JPH08228783A - 新規なバチルス菌株及び有害生物防除剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 有害生物防除剤の有効成分となる新規な結晶
性蛋白質及び該蛋白質を生産する微生物の提供。 【解決手段】 有害生物防除剤の有効成分となる新規な
結晶性蛋白質及び該蛋白質を生産するバチルス・チュー
リンゲンシス・バー・ジャポネンシスＮ１４１株及び該
蛋白質をコードする遺伝子の提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なバチルス・
チューリンゲンシス・バー・ジャポネンシスＮ１４１
（Bacillus thuringiensis var. japonensis N141、以
下Ｎ１４１と略記することもある）株及び殺虫性結晶蛋
白質をコードする遺伝子並びに殺虫性結晶蛋白質及び該
蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする有害
生物防除剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】バチルス・チューリンゲンシス（Bacill
us thuringiensis、以下Ｂｔと略記する）並びにＢｔの
産生する結晶性毒素蛋白質は、環境を汚染しない微生物
農薬（Ｂｔ剤）として、特に鱗翅目害虫に対する殺虫剤
として非常に有用であり、実際に世界各国で使用されて
いる。

【０００３】Ｂｔは、グラム陽性の桿状菌で対数増殖末
期の胞子形成期に結晶蛋白質を産生する。この結晶蛋白
質は、昆虫が経口的に消化管内に取り入れたとき、消化
液中でアルカリ分解、酵素分解を受けてはじめて腸管麻
痺並びに全身麻痺を伴う殺虫活性を示す蛋白質となる
が、哺乳類に対しては毒性を示さない。Ｂｔの産生する
結晶蛋白質は、一般にダイヤモンド型（diamond-shape
d）、重ピラミッド型（bipyramidal）、偏菱型立方体
（rhomboidal）等と呼ばれる形態をしている。結晶蛋白
質は、芽胞のう内で、芽胞とならんで形成され、芽胞の
うの時期を経て芽胞とともに菌体外に遊離する（Hanna
y, C. L.; Nature 172(1004) 1953）。

【０００４】Ｂｔの分類は、De Barjac and Bonefoi（E
ntomophaga 7(5-31) 1962）の提案による鞭毛抗原（H-a
ntigen）に基づいて行なわれており、今までに数多くの
亜種が見い出されている。

【０００５】これら菌株の殺虫活性は亜種によって異な
っており、極めて特異性の高いものとなっている。例え
ば、鱗翅目昆虫に活性を示す亜種としてクルスタキ（ku
rustaki）、アイザワイ（aizawai）等が、又鞘翅目昆虫
に活性を示す亜種としてテネブリオニス（tenebrioni
s）、ジャポネンシスブイブイ（japonensis buibui）等
が知られている。

【０００６】しかし実際には、同じ亜種でも菌株ごとに
殺虫活性スペクトラムは異なっており、一部の鱗翅目害
虫に活性を示すＢｔ株では害虫の抵抗性が生じている。
又、鞘翅目昆虫に有効な活性を示す菌株の報告も少な
い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】よって、Ｂｔ剤に抵抗
性の生じた鱗翅目害虫に対しても効果のある新規なＢｔ
剤が求められている。更に、鞘翅目昆虫に対して活性を
有するＢｔ剤に対する需要がある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鱗翅目、鞘
翅目の昆虫に対し優れた殺虫活性を有する結晶性蛋白質
を生産する、新規な菌株を見いだし、本発明を完成させ
た。

【０００９】本発明は通商産業省工業技術院生命工学技
術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４５７６；ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５２４１として寄託されたバチルス・チュー
リンゲンシス・バー・ジャポネンシスＮ１４１（Bacill
us thuringiensis var. japonensis N141）株に関す
る。

【００１０】本発明の別の要旨に於ては、Ｎ１４１によ
って産生された殺虫性結晶蛋白質（以下Ｎ１４１結晶蛋
白質と略記する）を主成分として含有することを特徴と
する有害生物防除剤が提供されるものであり、更に害虫
の被害から植物を保護する方法であって該害虫をＮ１４
１結晶蛋白質に接触させることからなる害虫の被害から
植物を保護する方法が提供されるものである。

【００１１】本発明の新規菌株Ｎ１４１は、一般に用い
られている耐熱性の胞子を形成するバチルス属細菌の分
離方法を用いて分離した。即ち、埼玉県内で採取した土
壌の懸濁液に５０〜９０℃熱処理を加え、標準的平板培
地、例えばＮＢ平板培地を用いて単離した。

【００１２】［本発明の新規菌株Ｎ１４１の特性］ 集落形態・・・・・・不規則縁を有する不透明白色のコ
ロニーを形成する。 増殖期の細胞形態・・Ｂｔに典型的。 鞭毛の血清型・・・・２３、ジャポネンシス（japonens
is）。 細胞内含有物・・・・胞子形成細胞は不定型結晶蛋白質
を作る。結晶蛋白質の電子顕微鏡写真を図１に示した。アルカリ 可溶性蛋白・・・本菌株は、１３０、０００ダルト
ン付近に泳動される蛋白質を持っている。 活性・・・・・・・・本菌株は試験された鱗翅目、鞘翅
目害虫を殺虫した。 遺伝子・・・・・・・本菌株の産生する約１３０、００
０ダルトンの結晶蛋白質をモルモットに免疫して得られ
た抗体を用いてスクリーニングを行ない、Ｎ１４１結晶
蛋白質をコードする遺伝子（以下Ｎ１４１遺伝子と略記
する）をクローニングした。得られた遺伝子は、３，７
５９塩基を有し、４７〜３，５５６の翻訳領域を含む。
更に、公知の鞘翅目昆虫に活性を示すジャポネンシスブ
イブイ（japonensis buibui）遺伝子（特開平６−６５
２９２）との比較の結果、図２に示した様
に両遺伝子は、アミノ酸配列で約６０％の相同
性しか有し ていなかった。

【００１３】以上のような事実から、本発明のＮ１４１
は、新規菌株と判断し、本発明を完成するに至った。

【００１４】

【発明の実施の形態】

【００１５】Ｎ１４１株は、標準的な既知培地と発酵手
段を用いて培養できる。即ち、培地は、炭素源として
は、例えば、蔗糖、麦芽糖、グルコース、フラクトー
ス、糖蜜、可溶性デンプン等が利用できる。

【００１６】窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、綿実粉、酵母エキス、大豆粉、
カゼイン水解物等が挙げられる。又、ミネラル及びビタ
ミンは、糖蜜、酵母エキス等の有機炭素源及び窒素源で
代用することができ、必要に応じては、無機塩類、ビタ
ミン類等を更に添加しても良い。ｐＨは、５〜８が好ま
しく、培養温度は、好ましくは２５〜３０℃、培養日数
は２〜５日が良い。培養方法は、好気的条件下での通気
撹拌培養が好ましい。

【００１７】培養終了後、培養液から殺虫性結晶蛋白質
部分を分離採取する場合、通常の遠心分離法、濾過法等
を利用する。

【００１８】Ｎ１４１株及び／又はＮ１４１結晶蛋白質
を、鞘翅目昆虫及び鱗翅目昆虫を制御するために用いら
れる有害生物防除剤中の活性成分として用い得る。しか
し、特に結晶性蛋白を前記の細菌から分離せずに、結晶
毒素含有成分として用いることもできる。

【００１９】得られた結晶毒素含有成分を有害生物防除
剤として使用するに当たっては、一般に適当な担体、例
えばタルク、カオリン等の天然の鉱物繊維や、軽石、ベ
ントナイト、珪藻土等の固体担体或いは水等のような液
体担体と混用して適用することができ、所望により乳化
剤、分散剤、懸濁剤、浸透剤、展着剤、安定剤等を添加
し、水和剤、粉剤、粒剤、フロアブル剤等任意の剤型と
して実用に供することができる。

【００２０】又、必要に応じて製剤時又は散布時に、結
晶性毒素活性を阻害しない範囲に於いて他種の除草剤、
各種殺虫剤、殺菌剤、植物生長調節剤、共力剤、誘引
剤、植物栄養剤、肥料等と混合使用することもできる。

【００２１】本発明の結晶毒素含有成分の施用薬量は適
用場面、施用時期、施用方法、対象病害虫、栽培作物等
により差異はあるが、一般には有効成分組成として、通
常、０．１〜９９％、好ましくは０．５〜５０％程度が
適当である。

【００２２】次に、本発明の各種製剤の配合割合及び種
類の例を下記に記載する。 ─────────────────────────────────── 有効成分 担 体 界 面 その他の成分 活性剤 （補助剤） ─────────────────────────────────── 水和剤 1〜70 15〜93 3〜10 0〜5 粉 剤 0.01〜30 67〜99.5 0〜3 粒 剤（ベイト剤） 0.01〜30 67〜99.5 0〜8 フロアブル剤 1〜70 10〜90 1〜20 0〜10 ─────────────────────────────────── 上記の表中の数値は、重量％を示す。

【００２３】施用に際しては、水和剤及びフロアブル剤
では所定量の水で希釈して散布し、粉剤及び粒剤は水で
希釈することなく、そのまま直接散布する。次に、上記
の各製剤中の各成分の例を挙げる。

【００２４】〔水和剤〕 有効成分 ：本発明の結晶毒素含有物 担 体 ：炭酸カルシウム、カオリナイト、ジーク
ライトＤ、ジークライトＰＥＰ、珪藻土、タルク 界面活性剤 ：ソルポール、リグニンスルホン酸カルシ
ウム、ルノックス その他の成分：カープレックス＃８０

【００２５】〔粉剤〕 有効成分 ：本発明の結晶毒素含有物 担 体 ：炭酸カルシウム、カオリナイト、ジーク
ライトＤ、珪藻土、タルク その他の成分：ジイソプロピルホスフェート、カープレ
ックス＃８０

【００２６】〔粒剤 ベイト剤〕 有効成分 ：本発明の結晶毒素含有物 担 体 ：小麦粉、フスマ、コーン・グリット、ジ
ークライトＤ その他の成分：パラフィン、大豆油

【００２７】〔フロアブル剤〕 有効成分 ：本発明の結晶毒素含有物 担 体 ：水 界面活性剤 ：ソルポール、リグニンスルホン酸ソー
ダ、ルノックス、ニッポール その他の成分：エチレングリコール、プロピレングリコ
ール

【００２８】次に、本発明の結晶毒素含有物を有効成分
とする有害生物防除剤の製剤例を示すが、本発明はこれ
らに限定されるものではない。尚、以下の製剤例に於い
て、「部」は重量部を意味する。

【００２９】 製剤例１ 水和剤 本発明の結晶毒素含有物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ２５部 ジークライトＰＥＰ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ６６部 （カオリナイトとセリサイトの混合物：ジークライト工業（株）商品名） ソルポール５０３９ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ４部 （アニオン性界面活性剤：東邦化学工業（株）商品名） カープレックス＃８０ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ３部 （ホワイトカーボン：塩野義製薬（株）商品名） リグニンスルホン酸カルシウム ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ２部 以上を均一に混合粉砕して水和剤とする。

【００３０】使用に際しては、上記水和剤を５００〜２
０００倍に希釈して本発明の結晶毒素含有成分量がヘク
タール当たり０．１〜５ｋｇになるように散布する。

【００３１】 製剤例２ 粉剤 本発明の結晶毒素含有物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ３．０部 クレー ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ９５ 部 燐酸ジイソプロピル ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ １．５部 カープレックス＃８０ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ０．５部 （ホワイトカーボン：塩野義製薬（株）商品名） 以上を均一に混合粉砕して粉剤とする。使用に際して
は、上記粉剤を本発明の結晶毒素含有成分量がヘクター
ル当たり０．１〜５ｋｇになるように散布する。

【００３２】 製剤例３ フロアブル剤 本発明の結晶毒素含有物 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ３５部 ルノックス１０００Ｃ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ０．５部 （陰イオン界面活性剤：東邦化学工業（株）商品名） ソルポール３３５３ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ １０部 （非イオン性界面活性剤：東邦化学工業（株）商品名） １％ザンタンガム水溶液 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ２０部 （天然高分子） 水 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３４．５部 本発明の結晶毒素含有成分を除く上記の成分を均一に溶
解し、次いで本発明の結晶毒素含有物を加えて良く撹拌
した後、サンドミルにて湿式粉砕してフロアブル剤を得
る。使用に際しては、上記フロアブル剤を５０〜２００
０倍に希釈して本発明の結晶毒素含有成分量がヘクター
ル当たり０．１〜５ｋｇになるように散布する。

【００３３】本発明の鱗翅目・鞘翅目害虫による虫害か
ら植物を保護する方法は、一般に害虫が蔓延した植物に
又は蔓延しそうな植物を水のような希釈剤で希釈した上
記の有害生物防除剤組成物で処理する（例えば噴霧す
る）ことによって行う。該防除剤の有効成分は有毒性の
δ−菌体内毒素である。所望ならば、該防除剤は有毒性
のδ−菌体内毒素を産生する細菌から独立して、植物に
又は蔓延する害虫に施用することが出来る。しかし、前
記の細菌から結晶性蛋白を分離することは一般に必要で
はない。

【００３４】本発明の方法で撲滅し得る害虫は鱗翅目
（Lepidoptera）害虫及び鞘翅目（Coleoptera）害虫が
挙げられる。

【００３５】鱗翅目害虫としては、例えばハスモンヨト
ウ（Spodoptera litura）、シロイチモジヨトウ（Spodo
ptera exigua）等のヨトウガ（Mamestra brassicae）
類、コナガ（Plutella xylostella）、コブノメイガ（C
naphalocrocis medinalis）、ニカメイガ（Chilo suppr
essalis）、イチモンジセセリ（Parnara guttata）、モ
ンシロチョウ（Pieris rapae crucivora）、イラガ（Mo
nema flavescens）及びキアゲハ（Papilio machaon hip
pocrates）等が挙げられる。

【００３６】鞘翅目害虫としては、例えばドウガネブイ
ブイ（Anomala cuprea）、チビサクラコガネ（Anomala
schonfeldti）、ヒメコガネ（Anomala rufocuprea）、
アカビロウドコガネ（Maladera castanea）、コイチャ
コガネ（Adoretus tenuimaculatus）、マメコガネ（Pop
illia japonica）等のコガネムシ類、ニジュウヤホシテ
ントウ（Epilachna vigintioctopunctata）、オオニジ
ュウヤホシテントウ（Epilachna vigintioctomaculat
a）等のテントウムシ類、イネミズゾウムシ（Lissorhop
trus oryzophilus）、サビヒョウタンゾウムシ（Scepti
cus griseus）、アリモドキゾウムシ（Cylas formicari
us）、シバオサゾウムシ（Sphenophrus venatus vestiu
s）、コクゾウムシ（Sitophilus zeamaise）等のゾウム
シ類、キスジノミハムシ（Phyllotreta striolata）、
ウリハムシ（Aulacophora femoralis）等のハムシ類、
オキナワカンシャクシコメツキ（Melanotus okinawaens
is）等のコメツキムシ類、マツノマダラカミキリ（Mono
chamus alternatus）、ゴマフカミキリ（Mesosa myop
s）等のカミキリムシ類、ニホンキクイムシ（Scolytus
japonicus）、ハンノキキクイムシ（Xylosandrus germa
nus）等のキクイムシ類、及びチャイロコメノゴミムシ
ダマシ（Tenebrio molitor）、コクヌストモドキ（Trib
olium castaneum）等のゴミムシダマシ類が挙げられ
る。

【００３７】本発明の方法は鱗翅目・鞘翅目害虫が蔓延
し易い広範囲の植物を保護するのに使用することが出来
る。本発明の方法で保護される植物は具体例に挙げた、
カンラン等に代表される野菜類の他、カリフラワー等の
果菜類、柑橘・落葉果樹、イネ、小麦、豆類等の穀類、
貯穀、貯蔵食品、ゴルフ場、庭園等における芝生、茶、
サトウキビ等の特用作物、及び花樹である。又、植林地
及び公園等の非農耕地の樹木等や森林の樹木等が挙げら
れる。

【００３８】Ｎ１４１遺伝子は、Ｎ１４１株から単離し
得る。１つ又はそれ以上の制限酵素を用いてＮ１４１株
の全ＤＮＡを消化後、産生されたＤＮＡ断片を２〜５Ｋ
ｂｐのＤＮＡ画分にサイズ分画し、このような画分を好
適なベクターに連結し、大腸菌を形質転換し得る。次
に、Ｎ１４１株の結晶蛋白質に対する抗体を用いたエン
ザイムイムノアッセイ法により、大腸菌の形質転換体を
から目的遺伝子を保持した大腸菌形質転換体を確認し得
る。

【００３９】上記のような過程を経て確認されたＮ１４
１由来の結晶蛋白質遺伝子ＤＮＡを、好適な制限酵素で
処理し、得られたＤＮＡ断片を好適なクローニングベク
ターに連結し、遺伝子カセットを作製し得る。

【００４０】該遺伝子カセットを用いて微生物を形質転
換することができる。例えば、大腸菌を形質転換し、ダ
イデオキシ法等の遺伝子解析法などにより、Ｎ１４１結
晶蛋白質の塩基配列を得ることができる。

【００４１】更に、該遺伝子カセットを用いて殺虫活性
を有するグラム陽性細菌、たとえばＢｔを形質転換する
こともできる。それにより、より広範囲の昆虫を制御す
るのに有効な形質転換Ｂｔを産生し得る。

【００４２】植物中でＮ１４１遺伝子を発現させるため
に、好適制限部位を導入し、各遺伝子又は遺伝子部分の
側面に位置させる。これは、特定部位の突然変異誘発に
より実施し得る。

【００４３】Ｎ１４１株の殺虫的有効部分をコードする
Ｎ１４１遺伝子部分は、単一な植物細胞の核ゲノム中に
安定に挿入され、そのようにして形質転換された細胞を
用いて、昆虫耐性である形質転換植物を作り得る。

【００４４】その結果生じた形質転換植物を用いて、同
一の特徴を有する形質転換された植物を生産し得るし、
あるいは同一又は関連の植物種の他の変種に殺虫剤的に
有効なＮ１４１遺伝子部分を導入し得る。形質転換植物
から得られる種子は、安定したゲノム挿入物として殺虫
剤的に有効なＮ１４１遺伝子部分を含有する。

【００４５】Ｎ１４１株はさらに、１つ又はそれ以上の
殺虫活性を持った外来Ｂｔ遺伝子で形質転換される。そ
れにより、より広範囲の害虫をも駆除するのに有用な形
質転換Ｎ１４１株が産生される。

【００４６】Ｎ１４１結晶蛋白質を用いて、モルモット
に対し免疫し、この結晶蛋白質に特異的な抗体を調製し
得る。

【００４７】

【作用】保護領域、即ちＮ１４１株及び／又はＮ１４１
結晶蛋白質を適用した領域で、数種類の昆虫がＮ１４１
株及び／又はＮ１４１結晶蛋白質又はそれらの混合物、
あるいはＮ１４１伝子を導入した形質転換体（植物、微
生物等）を食し、その結果昆虫は、Ｎ１４１結晶蛋白質
の影響で死亡するか、損傷を受ける。

【００４８】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４９】すなわち下記のものも本発明に用いること
ができる。

【００５０】（１）配列表の配列番号２に示すアミノ酸
配列において１又は複数のアミノ酸が付加、欠失又は置
換されており、且つ殺虫活性を示す蛋白質。 （２）Ｎ１４１株の産生する結晶性蛋白質をコードして
いる塩基配列を含んでなるＤＮＡ。 （３）上記（１）記載の蛋白質をコードしている塩基配
列を含んでなるＤＮＡ。

【００５１】実施例１：Ｎ１４１株の単離、性状 埼玉県内で採取した土壌からＮ１４１株を単離した。

【００５２】試料土壌１０ｍｇを三角フラスコに入れ１
０ｍＬの滅菌水を注入し３０分間振盪した後、暫時静置
した。その上澄み液２ｍＬをとり直ちに８０℃で１０分
間加熱した。加熱液は１０倍、１００倍の２段階希釈
し、各々１ｍＬをＮＢ平板培地（ＮＵＴＲＩＥＮＴＢＲ
ＯＴＨ８．４ｇ、アガー２０ｇ／滅菌水１ｌ）上で、３
０℃、２４〜４８時間培養した。

【００５３】［本発明の新規菌株Ｎ１４１の特性］ 集落形態・・・・・・不規則縁を有する不透明白色のコ
ロニーを形成する。 増殖期の細胞形態・・Ｂｔに典型的。 鞭毛の血清型・・・・２３、ジャポネンシス（japonens
is）。 細胞内含有物・・・・胞子形成細胞は不定型結晶蛋白質
を作る。結晶蛋白質の電子顕微鏡写真を図１に示した。アルカリ 可溶性蛋白・・・本菌株は、１３０、０００ダルト
ン付近に泳動される蛋白質を持っている。 活性・・・・・・・・本菌株は試験された鱗翅目、鞘翅
目害虫を殺虫した。 遺伝子・・・・・・・本菌株の産生する約１３０、００
０ダルトンの結晶蛋白質をモルモットに免疫して得られ
た抗体を用いてスクリーニングを行ない、Ｎ１４１結晶
蛋白質をコードする遺伝子（以下Ｎ１４１遺伝子と略記
する）をクローニングした。得られた遺伝子は、３，７
５９塩基を有し、４７〜３，５５６の翻訳領域を含む。
更に、公知の鞘翅目昆虫に活性を示すジャポネンシスブ
イブイ（japonensis buibui）遺伝子（特開平６−６５
２９２）との比較の結果、図２に示した様
に両遺伝子は、アミノ酸配列で約６０％の相同
性しか有し ていなかった。

【００５４】実施例２：Ｎ１４１株の保存、滅菌 Ｎ１４１株を長期保存するには、Ｎ１４１をＮＢ液体培
地（ＮＵＴＲＩＥＮＴＢＲＯＴＨ８．４ｇ／滅菌水１
Ｌ）を用い、３０℃で２４〜７２時間、１５０〜２００
ｒｐｍで回転振盪培養後、該培養液と３０％グリセロー
ルを等量ずつ混合し、これを−８０℃で保存するか、も
しくは、該培養液を遠心分離し、得られた菌体を保護液
（スキムミルク１０％、グルタミン酸ナトリウム１％）
に懸濁後、真空乾燥し、保存するのが望ましい。

【００５５】Ｎ１４１株の滅菌は、１２０℃、２０分間
オートクレーブ処理して実施する。

【００５６】実施例３：Ｎ１４１株結晶蛋白質の精製 Ｎ１４１株を一白金耳とり、５ｍＬのＮＢ液体培地（Ｎ
ＵＴＲＩＥＮＴ ＢＲＯＴＨ８．４ｇ／滅菌水１Ｌ）を
含んだ試験管に植菌し、３０℃で１２〜２４時間往復振
盪培養を行い種培養液を得た。種培養液を終濃度１％と
なるように１００ｍＬのＮＢ液体培地（ＮＵＴＲＩＥＮ
Ｔ ＢＲＯＴＨ８．４ｇ／滅菌水１Ｌ）を含んだ５００
ｍＬ容三角フラスコに植菌し、３０℃で７２〜９６時
間、１５０〜２００ｒｐｍで回転振盪培養を行った。次
いで、細胞、胞子及び結晶蛋白質を遠心分離によって回
収した。得られた沈殿に適当量の緩衝液（Tris-HCl、Na
Cl、EDTA）を加え超音波破砕を行い、懸濁液を得た。

【００５７】実施例４：Ｎ１４１株結晶蛋白質の特性 実施例３で得られた懸濁液を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
電気泳動にかけ泳動パターンを調べた。また、抗体を用
いてウエスタンブロッティングもおこなった。その結
果、Ｎ１４１株の産生する分子量約１３０，０００ダル
トンの結晶蛋白質の存在が明らかになった。

【００５８】実施例５：Ｎ１４１株のドウガネブイブイ
（Anomala cuprea）に対する殺虫活性 実施例３で調製した懸濁液を所定濃度に希釈し、展着剤
を添加した試料溶液を、予め滅菌処理しておいた腐葉土
に混和し、ドウガネブイブイ（Anomala cuprea）を放虫
し、観察した。その結果、ドウガネブイブイ（Anomala
cuprea）に対する殺虫活性を確認した。

【００５９】実施例６：Ｎ１４１株及びＮ１４１結晶蛋
白質のコナガ（Plutella xylostella）に対する殺虫活
性 実施例３で調製した懸濁液を所定濃度に希釈し、展着剤
を添加した試料溶液中にカンランの葉を浸し、その後十
分に風乾し、湿った濾紙を入れたスチロールカップに入
れた。この中に、３齢中期のコナガ（Plutella xyloste
lla）幼虫を放虫し、６日後の幼虫の死虫率を下記の計
算式から求めた。尚、試験は５連１区５頭制で行った。

【００６０】 死虫率（％）＝（死虫数／放虫数）×１００

【００６１】結果を表１に示した。 表１：Ｎ１４１株及びＮ１４１結晶蛋白質のコナガ（Pl
utella xylostella）３齢中期幼虫に対する殺虫活性。

【００６２】

【００６３】実施例７：Ｎ１４１株及びＮ１４１結晶蛋
白質のカイコガ（Bombyx mori）に対する殺虫活性 実施例３で調製した懸濁液を所定濃度に希釈し、展着剤
を添加した試料溶液中にクワの葉を浸し、その後十分に
風乾し、湿った濾紙を入れたスチロールカップに入れ
た。この中に、３齢２日目のカイコガ（Bombyx mori）
幼虫放虫し、６日後の幼虫の死虫率を下記の計算式から
求めた。尚、試験は５連１区５頭制で行った。

【００６４】 死虫率（％）＝（死虫数／放虫数）×１００

【００６５】結果を表２に示した。 表２：Ｎ１４１株及びＮ１４１結晶蛋白質のカイコガ
（Bombyx mori）３齢２日目幼虫に対する殺虫活性。

【００６６】

【００６７】実施例８：Ｎ１４１遺伝子の単離 Ｎ１４１株から得られる全ＤＮＡを調製し、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで部分的に消化した。消化ＤＮＡより約２〜５
ＫｂｐのＤＮＡ断片を分画し、ＥｃｏＲＩ消化したファ
ージベクター（λgt11）に連結し、その後大腸菌を形質
転換した。次に、組み換え大腸菌クローンを、Ｎ１４１
株結晶蛋白質と考えられる約１３０ｋＤａの蛋白質をモ
ルモットに免役して得られた抗体を用いて抗体スクリー
ニングして、Ｎ１４１遺伝子を含有するクローンを確認
した。この組み換え大腸菌クローンからＤＮＡを調製
し、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。消化ＤＮＡ断片を
０．８％アガロースゲルで電気泳動することにより約
３．４Ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を確認した。

【００６８】実施例９：Ｎ１４１遺伝子のクローニング 実施例８で得られたＤＮＡ断片を分画し、ＥｃｏＲＩ消
化したプラスミドベクターであるBluescript II SK (-)
に連結し、遺伝子カセット（ｐＢＮ１４１）を作成した
（図３）。ｐＢＮ１４１は、完全長ではなかったため、
再度クローニングを行い、ダイデオキシ法によりＮ１４
１完全長遺伝子を含有するＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列
を決定した。

【００６９】実施例１０：Ｎ１４１遺伝子の塩基配列お
よびアミノ酸配列 塩基配列は、配列番号１記載のように３７５９塩基より
なる。このうちオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）は第４７塩基目から第３５５６塩基目の３５１０塩
基であり、１１６９アミノ酸（１１７０番目は終止コド
ン）をコードしている。又、本Ｎ１４１のアミノ酸配列
と公知の鞘翅目昆虫に活性を示すジャポネンシスブイブ
イ（japonensis buibui）遺伝子由来アミノ酸（特開平
６−６５２９２）とのＮ−末端から６６２番目までの配
列比較の結果、図２に示した様に両遺伝子は、アミノ酸
レベルで約６０％の相同性しか有していなかった。

【００７０】実施例１１：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ：ＤＨ
５α）でのＮ１４１結晶蛋白質の発現 Ｎ１４１遺伝子を用い結晶蛋白質を生産させるために、
実施例９での作製した遺伝子カセット（ｐＢＮ１４１）
を用い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ：ＤＨ５α）を形質転換
し、組み換え大腸菌（後文ではＥ．ｃｏｌｉ：ＤＨ５α
（ｐＢＮ１４１）と記載する）を得た。該組み換え大腸
菌を、ＬＢ−ａｍｐ液体培地（Trypton １０ｇ、NaCl１
０ｇ、Yeast extract ５ｇ、Glucose ０．２％、Ampici
llin５０ｍｇ／滅菌水１Ｌ）を用いて３７℃で約３時間
培養した後、終濃度１ｍＭとなるようにIPTGを添加し、
さらに３７℃で２０時間培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離し、沈殿にＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを４倍
量（Ｗ／Ｖ）添加し、室温で１０間懸濁し、次いでＬｙ
ｓｏｚｙｍｅを終濃度１ｍｇ／ｍＬになるよう添加し、
混和後１０分間氷上で静置した。さらに、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を終濃度１％になるように添加し、混和後、
室温で１０分間静置した。次いで、遠心分離し、上清部
分を回収した。

【００７１】実施例１２：Ｅ．ｃｏｌｉ：ＤＨ５α（ｐ
ＢＮ１４１）発現蛋白の特性 実施例１１で得られた上清を、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ル電気泳動にかけ泳動パターンを調べた。また、抗体を
用いてウエスタンブロッティングもおこなった。その結
果、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＤＨ５α（ｐＢＮ１４１）がＮ１４
１結晶蛋白質を産生していることが確認された。

【００７２】実施例１３：Ｅ．ｃｏｌｉ：ＤＨ５α（ｐ
ＢＮ１４１）発現蛋白のコナガ（Plutella xylostell
a）幼虫に対する殺虫活性 実施例１１から得られた上清溶液に、展着剤を添加した
試料溶液の希釈液中にカンランの葉を浸し、その後十分
に風乾し、湿った濾紙を入れたスチロールカップに入れ
た。この中に、３齢中期のコナガ（Plutella xylostell
a）幼虫を放虫し、６日後の幼虫の死虫率を下記の計算
式から求めた。尚、試験は５連１区５頭制で行った。

【００７３】 死虫率（％）＝（死虫数／放虫数）×１００

【００７４】結果を表３に示した。 表３：Ｅ．ｃｏｌｉ：ＤＨ５α（ｐＢＮ１４１）発現蛋
白質のコナガ（Plutella xylostella）３齢中期幼虫に
対する殺虫活性

【００７５】

【００７６】実施例１４：Ｅ．ｃｏｌｉ：ＤＨ５α（ｐ
ＢＮ１４１）発現蛋白質のカイコガ（Bombyx mori）幼
虫に対する殺虫活性 実施例１１から得られた、上清溶液に展着剤を添加した
試料溶液の希釈液中にクワの葉を浸し、その後十分に風
乾し、湿った濾紙を入れたスチロールカップに入れた。
この中に、３齢２日目のカイコガ（Bombyx mori）幼虫
を放虫し、６日後の幼虫の死虫率を下記の計算式から求
めた。尚、試験は５連１区５頭制で行った。

【００７７】 死虫率（％）＝（死虫数／放虫数）×１００

【００７８】結果を表４に示した。 表４：Ｅ．ｃｏｌｉ：ＤＨ５α（ｐＢＮ１４１）発現蛋
白質のカイコガ（Bombyx mori）３齢２日目幼虫に対す
る殺虫活性

【００７９】

【００８０】

【発明の効果】本発明のＮ１４１結晶蛋白質は、鱗翅目
昆虫のみでなく鞘翅目昆虫例えばドウガネブイブイ（An
omala cuprea）に対しても活性を有することから、殺虫
剤組成物としての有用性が期待される。

【００８１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３７５９ 配列の型：核酸 起源 生物名：バチルス・チューリンゲンシス・バー・ジャポ
ネンシス（Bacillusthuringiensis var. japonensis） 株名：Ｎ１４１ 配列 TTTTAAATAC ATTGGAGTGT AATAGACTGG TATTGGAGGA ACAAGTATGA ATCGAAATAA 60 TCAAAATGAA TATGAAGTTA TTGATGCCCC ACATTGTGGG TGTCCGGCAG ATGATGTTGT 120 AAAATATCCT TTGACAGATG ATCCGAATGC TGGATTGCAA AATATGAACT ATAAGGAATA 180 TTTACAAACG TATGGTGGAG ACTATACAGA TCCTCTTATT AATCCTAACT TATCTGTTAG 240 TGGAAAAGAT GTAATACAAG TTGGAATTAA TATTGTAGGG AGATTACTAA GCTTTTTTGG 300 ATTCCCCTTT TCTAGTCAAT GGGTTACTGT ATATACCTAT CTTTTAAACA GCTTGTGGCC 360 GGATGACGAG AATTCTGTAT GGGACGCTTT TATGGAGAGA GTAGAAGAAC TTATTGATCA 420 AAAAATCTCA GAAGCAGTAA AGGGTAGGGC ATTGGATGAC CTAACTGGAT TACAATATAA 480 TTATAATTTA TATGTAGAAG CATTAGATGA GTGGCTGAAT AGACCAAATG GCGCAAGGGC 540 ATCCTTAGTT TCTCAGCGAT TTAACATTTT AGATAGCCTA TTTACACAAT TTATGCCAAG 600 CTTTGGCTCT GGTCCTGGAA GTCAAAATTA TGCAACTATA TTACTTCCAG TATATGCACA 660 AGCAGCAAAC CTTCATTTGT TATTATTAAA AGATGCAGAC ATTTATGGAG CTAGATGGGG 720 GCTGAATCAA ACTCAAATAG ATCAATTCCA TTCTCGTCAA CAAAGCCTTA CTCAGACTTA 780 TACAAATCAT TGTGTTACTG CGTATAATGA TGGATTAGCG GAATTAAGAG GCACAACCGC 840 TGAGAGTTGG TTTAAATACA ATCAATATCG TAGAGAAATG ACTTTGACGG CAATGGATTT 900 AGTGGCATTA TTCCCATATT ATAATTTACG ACAATATCCA GATGGGACAA ATCCTCAACT 960 TACACGTGAG GTCTATACAG ATCCGATTGC ATTTGATCCA CTGGAACAAC CAACTACTCA 1020 ATTATGTCGA TCATGGTACA TTAACCCAGC TTTTCGAAAT CATTTGAATT TCTCTGTACT 1080 AGAAAATTCA TTGATTCGTC CCCCGCACCT TTTTGAAAGG TTAAGTAATT TGCAAATTTT 1140 AGTTAATTAC CAAACAAACG GTAGCGCTTG GCGTGGGTCA AGGGTAAGAT ACCATTATTT 1200 GCATAGTTCT ATAATACAGG AAAAAAGTTA CGGCCTCCTC AGTGATCCCG TTGGAGCTAA 1260 TATCAATGTT CAAAATAATG ATATTTATCA GATTATTTCG CAGGTTAGCA ATTTTGCTAG 1320 TCCTGTTGGC TCATCATATA GTGTTTGGGA CACTAACTTT TATTTGAGTT CAGGACAAGT 1380 AAGTGGGATT TCAGGATATA CACAGCAAGG TATACCAGCA GTTTGTCTTC AACAACGAAA 1440 TTCAACTGAT GAGTTACCAA GCTTAAATCC GGAAGGAGAT ATCATTAGAA ATTATAGTCA 1500 TAGGTTATCT CATATAACCC AATATCGTTT TCAAGCAACT CAAAGTGGTA GTCCATCAAC 1560 TGTTAGCGCA AATTTACCTA CTTGTGTATG GACGCATCGA GATGTGGACC TTGATAATAC 1620 CATTACTGCG AATCAAATTA CACAACTACC ATTAGTAAAG GCATATGAGC TAAGTAGTGG 1680 TGCTACTGTC GTGAAAGGTC CAGGATTCAC AGGAGGAGAT GTAATCCGAA GAACAAATAC 1740 TGGTGGATTC GGAGCAATAA GGGTGTCGGT CACTGGACCG CTAACACAAC GATATCGCAT 1800 AAGGTTCCGT TATGCTTCGA CAATAGATTT TGATTTCTTT GTAACACGTG GAGGAACTAC 1860 TATAAATAAT TTTAGATTTA CACGTACAAT GAACAGGGGA CAGGAATCAA GATATGAATC 1920 CTATCGTACT GTAGAGTTTA CAACTCCTTT TAACTTTACA CAAAGTCAAG ATATAATTCG 1980 AACATCTATC CAGGGACTTA GTGGAAATGG GGAAGTATAC CTTGATAGAA TTGAAATCAT 2040 CCCTGTGAAC CCGGCACGAG AAGCAGAAGA GGATTTAGAA GCAGCGAAGA AAGCGGCTAG 2100 GCAGAACTTG TTTACACGTA CAAGGGACGG ATTACAGGTA AATGTGACAG ATTATCAAGT 2160 GGACCAAGCG GCAAATTTAG TGTCATGCTT ATCCGATGAA CAATATGGGC ATGACAAAAA 2220 GATGTTATTG GAAGCGGTAA GAGCGGCAAA ACGCCTCAGC CGCGAACGCA ACTTACTTCA 2280 AGATCCAGAT TTTAATACAA TCAATAGTAC AGAAGAGAAT GGCTGGAAGG CAAGTAACGG 2340 TGTTACTATT AGCGAGGGCG GTCCATTCTT TAAAGGTCGT GCACTTCAGT TAGCAAGCGC 2400 AAGAGAAAAT TATCCAACAT ACATTTATCA AAAAGTAGAT GCATCGGTGT TAAAGCCTTA 2460 TACACGCTAT AGACTGGATG GGTTCGTGAA GAGTAGTCAA GATTTAGAAA TTGATCTCAT 2520 TCACTATCAT AAAGTCCATC TTGTGAAAAA TGTACCAGAT AATTTAGTAT CCGATACTTA 2580 CTCGGATGGT TCTTGCAGTG GAATGAATCG ATGTGAGGAA CAACAGATGG TAAATGCGCA 2640 ACTGGAAACA GAACATCATC ATCCGATGGA TTGCTGTGAA GCGGCTCAAA CACATGAGTT 2700 TTCTTCCTAT ATTAATACAG GGGATCTAAA TGCAAGTGTA GATCAGGGCA TTTGGGTTGT 2760 ATTAAAAGTT CGAACAACAG ATGGGTATGC GACGTTAGGA AATCTTGAAT TGGTAGAGGT 2820 TGGGCCATTA TCGGGTGAAT CTCTAGAACG GGAACAAAGA GATAATGCGA AATGGAATGC 2880 AGAGCTAGGA AGAAAACGTG CAGAAATAGA TCGTGTGTAT TTAGCTGCGA AACAAGCAAT 2940 TAATCATCTG TTTGTAGACT ATCAAGATCA ACAATTAAAT CCAGAAATTG GGCTAGCAGA 3000 AATTAATGAA GCTTCAAATC TTGTAGAGTC AATTTCGGGT GTATATAGTG ATACACTATT 3060 ACAGATTCCT GGGATTAACT ACGAAATTTA CACAGAGTTA TCCGATCGCT TACAACAAGC 3120 ATCGTATCTG TATACGTCTC GAAATGCGGT GCAAAATGGA GACTTTAACA GTGGTCTAGA 3180 TAGTTGGAAT ACAACTACGG ATGCATCGGT TCAGCAAGAT GGCAATATGC ATTTCTTAGT 3240 TCTTTCGCAT TGGGATGCAC AAGTTTCTCA ACAATTGAGA GTAAATCCGA ATTGTAAGTA 3300 TGTCTTACGT GTGACAGCAA GAAAAGTAGG AGGCGGAGAT GGATACGTCA CAATCCGAGA 3360 TGGCGCTCAT CACCAAGAAA CTCTTACATT TAATGCATGT GACTACGATG TAAATGGTAC 3420 GTATGTCAAT GACAATTCGT ATATAACAGA AGAAGTGGTA TTCTACCCAG AGACAAAACA 3480 TATGTGGGTA GAGGTGAGTG AATCCGAAGG TTCATTCTAT ATAGACAGTA TTGAGTTTAT 3540 TGAAACACAA GAGTAGAAGA GGGGGATCCT AACGTATAGC AACTATGAGA GGATACTCCG 3600 TACAAACAAA GATTAAAAAA AGGTAAAATG AATAGAACCC CCTACTGGTA GAAGGTCTGG 3660 TAGGGGGTTC TTACATGAAA AAATGTAGCT GTTTACTAAG GTATATAAAA AACAGCATAT 3720 TTGATAGAAA AAAATGAGTA CCTTATAAAG AAAGAATTC 3759

【００８２】配列番号：２ 配列の長さ：１１６９ 配列の型：アミノ酸 配列 Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Val Ile Asp Ala Pro 5 10 15 His Cys Gly Cys Pro Ala Asp Asp Val Val Lys Tyr Pro Leu Thr 20 25 30 Asp Asp Pro Asn Ala Gly Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr 35 40 45 Leu Gln Thr Tyr Gly Gly Asp Tyr Thr Asp Pro Leu Ile Asn Pro 50 55 60 Asn Leu Ser Val Ser Gly Lys Asp Val Ile Gln Val Gly Ile Asn 65 70 75 Ile Val Gly Arg Leu Leu Ser Phe Phe Gly Phe Pro Phe Ser Ser 80 85 90 Gln Trp Val Thr Val Tyr Thr Tyr Leu Leu Asn Ser Leu Trp Pro 95 100 105 Asp Asp Glu Asn Ser Val Trp Asp Ala Phe Met Glu Arg Val Glu 110 115 120 Glu Leu Ile Asp Gln Lys Ile Ser Glu Ala Val Lys Gly Arg Ala 125 130 135 Leu Asp Asp Leu Thr Gly Leu Gln Tyr Asn Tyr Asn Leu Tyr Val 140 145 150 Glu Ala Leu Asp Glu Trp Leu Asn Arg Pro Asn Gly Ala Arg Ala 155 160 165 Ser Leu Val Ser Gln Arg Phe Asn Ile Leu Asp Ser Leu Phe Thr 170 175 180 Gln Phe Met Pro Ser Phe Gly Ser Gly Pro Gly Ser Gln Asn Tyr 185 190 195 Ala Thr Ile Leu Leu Pro Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His 200 205 210 Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Asp Ile Tyr Gly Ala Arg Trp Gly 215 220 225 Leu Asn Gln Thr Gln Ile Asp Gln Phe His Ser Arg Gln Gln Ser 230 235 240 Leu Thr Gln Thr Tyr Thr Asn His Cys Val Thr Ala Tyr Asn Asp 245 250 255 Gly Leu Ala Glu Leu Arg Gly Thr Thr Ala Glu Ser Trp Phe Lys 260 265 270 Tyr Asn Gln Tyr Arg Arg Glu Met Thr Leu Thr Ala Met Asp Leu 275 280 285 Val Ala Leu Phe Pro Tyr Tyr Asn Leu Arg Gln Tyr Pro Asp Gly 290 295 300 Thr Asn Pro Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Ala 305 310 315 Phe Asp Pro Leu Glu Gln Pro Thr Thr Gln Leu Cys Arg Ser Trp 320 325 330 Tyr Ile Asn Pro Ala Phe Arg Asn His Leu Asn Phe Ser Val Leu 335 340 345 Glu Asn Ser Leu Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Ser 350 355 360 Asn Leu Gln Ile Leu Val Asn Tyr Gln Thr Asn Gly Ser Ala Trp 365 370 375 Arg Gly Ser Arg Val Arg Tyr His Tyr Leu His Ser Ser Ile Ile 380 385 390 Gln Glu Lys Ser Tyr Gly Leu Leu Ser Asp Pro Val Gly Ala Asn 395 400 405 Ile Asn Val Gln Asn Asn Asp Ile Tyr Gln Ile Ile Ser Gln Val 410 415 420 Ser Asn Phe Ala Ser Pro Val Gly Ser Ser Tyr Ser Val Trp Asp 425 430 435 Thr Asn Phe Tyr Leu Ser Ser Gly Gln Val Ser Gly Ile Ser Gly 440 445 450 Tyr Thr Gln Gln Gly Ile Pro Ala Val Cys Leu Gln Gln Arg Asn 455 460 465 Ser Thr Asp Glu Leu Pro Ser Leu Asn Pro Glu Gly Asp Ile Ile 470 475 480 Arg Asn Tyr Ser His Arg Leu Ser His Ile Thr Gln Tyr Arg Phe 485 490 495 Gln Ala Thr Gln Ser Gly Ser Pro Ser Thr Val Ser Ala Asn Leu 500 505 510 Pro Thr Cys Val Trp Thr His Arg Asp Val Asp Leu Asp Asn Thr 515 520 525 Ile Thr Ala Asn Gln Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Tyr 530 535 540 Glu Leu Ser Ser Gly Ala Thr Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr 545 550 555 Gly Gly Asp Val Ile Arg Arg Thr Asn Thr Gly Gly Phe Gly Ala 560 565 570 Ile Arg Val Ser Val Thr Gly Pro Leu Thr Gln Arg Tyr Arg Ile 575 580 585 Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Thr Ile Asp Phe Asp Phe Phe Val Thr 590 595 600 Arg Gly Gly Thr Thr Ile Asn Asn Phe Arg Phe Thr Arg Thr Met 605 610 615 Asn Arg Gly Gln Glu Ser Arg Tyr Glu Ser Tyr Arg Thr Val Glu 620 625 630 Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Thr Gln Ser Gln Asp Ile Ile Arg 635 640 645 Thr Ser Ile Gln Gly Leu Ser Gly Asn Gly Glu Val Tyr Leu Asp 650 655 660 Arg Ile Glu Ile Ile Pro Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu 665 670 675 Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Ala Arg Gln Asn Leu Phe Thr 680 685 690 Arg Thr Arg Asp Gly Leu Gln Val Asn Val Thr Asp Tyr Gln Val 695 700 705 Asp Gln Ala Ala Asn Leu Val Ser Cys Leu Ser Asp Glu Gln Tyr 710 715 720 Gly His Asp Lys Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Ala Lys 725 730 735 Arg Leu Ser Arg Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Asn 740 745 750 Thr Ile Asn Ser Thr Glu Glu Asn Gly Trp Lys Ala Ser Asn Gly 755 760 765 Val Thr Ile Ser Glu Gly Gly Pro Phe Phe Lys Gly Arg Ala Leu 770 775 780 Gln Leu Ala Ser Ala Arg Glu Asn Tyr Pro Thr Tyr Ile Tyr Gln 785 790 795 Lys Val Asp Ala Ser Val Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu 800 805 810 Asp Gly Phe Val Lys Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ile Asp Leu Ile 815 820 825 His Tyr His Lys Val His Leu Val Lys Asn Val Pro Asp Asn Leu 830 835 840 Val Ser Asp Thr Tyr Ser Asp Gly Ser Cys Ser Gly Met Asn Arg 845 850 855 Cys Glu Glu Gln Gln Met Val Asn Ala Gln Leu Glu Thr Glu His 860 865 870 His His Pro Met Asp Cys Cys Glu Ala Ala Gln Thr His Glu Phe 875 880 885 Ser Ser Tyr Ile Asn Thr Gly Asp Leu Asn Ala Ser Val Asp Gln 890 895 900 Gly Ile Trp Val Val Leu Lys Val Arg Thr Thr Asp Gly Tyr Ala 905 910 915 Thr Leu Gly Asn Leu Glu Leu Val Glu Val Gly Pro Leu Ser Gly 920 925 930 Glu Ser Leu Glu Arg Glu Gln Arg Asp Asn Ala Lys Trp Asn Ala 935 940 945 Glu Leu Gly Arg Lys Arg Ala Glu Ile Asp Arg Val Tyr Leu Ala 950 955 960 Ala Lys Gln Ala Ile Asn His Leu Phe Val Asp Tyr Gln Asp Gln 965 970 975 Gln Leu Asn Pro Glu Ile Gly Leu Ala Glu Ile Asn Glu Ala Ser 980 985 990 Asn Leu Val Glu Ser Ile Ser Gly Val Tyr Ser Asp Thr Leu Leu 995 1000 1005 Gln Ile Pro Gly Ile Asn Tyr Glu Ile Tyr Thr Glu Leu Ser Asp 1010 1015 1020 Arg Leu Gln Gln Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Ser Arg Asn Ala Val 1025 1030 1035 Gln Asn Gly Asp Phe Asn Ser Gly Leu Asp Ser Trp Asn Thr Thr 1040 1045 1050 Thr Asp Ala Ser Val Gln Gln Asp Gly Asn Met His Phe Leu Val 1055 1060 1065 Leu Ser His Trp Asp Ala Gln Val Ser Gln Gln Leu Arg Val Asn 1070 1075 1080 Phe Asn Cys Lys Tyr Val Leu Arg Val Thr Ala Arg Lys Val Gly 1085 1090 1095 Gly Gly Asp Gly Tyr Val Thr Ile Arg Asp Gly Ala His His Gln 1100 1105 1110 Glu Thr Leu Thr Phe Asn Ala Cys Asp Tyr Asp Tyr Asn Gly Thr 1115 1120 1125 Tyr Val Asn Asp Asn Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Val Val Phe Tyr 1130 1135 1140 Pro Glu Thr Lys His Met Trp Val Glu Val Ser Glu Ser Glu Gly 1145 1150 1155 Ser Phe Tyr Ile Asp Ser Ile Glu Phe Ile Glu Thr Gln Glu 1160 1165 1169

【図面の簡単な説明】

【図１】バチルス・チューリンゲンシス・バー・ジャポ
ネンシスＮ１４１株の電子顕微鏡写真である。

【図２】バチルス・チューリンゲンシス・バー・ジャポ
ネンシスＮ１４１遺伝子とバチルス・チューリンゲンシ
ス・ブイブイ遺伝子各々に対応するアミノ酸配列との相
同性をＮ−末端から６６２番目のアミノ酸配列を比較し
た図である。

【図３】バチルス・チューリンゲンシス・バー・ジャポ
ネンシスＮ１４１遺伝子とベクターの連結図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｋ 14/325 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/325 Ｃ１２Ｎ 1/20 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ 8828−4Ｂ Ｅ 1/21 8828−4Ｂ 1/21 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 三宅 敏郎 埼玉県南埼玉郡白岡町大字白岡1470 日産 化学工業株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 新関 昌続 埼玉県南埼玉郡白岡町大字白岡1470 日産 化学工業株式会社生物科学研究所内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチルス・チューリンゲンシス・バー・
   ジャポネンシスＮ１４１株。
2. 【請求項２】 請求項１記載のバチルス・チューリンゲ
   ンシス・バー・ジャポネンシスＮ１４１株により産生さ
   れた結晶性毒素蛋白質。
3. 【請求項３】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
   蛋白質。
4. 【請求項４】 請求項３記載の蛋白質のアミノ酸配列に
   おいて１又は複数のアミノ酸が付加、欠失又は置換され
   ており、且つ殺虫活性を示すアミノ酸配列を有する蛋白
   質。
5. 【請求項５】 請求項２記載の蛋白質をコードしている
   塩基配列を含んでなるＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項４記載の蛋白質をコードしている
   塩基配列を含んでなるＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列番号１で示される塩基配列を有する
   ＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項１記載のバチルス・チューリンゲ
   ンシス・バー・ジャポネンシスＮ１４１株及び／又は請
   求項２記載の蛋白質を含むことを特徴とする有害生物防
   除剤。
9. 【請求項９】 請求項５記載の遺伝子を用いて形質転換
   されたことを特徴とする微生物。
10. 【請求項１０】 請求項５記載の遺伝子を用いて形質転
    換されたことを特徴とする植物又はその種子。
11. 【請求項１１】 請求項２記載の蛋白質を有害生物に適
    用することにより、該有害生物により引き起こされる被
    害から植物を保護する方法。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載の有害生物が鱗翅目又
    は鞘翅目害虫である植物防除法。