JPH08220101A - 欠損凝固ｖ因子を検出する試験方法で使用するためのキャリブレータ - Google Patents

欠損凝固ｖ因子を検出する試験方法で使用するためのキャリブレータ

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JPH08220101A JP7289448A JP28944895A JPH08220101A JP H08220101 A JPH08220101 A JP H08220101A JP 7289448 A JP7289448 A JP 7289448A JP 28944895 A JP28944895 A JP 28944895A JP H08220101 A JPH08220101 A JP H08220101A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 罹患患者からの血液供給とは無関係に調製さ
れ、欠損凝固Ｖ因子を検出する試験方法で使用されるキ
ャリブレータの解明。 【解決手段】 ヒト血漿にある種の動物の血漿を添加す
ることにより濃度依存様式でＡＰＣＴでの凝血時間が短
縮される知見に基づいて、活性化タンパク質ＣによるＶ
因子の分解を検出する凝固試験でキャリブレータとして
使用し得る血漿が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、活性化タンパク質Ｃに
よるＶ因子の分解を検知する凝固試験でキャリブレータ
として使用し得る血漿、かかる血漿の調製およびその使
用に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】第一
に、血液中での凝固系は、血流をその供給されるべき組
織に持続させることを確保するものであり；第二に、こ
の系は創傷閉鎖を行って傷害に対して反応し、これによ
って生体の完全な状態を維持することを確保するもので
ある。凝固が活性化されると、段階的にそれ自体活性化
するプロテアーゼのカスケード様系によって、活性プロ
テアーゼトロンビンが最終的に形成される。トロンビン
の形成は初めのうちは極めて低いが、タンパク質分解開
裂により補因子Ｖ因子およびVIII因子をトロンビンが活
性化するので、この形成はトロンビン自体により促進さ
れる。それぞれ、プロテアーゼＸａ因子およびIXａ因子
と共に、これらの活性化補因子はりん脂質表面で活性酵
素／補因子複合体を形成し、しかもこれらの複合体の活
性は個々のプロテアーゼの活性よりも約１０００の係数
で高いものである。この正のフィードバック機序はほぼ
爆発的に生じて大量のトロンビンを形成する。トロンビ
ンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、普通には
創傷閉鎖、創傷治癒が行われる。生命の危険がある凝固
の拡大、ひいては生体の血管系の閉鎖、すなわち血栓症
の誘起を防止するには、活性プロテアーゼの阻害、また
プロテアーゼ供給阻止が必要である。体内では、活性プ
ロテアーゼは共有結合複合体の形成によるプロテアーゼ
阻害剤で作用中性化される。プロテアーゼ供給の阻止は
トロンビン自体で開始される。このためには、トロンビ
ンは膜タンパク質トロンボモジュリンに結合し、酵素前
駆体タンパク質Ｃを活性プロテアーゼタンパク質Ｃａ
（ＡＰＣ）に変換する。ＡＰＣはその一部では補因子タ
ンパク質Ｓと共に複合体を形成し、この複合体は活性補
因子VIIIａ因子およびＶａ因子をタンパク質分解で開裂
し、それによって不活性化する。このようにしてＡＰＣ
はこれらの補因子がもたらす強力な促進効果を阻止す
る。
【０００３】上述したタンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系
は重要な抗凝血機序を表している。このことは、遺伝性
または後天性タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓの欠乏ま
たは欠損を有する人は血栓症、殊に再発性静脈血栓症に
極めて罹りやすいと言う事実によって確認された（Esmo
n, C.T. TCM 2: 214-219, 1992年）。タンパク質Ｃおよ
びタンパク質Ｓに加えて、その他の因子も系の活性に対
して影響を及ぼすことができる。これらの因子にはフォ
ン・ヴィレブランド因子および因子IXａ（Rick, M.E.
等, J. Lab. Clin. Med. 115: 415-421, 1990年）が含
まれ、これらの因子は因子VIIIａをタンパク質分解によ
る分解から防護することができる。
【０００４】後天性欠損はまたルプス抗凝血剤（Lupus
anticoagulants）の形成に因ることもある。これらは、
りん脂質に対向し、かつプロテアーゼ／補因子複合体の
りん脂質表面への結合（適切な機能のために必要であ
る）を阻害する抗体である（Amer, L. 等, Thromb. Re
s. 57巻, 247-258頁, 1990年）。最後に、Ｖ因子の変異
体はごく最近に報告され、このものは最早ＡＰＣで不活
性化され得ないか、または少なくともごく低い程度で不
活性化され得るだけである（Bertina, R.M. 等, Nature
369巻, 64-67頁, 1994年）。
【０００５】タンパク質Ｃ自体を除いて、タンパク質Ｃ
／タンパク質Ｓの系に対するこのような阻害は通常のス
クリーニング法（Amer, L. 等, 1990年）の変法、すな
わち活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の
変法（この変法を以下ＡＰＣ時間（ＡＰＣＴ）と称す
る）を用いて診断学上比較的容易に検出することができ
る。ＡＰＴＴを測定するためには、血漿試料を例えばシ
リカ、カオリンまたはガラスのような界面活性剤を含む
試薬およびりん脂質の等容量と接触させる。この混合物
を２、３分間＋３７℃でインキュベートする。この間
に、カルシウム依存ではない凝固系の因子（XII因子、 X
I因子およびIX因子）が活性化される。カルシウムイオ
ンを加えた後、凝固カスケードの残りが活性化され、ト
ロンビンが形成される。生成するトロンビン量を、天然
基質フィブリノーゲンがクロットに変換されることによ
るか、または色素形成基質からの発色団の遊離により、
測定する。このＡＰＴＴからＡＰＣＴへの変更は、カル
シウムイオンと同時に活性化タンパク質Ｃを添加するこ
とを伴っている。上述の如く、ＡＰＣはVIIIａおよびＶ
ａ補因子を破壊するので、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓ
系の機能効率に依存しているトロンビンの形成に減速が
生じてくる。
【０００６】凝固診断薬において、結果を標準の百分率
によって対照標準曲線から評価するのが通例である。こ
の関係で、健康な血液供給者からの血漿のプールを１０
０％の値とし、一方追加の較正点は通常生理食塩水でこ
のプールを希釈したものを用いてプロットする。しか
し、このようなアプローチはＡＰＣＴの較正には適当で
はない。その理由は、血漿の希釈は凝血時間を延長させ
るからである（実施例１参照）；しかしながら、タンパ
ク質Ｃ／タンパク質Ｓの系の機能効率を測定する試験で
は、病理試料の凝血時間が延長される程度は、試料の凝
固活性が不十分に抑制されているために、左程に大きい
ものではない。
【０００７】較正を実施するためには、正常な血漿（１
００％値）を検討すべき因子を除いておいた血漿と混合
するのが凝固診断薬で通常のことでもある。この方法は
また実施例１で実証するようにＡＰＣＴの較正には適し
ていない。Bertina等の研究（１９９４年）が明らかに
しているように、Ｖ因子の変異は不適切に長いＡＰＣＴ
の重要な原因である。Ｖ因子欠損血漿は使用し得ない。
その理由はこの血漿は該因子の欠損のためにＡＰＴＴま
たはＡＰＣＴで事実上凝固し得ないからである。理論上
は、罹患患者の血液からキャリブレータが得られること
も考えられる。しかし、このアプローチは倫理上および
技術上の理由から実行可能ではない。変異凝固因子によ
るその他の凝固障害についても同じような考え方が適用
できる。
【０００８】
【課題解決のための手段】従って、本発明の基本的な目
的は、罹患患者からの血液供給とは無関係に調製するこ
とができるキャリブレータを見い出すところにある。こ
の目的は特許請求の範囲に記載の態様を提供することに
より達成される。意外にも、ヒト血漿にある種の動物血
漿を添加すると濃度依存様式でＡＰＣＴでの凝血時間が
短縮されることが見い出された（実施例２参照）。この
知見は、多くの動物血漿はヒト血漿よりも著しく高い含
量でＶ因子を有していることが知られている（Karges
等, Drug Res. 44巻, 793-797頁, 1994年）ので、なお
一層意外なことである。従って、変異Ｖ因子を含む血漿
にヒト以外の血漿を添加すると、変異Ｖ因子は添加Ｖ因
子で遮蔽されているので、短縮ＡＰＣＴを無効としてし
まうと予想されていた。しかしながら、正確には反対の
効果が認められた（実施例３参照）。得られることがわ
かった効果は、おそらくは試験に用いたヒト活性化タン
パク質Ｃはヒト以外の凝固因子をタンパク質分解での開
裂をなし得ないことによるものである。
【０００９】従来から、当業者にとって、動物血漿Ｖ因
子は既知の前凝固試験法でヒトＶ因子の如く挙動するこ
とが知られていた。従って、動物Ｖ因子もまたＡＰＣＴ
試験でヒトＶ因子に相当する様式で挙動すると予測され
ていた筈である。意外にも、更に研究の結果、検討した
様々の動物種の血漿は、本発明のキャリブレータでの使
用適合性が異なっていることが明らかとなった。本発明
の教示により、凝血時間の短縮を示すＡＰＣＴ測定に使
用するのに適当な血漿との適合性は簡単な実験によって
定めることができる。兎および犬からの血漿またはＶ因
子が特に適当であることがわかったが、一方例えば馬の
血漿は左程適切ではない。
【００１０】動物Ｖ因子製剤は、動物血漿の形態、強化
または精製Ｖ因子フラクションの形態または遺伝子操作
で製造した純粋なＶ因子の形態で好適に使用される。兎
および犬の血漿が特に適当である。それで、Ｖ因子およ
び（または）タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系の機能効
率を検討するための機能試験でＶ因子の欠損に擬せられ
ているキャリブレータは、ヒト血漿に前述のヒト以外の
血漿またはヒト以外の起源のＶ因子を含むフラクション
を添加することによって調製することができる。
【００１１】
【実施例】次の実施例は本発明を具体的に説明するため
のものである。以下の略称を使用する。 ＡＰＣＴ 活性化タンパク質Ｃ時間 ＡＰＴＴ 活性化部分トロンボプラスチン時間 ＤＢＡ ジエチルバルビツール酸アセテート Ｆ.Ｖ.−Def. Ｖ因子変異を有するヒト血漿 ＳＨＰ 標準ヒト血漿
【００１２】実施例１ 健康血液供給者からの血漿プールの希釈によるキャリブ
レータの調製 凝固時間をSchnitger & Gross機械コアグロメータ（Ame
lungenから入手）を用いて測定した。試薬はすべてBehr
ingwerke A.G.から入手した。標準ヒト血漿を健康血液
供給者からの血漿プールとして用いた。ＡＰＴＴは次の
プロトコールに従って測定した。ヒト胎盤から得られた
りん脂質５mlについて、Pathromtin(R) １バイアルを界
面活性剤としてカオリンの懸濁液５mlに溶解した。塩化
カルシウム溶液（２５mM）を使用前＋３７℃に加温し
た。
【００１３】次のものを測定管に連続して注入した。 Pathromtin(R) １００μｌ 血漿試料 １００μｌ 混合物を２分間＋３７℃でインキュベートし、塩化カル
シウム溶液１００μｌを加えて凝固時間が開始した。同
時に、内蔵ストップウオッチのスイッチを入れ、凝固が
検出されるまでの経過時間を記録した。ＡＰＣＴは、Be
hringwerkeから入手したＡＰＣ感作試薬を用いて測定し
た。ＡＰＴＴについての活性化試薬を調製した。出発試
薬は塩化カルシウムおよび活性化タンパク質Ｃからな
り、これを蒸留水５mlに溶解し、使用前に＋３７℃に加
温した。
【００１４】次のものを測定管に連続して注入した。 Pathromtin(R) １００μｌ 血漿試料 １００μｌ 混合物を３分間＋３７℃で培養し、出発試薬１００μｌ
を加えて凝固時間が開始した。同時に、内蔵ストップウ
オッチのスイッチを入れ、凝固が検出されるまでの経過
時間を記録した。生理食塩水またはＤＢＡ緩衝液（Behr
ingwerkeから入手）を用いて、ＳＨＰを種々の濃度に希
釈し、ＡＰＴＴおよびＡＰＣＴを測定した。表１から、
ＡＰＴＴおよびＡＰＣＴ共に使用した培地とは関係なく
血漿の希釈を増大するにつれて増大していることがわか
る。従って、この方法は正常な血漿よりも短いＡＰＣＴ
を有するキャリブレータの調製には適当ではない。
【００１５】
【表１】
【００１６】実施例２ ヒト血漿にヒト以外の血漿を添加することによるキャリ
ブレータの調製 凝固時間を実施例１に記載の如く測定した。表２に、正
常ヒトクエン酸添加血漿（ＳＨＰ）を兎クエン酸添加血
漿または犬クエン酸添加血漿と混合したときに得られる
凝固時間（二回測定の平均値）をまとめた。混合物のＡ
ＰＣＴはヒト以外の血漿の比率が増大するにつれて短く
なることがわかる。兎血漿の効果は、犬の血漿よりも明
らかに顕著なものである。それで、タンパク質Ｃ／タン
パク質Ｓの系の欠陥は、ヒト血漿に小量のヒト以外の血
漿を加えることにより、ＡＰＣＴに擬することができ
る。従って、この方法は、適切に定められたキャリブレ
ータを調製するのに適切である。
【００１７】
【表２】
【００１８】実施例３ Ｖ因子遺伝子に欠陥を有するヒト血漿に対してヒトおよ
びヒト以外の血漿を加えることによる効果 凝固時間は実施例１に記載の如く測定した。正常血漿
（ＳＨＰ：実施例１参照）および兎クエン酸添加血漿
を、ＡＰＣがかろうじて不活性化することができるＶ因
子を含むヒト血漿と様々の濃度で混和し、ＡＰＣＴに対
する効果をモニターした（表３）。予想通り、過剰の正
常ヒト血漿は非分解性Ｖ因子の作用中性化をもたらし、
それによりＡＰＣＴで一層長い凝固時間が観察される。
対照的に、小量の兎血漿の添加でも、ＡＰＣＴの更に顕
著な短縮が得られ、これはまた正常ヒト血漿でも実証さ
れたとおりである。
【００１９】
【表３】

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト以外の血漿またはそのＶ因子含有フ
    ラクションおよびヒト血漿を含有することを特徴とする
    欠損凝固Ｖ因子検出のための試験法で使用するキャリブ
    レータ。
  2. 【請求項２】 正常なヒト血漿で得られるのとは異なっ
    た結果を、Ｆ.Ｖ−依存またはＦ.Ｖａ−依存試験法で生
    じる種からの血漿を使用する請求項１記載のキャリブレ
    ータ。
  3. 【請求項３】 ＡＰＣ依存検定法で、ヒト以外の血漿が
    凝血時間または同等のパラメータの低減を生じる請求項
    １記載のキャリブレータ。
  4. 【請求項４】 好ましくはヒト以外の起源のＶ因子を含
    むクエン酸添加血漿または血漿フラクションを使用する
    請求項１記載のキャリブレータ。
  5. 【請求項５】 ヒト血漿がヒトクエン酸添加血漿、特に
    好ましくは、現行法に従って安定化されているヒトクエ
    ン酸添加血漿である請求項１〜４記載のキャリブレー
    タ。
  6. 【請求項６】 ヒトクエン酸添加血漿に対するヒト以外
    のＶ因子含有添加物の濃度をキャリブレータの反応性が
    添加物なしのものと明確に異なるように選択する請求項
    １〜５記載のキャリブレータ。
  7. 【請求項７】 添加物を凝血時間が未反応ヒトクエン酸
    添加血漿で得られる凝血時間とは少なくとも２０％、好
    ましくは５０％異なっているように選択される請求項６
    記載のキャリブレータ。
  8. 【請求項８】 好適には、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓ
    系の機能効率を検査する凝固試験のための請求項１〜７
    記載のキャリブレータの使用。
  9. 【請求項９】 特に好適には、Ｖａ因子を分解する活性
    化タンパク質Ｃの能力を検査する凝固試験のための請求
    項１〜７記載のキャリブレータの使用。
  10. 【請求項１０】 活性化タンパク質Ｃを外因により添加
    する請求項８記載の使用。
  11. 【請求項１１】 試料のタンパク質Ｃが活性化される請
    求項８記載の使用。
  12. 【請求項１２】 フィブリンクロットの形成により、そ
    して（または）合成トロンビン基質の変換による色素形
    成により生成されるトロンビンの量を測定する凝固試験
    での請求項１〜７記載のキャリブレータの使用。
  13. 【請求項１３】 ヒト以外の血漿またはヒト以外の血漿
    からのＶ因子含有フラクションを添加することにより、
    ヒト血漿を補完する凝固検定法で使用する請求項１〜７
    記載のキャリブレータの製法。
  14. 【請求項１４】 ヒト以外の血漿が犬または兎、好まし
    くは兎から由来する請求項１〜７記載のキャリブレー
    タ。
  15. 【請求項１５】 ヒト血漿またはある種の変異を示すヒ
    トＶ因子の代替品としての動物血漿または動物血漿から
    のＶ因子含有フラクションの使用。
  16. 【請求項１６】 変異ヒトＶ因子が、ヒト活性化タンパ
    ク質Ｃにより、開裂されていないか、またはゆるやかに
    のみ開裂されている請求項１５記載の使用。
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