JPH08228763A - 脂質依存性テトラヒメニドの培養方法および脂質依存性テトラヒメニドの有用な生物産生産物の製造方法 - Google Patents
脂質依存性テトラヒメニドの培養方法および脂質依存性テトラヒメニドの有用な生物産生産物の製造方法Info
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- JPH08228763A JPH08228763A JP7272157A JP27215795A JPH08228763A JP H08228763 A JPH08228763 A JP H08228763A JP 7272157 A JP7272157 A JP 7272157A JP 27215795 A JP27215795 A JP 27215795A JP H08228763 A JPH08228763 A JP H08228763A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 分泌性もしくは細胞内の有用な生物産生産物
とくに酵素および不飽和脂肪酸を得ることができる脂質
依存性テトラヒメニド（脂質要求種）を、高細胞濃度で
比較的長時間にわたり大量に単純な培地上に維持するの
に適当な培養方法を提供する。 【解決手段】 ある条件下には、脂質を添加していない
単純な培地が脂質依存性テトラヒメニド（脂質要求種）
の大量培養にとくに適していることが発見された。すな
わち、本発明の課題は、脂質依存性テトラヒメニドを、
５〜１００ｇ／リットルの脱脂粉乳または綿実粕粉末、
１〜２０ｇ／リットルの酵母エキス、０.０３ｇ／リッ
トルの錯体鉄イオンの形態での鉄、および０〜１００ｇ
／リットル のグルコースを含有する培地上で培養する
ことによって達成される。
とくに酵素および不飽和脂肪酸を得ることができる脂質
依存性テトラヒメニド（脂質要求種）を、高細胞濃度で
比較的長時間にわたり大量に単純な培地上に維持するの
に適当な培養方法を提供する。 【解決手段】 ある条件下には、脂質を添加していない
単純な培地が脂質依存性テトラヒメニド（脂質要求種）
の大量培養にとくに適していることが発見された。すな
わち、本発明の課題は、脂質依存性テトラヒメニドを、
５〜１００ｇ／リットルの脱脂粉乳または綿実粕粉末、
１〜２０ｇ／リットルの酵母エキス、０.０３ｇ／リッ
トルの錯体鉄イオンの形態での鉄、および０〜１００ｇ
／リットル のグルコースを含有する培地上で培養する
ことによって達成される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は脂質依存性のテトラ
ヒメニド、いわゆる脂質要求種または選好性種、とくに
Tetrahymena setosaの培養方法、ならびに脂質依存性テ
トラヒメニドからの有用な生物産生産物（biogenic pro
ducts）とくに脂質依存性テトラヒメニドによって周辺
培地中に分泌される酵素、細胞内酵素および多不飽和脂
肪酸の製造方法に関する。
ヒメニド、いわゆる脂質要求種または選好性種、とくに
Tetrahymena setosaの培養方法、ならびに脂質依存性テ
トラヒメニドからの有用な生物産生産物（biogenic pro
ducts）とくに脂質依存性テトラヒメニドによって周辺
培地中に分泌される酵素、細胞内酵素および多不飽和脂
肪酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】すでに１９７２年には、繊毛虫類綱全毛
類亜綱のTetrahymena pyriformisがリソソーム酵素、β
−Ｎ−アセチルヘキソースアミニダーゼ、酸ホスファタ
ーゼ、α−およびβ−グルコシダーゼ、アミラーゼ、プ
ロテイナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌ
クレアーゼを周辺の培地中に分泌することが証明された
（M. Mueller，1972, J. Cell. Biol., 52, 478）。Blu
m（J.J. Blum, 1975, J.Cell Physiol., 86, 131）はα
−マンノシダーゼ、β−フコシダーゼおよびβ−ガラク
トシダーゼも分泌されることを証明し得た。T. thermop
hila（以前にT.pyriformisの交配型１とされ、したがっ
てきわめて類似している）はβ−Ｎ−アセチルヘキソー
スアミニダーゼ、酸ホスファターゼ、α−およびβ−グ
ルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、プロテアーゼおよ
びリホスホジエステラーゼＩを分泌することが証明され
（T. Kiy & A. Tiedtke, 1991, Appl. Microbiol. Biot
echnol., 35, 18; T. Kiy, & A. Tiedtke, 1993, BioEn
g., 5, 22）、またホスホリパーゼＣおよびホスホリパ
ーゼＡ1もT. thermophilaによって分泌される酵素とし
て同定された（J.Florin-Christensen等, 1986, Comp.
Biochem. Physiol.,85B, 149；J. Florin-Christensen
等, 1986, Comp. Biochem. Physiol., 85B,143）。
類亜綱のTetrahymena pyriformisがリソソーム酵素、β
−Ｎ−アセチルヘキソースアミニダーゼ、酸ホスファタ
ーゼ、α−およびβ−グルコシダーゼ、アミラーゼ、プ
ロテイナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌ
クレアーゼを周辺の培地中に分泌することが証明された
（M. Mueller，1972, J. Cell. Biol., 52, 478）。Blu
m（J.J. Blum, 1975, J.Cell Physiol., 86, 131）はα
−マンノシダーゼ、β−フコシダーゼおよびβ−ガラク
トシダーゼも分泌されることを証明し得た。T. thermop
hila（以前にT.pyriformisの交配型１とされ、したがっ
てきわめて類似している）はβ−Ｎ−アセチルヘキソー
スアミニダーゼ、酸ホスファターゼ、α−およびβ−グ
ルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、プロテアーゼおよ
びリホスホジエステラーゼＩを分泌することが証明され
（T. Kiy & A. Tiedtke, 1991, Appl. Microbiol. Biot
echnol., 35, 18; T. Kiy, & A. Tiedtke, 1993, BioEn
g., 5, 22）、またホスホリパーゼＣおよびホスホリパ
ーゼＡ1もT. thermophilaによって分泌される酵素とし
て同定された（J.Florin-Christensen等, 1986, Comp.
Biochem. Physiol.,85B, 149；J. Florin-Christensen
等, 1986, Comp. Biochem. Physiol., 85B,143）。
【０００３】上記種が産生するこれらの酵素には多くの
利用可能性がある。すなわち、β−ガラクトシダーゼ
は、たとえば、ラクトースの切断に、またβ−ガラクト
シダーゼ触媒グリコシド転移においてたとえばβ−ガラ
クトピラノシド、アラビノピラノシドおよびフコピラノ
シドの製造に使用できる。ホスファターゼは、たとえ
ば、食品中のリン酸塩含量の減量に使用できる。β−グ
ルコシダーゼはグルコ糖の合成に使用できる。プロテア
ーゼはアセチルトランスフェラーゼ反応を利用するペプ
チド合成に使用できる。
利用可能性がある。すなわち、β−ガラクトシダーゼ
は、たとえば、ラクトースの切断に、またβ−ガラクト
シダーゼ触媒グリコシド転移においてたとえばβ−ガラ
クトピラノシド、アラビノピラノシドおよびフコピラノ
シドの製造に使用できる。ホスファターゼは、たとえ
ば、食品中のリン酸塩含量の減量に使用できる。β−グ
ルコシダーゼはグルコ糖の合成に使用できる。プロテア
ーゼはアセチルトランスフェラーゼ反応を利用するペプ
チド合成に使用できる。
【０００４】細胞内酵素およびこれらの種によって周辺
培地に分泌される酵素に加えて、これらの繊毛虫類の培
養により、商業的に価値のあるその他の産物が培養上清
またはそれらの細胞自体から得られる。すなわちγ−リ
ノレン酸がT. thermophila細胞から単離されているし、
またメラニン前駆体がT. thermophila色素突然変異体の
培養上清から単離されている（T. Kiy & A. Tiedtke, 1
993, BioEng., 5, 22）。
培地に分泌される酵素に加えて、これらの繊毛虫類の培
養により、商業的に価値のあるその他の産物が培養上清
またはそれらの細胞自体から得られる。すなわちγ−リ
ノレン酸がT. thermophila細胞から単離されているし、
またメラニン前駆体がT. thermophila色素突然変異体の
培養上清から単離されている（T. Kiy & A. Tiedtke, 1
993, BioEng., 5, 22）。
【０００５】最初に挙げた２つの種は、いわゆるTetrah
ymena pyriformis群（complex）に属し、単純な、安価
な栄養培地上で比較的容易に培養される．この理由か
ら、pyriformis群の種の大量培養にも単純な無菌培地が
適当である（K. Keenanら, 1978, J. Protozool., 25,
385）。水１００mlあたり０.３ｇのビール酵母、１mgの
大豆レシチンおよび０.１mgの脱脂粉乳からなる、いわ
ゆるＴＧＭＭ−２培地（K. Keenanら, 1978, J. Protoz
ool., 25, 385）、ならびに最近では、脱脂粉乳、酵母
エキスおよびグルコースからなるいわゆる脱脂粉乳培地
（T. Kiy & A. Tiedtke, 1992, Appl. Microbiol. Biot
echnol., 37, 576）がこれらの代表的なpyriformis群の
大量培養のための培養培地としてとくに提案されてい
る。
ymena pyriformis群（complex）に属し、単純な、安価
な栄養培地上で比較的容易に培養される．この理由か
ら、pyriformis群の種の大量培養にも単純な無菌培地が
適当である（K. Keenanら, 1978, J. Protozool., 25,
385）。水１００mlあたり０.３ｇのビール酵母、１mgの
大豆レシチンおよび０.１mgの脱脂粉乳からなる、いわ
ゆるＴＧＭＭ−２培地（K. Keenanら, 1978, J. Protoz
ool., 25, 385）、ならびに最近では、脱脂粉乳、酵母
エキスおよびグルコースからなるいわゆる脱脂粉乳培地
（T. Kiy & A. Tiedtke, 1992, Appl. Microbiol. Biot
echnol., 37, 576）がこれらの代表的なpyriformis群の
大量培養のための培養培地としてとくに提案されてい
る。
【０００６】しかしながら、これらの微生物によって産
生される天然物質の検出および単離を可能にしたのは大
量培養のみである。
生される天然物質の検出および単離を可能にしたのは大
量培養のみである。
【０００７】リソソームの加水分解性酵素および他の天
然物質は商業的に興味があるが、今日まで、ほぼ８,０
００に及ぶ異なる繊毛虫類の種における他の多分さらに
優れている酵素生産種および酵素の研究は顧みられなか
った。
然物質は商業的に興味があるが、今日まで、ほぼ８,０
００に及ぶ異なる繊毛虫類の種における他の多分さらに
優れている酵素生産種および酵素の研究は顧みられなか
った。
【０００８】しかしながら、脂質依存性テトラヒメニ
ド、いわゆる「脂質要求種」もしくは「選好性種」の群
からの繊毛虫類（たとえば、T. setosa、T. rostrata、
T.paravoraxおよびT. patulaがとくに挙げられる）の比
較的長時間の大量培養はこれまで成功していない。これ
らの繊毛虫類は、それらの増殖における栄養条件がきわ
めて繁雑で特殊な栄養要求性を有する。これらの理由に
より、それらの可能性はほとんど研究されていない（K.
Keenanら，1978, J. Protozool., 25, 385）。その結
果、有用な物質たとえば酵素の存在の可能性は検討され
ていなかった。
ド、いわゆる「脂質要求種」もしくは「選好性種」の群
からの繊毛虫類（たとえば、T. setosa、T. rostrata、
T.paravoraxおよびT. patulaがとくに挙げられる）の比
較的長時間の大量培養はこれまで成功していない。これ
らの繊毛虫類は、それらの増殖における栄養条件がきわ
めて繁雑で特殊な栄養要求性を有する。これらの理由に
より、それらの可能性はほとんど研究されていない（K.
Keenanら，1978, J. Protozool., 25, 385）。その結
果、有用な物質たとえば酵素の存在の可能性は検討され
ていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、分泌性もしくは細胞内の有用な生物産生産物と
くに酵素および不飽和脂肪酸を得ることができる脂質依
存性テトラヒメニド（脂質要求種）を、高細胞濃度で比
較的長時間にわたり大量に単純な培地上に維持するのに
適当な、脂質依存性テトラヒメニド（脂質要求種）の培
養方法を提供することにある。
目的は、分泌性もしくは細胞内の有用な生物産生産物と
くに酵素および不飽和脂肪酸を得ることができる脂質依
存性テトラヒメニド（脂質要求種）を、高細胞濃度で比
較的長時間にわたり大量に単純な培地上に維持するのに
適当な、脂質依存性テトラヒメニド（脂質要求種）の培
養方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、ある条
件下には、脂質を添加していない単純な培地が脂質依存
性テトラヒメニド（脂質要求種）の大量培養にとくに適
していることが発見されたのである。
件下には、脂質を添加していない単純な培地が脂質依存
性テトラヒメニド（脂質要求種）の大量培養にとくに適
していることが発見されたのである。
【００１１】すなわち本発明の目的は、脂質依存性テト
ラヒメニド（脂質要求種）を培養する方法において、脂
質依存性テトラヒメニドを、５〜１００ｇ／リットルの
脱脂粉乳または綿実粕粉末、１〜２０ｇ／リットルの酵
母エキス、０.０３ｇ／リットルの錯体鉄イオンの形態
での鉄、および０〜１００ｇ／リットルのグルコースを
含有する培地上で培養することによる本発明によって達
成される。
ラヒメニド（脂質要求種）を培養する方法において、脂
質依存性テトラヒメニドを、５〜１００ｇ／リットルの
脱脂粉乳または綿実粕粉末、１〜２０ｇ／リットルの酵
母エキス、０.０３ｇ／リットルの錯体鉄イオンの形態
での鉄、および０〜１００ｇ／リットルのグルコースを
含有する培地上で培養することによる本発明によって達
成される。
【００１２】培地は、２０ｇ／リットルの脱脂粉乳、５
ｇ／リットルの酵母エキス、０.０３ｇ／リットルの錯
体鉄イオンの形態での鉄、および１０ｇ／リットルのグ
ルコースを含有することが好ましい。
ｇ／リットルの酵母エキス、０.０３ｇ／リットルの錯
体鉄イオンの形態での鉄、および１０ｇ／リットルのグ
ルコースを含有することが好ましい。
【００１３】本発明の方法の他の好ましい実施態様にお
いては、培地は、２０ｇ／リットルの綿実粕粉末、５ｇ
／リットルの酵母エキス、０.０３ｇ／リットルの錯体
鉄イオンの形態での鉄、および１０ｇ／リットルのグル
コースを含有する。この組成の場合には、培地に１０ml
／リットルの大豆油の添加を選択することもできる。
いては、培地は、２０ｇ／リットルの綿実粕粉末、５ｇ
／リットルの酵母エキス、０.０３ｇ／リットルの錯体
鉄イオンの形態での鉄、および１０ｇ／リットルのグル
コースを含有する。この組成の場合には、培地に１０ml
／リットルの大豆油の添加を選択することもできる。
【００１４】錯体鉄イオンとしては、鉄エチレンジアミ
ン四酢酸錯体（ＥＤＴＡ錯体）の形態の鉄イオンが使用
に適している。鉄はまたクエン酸鉄の形態で培養培地に
添加することもできる。
ン四酢酸錯体（ＥＤＴＡ錯体）の形態の鉄イオンが使用
に適している。鉄はまたクエン酸鉄の形態で培養培地に
添加することもできる。
【００１５】上記条件下に、培養はまた、膜を用いて細
胞を保持しながら、連続的に実施することも可能であ
る。
胞を保持しながら、連続的に実施することも可能であ
る。
【００１６】用いられる脂質依存性テトラヒメニドは好
ましくは、Tetrahymena rostrata、Tetrahymena patula
もしくはTetrahymena setosaであり、とくに、Tetrahym
enarostrata ATCC 30770、Tetrahymena patula CCAP 16
30/2もしくはTetrahymena setosa ATCC 30782またはそ
れらの突然変異体もしくは変異体が好ましい。
ましくは、Tetrahymena rostrata、Tetrahymena patula
もしくはTetrahymena setosaであり、とくに、Tetrahym
enarostrata ATCC 30770、Tetrahymena patula CCAP 16
30/2もしくはTetrahymena setosa ATCC 30782またはそ
れらの突然変異体もしくは変異体が好ましい。
【００１７】最初に挙げた目的はさらに、脂質依存性テ
トラヒメニド（脂質要求種）を上述の方法によって培養
し、既知の方法を用いて有用な生物産生産物を単離する
ことからなる、脂質依存性テトラヒメニド（脂質要求
種）から有用な生物産生産物を製造することによって達
成される。
トラヒメニド（脂質要求種）を上述の方法によって培養
し、既知の方法を用いて有用な生物産生産物を単離する
ことからなる、脂質依存性テトラヒメニド（脂質要求
種）から有用な生物産生産物を製造することによって達
成される。
【００１８】脂質依存性のテトラヒメニド（脂質要求
種）によって周囲の培地中に分泌される酵素は、上述の
方法により、脂質依存性テトラヒメニドを、分泌された
酵素が培地中に濃厚になるまで培養し、ついで酵素を既
知の方法によって無細胞培養上清から単離し、クロマト
グラフィー法によって互いに分離することにより好まし
くは製造される。
種）によって周囲の培地中に分泌される酵素は、上述の
方法により、脂質依存性テトラヒメニドを、分泌された
酵素が培地中に濃厚になるまで培養し、ついで酵素を既
知の方法によって無細胞培養上清から単離し、クロマト
グラフィー法によって互いに分離することにより好まし
くは製造される。
【００１９】細胞内酵素は、好ましくは、脂質依存性テ
トラヒメニド（脂質要求種）を上述の方法によって培養
し、細胞をホモジナイズし、遠心分離またはろ過によっ
て破壊された細胞から酵素含有溶液を分離し、酵素をク
ロマトグラフィー法によって互いに分離することによ
り、脂質依存性テトラヒメニドから得られる。
トラヒメニド（脂質要求種）を上述の方法によって培養
し、細胞をホモジナイズし、遠心分離またはろ過によっ
て破壊された細胞から酵素含有溶液を分離し、酵素をク
ロマトグラフィー法によって互いに分離することによ
り、脂質依存性テトラヒメニドから得られる。
【００２０】この方法はとくに多不飽和脂肪酸を得るた
めにも使用できる。
めにも使用できる。
【００２１】本発明は、実施例により、さらに詳細に説
明し例示する。
明し例示する。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明の方法は、脂質依存性のテ
トラヒメニド（脂質要求種）、たとえば、T.setosa、T.
rostrataまたはT. patulaを単純な複合培地中高い細胞
密度で首尾よく培養するために使用することができる。
これにより、脂質依存性テトラヒメニドについて、とく
に加水分解性リソソーム酵素の存在を調べることが可能
になる。たとえば、以下の酵素の活性がこれらの培養液
の無細胞上清および細胞ホモジネート中に検出できる。
すなわち、アルカリホスファターゼ、エステラーゼ（Ｃ
４）、エステラーゼリパーゼ（Ｃ８）、ホスホジエステ
ラーゼ、アリールアミダーゼ、トリプシン、キモトリプ
シン、酸ホスファターゼ、ナフトールＡＳ−ＢＩホスホ
ヒドロラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−
グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−グルコースアミニ
ダーゼ、α−およびβ−マンノシダーゼ、ならびにβ−
フコシダーゼである．これらの酵素の利点は、他の起源
に由来する大部分のリソソーム酵素とは異なり、それら
が分泌されまた細胞外できわめて安定なことである。
トラヒメニド（脂質要求種）、たとえば、T.setosa、T.
rostrataまたはT. patulaを単純な複合培地中高い細胞
密度で首尾よく培養するために使用することができる。
これにより、脂質依存性テトラヒメニドについて、とく
に加水分解性リソソーム酵素の存在を調べることが可能
になる。たとえば、以下の酵素の活性がこれらの培養液
の無細胞上清および細胞ホモジネート中に検出できる。
すなわち、アルカリホスファターゼ、エステラーゼ（Ｃ
４）、エステラーゼリパーゼ（Ｃ８）、ホスホジエステ
ラーゼ、アリールアミダーゼ、トリプシン、キモトリプ
シン、酸ホスファターゼ、ナフトールＡＳ−ＢＩホスホ
ヒドロラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−
グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−グルコースアミニ
ダーゼ、α−およびβ−マンノシダーゼ、ならびにβ−
フコシダーゼである．これらの酵素の利点は、他の起源
に由来する大部分のリソソーム酵素とは異なり、それら
が分泌されまた細胞外できわめて安定なことである。
【００２３】Tetrahymena patula CCAP 1630/2の場合は
Culture Collection of Algaeand Protozoa, Freshwate
r Biological Association, the Ferry House, Amble-s
ide,Cumbria LA220LP, UKから、一方、Tetrahymena set
osa ATCC 30782およびTetrahymena rostrata ATCC 3077
0は、American Type Culture Collection (ATCC), 1230
1 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USAから入手
した。それらが上記酵素活性を示す限り、T. patula CC
AP 1630/2、T. setosa ATCC 30782およびT.rostrata AT
CC 30770の突然変異体および変異体も母体生物に代えて
使用することができる。このような突然変異体はたとえ
ば、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ′−ニトロソグアニ
ジンを用い、T. thermophilaについて記載されている方
法（P. Huenselerら，1987, J. Cell Sci., 88, 47）に
よって単離できる。
Culture Collection of Algaeand Protozoa, Freshwate
r Biological Association, the Ferry House, Amble-s
ide,Cumbria LA220LP, UKから、一方、Tetrahymena set
osa ATCC 30782およびTetrahymena rostrata ATCC 3077
0は、American Type Culture Collection (ATCC), 1230
1 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USAから入手
した。それらが上記酵素活性を示す限り、T. patula CC
AP 1630/2、T. setosa ATCC 30782およびT.rostrata AT
CC 30770の突然変異体および変異体も母体生物に代えて
使用することができる。このような突然変異体はたとえ
ば、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ′−ニトロソグアニ
ジンを用い、T. thermophilaについて記載されている方
法（P. Huenselerら，1987, J. Cell Sci., 88, 47）に
よって単離できる。
【００２４】T. setosaは本発明の方法によって初め
て、脱脂粉乳培地および綿実粕粉末を主成分とするPhar
mamedia（登録商標）培地上で大量培養に成功したもの
である。この場合、この生物体はこれらの培地上で、以
前から知られているＴＧＭＭ−２培地上よりも有意に良
好に増殖することが見出された。
て、脱脂粉乳培地および綿実粕粉末を主成分とするPhar
mamedia（登録商標）培地上で大量培養に成功したもの
である。この場合、この生物体はこれらの培地上で、以
前から知られているＴＧＭＭ−２培地上よりも有意に良
好に増殖することが見出された。
【００２５】T. setosaを、以前用いられていたＴＧＭ
Ｍ−２培地（American Type CultureCollection Catalo
gue, Algae & Protozoa, 18版，1993, 培地986）上でバ
ッチ培養すると（振盪培養、25℃）、２８時間後に細胞
密度１５５,０００細胞／mlに達した。
Ｍ−２培地（American Type CultureCollection Catalo
gue, Algae & Protozoa, 18版，1993, 培地986）上でバ
ッチ培養すると（振盪培養、25℃）、２８時間後に細胞
密度１５５,０００細胞／mlに達した。
【００２６】同一の条件下において、細胞密度は、脱脂
粉乳培地中では２３倍高く（３,５００,０００細胞／m
l）、大豆油非添加Pharmamedia培地中では３９倍高く
（６,０００,０００細胞／ml）、Pharmamedia培地＋大
豆油中では３２倍高い（５,０００,０００細胞／ml）
（図１）。
粉乳培地中では２３倍高く（３,５００,０００細胞／m
l）、大豆油非添加Pharmamedia培地中では３９倍高く
（６,０００,０００細胞／ml）、Pharmamedia培地＋大
豆油中では３２倍高い（５,０００,０００細胞／ml）
（図１）。
【００２７】T. rostrataおよびT.patulaについても同
様の結果を達成することができる。この場合、驚くべき
ことに、脂質依存性のテトラヒメニド（脂質要求種）群
の代表種が、酵素の産生種として著しく適していること
が見出されたのである。すなわち、たとえば、T. pyrif
ormisの培養では８０時間後に約２１０mUのβ−ヘキソ
ースアミニダーゼおよび７５０mUの酸ホスファターゼが
検出されていた（Y. Bannoら、1987, Exp. Cell Res.,
170, 259）。これに比較して、ここに記載した培養系で
は、わずか７２時間後に、８００mUのβ−ヘキソースア
ミニダーゼおよび＞１０,０００mUの酸ホスファターゼ
が検出された。
様の結果を達成することができる。この場合、驚くべき
ことに、脂質依存性のテトラヒメニド（脂質要求種）群
の代表種が、酵素の産生種として著しく適していること
が見出されたのである。すなわち、たとえば、T. pyrif
ormisの培養では８０時間後に約２１０mUのβ−ヘキソ
ースアミニダーゼおよび７５０mUの酸ホスファターゼが
検出されていた（Y. Bannoら、1987, Exp. Cell Res.,
170, 259）。これに比較して、ここに記載した培養系で
は、わずか７２時間後に、８００mUのβ−ヘキソースア
ミニダーゼおよび＞１０,０００mUの酸ホスファターゼ
が検出された。
【００２８】ペプトン、トリプトン、肉エキスおよび肉
粉末、ならびに他の粉砕種子（たとえば、トーモロコ
シ、オート麦、小麦、大豆、および豆類種子）が、T. s
etosa、T. patulaおよびT. rostrataの栄養源としての
使用に適している。さらに、栄養溶液には脂質源（たと
えばアゾレクチン）を添加することもできる。
粉末、ならびに他の粉砕種子（たとえば、トーモロコ
シ、オート麦、小麦、大豆、および豆類種子）が、T. s
etosa、T. patulaおよびT. rostrataの栄養源としての
使用に適している。さらに、栄養溶液には脂質源（たと
えばアゾレクチン）を添加することもできる。
【００２９】脂質依存性のテトラヒメニド（脂質要求
種）は好気的に、すなわち、たとえば振盪フラスコまた
はファーメンター中で振盪または攪拌しながら、必要に
応じて空気または酸素を通じて、深部培養によって培養
される。さらに、ｐＨを調整することもできる。培養は
１８〜３７℃の温度範囲で行うことができるが、２３〜
３３℃の温度が好ましい。T．setosaは上述の条件下
に、培養液中に酵素が蓄積するまで培養する。別法とし
て、発酵は既にT．thermophilaを用いて証明されている
ように（T．Kiy & A．Tiedtke，1992，Appl．Microbio
l．Biotechnol., 38,141）、連続的に実施することもで
きる。この場合、生成物を含有する培養培地は連続的に
収穫される。
種）は好気的に、すなわち、たとえば振盪フラスコまた
はファーメンター中で振盪または攪拌しながら、必要に
応じて空気または酸素を通じて、深部培養によって培養
される。さらに、ｐＨを調整することもできる。培養は
１８〜３７℃の温度範囲で行うことができるが、２３〜
３３℃の温度が好ましい。T．setosaは上述の条件下
に、培養液中に酵素が蓄積するまで培養する。別法とし
て、発酵は既にT．thermophilaを用いて証明されている
ように（T．Kiy & A．Tiedtke，1992，Appl．Microbio
l．Biotechnol., 38,141）、連続的に実施することもで
きる。この場合、生成物を含有する培養培地は連続的に
収穫される。
【００３０】培養は好ましくは数工程に実施される。す
なわち、既に製造培地を使用する予備培養液に保存培養
を接種する。約２４〜７２時間後に、主培養液に予備培
養を、たとえば１：１０の液量比で接種する。
なわち、既に製造培地を使用する予備培養液に保存培養
を接種する。約２４〜７２時間後に、主培養液に予備培
養を、たとえば１：１０の液量比で接種する。
【００３１】発酵はバイオマスもしくは細胞の濃度を測
定してモニタリングすることができる。生成物の濃度は
単位液量あたりの酵素の活性を測定することによってモ
ニタリングすることができる。
定してモニタリングすることができる。生成物の濃度は
単位液量あたりの酵素の活性を測定することによってモ
ニタリングすることができる。
【００３２】酵素は無細胞上清からまたは細胞ホモジネ
ートのいずれかから単離することができる。
ートのいずれかから単離することができる。
【００３３】無細胞上清から酵素を単離する場合には、
細胞は培養培地から分離しなければならない。これはた
とえば、細胞の固定化により（T．Kiy & A．Tiedtke，1
991，Appl．Microbiol．Biotechnol., 35，18）、膜バ
イオリアクターもしくはスピンフィルターバイオリアク
ターを用いて発酵がなお進行中に、または発酵の終了後
に接面ろ過もしくは遠心分離を用いて行うことができ
る。
細胞は培養培地から分離しなければならない。これはた
とえば、細胞の固定化により（T．Kiy & A．Tiedtke，1
991，Appl．Microbiol．Biotechnol., 35，18）、膜バ
イオリアクターもしくはスピンフィルターバイオリアク
ターを用いて発酵がなお進行中に、または発酵の終了後
に接面ろ過もしくは遠心分離を用いて行うことができ
る。
【００３４】細胞内酵素を同様に分離する場合には、細
胞を最初にホモジナイズしなければならない。この場合
には、超音波または Ultraturrax 装置がとくに適して
いるが、細胞を破壊するためには単純な凍結が適当であ
る。ホモジナイズしたのちに、粒状の物質を上清から遠
心分離またはろ過によって分離する。
胞を最初にホモジナイズしなければならない。この場合
には、超音波または Ultraturrax 装置がとくに適して
いるが、細胞を破壊するためには単純な凍結が適当であ
る。ホモジナイズしたのちに、粒状の物質を上清から遠
心分離またはろ過によって分離する。
【００３５】酵素はクロマトグラフィー法によって分離
精製される。酵素含有サンプルはたとえば、最初陰イオ
ン交換カラム［たとえばＱ−Sepharose（登録商標）、M
onoQ］上に負荷する。カラムは上昇塩勾配を用いて溶出
する。別法として、等電点クロマトグラフィーカラム
（Mono P）を使用し、下降ｐＨ勾配を用いて溶出させる
こともできる。酵素の低分子量物質からの分離にはゲル
ろ過［たとえば、Superose（登録商標）またはSuperdex
（登録商標）］による分離が有用であることが見出され
た。
精製される。酵素含有サンプルはたとえば、最初陰イオ
ン交換カラム［たとえばＱ−Sepharose（登録商標）、M
onoQ］上に負荷する。カラムは上昇塩勾配を用いて溶出
する。別法として、等電点クロマトグラフィーカラム
（Mono P）を使用し、下降ｐＨ勾配を用いて溶出させる
こともできる。酵素の低分子量物質からの分離にはゲル
ろ過［たとえば、Superose（登録商標）またはSuperdex
（登録商標）］による分離が有用であることが見出され
た。
【００３６】各酵素の選択的精製にはアフィニティーク
ロマトグラフィー媒体の使用が適している。基質類縁
体、インヒビター、または酵素に対して特異的に指向す
る抗体がこの場合のリガンドとして好ましい。
ロマトグラフィー媒体の使用が適している。基質類縁
体、インヒビター、または酵素に対して特異的に指向す
る抗体がこの場合のリガンドとして好ましい。
【００３７】
１．産生株の保存培養 長期間の培養は試験管中２０℃においてオートクレーブ
滅菌したヒヨコマメ上で行う。この目的には、脱塩水１
０ml中試験管あたり１個のヒヨコマメを使用する。継代
培養は６カ月毎に行う。
滅菌したヒヨコマメ上で行う。この目的には、脱塩水１
０ml中試験管あたり１個のヒヨコマメを使用する。継代
培養は６カ月毎に行う。
【００３８】２．エルレンマイヤーフラスコ中での産生
株の予備培養および主培養 １０mlの培養培地を含む１００mlのエルレンマイヤーフ
ラスコに保存培養液１mlを接種し、ついで振盪器上（８
０rpm）２５℃で一夜インキュベートする。翌日、この
予備培養液１０mlを、培養培地１００mlを含む５００ml
のエルレンマイヤーフラスコに接種する。２４時間後
に、この予備培養液３０mlを５００mlの培地（２.５リ
ットルのエルレンマイヤーフラスコ中）に接種する。単
位液量あたりの最大活性は、酵素によって、４０〜９０
時間後に達成される。たとえば、培養液は、８,０００m
U／mlまでの酸ホスファターゼ、８００mU／mlまでのβ
−ヘキソースアミニダーゼ、１００mU／mlまでのβ−グ
ルコシダーゼ、１００mU／mlまでのβ−フコシダーゼお
よび４０mU／mlまでのホスホジエステラーゼを含有する
（図２および３）。培養を、細胞保持法を用いてたとえ
ば膜バイオリアクター中で連続的に行う場合には、単位
液量あたりの活性を５０倍まで上昇させることが可能で
ある。
株の予備培養および主培養 １０mlの培養培地を含む１００mlのエルレンマイヤーフ
ラスコに保存培養液１mlを接種し、ついで振盪器上（８
０rpm）２５℃で一夜インキュベートする。翌日、この
予備培養液１０mlを、培養培地１００mlを含む５００ml
のエルレンマイヤーフラスコに接種する。２４時間後
に、この予備培養液３０mlを５００mlの培地（２.５リ
ットルのエルレンマイヤーフラスコ中）に接種する。単
位液量あたりの最大活性は、酵素によって、４０〜９０
時間後に達成される。たとえば、培養液は、８,０００m
U／mlまでの酸ホスファターゼ、８００mU／mlまでのβ
−ヘキソースアミニダーゼ、１００mU／mlまでのβ−グ
ルコシダーゼ、１００mU／mlまでのβ−フコシダーゼお
よび４０mU／mlまでのホスホジエステラーゼを含有する
（図２および３）。培養を、細胞保持法を用いてたとえ
ば膜バイオリアクター中で連続的に行う場合には、単位
液量あたりの活性を５０倍まで上昇させることが可能で
ある。
【００３９】製造培地は脱脂粉乳（２０ｇ／リット
ル）、酵母エキス（５ｇ／リットル）、Sequestrene
（０.００３％）およびグルコース（１０ｇ／リット
ル）を含有する。グルコースは別個にオートクレーブ滅
菌して、冷却後にのみ培地に添加する。別法としてPhar
mamedia（登録商標）培地［綿実粕粉末２０ｇ／リット
ル、グルコース１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リ
ットルおよびSequestrene（登録商標）０.００３％また
は痕跡の鉄１ml／ml］を使用することもできる。
ル）、酵母エキス（５ｇ／リットル）、Sequestrene
（０.００３％）およびグルコース（１０ｇ／リット
ル）を含有する。グルコースは別個にオートクレーブ滅
菌して、冷却後にのみ培地に添加する。別法としてPhar
mamedia（登録商標）培地［綿実粕粉末２０ｇ／リット
ル、グルコース１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リ
ットルおよびSequestrene（登録商標）０.００３％また
は痕跡の鉄１ml／ml］を使用することもできる。
【００４０】３．酵素含有培養培地の収得 総培養容量２.５リットルからの細胞を、Filtron（登録
商標）接面ろ過ユニット（膜孔径、０.３μm）を用いて
培地から分離する。第二の工程では、無細胞上清を別の
膜（排出サイズ、１０kDa）を用いて３００mlの液量に
濃縮する。濃縮液を次のクロマトグラフィー精製のため
に開始緩衝溶液に転換透析し、同時にAmicon（登録商
標）セル（ＰＭ10膜）を用いてさらに５０mlの液量に濃
縮する。
商標）接面ろ過ユニット（膜孔径、０.３μm）を用いて
培地から分離する。第二の工程では、無細胞上清を別の
膜（排出サイズ、１０kDa）を用いて３００mlの液量に
濃縮する。濃縮液を次のクロマトグラフィー精製のため
に開始緩衝溶液に転換透析し、同時にAmicon（登録商
標）セル（ＰＭ10膜）を用いてさらに５０mlの液量に濃
縮する。
【００４１】４．酵素含有濃縮物の後処理 緩衝溶液Ａ（２０mMトリエタノールアミン、pH７.８）
中に転換透析したサンプルをＱ−Sepharose（登録商
標）カラム上に負荷した。１Ｍ ＮａＣｌを含有する２
０mMトリエタノールアミン緩衝溶液（pH７.８）を溶出
に使用した。一部のリソソーム酵素は空隙容量中に含ま
れる（たとえば、β−ガラクトシダーゼおよびβ−フコ
シダーゼ）が、他の酵素は勾配の経過中に溶出される。
所望の酵素を含む分画をプールして、クエン酸塩緩衝溶
液中（５０mMクエン酸塩、１００mM ＮａＣｌ、 pH６.
５）に転換透析した。低分子量の不純物を酵素からゲル
ろ過［Superose（登録商標）12］によって除去する。
中に転換透析したサンプルをＱ−Sepharose（登録商
標）カラム上に負荷した。１Ｍ ＮａＣｌを含有する２
０mMトリエタノールアミン緩衝溶液（pH７.８）を溶出
に使用した。一部のリソソーム酵素は空隙容量中に含ま
れる（たとえば、β−ガラクトシダーゼおよびβ−フコ
シダーゼ）が、他の酵素は勾配の経過中に溶出される。
所望の酵素を含む分画をプールして、クエン酸塩緩衝溶
液中（５０mMクエン酸塩、１００mM ＮａＣｌ、 pH６.
５）に転換透析した。低分子量の不純物を酵素からゲル
ろ過［Superose（登録商標）12］によって除去する。
【図１】様々な培地におけるT. setosaの増殖を示す。
【図２】T. setosaの振盪培養液中の酵素活性（脱脂粉
乳培地中２５℃で振盪培養）を示す。
乳培地中２５℃で振盪培養）を示す。
【図３】T. setosaの振盪培養液中の酵素活性（脱脂粉
乳培地中２５℃で振盪培養）を示す。
乳培地中２５℃で振盪培養）を示す。
Claims (17)
- 【請求項１】 脂質依存性テトラヒメニド（脂質要求
種）の培養方法において、脂質依存性テトラヒメニド
を、 ５〜１００ｇ／リットルの脱脂粉乳または綿実粕粉末、 １〜２０ｇ／リットルの酵母エキス、 ０.０３ｇ／リットルの錯体鉄イオンの形態での鉄、お
よび０〜１００ｇ／リットルのグルコースを含有する培
地上で培養することからなる方法。 - 【請求項２】 培地は、 ２０ｇ／リットルの脱脂粉乳、 ５ｇ／リットルの酵母エキス、 ０.０３ｇ／リットルの錯体鉄イオンの形態での鉄、お
よび１０ｇ／リットルのグルコースを含有する請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 培地は、 ２０ｇ／リットルの綿実粕粉末、 ５ｇ／リットルの酵母エキス、 ０.０３ｇ／リットルの錯体鉄イオンの形態での鉄、お
よび１０ｇ／リットルのグルコースを含有する請求項１
に記載の方法。 - 【請求項４】 培地は１０ml／リットルの大豆油を含有
する請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 錯体鉄イオンはＥＤＴＡ錯体として存在
する請求項１〜４の一項に記載の方法。 - 【請求項６】 鉄はクエン酸鉄として用いられる請求項
１〜４の一項に記載の方法。 - 【請求項７】 培養は細胞を膜によって保持しながら、
連続的に実施する請求項１〜６の一項に記載の方法。 - 【請求項８】 脂質依存性テトラヒメニドはTetrahymen
a setosaである請求項１〜７の一項に記載の方法。 - 【請求項９】 Tetrahymena setosa ATCC 30782、その
突然変異体または変異体を脂質依存性テトラヒメニドと
して用いる請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 脂質依存性テトラヒメニドはTetrahym
ena rostrataである請求項１〜７の一項に記載の方法。 - 【請求項１１】 脂質依存性のテトラヒメニドはTetrah
ymena rostrata ATCC 30770である請求項１０に記載の
方法。 - 【請求項１２】 脂質依存性のテトラヒメニドはTetrah
ymena patulaである請求項１〜７の一項に記載の方法。 - 【請求項１３】 脂質依存性テトラヒメニドはTetrahym
ena patula CCAP 1630/2である請求項１２に記載の方
法。 - 【請求項１４】 脂質依存性のテトラヒメニド（脂質要
求種）から有用な生物産生産物を製造する方法におい
て、脂質依存性のテトラヒメニドを請求項１〜１３の一
項に記載の方法によって培養し、既知の方法を用いて有
用な生物産生産物を単離することからなる方法。 - 【請求項１５】 脂質依存性のテトラヒメニド（脂質要
求種）によって周囲の培地中に分泌される酵素を製造す
る請求項１４に記載の方法において、脂質依存性テトラ
ヒメニドを、分泌された酵素が培地中に濃厚になるまで
請求項１〜１３の一項に記載の方法によって培養し、つ
いで酵素を既知の方法によって無細胞培養上清から単離
し、クロマトグラフィー法によって互いに分離する方
法。 - 【請求項１６】 脂質依存性のテトラヒメニド（脂質要
求種）から細胞内酵素を製造する請求項１４に記載の方
法において、脂質依存性テトラヒメニドを請求項１〜１
３の一項に記載の方法によって培養し、細胞をホモジナ
イズし、酵素含有溶液を遠心分離またはろ過によって破
壊された細胞から分離し、酵素をクロマトグラフィー法
によって互いに分離する方法。 - 【請求項１７】 有用な生物産生産物は多不飽和脂肪酸
である請求項１４に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4437615:4 | 1994-10-21 | ||
| DE4437615 | 1994-10-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08228763A true JPH08228763A (ja) | 1996-09-10 |
Family
ID=6531328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7272157A Abandoned JPH08228763A (ja) | 1994-10-21 | 1995-10-20 | 脂質依存性テトラヒメニドの培養方法および脂質依存性テトラヒメニドの有用な生物産生産物の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0708176B1 (ja) |
| JP (1) | JPH08228763A (ja) |
| AT (1) | ATE278772T1 (ja) |
| DE (1) | DE59510951D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001517429A (ja) * | 1997-09-19 | 2001-10-09 | アヴェンティス・リサーチ・ウント・テクノロジーズ・ゲーエムベーハー・ウント・コー・カーゲー | 繊毛虫（原生動物）の連続大量培養を用いた生物由来の貴重物質を生産する発酵法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19626564A1 (de) * | 1996-07-03 | 1998-01-08 | Hoechst Ag | Genetische Transformation von Ciliatenzellen durch Microcarrier-Bombardement mit DNA beladenen Goldpartikeln |
| IL128332A0 (en) * | 1996-08-30 | 2000-01-31 | Novo Nordisk As | GLP-1 derivatives |
| DE19903095C2 (de) * | 1999-01-27 | 2003-05-22 | Nutrinova Gmbh | Gewinnung von gamma-Linolensäure aus Protozoen der Gattung Colpidium |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2574089B1 (fr) * | 1984-12-03 | 1987-04-10 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de production d'acides gras, en particulier d'acide g-linoleique a partir de tetrahymena, produits obtenus et preparation medicamenteuse ou alimentaire contenant de l'acide g-linolenique ou ses derives en tant qu'agent anti-agregation plaquettaire |
| DE4238842A1 (de) * | 1992-11-17 | 1994-05-19 | Arno Prof Dr Tiedtke | Hochzelldichte Fermentation von Ciliaten zur Gewinnung von Naturstoffen |
-
1995
- 1995-10-16 EP EP95116245A patent/EP0708176B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-16 DE DE59510951T patent/DE59510951D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-16 AT AT95116245T patent/ATE278772T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-10-20 JP JP7272157A patent/JPH08228763A/ja not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001517429A (ja) * | 1997-09-19 | 2001-10-09 | アヴェンティス・リサーチ・ウント・テクノロジーズ・ゲーエムベーハー・ウント・コー・カーゲー | 繊毛虫（原生動物）の連続大量培養を用いた生物由来の貴重物質を生産する発酵法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE278772T1 (de) | 2004-10-15 |
| EP0708176A2 (de) | 1996-04-24 |
| EP0708176B1 (de) | 2004-10-06 |
| EP0708176A3 (de) | 1998-09-16 |
| DE59510951D1 (de) | 2004-11-11 |
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