JPH08224087A

JPH08224087A - Ｃｉｉｔａ活性を示すタンパク質の活性を抑制するインヒビター、その同定方法、およびその薬学的組成物

Info

Publication number: JPH08224087A
Application number: JP7219341A
Authority: JP
Inventors: Bernard Mach; マッハベルナルド
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-28
Publication date: 1996-09-03
Also published as: US5994082A; JP2006298923A

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明の目的は、CIITA活性を示しそしてＭ
ＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現に不可欠なタンパク質の活
性を抑制し得るインヒビターを提供すること。【解決手段】本発明のインヒビターは、CIITA活性を
有し、そして以下から選択される遺伝子によりコードさ
れる組換え生産したタンパク質の使用により得られる： (a) 配列表の配列番号５に示すＤＮＡ配列； (b) (a)のＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配
列； (c) (a)または(b)のＤＮＡ配列のアレル誘導体または
断片；または (d) (a)、(b)、または(c)のＤＮＡ配列と、遺伝子コー
ドの結果として縮重しているＤＮＡ配列。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、脊椎動物のＭＨＣ
クラスＩＩ遺伝子発現の一般的な制御に不可欠なトラン
ス作用性タンパク質の活性を抑制するインヒビターおよ
びその同定方法に関する。本発明はさらに、前記インヒ
ビターを含む薬学的組成物、好ましくは、ＭＨＣクラス
ＩＩ遺伝子の異常な発現に関連する病気の治療のための
薬学的組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】クラスＩＩ主要組織適合（ＭＨＣ）抗原
は、ヘテロダイマーのトランスメンブラン糖タンパク質
である。抗原提示細胞の表面におけるそれらの発現に
は、Ｔ細胞レセプターによる外来抗原の認識が必要であ
る。Ｔ細胞の活性化および抗原の提示は、個々の細胞に
おけるクラスＩＩ抗原の発現レベルに依存する。したが
って、クラスＩＩ遺伝子の発現の調節は、正常および異
常な免疫応答の両方の制御の重要な局面である。

【０００３】ヒトでは、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DR
クラスＩＩ分子のａ鎖およびｂ鎖をコードする遺伝子
は、第６染色体上のＭＨＣのＤ領域にクラスターしてい
る。これらの遺伝子は、厳しくかつ複雑な調節制御を受
けている。これらの発現は、一般に整合されており、そ
して主に免疫系の細胞（Ｂリンパ球、活性化Ｔリンパ
球、マクロファージ、樹枝状細胞、ならびにクッパー細
胞およびランゲルハンス細胞などのある種の特殊な細胞
など）に限定される。あるクラスＩＩネガティブ細胞で
は、発現はインターフェロンγまたはインターロイキン
４などのリンホカインによる刺激により誘導され得る。

【０００４】ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、調節された遺
伝子発現の特に複雑なケースを示している。ヘルパーＴ
細胞に対する外来抗原の提示ならびにＴリンパ球の胸腺
刺激には、ＭＨＣクラスＩＩ分子の正常な発現が必須と
されるので、これらの遺伝子の調節は正常に機能する免
疫系に必要である。ＭＨＣクラスＩＩ抗原をコードする
遺伝子は、最初は実際に「免疫応答遺伝子」と記載され
ていた［Benaceraff、Science 212 (1981)、1229-123
8］。この調節は、クラスＩＩ分子の発現レベルだけで
なく、非常に限定された細胞タイプの特異性にも関連す
る。これは体内のほとんどの細胞は通常ＭＨＣクラスＩ
Ｉネガティブであることによる。この調節の複雑性は、
２つの異なる制御態様、すなわち、Ｂリンパ球などの細
胞での構成的発現、および単球または線維芽細胞などの
細胞タイプでの誘導発現に関連する。最後に、この遺伝
子ファミリーは、３つの異なるHLAクラスＩＩイソタイ
プのａ鎖およびｂ鎖をコードし、そして一般に全体的に
調節される。

【０００５】多くのタンパク質ファクターは、ＭＨＣク
ラスＩＩプロモーターの機能的に必須の配列モチーフ、
特に保存されたＸおよびＹボックスに、インビトロで結
合し得ることが示されている［Glimcherら、Ann. Rev.
Immunol. 10 (1992)、13-49］。さらに、クラスＩＩプ
ロモーターの占有状態は、インビボで分析されている
［Karaら、Science 252 (1991)、709-712］。

【０００６】これまでに、本発明者らは、ＭＨＣクラス
ＩＩ遺伝子の発現に不可欠なタンパク質（ＭＨＣクラス
ＩＩ遺伝子発現のトランスアクチベーター、CIITA）を
単離し、同定し、そしてさらに、このタンパク質をコー
ドする遺伝子を単離した（Steimleら、CELL 75 (199
3)、135-146）。

【０００７】CIITAタンパク質およびこれに対応する遺
伝子は、以下のアプローチにより得られ得る：HLAクラ
スＩＩプロモーターに結合するタンパク質の検出可能な
欠失を示さない調節変異Ｂ細胞株を用いて、ＭＨＣクラ
スＩＩポジティブＢ細胞由来のｃＤＮＡによる表現変異
型の相補性テストを行い、影響を受けたＭＨＣクラスＩ
Ｉ調節遺伝子をクローニングしおよび同定した。選択
は、内因性のクラスＩＩ遺伝子の再発現だけでなく、抗
生物質耐性の遺伝子を誘導する(変異体細胞で不活性な)
ＭＨＣクラスＩＩプロモーターの再活性化に基づいて行
った。ライゲーションで再結合し得ないクローニング部
位を生成して、大きなｃＤＮＡの挿入の効率を確実にし
た。注意深くサイズ選択したｃＤＮＡを用い、そして4.
5kbのCIITAのｃＤＮＡの選択がうまくできるようなｃＤ
ＮＡライブラリーは、3.5kbより大きい平均サイズの挿
入物を含んでいた。さらに、Ｂリンパ球のトランスフェ
クション条件およびマグネットビーズを用いる表面発現
の免疫選択手順は、完全に最適化された。

【０００８】自由に入手可能なクラスＩＩネガティブＢ
細胞株RJ2.25の相補性テストによるCIITAのｃＤＮＡの
クローニングによって、以下の結果が導かれた：CIITA
は、実際にこの変異体で影響を受けた遺伝子であり、そ
して２つのCIITAアレルの欠失は本来のCIITAのｍＲＮＡ
がないことを説明している。１つのアレルはCIITA遺伝
子の内部欠失のみを有しており、そして転写リードスル
ーが短縮型転写物になるようである。CIITAｃＤＮＡに
よりＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現が回復することで、Ｂ
リンパ球でのＭＨＣクラスＩＩの構成的発現の制御にお
けるこのファクターの機能的役割を立証する。CIITA
は、３つの全てのHLAクラスＩＩイソタイプ、ＤＲ、Ｄ
Ｑ、およびＤＰのトランスアクチベーターとして作用
し、そしてこのファクターによる遺伝子座特異的制御の
証拠はない。CIITAをコードするＤＮＡ配列およびその
推定アミノ酸配列を、図３〜９に示す。

【０００９】CIITAは、1130アミノ酸からなるタンパク
質であり、そのｍＲＮＡは低レベルで発現される。その
構造は作用の態様に関してはあまり有益ではない。この
分子のNH₂末端部分は転写活性化ドメインにある保存に
関与している（Mitchellら、Science 245 (1989)、371-
378）。特に、酸性アミノ酸領域に続くプロリン、スレ
オニン、およびセリン残基に富む３つの短い伸長の領域
が寄与している。ある転写ファクターは、類似の活性化
ドメインを有する。ATP/GTP結合部位に対応する配列
は、アミノ酸420から427付近と考えられ、そしてこの位
置での変異は有益である。最後に、アミノ酸979から106
1付近にロイシンに富む領域があり、そこは、酵母のRNA
結合タンパク質のNH₂末端部分と弱い相同性を示す（Tra
gliaら、Mol. Cell. Biol. 9 (1989)、2989-2999）。こ
の弱い相同性は主にロイシンに富む領域内の最初のロイ
シン残基に関連するので、進化的な関連性を示し得な
い。CIITA配列中には明らかなＤＮＡ結合ドメインがな
いので、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターのＸおよびＹボ
ックスに結合することが知られているファクターと転写
機構との間のアダプターとして機能し得ることが推測さ
れ得る。

【００１０】さらに、トランスアクチベーターCIITA
は、Ｂリンパ球のような細胞中でＭＨＣクラスＩＩ遺伝
子の構成的発現を調節するだけでなく、他の細胞タイプ
でこれらと同様の遺伝子の誘導的発現（例えば、インタ
ーフェロンγまたはTNFによる誘導）も制御する。した
がって、それは、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現の一般的
制御に関連するファクターである。その構造は他のファ
クターに関連しない。

【００１１】いくつかの自己免疫疾患、例えば、インス
リン依存性糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、
および紅斑性エリテマトーデスなどは、少なくとも一部
は、通常はHLAクラスＩＩ抗原を発現しない細胞上に抗
原が異常に発現することによると考えられる。次いで、
異常なＴ細胞活性化が自己免疫過程を引き起こす。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】その結果として、例え
ば、自己免疫疾患を予防または治療するために、あるい
は臓器移植、特に骨髄移植の場合に、ならびにＭＨＣク
ラスＩＩネガティブ動物を外来性の臓器ドナーとするた
めに、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現を抑制調節し得る
ことが非常に望まれている。したがって、ＭＨＣクラス
ＩＩ遺伝子発現を抑制調節する能力を有する物質へアク
セスすることができれば、上述の疾患の治療方法を提供
し得る。

【００１３】したがって、本発明の根底にある技術的課
題は、CIITA活性を示しそしてＭＨＣクラスＩＩ遺伝子
の発現に不可欠なタンパク質の活性を抑制し得る物質を
単離かつ同定すること、およびその物質を精製形態で提
供することである。さらに、技術的課題は、CIITA活性
を示すタンパク質の活性を抑制し得る物質を同定する方
法を提供することである。さらに、技術的課題は、上記
物質を含む薬学的組成物を提供することである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記技術的課題は、請求
項で特徴付けられる本発明の実施態様を提供することに
より解決される。ＭＨＣ遺伝子発現を抑制し得るインヒ
ビターは、CIITA活性を有するタンパク質を用いること
により同定され得る。

【００１５】したがって、本発明の目的は、CIITA活性
を示しそしてＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現の一般的制
御に不可欠なタンパク質の活性を抑制し得るインヒビタ
ーを提供することであり、ここで、該インヒビターは、
CIITA活性を有し、そして以下から選択される遺伝子に
よりコードされる組換え生産したタンパク質の使用によ
り得られる： (a) 配列表の配列番号５に示すＤＮＡ配列； (b) (a)のＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配
列； (c) (a)または(b)のＤＮＡ配列のアレル誘導体または
断片；または (d) (a)、(b)、または(c)のＤＮＡ配列と、遺伝子コー
ドの結果として縮重しているＤＮＡ配列。

【００１６】

【発明の実施の形態】上記インヒビターを同定するため
のタンパク質をコードする好ましい配列は、図３〜９に
提供される。

【００１７】図３〜９に示す配列を提供された当業者に
は、哺乳類などの脊椎動物のゲノムライブラリーまたは
ｃＤＮＡライブラリー由来の、あるいは他のヒト個体由
来の関連するＤＮＡ配列を単離するために、このＤＮＡ
配列、その断片、または対応するオリゴヌクレオチドを
使用することが理解される。関連するＤＮＡ配列は、例
えば、対立ヒトＤＮＡ配列である。一方、実施例に示さ
れるように、本発明のスクリーニング法が提供される
と、当業者には、哺乳類などの他の脊椎動物由来のまた
は他のヒト個人由来の対応するＤＮＡ配列を単離し得
る。さらに、図３〜９に示されるＤＮＡ配列またはその
関連のＤＮＡ配列は、化学合成により得られ得る。上記
すべてのＤＮＡ配列は、本発明の範囲内である。したが
って、本発明はまた、従来のハイブリダイゼーション条
件下で図３〜９のＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮ
Ａ配列に関する。

【００１８】上記インヒビターを同定するためのタンパ
ク質をコードする、さらに好ましい配列は、遺伝子コー
ドの縮重により上記ＤＮＡ配列に関連するＤＮＡ配列、
または、図３〜９に示すアミノ酸配列を有するタンパク
質をコードするＤＮＡ配列である。

【００１９】本発明のインヒビターを同定するためのCI
ITA活性を有するタンパク質の組換え生産は、ベクター
への挿入に、上記ＤＮＡ配列を用いて従来法により行わ
れ得る。

【００２０】好ましい組換えベクターは、挿入された遺
伝子が発現制御配列に作動可能に連結しているプラスミ
ドである。他の好ましい組換えベクターは、pDVP10-1で
あり、これはヒトＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベー
ターをコードする4543bpのｃＤＮＡ挿入物をプラスミド
ベクターDV中に含む。このｃＤＮＡはHLAクラスＩＩポ
ジティブＢ細胞株RajiのｍＲＮＡから合成された。この
プラスミドは、該プラスミドを含む大腸菌株（E. coli
pDVP10-1）として1993年7月19日に寄託された。受託番
号は、DMS 8422である。

【００２１】生物学的に活性なCIITAの組換え生産に有
用な宿主生物体は、当業者に選択され得る。このような
宿主生物体は、好ましくは、E. coliまたはBacillus su
btilisなどの細菌、Saccharomycesの種または株（例え
ば、Saccharomyces cerevisiae）などの酵母、および、
昆虫細胞または哺乳類細胞などの他の真核生物宿主細胞
である。

【００２２】本発明の形質転換された宿主生物体は、培
養培地中で適切な条件下で培養され、そして得られる発
現産生物は培地から回収される。必要に応じて、回収さ
れた発現産生物は、イオン交換樹脂またはアフィニティ
ークロマトグラフ用材料（例えばマトリックスに結合し
たモノクローナルまたはポリクローナル抗体）を用いる
クロマトグラフィーなどの一般的な方法により精製され
得る。

【００２３】本発明のインヒビターは、テスト混合物を
調製することにより同定され得る。ここで、インヒビタ
ー候補物は、タンパク質が天然のコンフォメーションを
とり得る適当な条件下でCIITA活性を有するタンパク質
とともにインキュベートされる。このようなインビトロ
テストシステムは当該分野で周知の方法により確立され
得る。CIITA活性を示すタンパク質のインヒビターは、
例えば、まず組換えCIITAタンパク質に結合する合成ま
たは天然に存在する分子のいずれかをスクリーニングす
る工程、次いで、第２に、このようにして選択した分子
を細胞アッセイでCIITAの阻害をテストしてＭＨＣクラ
スＩＩ発現の阻害を反映するものとして同定され得た。

【００２４】組換えCIITAに結合する分子のスクリーニ
ングは、合成および天然の分子の「ライブラリー」由来
の候補分子の非常に多数についての大規模スクリーニン
グを容易に行い得た。結合は、とりわけ、組換えCIITA
が他の分子に結合する際の構造および／またはサイズの
微細な変化として、検出され得たが、それはタンパク質
化学アッセイの技術水準で検出されるようなものであ
る。これらには、蛍光屈折法（G. Turcattiら、Biochem
istry、34:3972-3980、1995）および表面プラスモン共
鳴（SPR）（D. J. O'Shannessyら、Methods in Enzymol
ogy、240:323-349、1994、A. C. Greenlund、Immunit
y、2:677-687、1995）が含まれる。SPRは、固定化したC
IITAまたは適当な支持体に固定化したインヒビター分子
候補物のいずれかを用いて行い得る。SPRはまた、競合
アッセイとして優れた感度で行い得る（R. Karlsson、A
nal. Biochem.、221:142-151、1994）。

【００２５】第２の工程において、CIITA阻害について
の細胞に基づくアッセイは、構成的プロモーターの制御
下でCIITAのｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたC
IITAネガティブ変異体Ｂ細胞株（RJ2.25またはRM3な
ど）、および／またはCIITAのｃＤＮＡでこれもまた安
定にトランスフェクトされたHeLa細胞などのＭＨＣクラ
スＩＩネガティブ細胞株の両方によるものである。この
アッセイは、標準的免疫蛍光法により測定されるHLA-DR
分子の細胞表面発現の阻害による。上記のように、この
ように安定なトランスフェクタントは、CIITAインヒビ
ターの細胞に基づくアッセイ用のツールとして研究室で
生成した。

【００２６】あるいは、このような分子の同定は、実施
例２、６、および７に記載の実施例に基づくインビボテ
ストシステムを用いて行われ得る。好ましくは、CIITA
活性を有するタンパク質を発現させるプラスミドを含む
ヒトの細胞であるHLAクラスＩＩネガティブ変異体細胞
株（例えば、以下の実施例２に記載のRJ2.25、RM3、ま
たはREM-34）を、インヒビター候補物に接触させ、次い
で、HLAクラスＩＩ遺伝子の発現レベルをインヒビター
候補物と接触させていないコントロール細胞のレベルと
比較する。HLAクラスＩＩ遺伝子の発現の測定は、以下
の実施例２に記載のように行い得る。

【００２７】好ましくは、本発明のインヒビターは、CI
ITA活性を示すタンパク質とＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の
制御配列との相互作用を阻害し、それにより該遺伝子の
発現の抑制調節を引き起こす。

【００２８】本発明のさらなる目的は、CIITAの３次元
構造に基づいて設計されるインヒビターであり、その情
報は、当業者の技術水準にある例えば、Ｘ線構造解析、
分光学的方法などの技術を用いて組換えCIITAから得ら
れ得る。

【００２９】本発明のさらなる目的は、合成有機化学物
質、天然発酵産生物、あるいは微生物、植物、または動
物から抽出される物質、あるいはペプチドであるインヒ
ビターである。このようなインヒビター候補物は、上記
のテストシステムの使用によりスクリーニングされ得
る。

【００３０】さらに、CIITA活性を示すタンパク質のATP
結合部位にまたはそのＮ末端酸性活性化ドメインに結合
するインヒビターは、CIITA活性を示すタンパク質の活
性を抑制するために用いられ得る。このようなインヒビ
ターはまた、上記のテストシステムによりスクレーニン
グされ得、ここで、タンパク質へのインヒビターの結合
部位が決定されるか、または、CIITA活性を示すタンパ
ク質の断片がその結合部位を含むように用いられる。こ
のような断片は、例えば、図３〜９に示す配列に基づい
て生成され得る：転写活性化ドメインに対応し得る酸性
アミノ酸のＮ末端領域には、プロリン、スレオニン、お
よびセリン残基に富む３つの短い伸長が続き、アミノ酸
420から427付近のこのアミノ酸配列は、ATP結合部位に
対応し得る。

【００３１】本発明のさらなる目的は、CIITA活性を有
し、そして配列表の配列番号５に示されるＤＮＡ配列、
この配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列、これらの配
列のアレル誘導体またはその断片あるいは上記配列と縮
重するＤＮＡ配列にコードされるか、または図３〜９に
示すアミノ酸配列を有する組換え生産したタンパク質の
CIITA活性を示すタンパク質の活性を抑制し得るインヒ
ビターの同定のための使用である。

【００３２】本発明のさらなる目的は、CIITAを示すタ
ンパク質の活性を抑制し得るインヒビターの同定方法で
あり、この方法は、適切な条件下でCIITA活性を示すタ
ンパク質に結合する能力を利用することにより、該イン
ヒビターについてスクリーニングする工程を含む。

【００３３】CIITA活性を有するタンパク質のこのよう
な使用について、またはこのような方法について、上記
のインビトロ−またはインビボ−テストシステムが好ま
しい。好ましくは、インヒビターは、ATP結合部位にま
たはCIITA活性を示すタンパク質のＮ末端酸性活性化ド
メインに結合するが、それは、例えば、上記のようにCI
ITAタンパク質の断片を用いてインヒビター候補物をア
ッセイすることにより同定される。

【００３４】本発明のさらなる目的は、CIITA活性を示
すタンパク質の活性を抑制し得るインヒビターを同定す
るための方法であり、この方法は、組換えCIITAタンパ
ク質の三次元構造に基づいて適切なインヒビターを設計
する工程を含む。好ましくは、上記テストシステムは、
このような方法に用いられる。

【００３５】本発明のさらなる目的は、本発明のインヒ
ビターを含む薬学的組成物である。この薬学的組成物は
また、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよ
び／または添加物を含む。用量は、被験体の状態および
病気の症状に依存する。

【００３６】好ましくは、上記インヒビターを含む本発
明の薬学的組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現レ
ベルの減少が望ましい病気の治療に用いられ得、あるい
は、外来性の移植用の臓器の供給源としてまたは万能細
胞移植用の細胞の供給源として、ＭＨＣクラスＩＩネガ
ティブトランスジェニック動物の生成に用いられ得る。
特に、これらは、特定の細胞表面でのHLAクラスＩＩ分
子の異常なおよび過剰な発現が、自己免疫の病理学的過
程の原因であると考えられる自己免疫疾患を含む。これ
らは、インスリン依存性糖尿病（IDD）、多発性硬化症
（MS）、紅斑性エリテマトーデス（LE）、およびリウマ
チ様関節炎（RA）を含む。ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子およ
びタンパク質の異常な発現は、これらの病気のある動物
モデルで実証されている。さらに、これらのいくつかの
自己免疫疾患の動物モデルは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に
対する抗体で、良好に治療されており、自己免疫疾患に
おけるＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現の抑制調節が望ま
しいことが、指摘されている。

【００３７】最後に、本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝
子の異常発現に関連する病気が、CIITA活性を有するタ
ンパク質が異常量存在することにより、または他のファ
クターにより引き起こされるかどうかを決定するため
の、本発明のインヒビターを含む薬学的組成物に関す
る。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現を低減また
は排除することにより特徴づけられる病気を有する被験
体の細胞が、アッセイシステムで該インヒビターの存在
下でポジティブな応答を示さない場合（例えば上記のよ
うに）、この病気がCIITAタンパク質の異常量の存在に
より引き起こされないが、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ遺
伝子自身でシス作用変異により引き起こされると結論し
得る。このような結果に基づいて、理論を適切に応用し
得る。

【００３８】

【実施例】本発明を以下の実施例により説明する：実施例１変異体RJ2.25の相補性による発現クローニングクラスＩＩ調節変異体RJ2.25の遺伝的相補性による発現
クローニングは、遺伝子欠陥の性質については偏りがな
く、欠陥が単一遺伝子に関することを必要とする。選択
マーカーとして内因性のHLAクラスＩＩ遺伝子の再発現
を用いることに加えて、発明者らは、いくつかの異なる
選択戦略を、別々にまたは組み合わせて可能にする、一
連のｃＤＮＡ発現ベクターを構築した。

【００３９】ｃＤＮＡ発現ベクターEBO-Sfiの構築ｃＤＮＡ発現ベクターEBO-Sfi（図１）を以下のように
して構築した。EBO-pLPPのハイグロマイシンＢ耐性を付
与する遺伝子hph［Spickofskyら、ＤＮＡ Prot.Engin.
Techn. 2 (1990)、14-18（R. F. Margolskee博士から供
与）］を、pTG76の最適化hph遺伝子［Giordanoら、loc.
cit.（W. T. McAllister博士により供与）］で置き換
えた。SV40初期プロモーターの制御下のhph-76遺伝子
を、PstI部分消化およびBamHI完全消化から得られる2,5
46bp断片としてpTG76から単離した（pTG76の1845位およ
び4391位）。EBO-pLPPから、6,675bpのPstI-EcoRV（185
9位、5765位）および615bpのBamHI-EcoRV断片（5141
位、5756位）を単離し、そしてhph-76 PstI-BamHI断片
と連結した。得られたベクターにおいて、両方のSV40初
期プロモーターのSfiI部位を、SfiI消化、３’オーバー
ハングの除去、および再連結により破壊した。これはプ
ロモーター活性に影響しなかった。次に、EBO-pLPPポリ
リンカー（SacI〜KpnI、EBO-pLPPにおける１〜37位）
を、SfiI-ｃＤＮＡクローニングカセットで置き換え
た。これについて、800bpの細菌性クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子を、オリ
ゴヌクレオチドアダプターを介してSacIおよびKpnI部位
に挿入した。得られたEBO-Sfiベクターにおいて、ｃＤ
ＮＡクローニングカセットを構成する配列は、以下の通
りである：5' GAGCTCGGCCTCACTGGCC-CAT-遺伝子-GGCCAG
TGAGGCCGGTACC 3'（配列番号１、配列番号２）。

【００４０】ベクターDVおよびDRA-CDの構築ベクターDV（図１Ｃ）を、EBO-Sfiの唯一のHindIII部位
とBgIII部位との間のSV40初期プロモーターを制御するh
ph-76遺伝子を、HLA DRAプロモーターの３００ｂｐ断片
（−２７０位〜+30位；転写開始部位に対して）で置き
換えることにより生成した。

【００４１】ベクターDVでは、ハイグロマイシンＢ耐性
遺伝子を、HLA-DRAプロモーターの制御下に配置する。
これにより、HLAクラスＩＩ転写の再活性化について抗
生物質選択を可能にする。

【００４２】DRA-CDの構築（図１Ｂ）については、300b
pのHLA DRAプロモーター、1,742bpヒトCD4 ｃＤＮＡ遺
伝子［Maddonら、loc. cit.］、およびpTG76の134bpのS
maI-BamHIポリアデニル化シグナルからなるリポーター
遺伝子カセットを、EBO-SfiのHindIII部位に挿入した。
ｃＤＮＡクローニングについて、プラスミドＤＮＡをSf
iIで完全に消化し、そして５％〜20％のショ糖勾配でCA
T-スタファー（stuffer）から分離した。

【００４３】ｃＤＮＡライブラリーおよびプラスミドプ
ールの構築２本鎖ｃＤＮＡを、Raji細胞から調製された20μgのポ
リアデニル化mRNAからSuperscript逆転写酵素(Gibco-BR
L)を用いて合成した。ｃＤＮＡをパリンドロームでない
SfiI-SalIアダプター(5'pTGGCCGTCGACTAC[配列番号
３]、5'pGTAGTCGACGGCCAGTG[配列番号４])に連結した。
アダプター連結ｃＤＮＡを5％〜20％ショ糖勾配でサイ
ズ分画し、そして2.5kbより大きな挿入物を、プラスミ
ドベクターDVおよびDRA-CDのそれぞれに連結した。連結
反応物をEscherichia coli DH5A株にエレクトロポレー
ションし、このサイズの画分について5×10⁷組換体以上
の可能性のあるライブラリー力価を生じた。SalIまたは
SfiI切断後、ｃＤＮＡの平均挿入物サイズは約3〜3.5kb
であった。組換え体を、50μg/mlアンピシリンを含有す
るLuria-broth寒天を含む15cmペトリ皿につき5×10⁴コ
ロニーが出るように播いた。細胞をプレートを掻いて集
め、5×10⁵組換え体をプールし、そして-70℃でグリセ
ロール貯蔵で一部保存し、残りの細菌をアルカリ溶解ミ
ニプレップ法[Sambrookら、Molecular Cloning, A Labo
ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989)]によりプラスミドＤＮＡを単離するために用い
た。

【００４４】RJ2.25トランスフェクション細胞を10％胎児ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイ
シン、およびグルタミンを添加したRPMI1640培地で37℃
にて5％CO₂中で培養した。

【００４５】RJ2.25をトランスフェクション実験前の限
界希釈により再クローニングした。50×10⁶のRJ2.25細
胞を、20μlプラスミドＤＮＡおよびキャリアとして800
μl RPMI培地中の400μg E. coli tRNAを用いるエレク
トロポレーションによりトランスフェクトした。電気パ
ルス放射後直ちに、１mlのFCSを各エレクトロポレーシ
ョンキュベットに添加した。トランスフェクションの48
時間後、ハイグロマイシンＢ(Calbiochem)を125μg/ml
で添加した。この投与量を3日間隔の2工程で最終濃度25
0μg/mlまで増加した。細胞数は、1×10⁵および1×10⁶/
mlの間で維持した。ハイグロマイシンＢ選択は2週間後
に完了した。限界希釈実験により測定されたトランスフ
ェクション効率は、ルーチンには、EBO-SfiおよびDRA-C
Dプラスミドを用いた25％の安定トランスフェクタント
より良かった。Raji細胞にトランスフェクトした場合、
DVプラスミドは、10〜15％の安定なトランスフェクタン
トを生じた；RJ2.25中へのトランスフェクション後、ハ
イグロマイシンＢ選択下で99.9％以上の細胞が死滅し
た。

【００４６】フローサイトメトリック分析以下のHLAクラスＩＩ特異的モノルローナル抗体を用い
た：2.06(DR、C. Epplenの贈与)、L243(DR)、B7/21(D
P、N. Reinsmoenの贈与)、Tu22(DQ、A. Zieglerの贈
与)。さらに、本願発明者らは、CD4特異性OKT4モノクロ
ーナル抗体(M. Hadamの贈与)を用いた。

【００４７】細胞(10⁶)を、染色緩衝液(リン酸緩衝溶
液、１％ウシ血清アルブミン、および2.5％熱不活性化
ヒトAB血清)中で、モノクローナル抗体と4℃で30分間イ
ンキュベートした。細胞を洗浄し、そしてFITC標識され
たウサギ抗マウスIgG(SEROTEC)とインキュベートした。
洗浄後、10,000の生存細胞をFACScanフローサイトメー
ター(Becton-Dickinson)を用いて分析した。死滅細胞
は、ヨウ化プロピジウムを用いてそれらを染色すること
により、そしてそれらの前方および側面の光散乱特性に
よる分析から排除した。

【００４８】細胞ソーティングトランスフェクトしたRJ2.25細胞は、トランスフェクシ
ョン後、3日から5日のソーティングの第一ラウンドを受
けた。3×10⁷と1.2×10⁸との間の細胞をトランスフェク
ションおよびソーティング工程あたり使用した。細胞
を、遠心分離により回収し、PBS/BSAで１回洗浄し、そ
して次いでPBS/BSA中の2.06またはOKT4腹水抗体を用い
て、2.5％熱不活性化ヒトAB血清の存在下で30分間氷上
で染色した。洗浄後、細胞をマグネットビーズ(Dynal,
Norway)と結合した5〜10μlヤギ抗マウスと、2.5％熱不
活性化ヤギ血清を添加したPBS/BSA中で30分間氷上でイ
ンキュベートした。ビーズに結合した細胞を、マグネッ
トの助けで染色されなかった細胞から分離し、数回洗浄
しそして増殖させた。ビーズは、数日間細胞に付着する
が、成長を阻害せず、そして除去されなかった。細胞集
団が十分な数(3〜5×10⁷)まで成長した時に、さらなる
選択のラウンドを実施した。抗体の濃度は、細胞の生存
を最適化するためにビーズ選択後1日または2日間は、し
ばしば減少させるが、ハイグロマイシンＢ選択を、この
全体のプロセスの間維持した。ソートされた集団を、2.
06またはL243で染色することによりおよび各選択のラウ
ンド後のFACS分析によりHLA DR発現について分析した。
ハイグロマイシンＢ選択に加えて、免疫選択の２つのラ
ウンドの後、5つのDV-ｃＤＮＡプールの中からの得られ
た3つのトランスフェクタントの培養物は、強いHLA-DR
発現を示した(図２Ａ、パネル１、２、３）。

【００４９】プラスミドレスキュープラスミドを、細菌ミニプレップ法によく似たアルカリ
溶解により、ソートされた細胞集団から単離した。レス
キューしたプラスミドプールを、E. coli DH10B株(Gibc
o-BRLの寛大な贈呈)へのエレクトロポレーションにより
トランスフェクトした。数百のコロニーを寒天プレート
からかきとり、増殖し、そしてプラスミドＤＮＡを抽出
した。これらのプラスミドプールの挿入物を、SfiI、Sa
lI、SacIおよびKpnIを用いた切断により分析し、続いて
ゲル電気泳動を行った。ランダムに選んだ単一のコロニ
ーからのプラスミドＤＮＡを同様に分析し、そしてレス
キューしたプールに優先的に見られるのと同じ型の挿入
物を含むプラスミドを、RJ2.25細胞に再トランスフェク
ションするために用いた。

【００５０】これらの高度に選択された集団からレスキ
ューされたプラスミドプールは、SalI、SfiI、SacIおよ
びKpnIで切断およびゲル電気泳動により、特徴的な挿入
物由来のバンドの限定的なセットを示した。同じ4.5kb
のｃＤＮＡ挿入物は、レスキューしたプラスミドを用い
て得られたランダムに選択した細菌のコロニーの50％以
上に見られた。HLA-DR発現について試験した場合、ハイ
グロマイシンＢ耐性についてのみ選択したトランスフェ
クタントはネガティブであった。これらの細胞からレス
キューしたプラスミドプールは、挿入物の大きさについ
てはランダムな分布を示した。

【００５１】最後に、ベクターDRA-CD中に調製されたｃ
ＤＮＡライブラリーを用いて安定にトランスフェクトさ
れたRJ2.25変異体細胞を、免疫選択により、HLA-DRの発
現についておよびCD4発現について(2.06およびOKT4抗体
ならびにマグネットビーズを用いる)の両方によりソー
トした。３つのラウンドのソーティングの後、選択した
トランスフェクト集団は、上記のRJ2.25/DVプールより
も幾分弱いが、はっきりとHLA-DRまたはCD4発現を示し
た(図２Ａ、パネル４)。HLA-DR発現単独についてソート
された細胞からレスキューしたプラスミドの約30％は、
DVトランスフェクタント(上記参照)に見い出される挿入
物と同じ優勢な4.5kb挿入物を示した。対照的に、CD4発
現単独について選択されたトランスフェクタントからレ
スキューしたプラスミドはまた、異なる優勢なｃＤＮＡ
挿入物を示し、変異体細胞中の再トランスフェクション
に際しては、HLAクラスＩＩ発現に有効でない(データを
示さない)。これらのプラスミドは、まだそれほど分析
されていない。

【００５２】実施例２ CIITA ｃＤＮＡは、変異体細胞株で完全な野生型HLAク
ラスＩＩの表現型の発現を復帰する。

【００５３】HLA-DRを再発現する選択したトランスフェ
クタント中に、優勢に見い出される4.5kbのｃＤＮＡ挿
入物を有する個々のコロニー由来のプラスミド(上記参
照)を単離し、そして次いで、クラスＩＩネガティブの
変異体RJ2.25のＢ細胞に再トランスフェクトした。次い
で、トランスフェクタントを、ハイグロマイシンＢ耐性
のみについて選択した。HLAクラスＩＩ発現について任
意の免疫選択をすることなく、安定なトランスフェクタ
ントは、野生型レベルのHLA-DRを発現した(図２Ｂ、パ
ネル２)。ハイグロマイシン耐性遺伝子が、SV40プロモ
ーターによりまたはDRAプロモーターにより駆動される
にしろ、これらの相補実験で同一の結果を得た。調節変
異体細胞株でHLA-DR遺伝子の発現を復帰し得ると見い出
されたｃＤＮＡを「クラスＩＩトランスアクチベーター」
の代わりにCIITAと名付けた。

【００５４】例外が記載されているが、異なるHLAクラ
スＩＩ遺伝子の発現は、一般に全体様式(global fashio
n)で調節される[Machら、Cold Spring Harb. Symp. Qua
nt.Biol. 51 (1986)、67-74]。CIITA ｃＤＮＡで安定に
トランスフェクトされたRJ2.25変異体細胞の細胞表面の
分析は、野生型レベルのHLA-DR分子(復帰細胞の初期選
択に使用されるクラスＩＩ分子)の発現のみならず、HLA
-DPおよびHLA-DQアイソタイプの再発現を示した(図２
Ｂ、パネル２−４)。従って、RJ2.25中で作用するCIITA
トランスアクチベーターは、すべてのHLA-DR、-DQおよ
び-DPのａおよびｂ鎖遺伝子の全ての発現を修正し、そ
して変異体細胞株で正常かつ完全なHLAクラスＩＩポジ
ティブ表現型を復帰するに十分である。

【００５５】実施例３ CIITA ｃＤＮＡおよびタンパク質の配列２本鎖ＤＮＡを、主としてPharmaciaのT7 G/A-deazaシ
ークエンシングキットを用いるがBioradのBstシークエ
ンシングキットもまた用いて、ジデオキシ鎖ターミネー
ション法により塩基配列を決定した。ｃＤＮＡおよび
翻訳されたタンパク質配列は、EMBL(リリース33)、GenB
ank(リリース74)、SWISS-PROT(リリース24)、およびdbE
STデータベースにある配列に対する相同性を試べた。配
列の分析をPC/Geneリリース6.7(Intelligenetics)、BLA
STサーバー、およびPROSITE辞書を用いて行った。

【００５６】CIITA ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび推定
アミノ酸配列を図３〜９に示す。いくつかの独立したソ
ーティング実験から得たCIITA ｃＤＮＡクローンの５'
末端は、配列が決定され、そしてそれらの開始点が図中
で示されている。クローンpDVP10-1の完全な塩基配列が
決定された。それは、長さが4,543bpであり、そして113
0アミノ酸の推定タンパク質をコードし、ヌクレオチド1
16位に開始コドンを有する3390bpの読みとり枠を含む。
同じ読み枠で20〜22位に停止コドンがある。この最初の
読み枠が合ったATGコドン(116位)が翻訳開始部位にとっ
て最も重要な基準を満たすが、塩基対188位(アミノ酸25
位)の第２番目の読み枠があったATGコドンは、完全な
「コザックボックス」の情報内にあり、そして1106アミ
ノ酸のタンパク質になる開始コドンとしてまた働き得
る。1130アミノ酸のタンパク質は推定分子量123.5kDを
有し、これはインビトロでCIITA ｃＤＮＡから翻訳され
たタンパク質について観察された見かけ分子量135〜140
kD（示していない）によく相当する。５'のUT領域は115
bpの長さであり、そして３'のUT領域は１kbの長さであ
る。

【００５７】CIITA ｃＤＮＡの３'の非翻訳領域のAlu繰
り返し(塩基対3890から4190)を除いて、入手出来るデー
タベースにあるヌクレオチドまたはタンパク質配列のい
ずれにも有意な相同性は検出されなかった。推定CIITA
タンパク質配列中の既知または可能な機能的要素(モチ
ーフ)についての調査は、アミノ酸420位から427位に潜
在的なATP/GTP結合部位を明らかにした(図３〜９)。タ
ンパク質のＮ末端部分は、30％のグルタミン酸／アスパ
ラギン酸を含む50から137残基にわたる配列をともな
う、酸性残基が豊富な領域を示し(アミノ酸30から160、
図３〜９参照)。162から322の残基は、プロリン、セリ
ンおよびトレオニンが豊富である。この領域の中で、３
つの範囲(残基163〜195、209〜237および260〜322)は、
20％から23％のプロリンおよび17％から28％のセリン／
トレオニンを示す。従って、CIITAは新規な遺伝子であ
り、その機能はＢリンパ球におけるＭＨＣクラスＩＩ遺
伝子発現に必須である。

【００５８】実施例４変異体Ｂ細胞株におけるCIITA遺伝子欠陥の同定 HLAクラスＩＩネガティブ変異体RJ2.25は、欠失および
染色体再配列を起こすことが知られている低線量の放射
線照射で生成したので、本願発明者らはサザンブロット
ハイブリダイゼーションにより、RJ2.25中のCIITA遺伝
子の構成を分析した。

【００５９】高分子量のＤＮＡを、培養細胞から抽出し
た[Millerら、Nucl. Acids Res. 16(1988)、1215]。制
限エンドヌクレアーゼ切断したＤＮＡを、0.7％アガロ
ース/TBEゲルで分離し、そして正に帯電するナイロンメ
ンブレン(Boehringer-Mannheim)に毛細管で移動した。
サザンハイブリダイゼーションを、Quick-hybridisatio
n Mix(Stratagene)にある³²P標識したｃＤＮＡ断片のラ
ンダム九量体を用いて、製造社の説明書に従って、競争
剤として音波処理した一本鎖ヒト胎盤ＤＮＡの存在下で
行った。ブロットを0.1％SDSを含む2×SSC中40℃で２回
洗浄し、続いて0.1％SDSを含む0.1×SSC中65℃で２回洗
浄し、その後、増強スクリーンを用いて-70℃でX-ARフ
ィルムに感光した。

【００６０】親Ｂ細胞株RajiからのHindIII切断したゲ
ノムＤＮＡは、完全長のCIITA ｃＤＮＡプローブとハイ
ブリダイズした後、３本のポジティブのバンド、および
CIITA ｃＤＮＡの３'の非翻訳領域にある先に記載したA
lu繰り返し配列(上記を参照のこと)による高バックグラ
ンドシグナルを示した。従って、ハイブリダイゼーショ
ンは、CIITA ｃＤＮＡの明確な断片を用いて行った。図
１０Ｂに示すように、CIITA ｃＤＮＡの1.8kb中央のHin
dIII断片は、親Ｂ細胞株RajiのゲノムＤＮＡ内の3.8kb
HindIII断片にハイブリダイズする。このバンドは、ブ
ロットを長く感光した後でさえ、変異体細胞株RJ2.25か
らのＤＮＡにおいては完全に存在しておらず(図１０
Ｂ、プローブｂ)、両方の染色体上にCIITA遺伝子のこの
中央領域の欠失示す。CIITA ｃＤＮＡの５'および３'の
プローブに、それぞれハイブリダイズするゲノムHindII
I断片は、両方に存在し、変異体細胞株からのＤＮＡに
おいて長さは、変化しない(図１０Ｂ，プローブａおよ
びｃ)。しかし、これら２本のバンドは、野生型Raji Ｄ
ＮＡと比較して、RJ2.25ではシグナル強度が半分に過ぎ
ず、変異体細胞ではこれら各２本の断片の１コピーのみ
の存在を示唆している。

【００６１】最後に、RNAse保護によるCIITA mRNAの分
析は、サザンブロットで証明された完全な欠失から予想
されるとおり、CIITA ｃＤＮＡの欠失した中央部分内に
位置するプローブとではシグナルの不在を示した(図１
１Ａ)。興味深いことには、CIITA mRNAの３'末端に対応
するプローブは保護され(図１１Ｂ)、変異した遺伝子内
に観察される内部欠失を横切るリードスルーを示唆す
る。

【００６２】これらの実験は、調製変異体RJ2.25でイン
タクトなCIITA遺伝子の欠損についての直接的な証拠を
提供し、そして変異株をつくるために用いた放射線照射
は、ある場合には、CIITAアレルの完全な損失に至り、
その一方他の場合には内部欠失を誘導することを示す。

【００６３】実施例５他のHLAクラスＩＩ調製変異体はまた、CIITAにより復帰
する。

【００６４】HLAクラスＩＩネガティブ調節変異体Ｂリ
ンパ芽球細胞株は、RJ2.25とは独立に、そして異なった
変異誘発のプロトコルを含む異なった手法により生じ
た。本願発明者らは、RJ2.25(図１２、パネル２)におけ
るようにCIITA ｃＤＮＡがHLA-DR発現を復帰し得るかど
うか探究するために２つの別のそのような細胞株を試験
した。変異体RM3[Calmanら、J. Immunol. 139 (1987)、
2489-2495]は、化学的変異誘発により生成され、そして
RJ2.25のようにHLAクラスＩＩ調節においてで劣性欠陥
に対応することを示した。クラスＩＩネガティブRM3変
異体ＢをCIITA ｃＤＮＡでトランスフェクトした場合、
HLA-DRの正常な発現を、図１２のパネル３に示すように
復元した。RJ2.25変異体の場合におけるように、HLA-DQ
および-DP発現は同様に復元された(データは示さな
い)。発明者らはまた、同じRaji親Ｂ細胞株から、EMSを
用いる変異誘発に続いて、HLAクラスＩＩネガティブ変
異体を生成した。１つのこのような変異体(REM-34)を、
CIITA ｃＤＮＡでトランスフェクトし、そしてHLA-DR発
現について分析した。２つの前の場合のように、CIITA
は、HLAクラスＩＩ分子の発現を復元した(図１２、パネ
ル４)。

【００６５】CIITAの分化(differential)発現ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は限られた数の細胞型において
のみ発現する。しかし、現在までのところ、ＭＨＣクラ
スＩＩ発現の制御に含まれるであろうと推測された因子
は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の制御と関係する発現のパ
ターンを示さなかった[Glimcherら、loc. cit.]。CIITA
に関するこの疑問と取り組むために、RNAse保護実験
を、いくつかのＭＨＣクラスＩＩネガティブおよびポジ
ティブ細胞株を用いて行った(図１１Ｃ)。

【００６６】２つのCIITA ｃＤＮＡ断片を、RNAse保護
プローブとして調製した。内部プローブは、225bpのCII
TA mRNAを保護するヌクレオチド2049(SfiI)から1824(Nc
oI)をカバーしている。３'末端プローブは、CIITAのヌ
クレオチド4520から4340(HinfI)にわたる180bpの断片に
相補的である。コントロールとして、TBP mRNAの275bp
断片(塩基対1228から953)の断片を調製した。線状化し
た構築物から、³²P-UTP標識リボプローブを、44bp、44b
p、および60bpの非相補性のベクターにコードされるオ
ーバーハングを残してインビトロ転写により生成した。
10μgの全RNAを、酵母RNAを用いて50μgにし、80％ホル
ムアミド中で、500,000cpmのプローブと50℃で一晩ハイ
ブリダイゼーションを行った。

【００６７】RNAseＡおよびT1[Sambrookら、loc. cit.]
での切断後、保護断片を6％ポリアクリルアミド、8M尿
素ゲルで電気泳動により分離し、そしてオートラジオグ
ラフィーにより可視化した。いくつかのEBV形質転換さ
れたＢ細胞株、およびクラスＩＩポジティブの結腸癌腫
細胞株CO115は、CIITA mRNAの発現を示した。対照的
に、３つのHLAクラスＩＩネガティブ細胞株、2102Ep、A
ndrews MOLT-4、およびSK-N-ASは、CIITA mRNA発現のシ
グナルを示さなかった(図１１Ｃ)。この初期研究から、
発明者らは、CIITA発現は遍在するのではなく、ＭＨＣ
クラスＩＩ発現と関連するように見えるパターンでそれ
自身が調節されていると結論づけた。

【００６８】実施例６ CIITA ｃＤＮＡは、遺伝性ＭＨＣクラスＩＩの欠陥を有
する患者からの細胞においてＭＨＣクラスＩＩ分子の発
現を復元し得る。

【００６９】遺伝性ＭＨＣクラスＩＩの欠陥は、ＭＨＣ
クラスＩＩ遺伝子の発現を全体的に欠く主要な免疫欠損
の形態である。この病気にかかっている患者は、しばし
ば多重感染により死亡する。CIITA遺伝子は、これらの
患者のいくつかの例で遺伝欠陥を復帰することを見い出
した(図１３参照)。ＭＨＣクラスＩＩ欠陥を有する患者
からのＢリンパ球を、すべてのＭＨＣクラスＩＩ遺伝子
の再発現を生じる、適切なベクター中にあるCIITA ｃＤ
ＮＡでトランスフェクトし得る。クローン化遺伝子によ
る生細胞中における遺伝子欠陥の復帰は、この病気の遺
伝子治療への道を開く。

【００７０】実施例７ CIITA ｃＤＮＡは、ＭＨＣクラスＩＩネガティブ細胞の
異なるタイプにおいてＭＨＣクラス分子の発現を誘導し
得る。

【００７１】身体の大部分の細胞は、通常、ＭＨＣクラ
スＩＩネガティブである。癌細胞に対するワクチン化ま
たは免疫応答の誘導のような多くの状況では、通常はク
ラスＩＩネガティブの細胞をより免疫原性にするため
に、これらの細胞内でＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現を
誘導または助長することが望まれる。図１４に示したデ
ータは、このことが実際に達成され得ることを示した。
３つの異なるＭＨＣクラスＩＩネガティブヒト細胞株
を、CIITA ｃＤＮＡでトランスフェクトし、ＣＩＩＴＡ
ｃＤＮＡは、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ表面分子の発
現を誘導するに十分であった。ＣＩＩＴＡｃＤＮＡの
この効果は、癌においてワクチン化および遺伝子治療に
ついて新しい戦略の明瞭に示唆する。

【００７２】実施例８トランスアクチベーター遺伝子CIITAにより誘導される
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ペプチド結合およびペプチド
特異的なＴリンパ球活性化において非常に有効である。

【００７３】ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現がトランスア
クチベーター遺伝子CIITA(CIITA ｃＤＮＡとして)によ
り誘導された細胞を、外因性のペプチドに結合するそれ
らの能力およびＴ細胞クローンにこのようなペプチドを
呈示するそれらの能力について試験した。これらのCIIT
Aトランスフェクタントを、ＭＨＣクラスＩＩ発現がイ
ンターフェロンガンマにより誘導された同じ細胞と比較
した。２つの型の細胞は、それらの表面で、同様なレベ
ルでＭＨＣクラスＩＩ分子を発現した。この実験は、適
切なHLA-DR特異性の、および用いた特定の破傷風トキソ
イドペプチドに対して特異性を示すＴ細胞クローンを用
いて行った。これらの２つの型のＭＨＣクラスＩＩポジ
ティブ細胞によるペプチド特異的なＴ細胞活性化を、刺
激指標として表したＨ³-チミジン取り込みにより測定し
た。この特別な実験で、黒腫細胞を抗原存在細胞として
用いた。

【００７４】図１５に見られ得るように、ＭＨＣクラス
ＩＩネガティブの、トランスフェクトされていないコン
トロール細胞は、Ｔリンパ球を活性化しなかった。イン
ターフェロンガンマで刺激されたＭＨＣクラスＩＩポジ
ティブ細胞はまた、高ペプチド濃度でさえ、顕著なＴ細
胞活性化を誘導しなかった。その一方、CIITA ｃＤＮＡ
でトランスフェクトされた細胞は、非常に有効な抗原提
示細胞およびペプチド特異的Ｔ細胞アクチベーターとし
て挙動する。これらの機能的な結果と一致して、これら
２つの型のＭＨＣクラスＩＩポジティブ細胞のペプチド
結合活性は劇的に異なり、インターフェロン活性化細胞
では低く、そしてCIITAトランスフェクタントでは高
い。従って、CIITAは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を
誘導し、ペプチドを結合し、そしてＴリンパ球にペプチ
ドを提示するそれらの非常に有効な能力において通常で
はないが、これらのリンパ球の活性化に至る。従って、
CIITA は、非常に高いペプチド特異的な免疫原性を示す
細胞を生成するために用い得る。

【００７５】

【発明の効果】本願発明は、脊椎動物のＭＨＣクラスＩ
Ｉの遺伝子発現の一般的なコントロールに必要であるト
ランス作用タンパク質の活性を抑制するインヒビターお
よび同じ物を同定する方法に関する。本願発明は前記イ
ンヒビターを包含する薬剤組成物に関し、好ましくは、
ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の異常型発現に関連する病気の
治療に関する。

【００７６】

【配列表】

【００７７】

【配列番号１】配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列 GAGCTCGGCC TCACTGGCC 19

【００７８】

【配列番号２】配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列 GGCCAGTGAG GCCGGTACC 19

【００７９】

【配列番号３】配列の長さ：１４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TGGCCGTCGA CTAC 14

【００８０】

【配列番号４】配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GTAGTCGACG GCCAGTG 17

【００８１】

【配列番号５】配列の長さ：４５４３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 TGATGAGGCT GTGTGCTTCT GAGCTGGGCA TCCGAAGGCA TCCTTGGGGA AGCTGAGGGC 60 ACGAGGAGGG GCTGCCAGAC TCCGGGAGCT GCTGCCTGGC TGGGATTCCT ACACAATGCG 120 TTGCCTGGCT CCACGCCCTG CTGGGTCCTA CCTGTCAGAG CCCCAAGGCA GCTCACAGTG 180 TGCCACCATG GAGTTGGGGC CCCTAGAAGG TGGCTACCTG GAGCTTCTTA ACAGCGATGC 240 TGACCCCCTG TGCCTCTACC ACTTCTATGA CCAGATGGAC CTGGCTGGAG AAGAAGAGAT 300 TGAGCTCTAC TCAGAACCCG ACACAGACAC CATCAACTGC GACCAGTTCA GCAGGCTGTT 360 GTGTGACATG GAAGGTGATG AAGAGACCAG GGAGGCTTAT GCCAATATCG CGGAACTGGA 420 CCAGTATGTC TTCCAGGACT CCCAGCTGGA GGGCCTGAGC AAGGACATTT TCAAGCACAT 480 AGGACCAGAT GAAGTGATCG GTGAGAGTAT GGAGATGCCA GCAGAAGTTG GGCAGAAAAG 540 TCAGAAAAGA CCCTTCCCAG AGGAGCTTCC GGCAGACCTG AAGCACTGGA AGCCAGCTGA 600 GCCCCCCACT GTGGTGACTG GCAGTCTCCT AGTGGGACCA GTGAGCGACT GCTCCACCCT 660 GCCCTGCCTG CCACTGCCTG CGCTGTTCAA CCAGGAGCCA GCCTCCGGCC AGATGCGCCT 720 GGAGAAAACC GTCCAGATTC CCATGCCTTT CTCCAGTTCC TCGTTGAGCT GCCTGAATCT 780 CCCTGAGGGA CCCATCCAGT TTGTCCCCAC CATCTCCACT CTGCCCCATG GGCTCTGGCA 840 AATCTCTGAG GCTGGAACAG GGGTCTCCAG TATATTCATC TACCATGGTG AGGTGCCCCA 900 GGCCAGCCAA GTACCCCCTC CCAGTGGATT CACTGTCCAC GGCCTCCCAA CATCTCCAGA 960 CCGGCCAGGC TCCACCAGCC CCTTCGCTCC ATCAGCCACT GACCTGCCCA GCATGCCTGA 1020 ACCTGCCCTG ACCTCCCGAG CAAACATGAC AGAGCACAAG ACGTCCCCCA CCCAATGCCC 1080 GGCAGCTGGA GAGGTCTCCA ACAAGCTTCC AAAATGGCCT GAGCCGGTGG AGCAGTTCTA 1140 CCGCTCACTG CAGGACACGT ATGGTGCCGA GCCCGCAGGC CCGGATGGCA TCCTAGTGGA 1200 GGTGGATCTG GTGCAGGCCA GGCTGGAGAG GAGCAGCAGC AAGAGCCTGG AGCGGGAACT 1260 GGCCACCCCG GACTGGGCAG AACGGCAGCT GGCCCAAGGA GGCCTGGCTG AGGTGCTGTT 1320 GGCTGCCAAG GAGCACCGGC GGCCGCGTGA GACACGAGTG ATTGCTGTGC TGGGCAAAGC 1380 TGGTCAGGGC AAGAGCTATT GGGCTGGGGC AGTGAGCCGG GCCTGGGCTT GTGGCCGGCT 1440 TCCCCAGTAC GACTTTGTCT TCTCTGTCCC CTGCCATTGC TTGAACCGTC CGGGGGATGC 1500 CTATGGCCTG CAGGATCTGC TCTTCTCCCT GGGCCCACAG CCACTCGTGG CGGCCGATGA 1560 GGTTTTCAGC CACATCTTGA AGAGACCTGA CCGCGTTCTG CTCATCCTAG ACGCCTTCGA 1620 GGAGCTGGAA GCGCAAGATG GCTTCCTGCA CAGCACGTGC GGACCGGCAC CGGCGGAGCC 1680 CTGCTCCCTC CGGGGGCTGC TGGCCGGCCT TTTCCAGAAG AAGCTGCTCC GAGGTTGCAC 1740 CCTCCTCCTC ACAGCCCGGC CCCGGGGCCG CCTGGTCCAG AGCCTGAGCA AGGCCGACGC 1800 CCTATTTGAG CTGTCCGGCT TCTCCATGGA GCAGGCCCAG GCATACGTGA TGCGCTACTT 1860 TGAGAGCTCA GGGATGACAG AGCACCAAGA CAGAGCCCTG ACGCTCCTCC GGGACCGGCC 1920 ACTTCTTCTC AGTCACAGCC ACAGCCCTAC TTTGTGCCGG GCAGTGTGCC AGCTCTCAGA 1980 GGCCCTGCTG GAGCTTGGGG AGGACGCCAA GCTGCCCTCC ACGCTCACGG GACTCTATGT 2040 CGGCCTGCTG GGCCGTGCAG CCCTCGACAG CCCCCCCGGG GCCCTGGCAG AGCTGGCCAA 2100 GCTGGCCTGG GAGCTGGGCC GCAGACATCA AAGTACCCTA CAGGAGGACC AGTTCCCATC 2160 CGCAGACGTG AGGACCTGGG CGATGGCCAA AGGCTTAGTC CAACACCCAC CGCGGGCCGC 2220 AGAGTCCGAG CTGGCCTTCC CCAGCTTCCT CCTGCAATGC TTCCTGGGGG CCCTGTGGCT 2280 GGCTCTGAGT GGCGAAATCA AGGACAAGGA GCTCCCGCAG TACCTAGCAT TGACCCCAAG 2340 GAAGAAGAGG CCCTATGACA ACTGGCTGGA GGGCGTGCCA CGCTTTCTGG CTGGGCTGAT 2400 CTTCCAGCCT CCCGCCCGCT GCCTGGGAGC CCTACTCGGG CCATCGGCGG CTGCCTCGGT 2460 GGACAGGAAG CAGAAGGTGC TTGCGAGGTA CCTGAAGCGG CTGCAGCCGG GGACACTGCG 2520 GGCGCGGCAG CTGCTTGAGC TGCTGCACTG CGCCCACGAG GCCGAGGAGG CTGGAATTTG 2580 GCAGCACGTG GTACAGGAGC TCCCCGGCCG CCTCTCTTTT CTGGGCACCC GCCTCACGCC 2640 TCCTGATGCA CATGTACTGG GCAAGGCCTT GGAGGCGGCG GGCCAAGACT TCTCCCTGGA 2700 CCTCCGCAGC ACTGGCATTT GCCCCTCTGG ATTGGGGAGC CTCGTGGGAC TCAGCTGTGT 2760 CACCCGTTTC AGGGCTGCCT TGAGCGACAC GGTGGCGCTG TGGGAGTCCC TGCGGCAGCA 2820 TGGGGAGACC AAGCTACTTC AGGCAGCAGA GGAGAAGTTC ACCATCGAGC CTTTCAAAGC 2880 CAAGTCCCTG AAGGATGTGG AAGACCTGGG AAAGCTTGTG CAGACTCAGA GGACGAGAAG 2940 TTCCTCGGAA GACACAGCTG GGGAGCTCCC TGCTGTTCGG GACCTAAAGA AACTGGAGTT 3000 TGCGCTGGGC CCTGTCTCAG GCCCCCAGGC TTTCCCCAAA CTGGTGCGGA TCCTCACGGC 3060 CTTTTCCTCC CTGCAGCATC TGGACCTGGA TGCGCTGAGT GAGAACAAGA TCGGGGACGA 3120 GGGTGTCTCG CAGCTCTCAG CCACCTTCCC CCAGCTGAAG TCCTTGGAAA CCCTCAATCT 3180 GTCCCAGAAC AACATCACTG ACCTGGGTGC CTACAAACTC GCCGAGGCCC TGCCTTCGCT 3240 CGCTGCATCC CTGCTCAGGC TAAGCTTGTA CAATAACTGC ATCTGCGACG TGGGAGCCGA 3300 GAGCTTGGCT CGTGTGCTTC CGGACATGGT GTCCCTCCGG GTGATGGACG TCCAGTACAA 3360 CAAGTTCACG GCTGCCGGGG CCCAGCAGCT CGCTGCCAGC CTTCGGAGGT GTCCTCATGT 3420 GGAGACGCTG GCGATGTGGA CGCCCACCAT CCCATTCAGT GTCCAGGAAC ACCTGCAACA 3480 ACAGGATTCA CGGATCAGCC TGAGATGATC CCAGCTGTGC TCTGGACAGG CATGTTCTCT 3540 GAGGACACTA ACCACGCTGG ACCTTGAACT GGGTACTTGT GGACACAGCT CTTCTCCAGG 3600 CTGTATCCCA TGAGGCCTCA GCATCCTGGC ACCCGGCCCC TGCTGGTTCA GGGTTGGCCC 3660 CTGCCCGGCT GCGGAATGAA CCACATCTTG CTCTGCTGAC AGACACAGGC CCGGCTCCAG 3720 GCTCCTTTAG CGCCCAGTTG GGTGGATGCC TGGTGGCAGC TGCGGTCCAC CCAGGAGCCC 3780 CGAGGCCTTC TCTGAAGGAC ATTGCGGACA GCCACGGCCA GGCCAGAGGG AGTGACAGAG 3840 GCAGCCCCAT TCTGCCTGCC CAGGCCCCTG CCACCCTGGG GAGAAAGTAC TTCTTTTTTT 3900 TTATTTTTAG ACAGAGTCTC ACTGTTGCCC AGGCTGGCGT GCAGTGGTGC GATCTGGGTT 3960 CACTGCAACC TCCGCCTCTT GGGTTCAAGC GATTCTTCTG CTTCAGCCTC CCGAGTAGCT 4020 GGGACTACAG GCACCCACCA TCATGTCTGG CTAATTTTTC ATTTTTAGTA GAGACAGGGT 4080 TTTGCCATGT TGGCCAGGCT GGTCTCAAAC TCTTGACCTC AGGTGATCCA CCCACCTCAG 4140 CCTCCCAAAG TGCTGGGGAT TACAAGCGTG AGCCACTGCA CCGGGCCACA GAGAAAGTAC 4200 TTCTCCACCC TGCTCTCCGA CCAGACACCT TGACAGGGCA CACCGGGCAC TCAGAAGACA 4260 CTGATGGGCA ACCCCCAGCC TGCTAATTCC CCAGATTGCA ACAGGCTGGG CTTCAGTGGC 4320 AGGCTGCTTT TGTCTATGGG ACTCAATGCA CTGACATTGT TGGCCAAAGC CAAAGCTAGG 4380 CCTGGCCAGA TGCACCAGGC CCTTAGCAGG GAAACAGCTA ATGGGACACT AATGGGGCGG 4440 TGAGAGGGGA ACAGACTGGA AGCACAGCTT CATTTCCTGT GTCTTTTTTC ACTACATTAT 4500 AAATGTCTCT TTAATGTCAC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 4543

【００８２】

【配列番号６】配列の長さ：１１３０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Arg Cys Leu Ala Pro Arg Pro Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Glu Pro 1 5 10 15 Gln Gly Ser Ser Gln Cys Ala Thr Met Glu Leu Gly Plo Leu Glu Gly 20 25 30 Gly Tyr Leu Glu Leu Leu Asn Ser Asp Ala Asp Pro Leu Cys Leu Tyr 35 40 45 His Phe Tyr Asp Gln Met Asp Leu Ala Gly Glu Glu Glu Ile Glu Leu 5O 55 60 Tyr Ser Glu Pro Asp Thr Asp Thr Ile Asn Cys Asp Gln Phe Ser Arg 65 70 75 80 Leu Leu Cys Asp Met Glu Gly Asp Glu Glu Thr Arg Glu Ala Tyr Ala 85 90 95 Asn Ile Ala Glu Leu Asp Gln Tyr Val Phe Gln Asp Ser Gln Leu Glu 100 105 110 Gly Leu Ser Lys Asp Ile Phe Lys His Ile Gly Pro Asp Glu Val Ile 115 120 125 Gly Glu Ser Met Glu Met Pro Ala Glu Val Gly Gln Lys Ser Gln Lys 130 135 140 Arg Pro Phe Pro Glu Glu Leu Pro Ala Asp Leu Lys His Trp Lys Pro 145 150 155 160 Ala Glu Pro Pro Thr Val Val Thr Gly Ser Leu Leu Val Gly Pro Val 165 170 175 Ser Asp Cys Ser Thr Leu Pro Cys Leu Pro Leu Pro Ala Leu Phe Asn 180 185 190 Gln Glu Pro Ala Ser Gly Gln Met Arg Leu Glu Lys Thr Asp Gln Ile 195 200 205 Pro Met Pro Phe Ser Ser Ser Ser Leu Ser Cys Leu Asn Leu Pro Glu 210 215 220 Gly Pro Ile Gln Phe Val Pro Thr Ile Ser Thr Leu Pro His Gly Leu 225 230 235 240 Trp Gln Ile Ser Glu Ala Gly Thr Gly Val Ser Ser Ile Phe Ile Tyr 245 250 255 His Gly Glu Val Pro Gln Ala Ser Gln Val Pro Pro Pro Ser Gly Phe 260 265 270 Thr Val His Gly Leu Pro Thr Ser Pro Asp Arg Pro Gly Ser Thr Ser 275 280 285 Pro Phe Ala Pro Ser Ala Thr Asp Leu Pro Ser Met Pro Glu Pro Ala 290 295 300 Leu Thr Ser Arg Ala Asn Met Thr Glu His Lys Thr Ser Pro Thr Gln 305 310 315 320 Cys Pro Ala Ala Gly Glu Val Ser Asn Lys Leu Pro Lys Trp Pro Glu 325 330 335 Pro Val Glu Gln Phe Tyr Arg Ser Leu Gln Asp Thr Tyr Gly Ala Glu 340 345 350 Pro Ala Gly Pro Asp Gly Ile Leu Val Glu Val Asp Leu Val Gln Ala 355 360 365 Arg Leu Glu Arg Ser Ser Ser Lys Ser Leu Glu Arg Glu Leu Ala Thr 370 375 380 Pro Asp Trp Ala Glu Arg Gln Leu Ala Gln Gly Gly Leu Ala Glu Val 385 390 395 400 Leu Leu Ala Ala Lys Glu His Arg Arg Pro Arg Glu Thr Arg Val Ile 405 410 415 Ala Val Leu Gly Lys Ala Gly Gln Gly Lys Ser Tyr Trp Ala Gly Ala 420 425 430 Val Ser Arg Ala Trp Ala Cys Gly Arg Leu Pro Gln Tyr Asp Phe Val 435 440 445 Phe Ser Val Pro Cys His Cys Leu Asn Arg Pro Gly Asp Ala Tyr Gly 450 455 460 Leu Gln Asp Leu Leu Phe Ser Leu Gly Pro Gln Pro Leu Val Ala Ala 465 470 475 480 Asp Glu Val Phe Ser His Ile Leu Lys Arg Pro Asp Arg Val Leu Leu 485 490 495 Ile Leu Asp Ala Phe Glu Glu Leu Glu Ala Gln Asp Gly Phe Leu His 500 505 510 Ser Thr Cys Gly Pro Ala Pro Ala Glu Pro Cys Ser Leu Arg Gly Leu 515 520 525 Leu Ala Gly Leu Phe Gln Lys Lys Leu Leu Arg Gly Cys Thr Leu Leu 530 535 540 Leu Thr Ala Arg Pro Arg Gly Arg Leu Val Gln Ser Leu Ser Lys Ala 545 550 555 560 Asp Ala Leu Phe Glu Leu Ser Gly Phe Ser Met Glu Gln Ala Gln Ala 565 570 575 Tyr Val Met Arg Tyr Phe Glu Ser Ser Gly Met Thr Glu His Gln Asp 580 585 590 Arg Ala Leu Thr Leu Leu Arg Asp Arg Pro Leu Leu Leu Ser His Ser 595 600 605 His Ser Pro Thr Leu Cys Arg Ala Val Cys Gln Leu Ser Glu Ala Leu 610 615 620 Leu Glu Leu Gly Glu Asp Ala Lys Leu Pro Ser Thr Leu Thr Gly Leu 625 630 635 640 Tyr Val Gly Leu Leu Gly Arg Ala Ala Leu Asp Ser Pro Pro Gly Ala 645 650 655 Leu Ala Glu Leu Ala Lys Leu Ala Trp Glu Leu Gly Arg Arg His Gln 660 665 670 Ser Thr Leu Gln Glu Asp Gln Phe Pro Ser Ala Asp Val Arg Thr Trp 675 680 685 Ala Met Ala Lys Gly Leu Val Gln His Pro Pro Arg Ala Ala Glu Ser 690 695 700 Glu Leu Ala Phe Pro Ser Phe Leu Leu Gln Cys Phe Leu Gly Ala Leu 705 710 715 720 Trp Leu Ala Leu Ser Gly Glu Ile Lys Asp Lys Glu Leu Pro Gln Tyr 725 730 735 Leu Ala Leu Thr Pro Arg Lys Lys Arg Pro Tyr Asp Asn Trp Leu Glu 740 745 750 Gly Val Pro Arg Phe Leu Ala Gly Leu Ile Phe Gln Pro Pro Ala Arg 755 760 765 Cys Leu Gly Ala Leu Leu Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ser Val Asp Arg 770 775 780 Lys Gln Lys Val Leu Ala Arg Tyr Leu Lys Arg Leu Gln Pro Gly Thr 785 790 795 800 Leu Arg Ala Arg Gln Leu Leu Glu Leu Leu His Cys Ala His Glu Ala 805 810 815 Glu Glu Ala Gly Ile Trp Gln His Val Val Gln Glu Leu Pro Gly Arg 820 825 830 Leu Ser Phe Leu Gly Thr Arg Leu Thr Pro Pro Asp Ala His Val Leu 835 840 845 Gly Lys Ala Leu Glu Ala Ala Gly Gln Asp Phe Ser Leu Asp Leu Arg 850 855 860 Ser Thr Gly Ile Cys Pro Ser Gly Leu Gly Ser Leu Val Gly Leu Ser 865 870 875 880 Cys Val Thr Arg Phe Arg Ala Ala Leu Ser Asp Thr Val Ala Leu Trp 885 890 895 Glu Ser Leu Arg Gln His Gly Glu Thr Lys Leu Leu Gln Ala Ala Glu 900 905 910 Glu Lys Phe Thr Ile Glu Pro Phe Lys Ala Lys Ser Leu Lys Asp Val 915 920 925 Glu Asp Leu Gly Lys Leu Val Gln Thr Gln Arg Thr Arg Ser Ser Ser 930 935 940 Glu Asp Thr Ala Gly Glu Leu Pro Ala Val Arg Asp Leu Lys Lys Leu 945 950 955 960 Glu Phe Ala Leu Gly Pro Val Ser Gly Pro Gln Ala Phe Pro Lys Leu 965 970 975 Val Arg Ile Leu Thr Ala Phe Ser Ser Leu Gln His Leu Asp Leu Asp 980 985 990 Ala Leu Ser Glu Asn Lys Ile Gly Asp Glu Gly Val Ser Gln Leu Ser 995 1000 1005 Ala Thr Phe Pro Gln Leu Lys Ser Leu Glu Thr Leu Asn Leu Ser Gln 1010 1015 1020 Asn Asn Ile Thr Asp Leu Gly Ala Tyr Lys Leu Ala Glu Ala Leu Pro 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Ala Ala Ser Leu Leu Arg Leu Ser Leu Tyr Asn Asn Cys Ile 1045 1050 1055 Cys Asp Val Gly Ala Glu Ser Leu Ala Arg Val Leu Pro Asp Met Val 1060 1065 1070 Ser Leu Arg Val Met Asp Val Gln Tyr Asn Lys Phe Thr Ala Ala Gly 1075 1080 1085 Ala Gln Gln Leu Ala Ala Ser Leu Arg Arg Cys Pro His Val Glu Thr 1090 1095 1100 Leu Ala Met Trp Thr Pro Thr Ile Pro Phe Ser Val Gln Glu His Leu 1105 1110 1115 1120 Gln Gln Gln Asp Ser Arg Ile Ser Leu Arg 1125 1130

【図面の簡単な説明】

【図１】EBO-Sfiおよびこれに由来するｃＤＮＡ発現ベ
クターDRA-CDおよびDVの制限マップである。 (a)ベクターEBO-SfiはプラスミドpTG76由来のハイグロ
マイシン耐性遺伝子（hygr-76）を含む［Giordanoら、G
ene 88 (1990)、 285-288］。ｃＤＮＡクローニングカ
セットは、細菌性クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子により分離される２つの反復SfiI部
位からなる（SfiI-CAT遺伝子-SfiI）。クローン化ｃＤ
ＮＡはシミアンウイルス40初期（SV40e）プロモーター
およびポリアデニル化シグナル（Poly-A）により誘導さ
れる。白四角は、EBV複製起点（ORI P）、シミアンウイ
ルス40後期プロモーター（SV40l）の制御下のEBV核抗原
遺伝子１（EBNA-1）、および細菌性アンピシリン耐性遺
伝子(amp）を示す。 (b)ベクターDRA-CDは、EBO-Sfiから生成されたが、それ
は300bpのHLA DRAプロモーターの制御下のCD4 ｃＤＮＡ
[Maddonら、Cell 42 (1965)、93-104]および130bpのポ
リアデニル化シグナルをEBO-Sfiの唯一のHindIII部位へ
挿入して生成された。 (c)ベクターDVの生成については、hygr-76遺伝子由来の
SV40初期プロモーターが、唯一のHindIIIおよびBglII部
位を介して、300bpのHLA DRAプロモーターに置換され
た。

【図２】RJ2.25細胞でのHLAクラスＩＩ発現のクローニ
ングおよび修正によるCIITAのｃＤＮＡの単離。 (a)HLA-DRポジティブ細胞の選択を示す。DV-プールのDV
P6、-7、および-10（パネル１〜３）および１つのDRA-C
Dプール（DRA-CDP1、パネル４）由来のプラスミドＤＮ
ＡでトランスフェクトしたRJ2.25細胞を、ハイグロマイ
シンＢ耐性について選択し、そしてHLA DR特異抗体2.06
およびマグネットビーズで２回（DVトランスフェクタン
ト）または３回（DRA-CDトランスフェクタント）選別し
た。選別した群を、HLA DR抗体L243で染色し、そしてFA
CSにより分析した（影で示すプロフィル）。ネガティブ
およびポジティブコントロールとして、RJ2.25およびRa
ji細胞を同様に分析した（白抜きのプロフィル）。 (b)CIITA ｃＤＮＡは３つのすべてのHLAクラスＩＩイソ
タイプの発現を回復する。RJ2.25およびRaji細胞（パネ
ル１、３、５）またはDRA-CDおよびDRA-CD/CIITAでトラ
ンスフェクトしたRJ2.25細胞（パネル２、４、６の白抜
きおよび影のプロフィル）を、HLA DR（L243；パネル
１、２）、-DP（B7/21；パネル３、４）、および-DQ（T
u22；パネル５、６）に特異的な抗体で染色し、そしてF
ACS（蛍光活性化細胞選別器）により分析した。

【図３】CIITA ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定
アミノ酸配列を示す。ｃＤＮＡクローンpDVP10-1の完全
ヌクレオチド配列およびCIITAの推定アミノ酸配列を示
す。グルタミン酸／アスパラギン酸に富むＮ末端領域
（「acidic」で示す）およびプロリン／セリン／スレオ
ニンに富む伸長（「Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」で示す）を上線
で示す。ATP/GTP結合カセットを二重下線で示す。プロ
テインキナーゼＣおよびカゼインキナーゼＩＩ部位（13
および15）と思われる部位が多数配列中に存在するが、
図には示していない。

【図４】図３の続きである。

【図５】図４の続きである。

【図６】図５の続きである。

【図７】図６の続きである。

【図８】図７の続きである。

【図９】図８の続きである。

【図１０】変異細胞株RJ2.25のCIITA遺伝子の欠失の証
拠。 (a)３つの内部HindIII部位（Ｈ）を有するCIITA ｃＤＮ
Ａの概略図である。サザーンハイブリダイゼーションプ
ローブとして用いたCIITA ｃＤＮＡの３つのフララグメ
ントを黒塗りのバーで示す。 (b)10μgのゲノムＤＮＡをHindIIIで消化し、0.7％アガ
ロースゲルで分画し、変性し、転写し、そしてCIITAプ
ローブまたはTBPプローブとハイブリダイズさせた。Raj
i（レーン１）およびRJ2.25（レーン２）由来のＤＮＡ
を用いて２つの同一のフィルターを調製した。第１のフ
ィルターをCIITAの５’末端由来の1.1kBのHindIIIプロ
ーブ（プローブＡ）とハイブリダイズさせた。ストリッ
ピングした後、同じフィルターをプローブＢ（CIITA ｃ
ＤＮＡの中央の1.8kbのHindIII断片）と再ハイブリダイ
ズさせた。第２のフィルターを、まず、CIITAの4152〜4
520ヌクレオチドの範囲のプローブＣとハイブリダイズ
させた。次いで、両方のレーンのＤＮＡ量が等しいこと
を確認するために、このフィルターをストリップし、ヒ
トTBP ｃＤＮＡの３’末端由来のプローブとハイブリダ
イズさせた［Kaoら、Science 248 (1990)、1646-165
0］。CIITA特異的なバンドは、プローブＡ、Ｂ、および
Ｃについてそれぞれ13kb、3.8kb、および14kbの長さで
あった。

【図１１】CIITA発現のRNAse保護分析を示す。10μgの
全ＲＮＡを80％ホルムアミド中で500,000cpmのプローブ
にハイブリダイズさせた。保護されたプローブを変性６
％ポリアクリルアミドゲルで解離させた。（ａ、ｂ）Ra
ji（レーン２）およびRJ2.25（レーン３）の全ＲＮＡ
を、それぞれ、CIITAのヌクレオチド2049〜1824（ａ）
およびヌクレオチド4520〜4340（ｂ）に相補的なリボプ
ローブにハイブリダイズさせた。未消化のプローブおよ
び酵母ＲＮＡコントロールをレーン１および４に示す。（ｃ）種々の細胞株由来の全ＲＮＡを（ａ）で用いたの
と同じ中央のCIITAプローブにハイブリダイズさせた。
１、酵母コントロール；２、CO115結腸癌腫；３、４、M
ann、QBL B-LCL；５、2102Ep奇形癌腫；６、MOLT4 Ｔリ
ンパ腫；７、SK-N-AS神経芽細胞腫；８、未消化プロー
ブ。ＲＮＡの量および質を、TBP特異的プローブにハイ
ブリダイゼーションすることにより制御した（図示せ
ず）。

【図１２】CIITA ｃＤＮＡが３つの異なるHLAクラスＩ
Ｉネガティブ変異細胞株を修正することを示す。RJ2.25
（パネル２）、RM3（パネル３）、またはREM-34（パネ
ル４）細胞を、EBO-Sfiにクローン化したCIITA ｃＤＮ
Ａ（黒いプロフィル）で、またはEBO-Sfi単独（白いプ
ロフィル）でトランスフェクトした。L243抗体を用いる
FACSによる表面HLA DR発現の分析を、ハイグロマイシン
Ｂ選択の２週間後（RJ2.25、RM3）またはたった５日後
（REM-34）に行った。パネル１はネガティブコントロー
ル（RJ2.25；EBO-Sfiトランスフェクトした）およびポ
ジティブコントロール（Raji）を示す。

【図１３】CIITA ｃＤＮＡが、HLAクラスＩＩ欠失被験
体由来のＢリンパ球のHLAクラスＩＩ発現を十分に修正
することを示す。被験体BLS1由来のＢリンパ球を、CIIT
A ｃＤＮＡでトランスフェクトした。ハイグロマイシン
での選択の後、細胞をHLA-DR、-DP、および-DQの表面発
現について分析した。

【図１４】CIITA遺伝子がクラスＩＩネガティブ細胞に
おいてMHCクラスＩＩ遺伝子の発現を誘導することを示
す。３つのタイプのMHCクラスＩＩネガティブ細胞を、C
IITA ｃＤＮＡでトランスフェクトした。ハイグロマイ
シンでの選択の後、細胞を、HLA-DR分子の表面発現につ
いて分析した。Ａ．メラノーマ細胞株。Ｂ．線維芽細胞
株、143B。Ｃ．HeLa細胞。

【図１５】CIITAトランスフェクタントおよびAPO'sとし
て用いたインターフェロン刺激細胞を用いるヒトＴ細胞
クローンの活性化を示す。３つのタイプの細胞をAPC'S
としてテストした：非トランスフェクト化メラノーマ細
胞株、MHCクラスＩＩネガティブ（●）；200μg/mlのイ
ンターフェロンγへの曝露の48時間後の同じ細胞株、MH
CクラスＩＩポジティブ（■）；CIITA ｃＤＮＡで以前
にトランスフェクトした同じ細胞株、MHCクラスＩＩポ
ジティブ（▲）。これらの細胞を、種々の濃度のp4、破
傷風トキソイドペプチドで、図に示した濃度で処理し、
ＵＶ光で固定化し、そしてそのペプチドに特異的な２つ
の異なるヒトＴ細胞クローンT-50およびT-87とともにイ
ンキュベートした。Ｔ細胞活性化の範囲をH³-チミジン
の取り込みによる標準アッセイで測定し、そして「刺激
インデックス」として表した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＢ // Ｃ０７Ｈ 21/04 37/64 (71)出願人 595123807 45 ＲｏｕｔｅｄｅＰｒｅｇｎｙ, 1292 Ｃｈａｍｂ▲ｅ▼ｓｙ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 CIITA活性を示し、そして脊椎動物細胞
でＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現の一般的な制御に不可
欠なタンパク質の活性を抑制し得るインヒビターであっ
て、該インヒビターはCIITA活性を有しそして以下から
選択される遺伝子によりコードされる組換え生産された
タンパク質を用いて得られる： (ａ)配列表の配列番号５に示されるＤＮＡ配列； (ｂ)(ａ)のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配
列； (ｃ)(ａ)または(ｂ)のＤＮＡ配列のアレル誘導体または
断片；または (ｄ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)のＤＮＡ配列と、遺伝子コー
ドの結果として、縮重するＤＮＡ配列。
【請求項２】前記CIITA活性を有するタンパク質が配
列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する、請
求項１に記載のインヒビター。
【請求項３】前記インヒビターが前記CIITA活性を有
するタンパク質の３次元構造を基礎として設計される、
請求項１または２に記載のインヒビター。
【請求項４】前記インヒビターが合成有機化学物質、
天然発酵生産物、あるいは微生物、植物あるいは動物か
ら抽出された物質、またはペプチドである、請求項１か
ら３のいずれかの項に記載のインヒビター。
【請求項５】前記インヒビターがCIITA活性を示すタ
ンパク質のATP結合部位に結合する、請求項１から４の
いずれかの項に記載のインヒビター。
【請求項６】前記インヒビターがCIITA活性を示すタ
ンパク質のＮ末端酸性活性化ドメインに結合する、請求
項１から４のいずれかの項に記載のインヒビター。
【請求項７】 CIITA活性を有し、そして請求項１に記
載の遺伝子にコードされるか、または配列表の配列番号
６に示すアミノ酸配列を有する組換え生産されたタンパ
ク質の、CIITA活性を示すタンパク質の活性を抑制し得
るインヒビターの同定のための、使用。
【請求項８】 CIITA活性を示すタンパク質の活性を抑
制し得るインヒビターを同定する方法であって、該方法
は適切な条件下で請求項１または２に記載の組換えCIIT
Aタンパク質に結合する該インヒビターの能力を利用す
ることによるスクリーニングを包含する、方法。
【請求項９】 CIITA活性を示すタンパク質の活性を抑
制し得るインヒビターを同定する方法であって、該方法
は請求項１または２に記載の組換えCIITAタンパク質の
３次元構造を基礎として適切なインヒビターを設計する
ことを包含する、方法。
【請求項１０】請求項１から６のいずれかの項に記載
のインヒビターを包含する薬学的組成物。
【請求項１１】ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現レベル
の減少が所望されるＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の異常発現
に関連する病気の治療のため、または外来性移植組織の
ための臓器の供給源または万能細胞移植の細胞の供給源
としてＭＨＣクラスＩＩネガティブトランスジェニック
動物を作るための請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の異常発現に
関連する病気が、CIITA活性を有するタンパク質の異常
な量の存在または他の因子により起こるのかどうかを決
定するための請求項１０に記載の薬学的組成物。