明者 伊福 欧二 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ 株 式会社資生堂第２リサーチセンター内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ビオチンオペロンの一部ないし全部を含
   むプラスミドを有し、ニコチン酸アナログ耐性を示す微
   生物。
2. 【請求項２】 微生物が、エシェリヒア(Escherichia)
   属、バチルス(Bacillus)属またはセラチア(Serratia)属
   に属する微生物である請求項１記載の微生物。
3. 【請求項３】 ニコチン酸アナログが、６−アミノニコ
   チンアミドである請求項１記載の微生物。
4. 【請求項４】 請求項１記載の微生物を培地で培養し、
   培養物中にビオチンを生成蓄積せしめ、これを採取する
   ことを特徴とするビオチンの製造法。