JPH08228785A - 生存運動ニューロン（ｓｍｎ）遺伝子：脊髄筋萎縮 - Google Patents
生存運動ニューロン（ｓｍｎ）遺伝子：脊髄筋萎縮Info
- Publication number
- JPH08228785A JPH08228785A JP7306349A JP30634995A JPH08228785A JP H08228785 A JPH08228785 A JP H08228785A JP 7306349 A JP7306349 A JP 7306349A JP 30634995 A JP30634995 A JP 30634995A JP H08228785 A JPH08228785 A JP H08228785A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- sequence
- smn
- dna
- sequences
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 172
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 title description 5
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 title description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 title description 2
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 claims abstract description 94
- 101150113275 Smn gene Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 201000010901 lateral sclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 208000032319 Primary lateral sclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 206010046298 Upper motor neurone lesion Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 51
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 49
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 23
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 101100203487 Mus musculus Smn1 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101100148113 Mus musculus Snrpn gene Proteins 0.000 claims description 11
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 11
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 208000022074 proximal spinal muscular atrophy Diseases 0.000 claims description 7
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 4
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000006111 contracture Diseases 0.000 claims description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 3
- 206010062575 Muscle contracture Diseases 0.000 claims description 3
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000010415 tropism Effects 0.000 claims description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 3
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 abstract description 12
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 abstract description 8
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 36
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 28
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 18
- 101000617738 Homo sapiens Survival motor neuron protein Proteins 0.000 description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 16
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 14
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 12
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 12
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 11
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010023201 Joint contracture Diseases 0.000 description 4
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 229920000147 Styrene maleic anhydride Polymers 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 4
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 4
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000007379 Muscle Hypotonia Diseases 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000025150 arthrogryposis multiplex congenita Diseases 0.000 description 2
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 2
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150112388 cms1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 230000002638 denervation Effects 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037748 distal type 1A arthrogryposis Diseases 0.000 description 2
- 238000002567 electromyography Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000001964 muscle biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 101150029062 15 gene Proteins 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100459438 Caenorhabditis elegans nac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 208000004929 Facial Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010021118 Hypotonia Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010027543 Micrognathia Diseases 0.000 description 1
- 208000002598 Micrognathism Diseases 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- WGZDBVOTUVNQFP-UHFFFAOYSA-N N-(1-phthalazinylamino)carbamic acid ethyl ester Chemical compound C1=CC=C2C(NNC(=O)OCC)=NN=CC2=C1 WGZDBVOTUVNQFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001184 Oligohydramnios Diseases 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 208000032225 Proximal spinal muscular atrophy type 1 Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 208000036826 VIIth nerve paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 210000002226 anterior horn cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 208000037873 arthrodesis Diseases 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000002594 corticospinal effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N delta1-THC Chemical compound C1=C(C)CC[C@H]2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3[C@@H]21 CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 229920003045 dextran sodium sulfate Polymers 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920006284 nylon film Polymers 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008529 pathological progression Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001144 postural effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 208000032471 type 1 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は染色体５−ＳＭＡ（脊髄筋萎縮）決定遺伝子で
あるヒト生存運動ニューロン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子の
発見に関連する。本発明は更に、ＳＭＮ遺伝子をコード
するヌクレオチド配列及び対応のアミノ酸配列、ＳＭＮ
タンパク質をコードする遺伝子又はこの遺伝子に対応す
るＤＮＡ配列を含むベクター、並びにＳＭＮ遺伝子又は
この遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含む形質転換体に関
連する。
あるヒト生存運動ニューロン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子の
発見に関連する。本発明は更に、ＳＭＮ遺伝子をコード
するヌクレオチド配列及び対応のアミノ酸配列、ＳＭＮ
タンパク質をコードする遺伝子又はこの遺伝子に対応す
るＤＮＡ配列を含むベクター、並びにＳＭＮ遺伝子又は
この遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含む形質転換体に関
連する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は染色体５−ＳＭＡ
（脊髄筋萎縮）決定遺伝子であるヒト生存運動ニューロ
ン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子の発見に関連する。本発明は
更に、ＳＭＮ遺伝子をコードするヌクレオチド配列及び
対応のアミノ酸配列、ＳＭＮタンパク質をコードする遺
伝子又はこの遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含むベクタ
ー、並びにＳＭＮ遺伝子又はこの遺伝子に対応するＤＮ
Ａ配列を含む形質転換体に関連する。
（脊髄筋萎縮）決定遺伝子であるヒト生存運動ニューロ
ン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子の発見に関連する。本発明は
更に、ＳＭＮ遺伝子をコードするヌクレオチド配列及び
対応のアミノ酸配列、ＳＭＮタンパク質をコードする遺
伝子又はこの遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含むベクタ
ー、並びにＳＭＮ遺伝子又はこの遺伝子に対応するＤＮ
Ａ配列を含む形質転換体に関連する。
【０００２】より詳しくは、本発明は知覚の変化を伴う
又は伴わない筋肉の弱体化の症状を有する運動ニューロ
ン障害、例えば筋萎縮性外側硬化症（ＡＬＳ）、脊髄筋
萎縮（ＳＭＡ）、一次外側硬化症（ＰＬＣ）、先天性多
発性関節拘縮症（ＡＭＣ）等を検査するための手段及び
方法に関連する。かかる運動ニューロン障害を検査する
ための方法は、限定することなく、ＰＣＲ技術における
特異的なＤＮＡプライマーの利用、ハイブリダイゼーシ
ョンプローブの利用、並びにポリクローナル及びモノク
ローナル抗体の利用を含む。
又は伴わない筋肉の弱体化の症状を有する運動ニューロ
ン障害、例えば筋萎縮性外側硬化症（ＡＬＳ）、脊髄筋
萎縮（ＳＭＡ）、一次外側硬化症（ＰＬＣ）、先天性多
発性関節拘縮症（ＡＭＣ）等を検査するための手段及び
方法に関連する。かかる運動ニューロン障害を検査する
ための方法は、限定することなく、ＰＣＲ技術における
特異的なＤＮＡプライマーの利用、ハイブリダイゼーシ
ョンプローブの利用、並びにポリクローナル及びモノク
ローナル抗体の利用を含む。
【０００３】更にもっと詳しくは、本発明はヒトＳＭＮ
遺伝子もしくはその遺伝子の一部、ｃＤＮＡ、オリゴヌ
クレオチド又はそれによりコードされたタンパク質もし
くはその一部の治療における利用に関連し、その治療は
かかるヒトＳＭＮ遺伝子もしくはその遺伝子の一部、ｃ
ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド又はそれによりコードされ
たタンパク質もしくはその一部を骨髄細胞を含む体細胞
に輸送するための無害な担体を担う操作されたウィルス
又はベクターに、必要ならばかかるヒトＳＭＮ遺伝子も
しくはその遺伝子の一部、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチ
ド又はそれによりコードされたタンパク質もしくはその
一部を挿入することによる。
遺伝子もしくはその遺伝子の一部、ｃＤＮＡ、オリゴヌ
クレオチド又はそれによりコードされたタンパク質もし
くはその一部の治療における利用に関連し、その治療は
かかるヒトＳＭＮ遺伝子もしくはその遺伝子の一部、ｃ
ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド又はそれによりコードされ
たタンパク質もしくはその一部を骨髄細胞を含む体細胞
に輸送するための無害な担体を担う操作されたウィルス
又はベクターに、必要ならばかかるヒトＳＭＮ遺伝子も
しくはその遺伝子の一部、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチ
ド又はそれによりコードされたタンパク質もしくはその
一部を挿入することによる。
【０００４】本発明は更にＳＭＮ遺伝子に対して誘導さ
れた抗原配列に関連する。
れた抗原配列に関連する。
【０００５】運動ニューロン障害の治療のための手段を
提供するため、本発明はＳＭＮ遺伝子によりコードされ
るタンパク質にも関連する。
提供するため、本発明はＳＭＮ遺伝子によりコードされ
るタンパク質にも関連する。
【０００６】本発明は更にマウスＳＭＮ遺伝子、このマ
ウスＳＭＮ遺伝子をコードするヌクレオチド配列及び対
応のアミノ酸配列の単離に関連する。このＳＭＮ遺伝子
全体又はその一部を過剰発現する遺伝子導入マウスモデ
ル及び突然変異したＳＭＮ遺伝子との相同的組換により
生成された遺伝子導入マウスモデルも記述する。
ウスＳＭＮ遺伝子をコードするヌクレオチド配列及び対
応のアミノ酸配列の単離に関連する。このＳＭＮ遺伝子
全体又はその一部を過剰発現する遺伝子導入マウスモデ
ル及び突然変異したＳＭＮ遺伝子との相同的組換により
生成された遺伝子導入マウスモデルも記述する。
【０００７】
【従来の技術】変性運動ニューロン障害は３つの主要カ
デゴリーに分類できる。筋萎縮性外側硬化症又はＡＬ
Ｓ；運動ニューロン障害、例えば脊髄筋萎縮（ＳＭ
Ａ）；更には一次外側硬化症（ＰＬＳ）の如くのその他
の変性障害に関係する運動ニューロン障害。
デゴリーに分類できる。筋萎縮性外側硬化症又はＡＬ
Ｓ；運動ニューロン障害、例えば脊髄筋萎縮（ＳＭ
Ａ）；更には一次外側硬化症（ＰＬＳ）の如くのその他
の変性障害に関係する運動ニューロン障害。
【０００８】筋萎縮性外側硬化症（ＡＬＳ）は進行性の
ニューロン障害の最もよく遭遇する形態であり、そして
それは特徴的な中年の障害である。この障害は、大脳皮
質及び脊髄の前角の両者における運動ニューロンと、脳
幹の一部の運動核の中のその同族体との進行性欠損を特
徴とする。それは一般に上部及び下部運動ニューロンに
影響を及ぼすが、しかしながらその変異体は主に特定の
運動ニューロンのサブセット、特に病気の経過における
初期のニューロンのサブセットのみに関与しうる。
ニューロン障害の最もよく遭遇する形態であり、そして
それは特徴的な中年の障害である。この障害は、大脳皮
質及び脊髄の前角の両者における運動ニューロンと、脳
幹の一部の運動核の中のその同族体との進行性欠損を特
徴とする。それは一般に上部及び下部運動ニューロンに
影響を及ぼすが、しかしながらその変異体は主に特定の
運動ニューロンのサブセット、特に病気の経過における
初期のニューロンのサブセットのみに関与しうる。
【０００９】ＡＬＳは冒された筋肉の疲労及び痙攣を伴
う非対称的な虚弱化の発症により明確となる。その虚弱
化には目に見えるるいそうが伴い、そして筋肉の萎縮が
進展し、そして時間が経過すると、かむ、のむ、並びに
顔面及び舌の運動の筋肉を含む全ての領域の対称性分布
に障害が及ぶまで一層多くの筋肉が関与し始める。ＡＬ
Ｓを有する患者の５０％が障害の発症から３〜５年で死
亡することが予測されうる。現在、ＡＬＳの病理進行に
効果のある処置はない。
う非対称的な虚弱化の発症により明確となる。その虚弱
化には目に見えるるいそうが伴い、そして筋肉の萎縮が
進展し、そして時間が経過すると、かむ、のむ、並びに
顔面及び舌の運動の筋肉を含む全ての領域の対称性分布
に障害が及ぶまで一層多くの筋肉が関与し始める。ＡＬ
Ｓを有する患者の５０％が障害の発症から３〜５年で死
亡することが予測されうる。現在、ＡＬＳの病理進行に
効果のある処置はない。
【００１０】脊髄筋萎縮（ＳＭＡ）は、筋肉の萎縮にか
かわる進行性の対称的四肢及び体幹麻痺を招いてしまう
脊髄の前角細胞の変性を特徴とする。ＳＭＡは二番目に
致死的な、嚢胞性線維症後の常染色体劣性障害である
（６０００人の新生児のうち１人）。子供のＳＭＡは一
般に、発症年齢及び臨床経過に基づいて３つの臨床グル
ープに副分類される。急性のウェルドニグ・ホフマン
(Werdnig-Hoffmann) 病（Ｉ型）は、重症の全身化筋肉
虚弱並びに誕生時及び生後３ヶ月内での緊張低下を特徴
とする。呼吸困難による死亡が、最初の２年以内に通常
起こる。この障害は中間（II型）及び若年(III型、クー
ゲルベルグ−ウェランダー (Kugelberg-Welander) 障
害）形態とは区別できる。II型の子供は座ることはでき
るが、立つ又は助けなしで歩行することができず、２才
以降に起こる。基礎となる生化学的欠陥はわかっていな
いままである。更に、時折りＳＭＡIVと呼ばれる、ゆっ
くりと進行する成人のＳＭＡ形態があることも知られて
いる。
かわる進行性の対称的四肢及び体幹麻痺を招いてしまう
脊髄の前角細胞の変性を特徴とする。ＳＭＡは二番目に
致死的な、嚢胞性線維症後の常染色体劣性障害である
（６０００人の新生児のうち１人）。子供のＳＭＡは一
般に、発症年齢及び臨床経過に基づいて３つの臨床グル
ープに副分類される。急性のウェルドニグ・ホフマン
(Werdnig-Hoffmann) 病（Ｉ型）は、重症の全身化筋肉
虚弱並びに誕生時及び生後３ヶ月内での緊張低下を特徴
とする。呼吸困難による死亡が、最初の２年以内に通常
起こる。この障害は中間（II型）及び若年(III型、クー
ゲルベルグ−ウェランダー (Kugelberg-Welander) 障
害）形態とは区別できる。II型の子供は座ることはでき
るが、立つ又は助けなしで歩行することができず、２才
以降に起こる。基礎となる生化学的欠陥はわかっていな
いままである。更に、時折りＳＭＡIVと呼ばれる、ゆっ
くりと進行する成人のＳＭＡ形態があることも知られて
いる。
【００１１】一次外側硬化症（ＰＬＳ）はＡＬＳの変種
であり、そして高齢の散在性障害として認められる。Ｐ
ＬＳにおける神経病理学においては皮質脊髄（ピラミッ
ド）管の変性があり、これは脳幹レベルにおいてはほぼ
正常であるが、それらが脊髄を下ると萎縮性が高まる。
下肢は初期において、且つ最もひどく冒される。
であり、そして高齢の散在性障害として認められる。Ｐ
ＬＳにおける神経病理学においては皮質脊髄（ピラミッ
ド）管の変性があり、これは脳幹レベルにおいてはほぼ
正常であるが、それらが脊髄を下ると萎縮性が高まる。
下肢は初期において、且つ最もひどく冒される。
【００１２】先天性多発性関節拘縮症（ＡＭＣ）は先天
的な関節固定（新生児３０００人のうちの１人）を特徴
とし、子宮内での胎児運動低下に由来するよくある症状
である(Stern, W.G., JAMA, 81：1507〜1510 (1923) ；
Hall, J.G., Clin.Orthop. 194 ：44-53 (1985)) 。ＡＭ
Ｃは羊水過少症か、又は中枢神経系、骨格筋もしくは脊
髄にかかわる様々な障害のいづれかを原因とする。神経
変性及び神経細胞侵食は又は前角において生ずるため、
神経原起源のＡＭＣは急性脊髄筋萎縮、即ちＩ型ＳＭＡ
ウェルドニグ−ホフマン障害に関連しうるものと仮定さ
れている（Bander, B.Q., Hum.Pathol. , (1980)；117
：656-672)。
的な関節固定（新生児３０００人のうちの１人）を特徴
とし、子宮内での胎児運動低下に由来するよくある症状
である(Stern, W.G., JAMA, 81：1507〜1510 (1923) ；
Hall, J.G., Clin.Orthop. 194 ：44-53 (1985)) 。ＡＭ
Ｃは羊水過少症か、又は中枢神経系、骨格筋もしくは脊
髄にかかわる様々な障害のいづれかを原因とする。神経
変性及び神経細胞侵食は又は前角において生ずるため、
神経原起源のＡＭＣは急性脊髄筋萎縮、即ちＩ型ＳＭＡ
ウェルドニグ−ホフマン障害に関連しうるものと仮定さ
れている（Bander, B.Q., Hum.Pathol. , (1980)；117
：656-672)。
【００１３】ＡＬＳ，ＡＭＣ，ＳＭＡ及びＰＬＳについ
ての検査及び臨床診断は筋肉生検にかなり制約されてい
る。診断は医師により筋電計（ＥＭＧ）により行われ
る。例えば、ＳＭＡを診断するための臨床基準はClinic
al Criteria International SMA Consortium (Munsal
T.L., Neuromuscular Disorders, Vol.1, p81 (1991))
に記載されている。しかしながら、運動神経障害を検査
するための様々な検査の複雑さのため、臨床医は通常、
上記の検査法を利用する前に、構造的損傷、感染症、中
毒、代謝障害及び遺伝的生化学的障害の如くの様々なカ
テゴリーの障害を省こうとする。
ての検査及び臨床診断は筋肉生検にかなり制約されてい
る。診断は医師により筋電計（ＥＭＧ）により行われ
る。例えば、ＳＭＡを診断するための臨床基準はClinic
al Criteria International SMA Consortium (Munsal
T.L., Neuromuscular Disorders, Vol.1, p81 (1991))
に記載されている。しかしながら、運動神経障害を検査
するための様々な検査の複雑さのため、臨床医は通常、
上記の検査法を利用する前に、構造的損傷、感染症、中
毒、代謝障害及び遺伝的生化学的障害の如くの様々なカ
テゴリーの障害を省こうとする。
【００１４】現在、いづれの上記の運動ニューロン障害
にとっての処置法もない。様々な複数の機械的な助けを
含む基本的なリハビリテーション的手段が、このような
障害を有する患者がその不具に打ち勝つ助けとなること
があるが、しかし往々にしてかかる患者が長く生存する
には拘束的な呼吸補助システムを必要とする。
にとっての処置法もない。様々な複数の機械的な助けを
含む基本的なリハビリテーション的手段が、このような
障害を有する患者がその不具に打ち勝つ助けとなること
があるが、しかし往々にしてかかる患者が長く生存する
には拘束的な呼吸補助システムを必要とする。
【００１５】従って、本発明の目的はＳＭＡ障害の原因
となるＳＭＡ遺伝子を特性決定すること、及びＳＭＡ遺
伝子をベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファー
ジ、ＹＡＣベクターであって、ＳＭＮ遺伝子及びＳＭＮ
タンパク質を大量に生産させるようにする形質転換工程
において利用できうるものにクローニングすることにあ
る。
となるＳＭＡ遺伝子を特性決定すること、及びＳＭＡ遺
伝子をベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファー
ジ、ＹＡＣベクターであって、ＳＭＮ遺伝子及びＳＭＮ
タンパク質を大量に生産させるようにする形質転換工程
において利用できうるものにクローニングすることにあ
る。
【００１６】本発明の更なる別の観点は、ＡＭＣ，ＡＬ
Ｓ，ＳＭＡ及びＰＬＳの如くの運動ニューロン障害を有
する患者を検査及び診断するためのプライマー及びハイ
ブリダイゼーションプローブの利用にある。本発明の更
なる別の観点は、ＳＭＮ遺伝子もしくはその一部、又は
ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質もしくはそ
の一部の、ＡＭＣ，ＳＭＡ，ＡＬＳ及びＰＬＳ患者の如
くの障害、特に遺伝子障害を治す治療における利用にあ
る。
Ｓ，ＳＭＡ及びＰＬＳの如くの運動ニューロン障害を有
する患者を検査及び診断するためのプライマー及びハイ
ブリダイゼーションプローブの利用にある。本発明の更
なる別の観点は、ＳＭＮ遺伝子もしくはその一部、又は
ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質もしくはそ
の一部の、ＡＭＣ，ＳＭＡ，ＡＬＳ及びＰＬＳ患者の如
くの障害、特に遺伝子障害を治す治療における利用にあ
る。
【００１７】更なる別の観点において、本発明はＳＭＡ
患者におけるＳＭＮ遺伝子欠陥の検出のためのモノクロ
ーナル及びポリクローナル抗体を提供する。
患者におけるＳＭＮ遺伝子欠陥の検出のためのモノクロ
ーナル及びポリクローナル抗体を提供する。
【００１８】本発明の別の観点は、マウスにおけるＳＭ
Ａ遺伝子の特性決定を提供する。遺伝子導入マウスのモ
デルであって、ＳＭＮ遺伝子全体又はその一部分を過剰
発現するもの、又は突然変異したマウスＳＭＮ遺伝子に
よる相同的組換によりＳＭＮ遺伝子を異常に生産する遺
伝子導入マウスも述べる。
Ａ遺伝子の特性決定を提供する。遺伝子導入マウスのモ
デルであって、ＳＭＮ遺伝子全体又はその一部分を過剰
発現するもの、又は突然変異したマウスＳＭＮ遺伝子に
よる相同的組換によりＳＭＮ遺伝子を異常に生産する遺
伝子導入マウスも述べる。
【００１９】本発明の更なる観点に従うと、運動ニュー
ロン障害の治療はＳＭＮ遺伝子によりコードされるタン
パク質を包括しうる。
ロン障害の治療はＳＭＮ遺伝子によりコードされるタン
パク質を包括しうる。
【００２０】これら及びその他の目的は本発明の概要、
好適な態様の説明及び請求の範囲により明らかとなる。
好適な態様の説明及び請求の範囲により明らかとなる。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
のヒト生存運動ニューロン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子、そ
のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を提供することにある。
のヒト生存運動ニューロン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子、そ
のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を提供することにある。
【００２２】本発明の別の観点は新規のマウス生存運動
ニューロン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子、そのＤＮＡ配列及
びアミノ酸配列を提供することにある。
ニューロン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子、そのＤＮＡ配列及
びアミノ酸配列を提供することにある。
【００２３】本発明の更なる別の観点は、宿主微生物の
中で複製できて、大量のヒト又はマウスＳＭＮタンパク
質を供することのできるベクターの提供にある。
中で複製できて、大量のヒト又はマウスＳＭＮタンパク
質を供することのできるベクターの提供にある。
【００２４】本発明の別の観点は、脊髄筋萎縮及びその
他の運動ニューロン障害を検査及び診断するのに利用す
ることのできる特異的なＤＮＡ配列の提供にある。これ
らのＤＮＡ配列はＳＭＮ遺伝子配列、ＳＭＮ遺伝子配列
のトランケート又は突然変異バージョンを増幅及び検出
するため、又は前記配列の欠失を検出するために、ポリ
メラーゼ連鎖反応においてプライマーとして利用するこ
とができ、これによりＳＭＡ，ＡＭＣ及びその他の運動
ニューロン障害の診断ができる。
他の運動ニューロン障害を検査及び診断するのに利用す
ることのできる特異的なＤＮＡ配列の提供にある。これ
らのＤＮＡ配列はＳＭＮ遺伝子配列、ＳＭＮ遺伝子配列
のトランケート又は突然変異バージョンを増幅及び検出
するため、又は前記配列の欠失を検出するために、ポリ
メラーゼ連鎖反応においてプライマーとして利用するこ
とができ、これによりＳＭＡ，ＡＭＣ及びその他の運動
ニューロン障害の診断ができる。
【００２５】本発明の更なる別の観点は、ＳＭＮ遺伝子
全体もしくはその一部を過剰発現する遺伝子導入マウス
を提供し、又は突然変異されたマウスＳＭＮ遺伝子によ
る相同的組換によりＳＭＮ遺伝子を異常に生成する遺伝
子導入マウスも述べる。
全体もしくはその一部を過剰発現する遺伝子導入マウス
を提供し、又は突然変異されたマウスＳＭＮ遺伝子によ
る相同的組換によりＳＭＮ遺伝子を異常に生成する遺伝
子導入マウスも述べる。
【００２６】本発明者は、運動ニューロン障害に関与す
るＴ−ＢＣＤ５４１及びＣ−ＢＣＤ５４１と称する２種
の遺伝子を同定した。
るＴ−ＢＣＤ５４１及びＣ−ＢＣＤ５４１と称する２種
の遺伝子を同定した。
【００２７】Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子はＳＭＡ型の運動
ニューロン障害の原因であり、なぜならそれらの部分的
もしくは全体的欠損、突然変異又はその他の任意の改良
は、臨床的筋電図又は筋肉形態レベルでの病理状態を招
くに足りるからである。
ニューロン障害の原因であり、なぜならそれらの部分的
もしくは全体的欠損、突然変異又はその他の任意の改良
は、臨床的筋電図又は筋肉形態レベルでの病理状態を招
くに足りるからである。
【００２８】Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子はｃＤＮＡのレベ
ルでＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子とは異なり、なぜなら２個
のヌクレオチドが改良されているからである。にもかか
わらず、このＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子はコントロール及
び運動ニューロン障害に苦しむ患者における転写の際に
適正にプロセシングされないからである。このＣ−ＢＣ
Ｄ５４１遺伝子のゲノムＤＮＡは転写の際に適正にスプ
ライスされず、それ故異常な転写物である。Ｔ−ＢＣＤ
５４１及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のスプライシング間
での相違はこれらの遺伝子のイントロン配列における相
違に由来する。
ルでＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子とは異なり、なぜなら２個
のヌクレオチドが改良されているからである。にもかか
わらず、このＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子はコントロール及
び運動ニューロン障害に苦しむ患者における転写の際に
適正にプロセシングされないからである。このＣ−ＢＣ
Ｄ５４１遺伝子のゲノムＤＮＡは転写の際に適正にスプ
ライスされず、それ故異常な転写物である。Ｔ−ＢＣＤ
５４１及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のスプライシング間
での相違はこれらの遺伝子のイントロン配列における相
違に由来する。
【００２９】従って、本発明はヒトＳＭＮ遺伝子の構造
及び結合を更に特性決定し、これは長さ約２０kbであ
り、そして８本のイントロンにより分断された９本のエ
クソンより成ることがわかった。ヒトＳＭＮ遺伝子のヌ
クレオチド配列、アミノ酸配列及びエクソン−イントロ
ン境界を図１２に示す。全てのエクソン−イントロン境
界はその他のヒト遺伝子において見い出された共通配列
を示している。ポリアデニル化共通部位が停止コドンの
約５５０bp下流にある（図１２）。ＳＭＮ遺伝子の全イ
ントロン／エクソン構造は、ＳＭＡ障害又はその他の運
動ニューロン障害におけるＳＭＮ遺伝子突然変異の特性
決定を可能にする。
及び結合を更に特性決定し、これは長さ約２０kbであ
り、そして８本のイントロンにより分断された９本のエ
クソンより成ることがわかった。ヒトＳＭＮ遺伝子のヌ
クレオチド配列、アミノ酸配列及びエクソン−イントロ
ン境界を図１２に示す。全てのエクソン−イントロン境
界はその他のヒト遺伝子において見い出された共通配列
を示している。ポリアデニル化共通部位が停止コドンの
約５５０bp下流にある（図１２）。ＳＭＮ遺伝子の全イ
ントロン／エクソン構造は、ＳＭＡ障害又はその他の運
動ニューロン障害におけるＳＭＮ遺伝子突然変異の特性
決定を可能にする。
【００３０】本発明はまた、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子の
レベル又はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のレベルでの運動ニ
ューロン障害に関係するゲノム異常の検査のための手段
も規定する。
レベル又はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のレベルでの運動ニ
ューロン障害に関係するゲノム異常の検査のための手段
も規定する。
【００３１】
【課題を解決するための手段】本発明の遺伝子は、その
各々が下記の配列に対応するイントロン配列を含んで成
ることで更に規定されうる：Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子に
おいて、
各々が下記の配列に対応するイントロン配列を含んで成
ることで更に規定されうる：Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子に
おいて、
【００３２】
【化１】
【００３３】
【化２】
【００３４】Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子において、
【００３５】
【化３】
【００３６】
【化４】
【００３７】本発明の好適な態様において、本発明の遺
伝子はプローブとして用いる図４及び５の配列とストリ
ンジェンシー条件においてハイブリダイズできる。
伝子はプローブとして用いる図４及び５の配列とストリ
ンジェンシー条件においてハイブリダイズできる。
【００３８】上記の如く、本発明は更にＳＭＮ遺伝子の
変異体に関連し、この変異体は図２及び３の配列に対応
するｃＤＮＡ配列を有するＣ−ＢＣＤ５４１である。
変異体に関連し、この変異体は図２及び３の配列に対応
するｃＤＮＡ配列を有するＣ−ＢＣＤ５４１である。
【００３９】本発明はまた、上記の遺伝子のいづれかか
ら獲得できるかの如くのｃＤＮＡ配列に関連もする。か
かるｃＤＮＡ配列を図２及び３、並びに図４及び５に開
示する。これらのｃＤＮＡ配列は共に図１に記載のアミ
ノ酸配列を含んで成るタンパク質をコードすることがで
きる。
ら獲得できるかの如くのｃＤＮＡ配列に関連もする。か
かるｃＤＮＡ配列を図２及び３、並びに図４及び５に開
示する。これらのｃＤＮＡ配列は共に図１に記載のアミ
ノ酸配列を含んで成るタンパク質をコードすることがで
きる。
【００４０】かかるタンパク質をコードする能力にもか
かわらず、本発明者はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子がインビ
ボでこのタンパク質を生成できるか、又は転写の際の遺
伝子の異常なスプライシングに基づき有意義な量でそれ
を生成できないことを認識した。即ち、Ｃ−ＢＣＤ５４
１遺伝子の存在はインビボで、ＳＭＡ型の運動ニューロ
ン障害又はその他の運動ニューロン障害の原因たるＴ−
ＢＣＤ５４１遺伝子の欠陥（欠損、突然変異）を修復で
きない。
かわらず、本発明者はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子がインビ
ボでこのタンパク質を生成できるか、又は転写の際の遺
伝子の異常なスプライシングに基づき有意義な量でそれ
を生成できないことを認識した。即ち、Ｃ−ＢＣＤ５４
１遺伝子の存在はインビボで、ＳＭＡ型の運動ニューロ
ン障害又はその他の運動ニューロン障害の原因たるＴ−
ＢＣＤ５４１遺伝子の欠陥（欠損、突然変異）を修復で
きない。
【００４１】特定の態様において、本発明は図４及び５
の配列のヌクレオチド３４〜９１５を含んで成るヌクレ
オチド配列、又は図２及び３の配列のヌクレオチド３４
〜９１５を含んで成る配列にも関連する。
の配列のヌクレオチド３４〜９１５を含んで成るヌクレ
オチド配列、又は図２及び３の配列のヌクレオチド３４
〜９１５を含んで成る配列にも関連する。
【００４２】これらのヌクレオチド配列はそれぞれＴ−
ＢＣＤ５４１遺伝子及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子をコー
ドする配列に対応する。
ＢＣＤ５４１遺伝子及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子をコー
ドする配列に対応する。
【００４３】上記の遺伝子のイントロンも本明細書に含
ませた。特にイントロン６及び７はそれぞれ下記の配列
を有する：
ませた。特にイントロン６及び７はそれぞれ下記の配列
を有する：
【００４４】Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子について：
【００４５】
【化５】
【００４６】
【化６】
【００４７】Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子について：
【００４８】
【化７】
【００４９】
【化８】
【００５０】本発明は更に、ヌクレオチド配列であっ
て、少なくとも約９個のヌクレオチドを含んで成り、且
つ上記の配列を含んで成るか、又はオリゴヌクレオチド
を選定した後に決定されるハイブリダイゼーション条件
において上記の配列とハイブリダイズすることを特徴と
する配列を包括する。
て、少なくとも約９個のヌクレオチドを含んで成り、且
つ上記の配列を含んで成るか、又はオリゴヌクレオチド
を選定した後に決定されるハイブリダイゼーション条件
において上記の配列とハイブリダイズすることを特徴と
する配列を包括する。
【００５１】ハイブリダイゼーション条件の決定につい
ては、Sambrookら、Molecular Clon ing, a Laboratory
Manual 第２版、１９８９を参照のこと。
ては、Sambrookら、Molecular Clon ing, a Laboratory
Manual 第２版、１９８９を参照のこと。
【００５２】本発明の配列はＤＮＡ（特にゲノムＤＮＡ
又はｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ）又はＲＮＡである。これ
らはＴ−ＢＣＤ５４１又はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子の検
出のためのプローブとして、又は生物試料中に存在する
ゲノムＤＮＡの増幅のためのプライマーとして利用でき
うる。
又はｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ）又はＲＮＡである。これ
らはＴ−ＢＣＤ５４１又はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子の検
出のためのプローブとして、又は生物試料中に存在する
ゲノムＤＮＡの増幅のためのプライマーとして利用でき
うる。
【００５３】好適なプライマーは、下記の配列を含んで
成るか、又はそれに対応するものである：
成るか、又はそれに対応するものである：
【００５４】
【化９】
【００５５】上記のプライマーはＴ−ＢＣＤ５４１遺伝
子のエクソン７を特徴とする。
子のエクソン７を特徴とする。
【００５６】
【００５７】
【化１０】
【００５８】上記のプライマーはＴ−ＢＣＤ５４１遺伝
子のエクソン８を特徴とする。
子のエクソン８を特徴とする。
【００５９】ペアーで使用するプライマーは運動ニュー
ロン障害を検査するため、ゲノムＤＮＡの増幅のための
セットを構成できる。
ロン障害を検査するため、ゲノムＤＮＡの増幅のための
セットを構成できる。
【００６０】上記のプライマーに関する反転相補性配列
も使用してよい。
も使用してよい。
【００６１】好適なプライマーのセットは以下の通りで
ある： −図４及び５の配列のヌクレオチド９２１〜１４６９を
含んで成る配列の中に含まれるプライマーのペアー及び
／又は −以下の配列を含んで成るプライマーのペアー：
ある： −図４及び５の配列のヌクレオチド９２１〜１４６９を
含んで成る配列の中に含まれるプライマーのペアー及び
／又は −以下の配列を含んで成るプライマーのペアー：
【００６２】
【化１１】
【００６３】別の好適なプライマーのセットは以下を含
んで成る： −以下の配列を有するプライマーのペアー：
んで成る： −以下の配列を有するプライマーのペアー：
【００６４】
【化１２】
【００６５】−以下の配列を有するプライマーのペア
ー：
ー：
【００６６】
【化１３】
【００６７】エクソン７における相違の検出のための一
般的観点から、Ｔ−ＢＣＤ５４１及びＣ−ＢＣＤ５４１
遺伝子の間で、オリゴヌクレオチドプライマーをその相
違の５′側のフラグメントにおいて、且つエクソン７又
はイントロン７の中で決定できる。
般的観点から、Ｔ−ＢＣＤ５４１及びＣ−ＢＣＤ５４１
遺伝子の間で、オリゴヌクレオチドプライマーをその相
違の５′側のフラグメントにおいて、且つエクソン７又
はイントロン７の中で決定できる。
【００６８】診断の目的のためのＳＳＣＰ分析に利用で
きうるその他のプライマーはとりわけ以下の通りであ
る：
きうるその他のプライマーはとりわけ以下の通りであ
る：
【００６９】
【化１４】
【００７０】
【化１５】
【００７１】
【化１６】
【００７２】本発明はまた、Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子
と、そして特にイントロン配列と、特にＴ−ＢＣＤ５４
１遺伝子における対応部とは異なるイントロンのフラグ
メントとハイブリダイズできるアンチセンスＤＮＡ又は
ＲＮＡに関する。
と、そして特にイントロン配列と、特にＴ−ＢＣＤ５４
１遺伝子における対応部とは異なるイントロンのフラグ
メントとハイブリダイズできるアンチセンスＤＮＡ又は
ＲＮＡに関する。
【００７３】本発明はまた、図１のアミノ酸配列を含ん
で成るタンパク質、又は図１０のアミノ酸配列を有する
タンパク質に関する。
で成るタンパク質、又は図１０のアミノ酸配列を有する
タンパク質に関する。
【００７４】図１の配列に関するタンパク質は、経口、
筋肉内、静脈内投与を介して、又は脊髄流体への投与を
介して、運動ニューロン障害の処置のための組成物にお
いて利用できうる。
筋肉内、静脈内投与を介して、又は脊髄流体への投与を
介して、運動ニューロン障害の処置のための組成物にお
いて利用できうる。
【００７５】本発明は更に、運動ニューロン障害のイン
ビトロ診断のためのキットを提供し、このキットは： −上記のプライマーのセット； −増幅反応のための試薬；及び −増幅生成物の検出のためのプローブ； を含んで成る。
ビトロ診断のためのキットを提供し、このキットは： −上記のプライマーのセット； −増幅反応のための試薬；及び −増幅生成物の検出のためのプローブ； を含んで成る。
【００７６】本発明の別の態様に従うと、上記のハイブ
リダイゼーションプローブを含む運動ニューロン障害の
検査のためのキットを提供する。
リダイゼーションプローブを含む運動ニューロン障害の
検査のためのキットを提供する。
【００７７】遺伝子間の相違に対応するオリゴヌクレオ
チドプローブを利用してよい。
チドプローブを利用してよい。
【００７８】診断は特にＳＭＡ運動ニューロン病理に向
けられている。
けられている。
【００７９】本発明は上記のヌクレオチド配列を含んで
成るクローニング又は発現ベクターに関する。かかるベ
クターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、Ｙ
ＡＣ、ｐＹＡＣ等であってよい。好ましくは、かかるベ
クターは運動ニューロン向性を有する。特に遺伝子治療
のための手段を規定する目的のためには、とりわけポリ
オウィルスベクター、ヘルペスウィルス、アデノウィル
ス、レトロウィルスベクター、合成ベクター等が選ばれ
うる。
成るクローニング又は発現ベクターに関する。かかるベ
クターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、Ｙ
ＡＣ、ｐＹＡＣ等であってよい。好ましくは、かかるベ
クターは運動ニューロン向性を有する。特に遺伝子治療
のための手段を規定する目的のためには、とりわけポリ
オウィルスベクター、ヘルペスウィルス、アデノウィル
ス、レトロウィルスベクター、合成ベクター等が選ばれ
うる。
【００８０】本発明の範囲において更なる組換配列を考
慮する。本発明は更に組換宿主細胞、即ち、上記の組換
配列により形質転換された酵母、ＣＨＯ細胞、バキュロ
ウィルス、骨髄細胞、Ｅ．コリ、繊維芽細胞−上皮細胞
に関する。
慮する。本発明は更に組換宿主細胞、即ち、上記の組換
配列により形質転換された酵母、ＣＨＯ細胞、バキュロ
ウィルス、骨髄細胞、Ｅ．コリ、繊維芽細胞−上皮細胞
に関する。
【００８１】本発明は更に、脊髄筋萎縮、栄養性外側硬
化症及び一次外側硬化症を含む運動ニューロン障害の検
査のための方法であって： （ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する； （ｂ）前記ＤＮＡを前記のプライマーにより増幅させ
る； （ｃ）この増幅したＤＮＡをＳＣＣＰにかける； （ｄ）このゲルをオートラジオグラフィーにかける；そ
して （ｅ）運動ニューロン障害の有無を検出する； 工程を含んで成る方法に関する。
化症及び一次外側硬化症を含む運動ニューロン障害の検
査のための方法であって： （ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する； （ｂ）前記ＤＮＡを前記のプライマーにより増幅させ
る； （ｃ）この増幅したＤＮＡをＳＣＣＰにかける； （ｄ）このゲルをオートラジオグラフィーにかける；そ
して （ｅ）運動ニューロン障害の有無を検出する； 工程を含んで成る方法に関する。
【００８２】工程（ｃ）及び（ｄ）はＢｓｒＩ酵素もし
くは遺伝子間の相違又は遺伝子における誤対合を特異的
に認識できるその他の酵素による消化の工程又は配列決
定の工程に置き換えてよい。
くは遺伝子間の相違又は遺伝子における誤対合を特異的
に認識できるその他の酵素による消化の工程又は配列決
定の工程に置き換えてよい。
【００８３】本発明は更に、脊髄筋萎縮を検査するため
の方法であって、 （ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する； （ｂ）前記ＤＮＡを、ストリンジェンシー条件において
図４及び５又は図２及び３のＤＮＡ配列全体又はその一
部を含んで成るＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ
る；そして （ｃ）形成された可能性のあるハイブリドを検出する；
ことを含んで成る方法に関する。
の方法であって、 （ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する； （ｂ）前記ＤＮＡを、ストリンジェンシー条件において
図４及び５又は図２及び３のＤＮＡ配列全体又はその一
部を含んで成るＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ
る；そして （ｃ）形成された可能性のあるハイブリドを検出する；
ことを含んで成る方法に関する。
【００８４】本発明は更に、先天性多発性関節拘縮症
（ＡＭＣ）を検査するための方法であって： （ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する； （ｂ）前記ＤＮＡをＳＭＮ遺伝子のエクソン７又はエク
ソン８由来の未ラベルプライマーを用いるＰＣＲを介し
て増幅させる； （ｃ）この増幅させたＤＮＡをＳＣＣＰにかける； （ｄ）このゲルをオートラジオグラフィーにかける；そ
して （ｅ）先天性多発性関節拘縮症の有無を検出する； 工程を含んで成る方法に関する。
（ＡＭＣ）を検査するための方法であって： （ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する； （ｂ）前記ＤＮＡをＳＭＮ遺伝子のエクソン７又はエク
ソン８由来の未ラベルプライマーを用いるＰＣＲを介し
て増幅させる； （ｃ）この増幅させたＤＮＡをＳＣＣＰにかける； （ｄ）このゲルをオートラジオグラフィーにかける；そ
して （ｅ）先天性多発性関節拘縮症の有無を検出する； 工程を含んで成る方法に関する。
【００８５】先天性多発性関節拘縮症を検査するための
更なる別の方法は、ＰＣＲ増幅後にゲノタイプ用マーカ
ーＣ２７２及びＣ２１２を用いるジヌクレオチド反復多
形態分析を考慮する。
更なる別の方法は、ＰＣＲ増幅後にゲノタイプ用マーカ
ーＣ２７２及びＣ２１２を用いるジヌクレオチド反復多
形態分析を考慮する。
【００８６】本発明は更に図１のタンパク質、図１０の
タンパク質及び図１５のタンパク質に対して誘導したポ
リクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を考慮す
る。
タンパク質及び図１５のタンパク質に対して誘導したポ
リクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を考慮す
る。
【００８７】本発明の別の観点はＳＭＡを検査するため
のプローブ並びに動物又は生体におけるＳＭＮ遺伝子運
動ニューロンに関連する遺伝子を同定及びクローニング
するためのプローブとしてＳＭＮの全又は部分ヌクレオ
チド配列の利用に向けられている。
のプローブ並びに動物又は生体におけるＳＭＮ遺伝子運
動ニューロンに関連する遺伝子を同定及びクローニング
するためのプローブとしてＳＭＮの全又は部分ヌクレオ
チド配列の利用に向けられている。
【００８８】本発明の更なる別の観点は、ポリクローナ
ル及びモノクローナル抗体を製造するためのＳＭＡタン
パク質の利用にあり、その抗体はＳＭＡを検査及び診断
するのに利用できうる。
ル及びモノクローナル抗体を製造するためのＳＭＡタン
パク質の利用にあり、その抗体はＳＭＡを検査及び診断
するのに利用できうる。
【００８９】別の観点において、図１，１０及び１５の
アミノ酸配列（アミノ酸末端及びカルボキシ末端を含
む）に対応する合成ペプチドに対するポリクローナルウ
サギ抗血清を作った。
アミノ酸配列（アミノ酸末端及びカルボキシ末端を含
む）に対応する合成ペプチドに対するポリクローナルウ
サギ抗血清を作った。
【００９０】従って、その方法の一の観点において、本
発明はＳＭＡ又はＡＭＳ，ＡＬＳ及びＰＬＳの如くの関
連の運動ニューロン障害を有する患者におけるＳＭＡの
検査に関する。
発明はＳＭＡ又はＡＭＳ，ＡＬＳ及びＰＬＳの如くの関
連の運動ニューロン障害を有する患者におけるＳＭＡの
検査に関する。
【００９１】本発明の更なる別の観点は、ＳＭＮ遺伝子
もしくはその一部、ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド
を、かかる遺伝子を欠くか、又はかかる遺伝子が遺伝子
的に欠陥となっている患者に、そのまま、又は操作した
ウィルスもしくはベクターに組込んでから投与すること
にある。
もしくはその一部、ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド
を、かかる遺伝子を欠くか、又はかかる遺伝子が遺伝子
的に欠陥となっている患者に、そのまま、又は操作した
ウィルスもしくはベクターに組込んでから投与すること
にある。
【００９２】本発明のこれら及びその他の観点を本発明
の好適な態様において以下に詳しく説明する。
の好適な態様において以下に詳しく説明する。
【００９３】
【発明の実施の形態】本明細書で用いる語「contig」と
は、重複するヌクレオチド配列を意味する。
は、重複するヌクレオチド配列を意味する。
【００９４】リンケージ分析による従来の研究は、脊髄
筋萎縮の３種の形態が全て５ｑ１１．２−ｑ１３．３に
位置することを示す(L.M.Brzustowiczら、Nature, 344,
540(1990) ; J.Melkiら、Nature, 345, 823 (1990) ;
J.Melkiら、Lancet, 336,271 (1990))。その領域にお
いてコピー反復が少ないことを示す、障害遺伝子座に広
がる５ｑ１３領域の酵母人工染色体（ＹＡＣ）contig
を、構築した。２０１ＳＭＡ家族におけるＹＡＣcontig
（Ｃ２１２，Ｃ２１７及びＣ１６１）に由来するマーカ
ーにより検出される最も近い遺伝子座においてアレル・
セグレゲーションが分析された。これらのマーカーは５
ｑ１３領域上の２つの遺伝子座（Ｃ２１２，Ｃ２７２）
又は３つの遺伝子座（Ｃ１６１）を示した。固有及び d
e novo欠失が９人の無縁のＳＭＡ患者において認められ
た。更に、研究した遺伝子座についてのめざましいヘテ
ロ接合欠損の観察により、Ｉ型のＳＭＡ患者の１８％以
上において欠損があることが強く裏付けられた。これら
の結果は、欠損現象がＳＭＡの重症な形態に系統的に係
っていることを示唆した。
筋萎縮の３種の形態が全て５ｑ１１．２−ｑ１３．３に
位置することを示す(L.M.Brzustowiczら、Nature, 344,
540(1990) ; J.Melkiら、Nature, 345, 823 (1990) ;
J.Melkiら、Lancet, 336,271 (1990))。その領域にお
いてコピー反復が少ないことを示す、障害遺伝子座に広
がる５ｑ１３領域の酵母人工染色体（ＹＡＣ）contig
を、構築した。２０１ＳＭＡ家族におけるＹＡＣcontig
（Ｃ２１２，Ｃ２１７及びＣ１６１）に由来するマーカ
ーにより検出される最も近い遺伝子座においてアレル・
セグレゲーションが分析された。これらのマーカーは５
ｑ１３領域上の２つの遺伝子座（Ｃ２１２，Ｃ２７２）
又は３つの遺伝子座（Ｃ１６１）を示した。固有及び d
e novo欠失が９人の無縁のＳＭＡ患者において認められ
た。更に、研究した遺伝子座についてのめざましいヘテ
ロ接合欠損の観察により、Ｉ型のＳＭＡ患者の１８％以
上において欠損があることが強く裏付けられた。これら
の結果は、欠損現象がＳＭＡの重症な形態に系統的に係
っていることを示唆した。
【００９５】ＹＡＣcontigに由来する全ての多形態ＤＮ
Ａマーカーを研究することにより、最小のリアレンジメ
ントは、Ｃ１６１及びＣ２１２−Ｃ２７２により検出さ
れる遺伝子座に接しており、且つ全体的に１．２−Ｍｂ
ＹＡＣクローン９０３Ｄ１に含まれている領域内で認
められた。例えば、フランス特許出願第９４０６８５６
を参照のこと。
Ａマーカーを研究することにより、最小のリアレンジメ
ントは、Ｃ１６１及びＣ２１２−Ｃ２７２により検出さ
れる遺伝子座に接しており、且つ全体的に１．２−Ｍｂ
ＹＡＣクローン９０３Ｄ１に含まれている領域内で認
められた。例えば、フランス特許出願第９４０６８５６
を参照のこと。
【００９６】本発明は、ＳＭＡ患者における遺伝子的及
び物理的地図化の組合せにより、約１４０kbの小さなネ
スト型基準ＳＭＡ領域を特徴とする。この領域はＳＭＡ
遺伝子についての適正な位置決定を提供し、従って、候
補遺伝子についてサーチする一定の領域を提供する。本
発明は５ｑ１３領域由来の二本鎖遺伝子を同定した。そ
の一方（テロマー遺伝子）はこの基準領域内にある。更
に、この遺伝子は２３０人のＳＭＡ患者のうちの２１３
人（９２．２％）において欠失しているか、又は２３０
人のうちの１３人（５．６％）において分断されてい
る。テロマー遺伝子が欠失していない又は分断されてい
ない患者において、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝
子と呼ばれるこのテロマー遺伝子が示唆する有害な突然
変異は、染色体５ＳＭＡ決定遺伝子である。
び物理的地図化の組合せにより、約１４０kbの小さなネ
スト型基準ＳＭＡ領域を特徴とする。この領域はＳＭＡ
遺伝子についての適正な位置決定を提供し、従って、候
補遺伝子についてサーチする一定の領域を提供する。本
発明は５ｑ１３領域由来の二本鎖遺伝子を同定した。そ
の一方（テロマー遺伝子）はこの基準領域内にある。更
に、この遺伝子は２３０人のＳＭＡ患者のうちの２１３
人（９２．２％）において欠失しているか、又は２３０
人のうちの１３人（５．６％）において分断されてい
る。テロマー遺伝子が欠失していない又は分断されてい
ない患者において、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝
子と呼ばれるこのテロマー遺伝子が示唆する有害な突然
変異は、染色体５ＳＭＡ決定遺伝子である。
【００９７】ＳＭＮ遺伝子は、制限地図化、サザンブロ
ットによるＥTel からＥCen の区別、並びに遺伝子的及
び物理的地図化によるＳＭＡ患者におけるＥTel 間の相
違の決定の複合系を用いて発見した。ＳＭＮ遺伝子の位
置を確認した後、このテロマー要素の基準領域に広がる
ファージcontigを、ＳＭＮ遺伝子を含む特定のクローン
を同定するために構築した。
ットによるＥTel からＥCen の区別、並びに遺伝子的及
び物理的地図化によるＳＭＡ患者におけるＥTel 間の相
違の決定の複合系を用いて発見した。ＳＭＮ遺伝子の位
置を確認した後、このテロマー要素の基準領域に広がる
ファージcontigを、ＳＭＮ遺伝子を含む特定のクローン
を同定するために構築した。
【００９８】正常の患者のＳＭＮ遺伝子と比べたＳＭＡ
患者におけるＳＭＮ遺伝子の分析は、ＳＭＡ患者の９８
％においてＳＭＮ遺伝子が欠失しているかもしくはトラ
ンケートされている、又は正常のコントロール患者にお
いて存在しない組合せ突然変異を有することを示した。
患者におけるＳＭＮ遺伝子の分析は、ＳＭＡ患者の９８
％においてＳＭＮ遺伝子が欠失しているかもしくはトラ
ンケートされている、又は正常のコントロール患者にお
いて存在しない組合せ突然変異を有することを示した。
【００９９】５ｑ１３領域の大きな反転二量化及び複雑
なゲノム統合を同定するため、ＹＡＣcontigのパルプ・
フィールド・ゲル電気泳動（ＰＧＦＥ）を利用し、長レ
ンジ制限地図化を行った。
なゲノム統合を同定するため、ＹＡＣcontigのパルプ・
フィールド・ゲル電気泳動（ＰＧＦＥ）を利用し、長レ
ンジ制限地図化を行った。
【０１００】ＹＡＣはそのハロタイプを、ヒトドナーの
それと、多形態遺伝子座検出されたマーカーＣ２１２，
Ｃ２７２，Ｃ１７１及びＣ１６１において比較すること
により順序立てた（図６）。
それと、多形態遺伝子座検出されたマーカーＣ２１２，
Ｃ２７２，Ｃ１７１及びＣ１６１において比較すること
により順序立てた（図６）。
【０１０１】制限酵素ＳａｃII，ＢｓｓＨII，Ｓｆｉ
Ｉ，ＥａｇＩ及びＸｈｏＩを、マーカーＣ２１２，Ｃ２
７２，Ｃ１７１及びＣ１６１により検出されたテロマー
遺伝子座を含むＹＡＣ（ＹＡＣクローン５９５Ｃ１
１）、これらのマーカーにより検出されたセントロマー
遺伝子座（ＹＡＣクローン１２１Ｂ８，７５９Ａ３，２
７８Ｇ７）、又はその両者（ＹＡＣクローン９０３Ｄ１
及び９２０（ａ）を消化するために用いた。ＹＡＣ５９
５Ｃ１１，１２１Ｂ８及び９０３Ｄ１のラムダファージ
ライブラリーを構築し、そしてマーカーＣ２１２（ｐ３
２２），Ｃ２７２（１３２ＳＥ１１），Ｃ１６１（Ｈｅ
３）、ＡＦＭ１５７ｘｄ１０（１３１ｘｂ４）及びＣＭ
Ｓ１（ｐ１１Ｍ１）を含むファージ由来のサブクローン
をＰＦＧＥ分析のためのプローブとして用いた。図７
は、プローブ１３２ＳＥ１１，１１Ｐ１及びＰ３２２が
２つの遺伝子座を示し、そしてプローブＨｅ３がＹＡＣ
contig上で４つの遺伝子座を示し、そしてプローブ１３
１ｘｂ４が５ｐ及び５ｑ１３上の複数の遺伝子座を示す
ことを示した。その制限地図（図８）は、５ｑ１３領域
が、テロマー及びセントロマー要素のそれぞれについて
のＥTel 及びＥCon と呼ばれる少なくとも５００kbの要
素（Ｅ）の大きな反転二量体を含むことを示した。
Ｉ，ＥａｇＩ及びＸｈｏＩを、マーカーＣ２１２，Ｃ２
７２，Ｃ１７１及びＣ１６１により検出されたテロマー
遺伝子座を含むＹＡＣ（ＹＡＣクローン５９５Ｃ１
１）、これらのマーカーにより検出されたセントロマー
遺伝子座（ＹＡＣクローン１２１Ｂ８，７５９Ａ３，２
７８Ｇ７）、又はその両者（ＹＡＣクローン９０３Ｄ１
及び９２０（ａ）を消化するために用いた。ＹＡＣ５９
５Ｃ１１，１２１Ｂ８及び９０３Ｄ１のラムダファージ
ライブラリーを構築し、そしてマーカーＣ２１２（ｐ３
２２），Ｃ２７２（１３２ＳＥ１１），Ｃ１６１（Ｈｅ
３）、ＡＦＭ１５７ｘｄ１０（１３１ｘｂ４）及びＣＭ
Ｓ１（ｐ１１Ｍ１）を含むファージ由来のサブクローン
をＰＦＧＥ分析のためのプローブとして用いた。図７
は、プローブ１３２ＳＥ１１，１１Ｐ１及びＰ３２２が
２つの遺伝子座を示し、そしてプローブＨｅ３がＹＡＣ
contig上で４つの遺伝子座を示し、そしてプローブ１３
１ｘｂ４が５ｐ及び５ｑ１３上の複数の遺伝子座を示す
ことを示した。その制限地図（図８）は、５ｑ１３領域
が、テロマー及びセントロマー要素のそれぞれについて
のＥTel 及びＥCon と呼ばれる少なくとも５００kbの要
素（Ｅ）の大きな反転二量体を含むことを示した。
【０１０２】ＳＭＡ及びコントロール個体のＰＦＧＥ分
析は、制限フラグメントの多様性の度合いの高さを示
し、これはＥTel からＥCen の区別及びＳＭＡ患者にお
ける異常な制限フラグメントの認識を妨げた。
析は、制限フラグメントの多様性の度合いの高さを示
し、これはＥTel からＥCen の区別及びＳＭＡ患者にお
ける異常な制限フラグメントの認識を妨げた。
【０１０３】ＥTel とＥCen とを区別するため、サザン
ブロット分析を行った。このサザンブロットはSambrook
ら、前掲に記載の方法により実施した。
ブロット分析を行った。このサザンブロットはSambrook
ら、前掲に記載の方法により実施した。
【０１０４】より詳しくは、ＹＡＣクローン、コントロ
ール及びＳＭＡ患者由来のＤＮＡを、サザンブロッティ
ングのために制限酵素ＳａｃＩ，ＫｐｎＩ，ＭｓｐＩ，
ＰｓｔＩ，ＰｖｕII，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII ，Ｂｇ
ｌII及びＸｂａＩで消化し、そしてプローブとしてクロ
ーン１３２ＳＥ１１，１１ｐ１，Ｈｅ３，１３１ｘｂ４
及びｐ３２２を用いてハイブリダイズさせた。１２，１
１及び３．７kbの３本のＨｉｎｄIII 制限フラグメント
がプローブＨｅ３により検出された。１２kbのＨｉｎｄ
III 制限フラグメントはＹＡＣクローン７５４Ｈ５及び
７５９Ａ３において検出され、このフラグメントがＥ
Cen におけるほとんどのセントロマー遺伝子座に対応す
ることを示唆した。反対に、１１kbのＨｉｎｄIII フラ
グメントがＹＡＣクローン５９５Ｃ１１，９０３Ｄ１及
び９２０Ｃ９において検出され、このフラグメントがＥ
Tel 上の一の遺伝子座に対応することを示唆した。最後
に、３．７kbのＨｉｎｄIII フラグメントがＥTel 又は
ＥCen のいずれかを含む非重複ＹＡＣにおいて認めら
れ、このフラグメントが２種類の遺伝子座に対応するこ
とを示唆した。同様の結果がＳａｃＩ及びＫｐｎＩで得
られた。Ｈｅ３により検出される３つの制限フラグメン
トが単染色体ハイブリドＨＨＷ１０５／ Carlock, L.R.
ら、Am.J.of Human Genet. 1985, Vol.37, p839)上及び
３０人の無縁の健康な個体において認められ、これらの
フラグメントが多形性によるものでないことを確証せし
めた。サザン分析の結果は、コントロール及びＳＭＡ患
者の両者においてＥTel からＥCen を区別することを可
能とした。
ール及びＳＭＡ患者由来のＤＮＡを、サザンブロッティ
ングのために制限酵素ＳａｃＩ，ＫｐｎＩ，ＭｓｐＩ，
ＰｓｔＩ，ＰｖｕII，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII ，Ｂｇ
ｌII及びＸｂａＩで消化し、そしてプローブとしてクロ
ーン１３２ＳＥ１１，１１ｐ１，Ｈｅ３，１３１ｘｂ４
及びｐ３２２を用いてハイブリダイズさせた。１２，１
１及び３．７kbの３本のＨｉｎｄIII 制限フラグメント
がプローブＨｅ３により検出された。１２kbのＨｉｎｄ
III 制限フラグメントはＹＡＣクローン７５４Ｈ５及び
７５９Ａ３において検出され、このフラグメントがＥ
Cen におけるほとんどのセントロマー遺伝子座に対応す
ることを示唆した。反対に、１１kbのＨｉｎｄIII フラ
グメントがＹＡＣクローン５９５Ｃ１１，９０３Ｄ１及
び９２０Ｃ９において検出され、このフラグメントがＥ
Tel 上の一の遺伝子座に対応することを示唆した。最後
に、３．７kbのＨｉｎｄIII フラグメントがＥTel 又は
ＥCen のいずれかを含む非重複ＹＡＣにおいて認めら
れ、このフラグメントが２種類の遺伝子座に対応するこ
とを示唆した。同様の結果がＳａｃＩ及びＫｐｎＩで得
られた。Ｈｅ３により検出される３つの制限フラグメン
トが単染色体ハイブリドＨＨＷ１０５／ Carlock, L.R.
ら、Am.J.of Human Genet. 1985, Vol.37, p839)上及び
３０人の無縁の健康な個体において認められ、これらの
フラグメントが多形性によるものでないことを確証せし
めた。サザン分析の結果は、コントロール及びＳＭＡ患
者の両者においてＥTel からＥCen を区別することを可
能とした。
【０１０５】従って、ＥTel からＥCen を区別した後、
ＳＭＡ患者におけるＥTel と正常コントロールのそれと
の間の相違を決定する必要があった。これは遺伝子的及
び物理的地図化によって行った。この遺伝子的及び物理
的地図化はＳＭＡ患者のＥTel のテロマー要素における
ゲノムのリアレンジメントと同定せしめた。
ＳＭＡ患者におけるＥTel と正常コントロールのそれと
の間の相違を決定する必要があった。これは遺伝子的及
び物理的地図化によって行った。この遺伝子的及び物理
的地図化はＳＭＡ患者のＥTel のテロマー要素における
ゲノムのリアレンジメントと同定せしめた。
【０１０６】２０１人のＳＭＡ患者のうちの９人（９／
２０１）が一の突然変異染色体上に、マーカーＣ２１２
及びＣ２７２により検出される１又は２つの遺伝子座の
いづれかを包括する大スケール欠損を示すことを示した
(J.Melkiら、Science , 264,1474 (1994)) 。一方、血
族関係にある親から生まれた３０人の患者のうちの２２
人（２２／３０）（そのうち、１４人のうちの１３人
（１３／１４）がＩ型であり、そして１０人のうち９人
（９／１０）が III型ＳＭＡである）が、最も近くに隣
接する多形性マーカーについての遺伝によりホモ接合性
であった。
２０１）が一の突然変異染色体上に、マーカーＣ２１２
及びＣ２７２により検出される１又は２つの遺伝子座の
いづれかを包括する大スケール欠損を示すことを示した
(J.Melkiら、Science , 264,1474 (1994)) 。一方、血
族関係にある親から生まれた３０人の患者のうちの２２
人（２２／３０）（そのうち、１４人のうちの１３人
（１３／１４）がＩ型であり、そして１０人のうち９人
（９／１０）が III型ＳＭＡである）が、最も近くに隣
接する多形性マーカーについての遺伝によりホモ接合性
であった。
【０１０７】大スケール欠損を有する９人の患者及び遺
伝によりホモ接合性を示す２２人の血族関係にある親の
ゲノムＤＮＡをサザンブロッティングのためにＨｉｎｄ
IIIで消化し、そしてプローブＨｅ３とハイブリダイズ
させた。プローブＨｅ３により示される１１kbのフラグ
メントは１３人の血族関係にあるＩ型の親１３人のうち
の１２人（１２／１３）になかった。１２人のうちの２
人において（２／１２）、その欠損は３．７kbのフラグ
メントも含んでいた。一方、８人の血族関係にある III
型の親のうちの１人（１／８）においてのみ、１１kbの
フラグメントがなかった。これと一致して、一の突然変
異染色体上に大スケール欠損を有する９人の患者のうち
の４人（４／９）において１１kbのＨｉｎｄIII フラグ
メントがなかった。特に注目されるのは、マーカーＣ２
１２及びＣ２７２により検出される２つの遺伝子座のう
ちの一つの欠損を有する患者における１１kbのフラグメ
ントのなさである。
伝によりホモ接合性を示す２２人の血族関係にある親の
ゲノムＤＮＡをサザンブロッティングのためにＨｉｎｄ
IIIで消化し、そしてプローブＨｅ３とハイブリダイズ
させた。プローブＨｅ３により示される１１kbのフラグ
メントは１３人の血族関係にあるＩ型の親１３人のうち
の１２人（１２／１３）になかった。１２人のうちの２
人において（２／１２）、その欠損は３．７kbのフラグ
メントも含んでいた。一方、８人の血族関係にある III
型の親のうちの１人（１／８）においてのみ、１１kbの
フラグメントがなかった。これと一致して、一の突然変
異染色体上に大スケール欠損を有する９人の患者のうち
の４人（４／９）において１１kbのＨｉｎｄIII フラグ
メントがなかった。特に注目されるのは、マーカーＣ２
１２及びＣ２７２により検出される２つの遺伝子座のう
ちの一つの欠損を有する患者における１１kbのフラグメ
ントのなさである。
【０１０８】一緒に分析したとき、これらの観察はＳＭ
Ａ患者におけるＥTel のゲノムアレンジメントについて
の証拠を提供し、そして１１kbのＨｉｎｄIII フラグメ
ントにより示される遺伝子座に対するＳＭＡ遺伝子のセ
ントロマー位置を裏付けし、なぜなら１人を除く全ての
血族関係にある III型患者がこの遺伝子座について欠失
していなかったからである。
Ａ患者におけるＥTel のゲノムアレンジメントについて
の証拠を提供し、そして１１kbのＨｉｎｄIII フラグメ
ントにより示される遺伝子座に対するＳＭＡ遺伝子のセ
ントロマー位置を裏付けし、なぜなら１人を除く全ての
血族関係にある III型患者がこの遺伝子座について欠失
していなかったからである。
【０１０９】この障害におけるゲノムリアレンジメント
のセントロマー境界を特性決定するため、血族関係にあ
るＳＭＡ患者におけるマーカーＣ２７２により検出され
る遺伝子座においてアレルセグレーションを分析した。
血族関係にあるＳＭＡ Ｉ型患者は全て一のＰＣＲ増幅
生成物を有し、それに比べて６０人のコントロールでは
０人であった。このめざましいヘテロ接合欠損はＣ２７
２により検出される２つの遺伝子座のうちの一方の欠損
に基づき、それはこのマーカーの近くを地図化するプロ
ーブ１３２ＳＥ１１を有する遺伝子量のめざましい低下
により示される。一方、９人の血族関係にある III型Ｓ
ＭＡ患者のうちの７人が両親から遺伝されたＣ２７２増
幅生成物を有し、マーカー２７２により検出される各座
においてのホモ接合性を示唆する。更に、プローブ１３
２ＳＥ１１では遺伝子量効果は認められず、 III型の血
族関係にある患者におけるＣ２７２により検出される遺
伝子座に係る欠損のなさを示唆する。
のセントロマー境界を特性決定するため、血族関係にあ
るＳＭＡ患者におけるマーカーＣ２７２により検出され
る遺伝子座においてアレルセグレーションを分析した。
血族関係にあるＳＭＡ Ｉ型患者は全て一のＰＣＲ増幅
生成物を有し、それに比べて６０人のコントロールでは
０人であった。このめざましいヘテロ接合欠損はＣ２７
２により検出される２つの遺伝子座のうちの一方の欠損
に基づき、それはこのマーカーの近くを地図化するプロ
ーブ１３２ＳＥ１１を有する遺伝子量のめざましい低下
により示される。一方、９人の血族関係にある III型Ｓ
ＭＡ患者のうちの７人が両親から遺伝されたＣ２７２増
幅生成物を有し、マーカー２７２により検出される各座
においてのホモ接合性を示唆する。更に、プローブ１３
２ＳＥ１１では遺伝子量効果は認められず、 III型の血
族関係にある患者におけるＣ２７２により検出される遺
伝子座に係る欠損のなさを示唆する。
【０１１０】３種のＳＭＡの全てにおいて同一の遺伝子
座が係っていると仮定して、これらの結果は、この障害
を及ぼす遺伝子がＣ２７２により検出されるテロマー遺
伝子座から離れていることを示唆する。
座が係っていると仮定して、これらの結果は、この障害
を及ぼす遺伝子がＣ２７２により検出されるテロマー遺
伝子座から離れていることを示唆する。
【０１１１】これらの研究は、ＳＭＡ遺伝子を、マーカ
ーＣ２７２及びＨｅ３により検出されるテロマー遺伝子
座の間（１１kbのＨｉｎｄIII フラグメント）にあるテ
ロマー要素ＥTel 内に位置決めする。ＹＡＣcontigのＰ
ＧＦＥを用いる長レンジ制限地図化に基づき、この基準
領域はＹＡＣクローン９０３Ｄ１の１４０kbのＳａｃII
フラグメント（又はＹＡＣクローン９２０Ｄ９の１５０
kbのＳａｃIIフラグメント）内に全体的に含まれてい
る。
ーＣ２７２及びＨｅ３により検出されるテロマー遺伝子
座の間（１１kbのＨｉｎｄIII フラグメント）にあるテ
ロマー要素ＥTel 内に位置決めする。ＹＡＣcontigのＰ
ＧＦＥを用いる長レンジ制限地図化に基づき、この基準
領域はＹＡＣクローン９０３Ｄ１の１４０kbのＳａｃII
フラグメント（又はＹＡＣクローン９２０Ｄ９の１５０
kbのＳａｃIIフラグメント）内に全体的に含まれてい
る。
【０１１２】ＳＭＮ遺伝子が１４０kbのＳａｃIIフラグ
メント上にあることを確認後、テロマー要素の基準領域
に広がるファージcontigをＳＭＮ遺伝子の同定及び特性
決定のために構築した。
メント上にあることを確認後、テロマー要素の基準領域
に広がるファージcontigをＳＭＮ遺伝子の同定及び特性
決定のために構築した。
【０１１３】マーカーＣ２１２，Ｃ２７２，Ｃ１７１及
びＣ１６１を含むファージクローンをＹＡＣクローン５
９５Ｃ１１及び９０３Ｄ１から構築したλファージライ
ブラリーより単離し、そして二方向歩行(bidirectional
walking) のための出発点として使用した。マーカーＣ
２１２，Ｃ２７２及びＣ１７１のまわりのファージcont
ig（６０kb）をファージクローンの制限地図に基づいて
構築した（図８）。
びＣ１６１を含むファージクローンをＹＡＣクローン５
９５Ｃ１１及び９０３Ｄ１から構築したλファージライ
ブラリーより単離し、そして二方向歩行(bidirectional
walking) のための出発点として使用した。マーカーＣ
２１２，Ｃ２７２及びＣ１７１のまわりのファージcont
ig（６０kb）をファージクローンの制限地図に基づいて
構築した（図８）。
【０１１４】contigの中の遺伝子を同定するため、以下
の３段階手法を利用した； １）種間保存配列についてのサーチを行う； ２）エクソン・トラッピング法を行う；及び ３）直接ｃＤＮＡ選択を行う。マーカーＣ２７２を含む
ファージに由来するゲノムプローブ１３２ＳＥ１１は、
ハムスターＤＮＡと陽性ハイブリダイゼーションシグナ
ルを供し、種間保存配列の存在を示唆した。プローブ１
３２ＳＥ１１によるλｇｔ１０ヒト胎児脳ｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニングは、１．６kbp にわたって広
がる７つの重複λクローンの選択をもたらした。クロー
ンの配列分析は、８８２bpのオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）及び５８０bpの非コード領域を示した。
１．５kbp のクローン（ＢＣＤ５４１）はコード配列全
体及び３′非コード領域のほとんどを含んでいた。ｃＤ
ＮＡの３′末端とそのポリ（Ａ) + テールをリンホブラ
ストイド細胞系ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅によ
り獲得した。
の３段階手法を利用した； １）種間保存配列についてのサーチを行う； ２）エクソン・トラッピング法を行う；及び ３）直接ｃＤＮＡ選択を行う。マーカーＣ２７２を含む
ファージに由来するゲノムプローブ１３２ＳＥ１１は、
ハムスターＤＮＡと陽性ハイブリダイゼーションシグナ
ルを供し、種間保存配列の存在を示唆した。プローブ１
３２ＳＥ１１によるλｇｔ１０ヒト胎児脳ｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニングは、１．６kbp にわたって広
がる７つの重複λクローンの選択をもたらした。クロー
ンの配列分析は、８８２bpのオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）及び５８０bpの非コード領域を示した。
１．５kbp のクローン（ＢＣＤ５４１）はコード配列全
体及び３′非コード領域のほとんどを含んでいた。ｃＤ
ＮＡの３′末端とそのポリ（Ａ) + テールをリンホブラ
ストイド細胞系ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅によ
り獲得した。
【０１１５】２つのｃＤＮＡクローンは６６１〜７５５
のヌクレオチドを欠き、別のスプライシングが生じうる
ことを示唆する。心臓、脳、肝臓、筋肉、肺、腎臓及び
膵臓を含む様々な組織由来のポリ（Ａ) + ＲＮＡのノー
ザンブロット分析は、幅広く実現される１．７kbの転写
体の存在を示した。ＯＲＦは約３２kDの推定分子量の２
９４個のアミノ酸の推定タンパク質をコードする。
のヌクレオチドを欠き、別のスプライシングが生じうる
ことを示唆する。心臓、脳、肝臓、筋肉、肺、腎臓及び
膵臓を含む様々な組織由来のポリ（Ａ) + ＲＮＡのノー
ザンブロット分析は、幅広く実現される１．７kbの転写
体の存在を示した。ＯＲＦは約３２kDの推定分子量の２
９４個のアミノ酸の推定タンパク質をコードする。
【０１１６】ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴネットワークを
使用する相同性サーチでは、ヌクレオチドレベルでもア
ミノ酸レベルでも相同性を全く検出できなかった。
使用する相同性サーチでは、ヌクレオチドレベルでもア
ミノ酸レベルでも相同性を全く検出できなかった。
【０１１７】５ｑ１３領域においてＢＣＤ５４１遺伝子
の任意の重複があるかを更に調べるため、ＢＣＤ５４１
ｃＤＮＡを、障害遺伝子座に広がるＹＡＣクローンの
サザンブロット及びＰＦＧＥ分析のためのプローブとし
て用いた。
の任意の重複があるかを更に調べるため、ＢＣＤ５４１
ｃＤＮＡを、障害遺伝子座に広がるＹＡＣクローンの
サザンブロット及びＰＦＧＥ分析のためのプローブとし
て用いた。
【０１１８】ＥCen のみ（ＹＡＣクローン７５９Ａ３，
１２１Ｂ８及び２７８Ｇ７）又はＥTel のみ（ＹＡＣク
ローン５９５Ｃ１１）のいづれかを含む非重複ＹＡＣと
の特異的なハイブリダイゼーションは、ＢＣＤ５４１遺
伝子の二量化についての証拠を担う。各遺伝子は約２０
kbを占め、そして同一の制限パターンを示す。２つの遺
伝子のヘッド間配方についての証拠は、ＥCen 又はＥ
Tel のいづれかを含む非重複ＹＡＣクローンのＳａｃII
及びＥａｇＩ制限部位の位置決定、それに続く各要素の
ＳａｃII及びＥａｇＩ部位に隣接するプローブＢＣＤ５
４１及びｐ３２２によるハイブリダイゼーション実験に
由来する。
１２１Ｂ８及び２７８Ｇ７）又はＥTel のみ（ＹＡＣク
ローン５９５Ｃ１１）のいづれかを含む非重複ＹＡＣと
の特異的なハイブリダイゼーションは、ＢＣＤ５４１遺
伝子の二量化についての証拠を担う。各遺伝子は約２０
kbを占め、そして同一の制限パターンを示す。２つの遺
伝子のヘッド間配方についての証拠は、ＥCen 又はＥ
Tel のいづれかを含む非重複ＹＡＣクローンのＳａｃII
及びＥａｇＩ制限部位の位置決定、それに続く各要素の
ＳａｃII及びＥａｇＩ部位に隣接するプローブＢＣＤ５
４１及びｐ３２２によるハイブリダイゼーション実験に
由来する。
【０１１９】ＢＣＤ５４１遺伝子の２つのコピーにおけ
る相違を探すため、テロマー遺伝子の統合を特性決定
し、そしてセントロマー対応物のそれと比較した。ゲノ
ム配列分析は、テロマーＢＣＤ５４１遺伝子が８のエク
ソンより成ることを示した（図４及び５）。しかしなが
ら、従来から公知であったエクソン２は図１２及び１３
に示す追加のイントロンにより分割された２つのエクソ
ンより成ることがこの度わかり、従って、ＳＭＮ遺伝子
は９つのエクソンより成る。
る相違を探すため、テロマー遺伝子の統合を特性決定
し、そしてセントロマー対応物のそれと比較した。ゲノ
ム配列分析は、テロマーＢＣＤ５４１遺伝子が８のエク
ソンより成ることを示した（図４及び５）。しかしなが
ら、従来から公知であったエクソン２は図１２及び１３
に示す追加のイントロンにより分割された２つのエクソ
ンより成ることがこの度わかり、従って、ＳＭＮ遺伝子
は９つのエクソンより成る。
【０１２０】セントロマー又はテロマー遺伝子座（ＹＡ
Ｃクローン１２１Ｂ８及び５９５Ｃ１１のそれぞれ）の
いづれから出発して、各エクソン及びその隣接領域のＰ
ＣＲ−増幅及び配列は、セントロマーとテロマーＢＣＤ
５４１遺伝子間で５つの相違を示した。最初のものはテ
ロマー（ＴＴＣ）又はセントロマーＢＣＤ５４１遺伝子
（ＴＴＴ）に特異的なエクソン７（コドン２８０）にお
ける保存性置換である。第二のものは、３′非コード領
域に位置し（エクソン８、ヌクレオチドｎ°１１５
５）、テロマー（ＴＧＧ）又はセントロマーＢＣＤ５４
１遺伝子（ＴＧＡ）に特異的である。第６及び７番目イ
ントロンにおいて３つの更なる塩基置換が認められた。
Ｃクローン１２１Ｂ８及び５９５Ｃ１１のそれぞれ）の
いづれから出発して、各エクソン及びその隣接領域のＰ
ＣＲ−増幅及び配列は、セントロマーとテロマーＢＣＤ
５４１遺伝子間で５つの相違を示した。最初のものはテ
ロマー（ＴＴＣ）又はセントロマーＢＣＤ５４１遺伝子
（ＴＴＴ）に特異的なエクソン７（コドン２８０）にお
ける保存性置換である。第二のものは、３′非コード領
域に位置し（エクソン８、ヌクレオチドｎ°１１５
５）、テロマー（ＴＧＧ）又はセントロマーＢＣＤ５４
１遺伝子（ＴＧＡ）に特異的である。第６及び７番目イ
ントロンにおいて３つの更なる塩基置換が認められた。
【０１２１】両遺伝子座を含むＹＡＣクローン（ＹＡＣ
クローン９２０Ｃ９）又は単染色体ハイブリドＨＨＷ１
０５のいづれかの上の各エクソン（エクソン７及び８）
の両バージョンの観察は、これらの置換がアレルでもな
く、多形性に基づくものでもないことを示した。増幅さ
せたエクソン７及び８のＳＳＣＰ分析に基づくバンドシ
フトは、コントロール及びＳＭＡ患者の両者におけるテ
ロマー（Ｔ−ＢＣＤ５４１）及びセントロマー遺伝子
（Ｃ−ＢＣＤ５４１）の容易なる識別を可能にする。試
験した無縁の健康コントロール全員（ｎ＝７５）がエク
ソン７及び８のＳＳＣＰ分析による決定に従い、Ｔ−Ｂ
ＣＤ５４１遺伝子を有していた（１００％）。そのほと
んど（８９．３％）がＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子も有して
いたが、７５人のうちの８人（１０．７％）がＣ−ＢＣ
Ｄ５４１を欠いていた。
クローン９２０Ｃ９）又は単染色体ハイブリドＨＨＷ１
０５のいづれかの上の各エクソン（エクソン７及び８）
の両バージョンの観察は、これらの置換がアレルでもな
く、多形性に基づくものでもないことを示した。増幅さ
せたエクソン７及び８のＳＳＣＰ分析に基づくバンドシ
フトは、コントロール及びＳＭＡ患者の両者におけるテ
ロマー（Ｔ−ＢＣＤ５４１）及びセントロマー遺伝子
（Ｃ−ＢＣＤ５４１）の容易なる識別を可能にする。試
験した無縁の健康コントロール全員（ｎ＝７５）がエク
ソン７及び８のＳＳＣＰ分析による決定に従い、Ｔ−Ｂ
ＣＤ５４１遺伝子を有していた（１００％）。そのほと
んど（８９．３％）がＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子も有して
いたが、７５人のうちの８人（１０．７％）がＣ−ＢＣ
Ｄ５４１を欠いていた。
【０１２２】ゲノムＤＮＡのＰＣＲ−増幅の後に、ＳＳ
ＣＰ法によりエクソン７及び８において検出される単塩
基置換について全部で２３０人のＳＭＡ患者を試験し
た。そのうち、１０３人がＩ型に、９１人がII型に、そ
して３６人が III型に属した。興味深いことに、２３０
人のＳＭＡ患者のうちの２１３人（９２．６％）が両突
然変異染色体上にＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を欠き、それ
に比して７５人のコントロールではそれは０であった
（０％）。更に、２３０人のＳＭＡ患者のうちの１３人
（５．６％）が両突然変異染色体上のエクソン７につい
てのＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を欠き、しかしエクソン８
についてのＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子は保持しており、そ
れに比して７５人のコントロールではそれは０であった
（０％）。最後に、２３０人のＳＭＡ患者のうちの４人
（１．７％）がエクソン７及び８のＳＳＣＰ分析による
決定に従い、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子を有していた。
ＣＰ法によりエクソン７及び８において検出される単塩
基置換について全部で２３０人のＳＭＡ患者を試験し
た。そのうち、１０３人がＩ型に、９１人がII型に、そ
して３６人が III型に属した。興味深いことに、２３０
人のＳＭＡ患者のうちの２１３人（９２．６％）が両突
然変異染色体上にＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を欠き、それ
に比して７５人のコントロールではそれは０であった
（０％）。更に、２３０人のＳＭＡ患者のうちの１３人
（５．６％）が両突然変異染色体上のエクソン７につい
てのＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を欠き、しかしエクソン８
についてのＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子は保持しており、そ
れに比して７５人のコントロールではそれは０であった
（０％）。最後に、２３０人のＳＭＡ患者のうちの４人
（１．７％）がエクソン７及び８のＳＳＣＰ分析による
決定に従い、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子を有していた。
【０１２３】これらの結果は、ＳＭＡ患者のうちの９８
％において、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子が欠いているか又
はトランケートされていることを示す。更に、これらの
データーは、Ｃ２７２及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエ
クソン８により検出されるテロマー遺伝子座の間に障害
遺伝子が位置する見地を裏付けする。従って、ファージ
contigの重複制限地図に従い、基準領域は２０kbにおい
て全体的に含まれており、テロマーＢＣＤ５４１遺伝子
が染色体５ＳＭＡ決定遺伝子の中にあることを示唆す
る。
％において、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子が欠いているか又
はトランケートされていることを示す。更に、これらの
データーは、Ｃ２７２及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエ
クソン８により検出されるテロマー遺伝子座の間に障害
遺伝子が位置する見地を裏付けする。従って、ファージ
contigの重複制限地図に従い、基準領域は２０kbにおい
て全体的に含まれており、テロマーＢＣＤ５４１遺伝子
が染色体５ＳＭＡ決定遺伝子の中にあることを示唆す
る。
【０１２４】Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子がＳＭＡの原因で
あることを実証するため、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のリ
アレンジメントが認められていない４人のＳＭＡ患者に
おける部位突然変異をサーチした。各エクソンとその隣
接領域のＰＣＲ増幅生成物の直接配列決定をこの４人の
患者について行った。
あることを実証するため、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のリ
アレンジメントが認められていない４人のＳＭＡ患者に
おける部位突然変異をサーチした。各エクソンとその隣
接領域のＰＣＲ増幅生成物の直接配列決定をこの４人の
患者について行った。
【０１２５】イントロン６の３′スプライスアクセプタ
ー部位における７bp欠損（ポリピリミジン・トラクト）
が患者ＳＡにおいて見い出せた。この欠損イントロンに
隣接するエクソン７の配列分析は、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺
伝子に特異的な配列を認識せしめた。更に、同一の領域
に対応する非欠損ＰＣＲ生成物はＣ−ＢＣＤ５４１に特
異的な配列を有し、その他の突然変異アレルがＴ−ＢＣ
Ｄ５４１遺伝子を欠くことを示唆する。
ー部位における７bp欠損（ポリピリミジン・トラクト）
が患者ＳＡにおいて見い出せた。この欠損イントロンに
隣接するエクソン７の配列分析は、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺
伝子に特異的な配列を認識せしめた。更に、同一の領域
に対応する非欠損ＰＣＲ生成物はＣ−ＢＣＤ５４１に特
異的な配列を有し、その他の突然変異アレルがＴ−ＢＣ
Ｄ５４１遺伝子を欠くことを示唆する。
【０１２６】患者ＢＩにおいては、イントロン７の５′
共通スプライスドナー部位における４bpの欠損が見い出
された。この欠損は隣接するエクソン７の配列分析によ
る決定に従いＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子上に認められた。
共通スプライスドナー部位における４bpの欠損が見い出
された。この欠損は隣接するエクソン７の配列分析によ
る決定に従いＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子上に認められた。
【０１２７】患者ＨＵにおいて、コドン２７２の部位突
然変異（ＴＡＴ→ＴＧＴ）が認められた。この突然変異
はチロシンをシステインに変えた。この患者は突然変異
に関してヘテロ接合性であり、おそらくは別のアレル上
に別のＳＭＡ突然変異を有している。患者ＳＡ，ＨＵ及
びＢＩの全員において認められた３つの突然変異は全
て、正常な１００の染色体においては検出されず、まれ
なる多形態の可能性を排除する。
然変異（ＴＡＴ→ＴＧＴ）が認められた。この突然変異
はチロシンをシステインに変えた。この患者は突然変異
に関してヘテロ接合性であり、おそらくは別のアレル上
に別のＳＭＡ突然変異を有している。患者ＳＡ，ＨＵ及
びＢＩの全員において認められた３つの突然変異は全
て、正常な１００の染色体においては検出されず、まれ
なる多形態の可能性を排除する。
【０１２８】エクソン７の様々なスプライシングは、逆
転写ベースＰＣＲを利用することにより、Ｃ−ＢＣＤ５
４１をＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子から区別させた。１１人
のＳＭＡ患者をノーザンブロット又は逆転写ベースＰＣ
Ｒ増幅によりその転写体の分析について選別した。その
うちの８人はＩ型に、１人はII型に、そして２人が III
型に属した。ゲノムＤＮＡのＳＳＣＰ分析は、１０人の
患者におけるＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のなさを示し、そ
して１人の患者（ＳＡ）はエクソン７及び８の両方につ
いてのＣ−ＢＣＤ５４１及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を
有していた。６人の無縁のコントロールであってＣ−Ｂ
ＣＤ５４１及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子の両方を有する
者及び２人のコントロールであってＴ−ＢＣＤ５４１遺
伝子のみを有する者をこの研究に含ませた。
転写ベースＰＣＲを利用することにより、Ｃ−ＢＣＤ５
４１をＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子から区別させた。１１人
のＳＭＡ患者をノーザンブロット又は逆転写ベースＰＣ
Ｒ増幅によりその転写体の分析について選別した。その
うちの８人はＩ型に、１人はII型に、そして２人が III
型に属した。ゲノムＤＮＡのＳＳＣＰ分析は、１０人の
患者におけるＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のなさを示し、そ
して１人の患者（ＳＡ）はエクソン７及び８の両方につ
いてのＣ−ＢＣＤ５４１及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を
有していた。６人の無縁のコントロールであってＣ−Ｂ
ＣＤ５４１及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子の両方を有する
者及び２人のコントロールであってＴ−ＢＣＤ５４１遺
伝子のみを有する者をこの研究に含ませた。
【０１２９】リンホブラストにおけるこの遺伝子の発現
は、コントロール及びＳＭＡ患者に由来する細胞系にお
けるＢＣＤ５４１転写体の分析を可能にした。リンホブ
ラストイド細胞系由来のＲＮＡのノーザンブロット分析
は、全サンプルにおける１．７kbのｍＲＮＡの存在を示
した。どのＳＭＡ患者も、サイズの変った転写体を示さ
なかった。４人のＩ型ＳＭＡ患者のうちの３人におい
て、β−アクチン遺伝子の発現と比べたときに、転写レ
ベルの低下は認められなかった。その他のＳＭＡプロバ
ンドにとっての正常なｍＲＮＡレベルが認められた。
は、コントロール及びＳＭＡ患者に由来する細胞系にお
けるＢＣＤ５４１転写体の分析を可能にした。リンホブ
ラストイド細胞系由来のＲＮＡのノーザンブロット分析
は、全サンプルにおける１．７kbのｍＲＮＡの存在を示
した。どのＳＭＡ患者も、サイズの変った転写体を示さ
なかった。４人のＩ型ＳＭＡ患者のうちの３人におい
て、β−アクチン遺伝子の発現と比べたときに、転写レ
ベルの低下は認められなかった。その他のＳＭＡプロバ
ンドにとっての正常なｍＲＮＡレベルが認められた。
【０１３０】ノーザンブロット分析は、ＳＳＣＰ分析に
よる決定に従いエクソン７及び８の両者についてのみの
Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子を有するＳＭＡ患者において、
転写体の存在を示したため、これらの結果は、Ｃ−ＢＣ
Ｄ５４１及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子が共に発現された
ことを示唆する。両ＢＣＤ５４１遺伝子が発現されたか
を証明するため、コントロール及びＳＭＡ患者由来のリ
ンホブラストイド細胞系から単離したＲＮＡのＲＴ−ベ
ースＰＣＲ増幅を利用した。エクソン７及び８に隣接す
るＰＣＲ生成物の直接配列決定は、Ｃ−ＢＣＤ５４１の
みを有する患者がＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子に特異的な配
列を示すことを示した。Ｔ−ＢＣＤ５４１及びＣ−ＢＣ
Ｄ５４１遺伝子の両方を有するコントロールは両ＢＣＤ
５４１遺伝子に対応する２種の転写体を有していた。こ
の結果は、両遺伝子が発現されたことを確証せしめる。
更に、異なる転写体をもたらすエクソン５又はエクソン
７が関与する２つの別のスプライシングが観察された。
エクソン５の別のスプライシングは、ｃＤＮＡクローン
上の従来の配列データーを確証せしめた。
よる決定に従いエクソン７及び８の両者についてのみの
Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子を有するＳＭＡ患者において、
転写体の存在を示したため、これらの結果は、Ｃ−ＢＣ
Ｄ５４１及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子が共に発現された
ことを示唆する。両ＢＣＤ５４１遺伝子が発現されたか
を証明するため、コントロール及びＳＭＡ患者由来のリ
ンホブラストイド細胞系から単離したＲＮＡのＲＴ−ベ
ースＰＣＲ増幅を利用した。エクソン７及び８に隣接す
るＰＣＲ生成物の直接配列決定は、Ｃ−ＢＣＤ５４１の
みを有する患者がＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子に特異的な配
列を示すことを示した。Ｔ−ＢＣＤ５４１及びＣ−ＢＣ
Ｄ５４１遺伝子の両方を有するコントロールは両ＢＣＤ
５４１遺伝子に対応する２種の転写体を有していた。こ
の結果は、両遺伝子が発現されたことを確証せしめる。
更に、異なる転写体をもたらすエクソン５又はエクソン
７が関与する２つの別のスプライシングが観察された。
エクソン５の別のスプライシングは、ｃＤＮＡクローン
上の従来の配列データーを確証せしめた。
【０１３１】エクソン６〜８を包括するＲＴ−ＰＣＲ増
幅生成物の分析は、エクソン７を保持しているスプライ
スされた転写体が、Ｃ−ＢＣＤ５４１及びＴ−ＢＣＤ５
４１遺伝子の両者を有するコントロール並びにＴ−ＢＣ
Ｄ５４１遺伝子のみを有するコントロールにおいて存在
していることを示した。逆に、エクソン７を欠く別のス
プライスされた転写体は、両方の遺伝子を有するコント
ロールにおいては認められたが、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝
子のみを有するコントロールにおいては認められなかっ
た。これらの結果は、エクソン７を欠く別のスプライス
された転写体はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のみに由来する
ことを示唆する。
幅生成物の分析は、エクソン７を保持しているスプライ
スされた転写体が、Ｃ−ＢＣＤ５４１及びＴ−ＢＣＤ５
４１遺伝子の両者を有するコントロール並びにＴ−ＢＣ
Ｄ５４１遺伝子のみを有するコントロールにおいて存在
していることを示した。逆に、エクソン７を欠く別のス
プライスされた転写体は、両方の遺伝子を有するコント
ロールにおいては認められたが、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝
子のみを有するコントロールにおいては認められなかっ
た。これらの結果は、エクソン７を欠く別のスプライス
された転写体はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のみに由来する
ことを示唆する。
【０１３２】Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のイントロン６の
３′スプライスアクセプター部位の７bpの欠損をもつ患
者ＳＡの転写体分析は、エクソン７を保持するスプライ
スされた転写体及びエクソン７を欠く別のスプライスさ
れた転写体の両方の存在を示す。更に、エクソン７を保
持しているスプライスされた転写体由来の増幅生成物の
配列分析は、Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子に特異的な配列を
示した（図２及び３）。これらの結果は、患者ＳＡにお
いて認められたイントロン６の７bpの欠損がＴ−ＢＣＤ
５４１遺伝子のみのエクソン７の適正なスプライシング
にとって有害であることを示す。更に、エクソン７の示
差的なスプライシングは２ＢＣＤ５４１遺伝子の区別を
可能とするため、この相違をコントロールと、ＳＡ患者
を含むＳＭＡ患者との間で分析した。コントロールにお
いては、エクソン７を欠く別のスプライスされた転写体
の量はエクソン７を保持しているスプライスされた生成
物のそれより少なかった。逆に、ＳＭＡ患者において
は、エクソン７を欠く別のスプライスされた転写体の量
はエクソン７を保持しているスプライスされた生成物の
それと同等又はそれより多かった。
３′スプライスアクセプター部位の７bpの欠損をもつ患
者ＳＡの転写体分析は、エクソン７を保持するスプライ
スされた転写体及びエクソン７を欠く別のスプライスさ
れた転写体の両方の存在を示す。更に、エクソン７を保
持しているスプライスされた転写体由来の増幅生成物の
配列分析は、Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子に特異的な配列を
示した（図２及び３）。これらの結果は、患者ＳＡにお
いて認められたイントロン６の７bpの欠損がＴ−ＢＣＤ
５４１遺伝子のみのエクソン７の適正なスプライシング
にとって有害であることを示す。更に、エクソン７の示
差的なスプライシングは２ＢＣＤ５４１遺伝子の区別を
可能とするため、この相違をコントロールと、ＳＡ患者
を含むＳＭＡ患者との間で分析した。コントロールにお
いては、エクソン７を欠く別のスプライスされた転写体
の量はエクソン７を保持しているスプライスされた生成
物のそれより少なかった。逆に、ＳＭＡ患者において
は、エクソン７を欠く別のスプライスされた転写体の量
はエクソン７を保持しているスプライスされた生成物の
それと同等又はそれより多かった。
【０１３３】これらの結果は、これらの遺伝子の転写レ
ベルのでのコントロールとＳＭＡ患者との間での相違に
ついての証拠を供する。エクソン７を欠く別のスプライ
スされた転写体は、タンパク質融合に影響を及ぼしうる
別のＣ−末端タンパク質を有する短めのＯＲＦをもたら
す。
ベルのでのコントロールとＳＭＡ患者との間での相違に
ついての証拠を供する。エクソン７を欠く別のスプライ
スされた転写体は、タンパク質融合に影響を及ぼしうる
別のＣ−末端タンパク質を有する短めのＯＲＦをもたら
す。
【０１３４】ヒトＳＭＮ遺伝子の全体構造及び統合を更
に特性決定するため、３種のゲノムクローンをＹＡＣク
ローン５９５Ｃ１１由来のＦＩＸIIファージライブラリ
ーから単離し、そしてプローブとしての全長ＢＣＤ５４
１ ｃＤＮＡ（図２）でスクリーニングした。プローブ
にハイブリダイズする複数のクローンを選別後、制限地
図化及びサザンブロット分析は全ＳＭＮ遺伝子に広がる
ファージＬ−１３２，Ｌ−５及びＬ−１３を示唆した。
に特性決定するため、３種のゲノムクローンをＹＡＣク
ローン５９５Ｃ１１由来のＦＩＸIIファージライブラリ
ーから単離し、そしてプローブとしての全長ＢＣＤ５４
１ ｃＤＮＡ（図２）でスクリーニングした。プローブ
にハイブリダイズする複数のクローンを選別後、制限地
図化及びサザンブロット分析は全ＳＭＮ遺伝子に広がる
ファージＬ−１３２，Ｌ−５及びＬ−１３を示唆した。
【０１３５】これらの３つのファージクローンを更に、
Sambrookら前掲に開示のMaxam-Glbert又はSangerらの配
列決定法を利用して配列決定にかけた。
Sambrookら前掲に開示のMaxam-Glbert又はSangerらの配
列決定法を利用して配列決定にかけた。
【０１３６】エクソン及びイントロンを含む全ＳＭＮ遺
伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図１２及び１３
に示す。ヒト遺伝子は長さ約２０kbであり、そして図１
２及び１３に示すように８イントロンで分断された９つ
のエクソンより成る。ヒトＳＭＮ遺伝子は約３２kDA の
分子量を有する。
伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図１２及び１３
に示す。ヒト遺伝子は長さ約２０kbであり、そして図１
２及び１３に示すように８イントロンで分断された９つ
のエクソンより成る。ヒトＳＭＮ遺伝子は約３２kDA の
分子量を有する。
【０１３７】１つのエクソン２のみがＳＭＮ遺伝子の中
に存在しているものと考えられているにもかかわらず
（Lefebvreら、Cell, 80：155-165 (1995)) 、配列決定
データーは、Lefebvreら前掲における事前に述べられて
いるエクソン２が、図１１並びに１２及び１３に示して
いるように、更なるイントロンにより２つのエクソンに
分割されて成ることを証明した。エクソンの再番号付け
の混乱を避けるため、エクソン２の中の２つのエクソン
をエクソン２ａ及びエクソン２ｂと呼ぶ。
に存在しているものと考えられているにもかかわらず
（Lefebvreら、Cell, 80：155-165 (1995)) 、配列決定
データーは、Lefebvreら前掲における事前に述べられて
いるエクソン２が、図１１並びに１２及び１３に示して
いるように、更なるイントロンにより２つのエクソンに
分割されて成ることを証明した。エクソンの再番号付け
の混乱を避けるため、エクソン２の中の２つのエクソン
をエクソン２ａ及びエクソン２ｂと呼ぶ。
【０１３８】エクソン−イントロン境界は全てその他の
ヒト遺伝子において見い出せる共通配列を示し、そして
ポリアデニル化共通部位は停止コドンから５５bp下流に
位置する（図１２及び１３）。
ヒト遺伝子において見い出せる共通配列を示し、そして
ポリアデニル化共通部位は停止コドンから５５bp下流に
位置する（図１２及び１３）。
【０１３９】ＹＡＣクローン１２１Ｂ８又は５９５Ｃ１
１（これらはそれぞれＣ−ＢＣＤ５４１及びＳＭＮ遺伝
子を含む：Lefebvreら、前掲を参照のこと）のいづれか
から出発して、イントロンのＰＣＲ増幅及び配列分析
は、従来述べられているものの他に（Lefebvreら、前掲
による）ＳＭＮとＣ−ＢＣＤ５４１との間に３つの相違
を示した。これらにはイントロン６における２塩基の変
化（−４５bp／エクソン７、ａｔｇｔ、テロマー；ａｔ
ａｔ、セントロマー）及びイントロン７における塩の変
化（＋１００bp／エクソン７、ｔｔａａ、テロマー；ｔ
ｔａｇ、セントロマー、及び位置＋２１４bp／エクソン
７、ｔｔａｔ、テロマー；ｔｔｇｔ、セントロマー、図
１２及び１３）。両遺伝子を含むＹＡＣクローン（ＹＡ
Ｃ９２０Ｃ９）における及びコントロール集団における
両バージョンの存在は、これらの置換が、多形性に基づ
くものでなく、遺伝子座特異性であることを示す。ＰＣ
Ｒ増幅したイントロン７の一本鎖コンホメーション多形
性（ＳＳＣＰ）分析に基づくバンドシフトは、ＳＭＮ及
びそのセントロマー対応物（Ｃ−ＢＣＤ５４１）の容易
なる識別を可能とした（図１８参照のこと）。
１（これらはそれぞれＣ−ＢＣＤ５４１及びＳＭＮ遺伝
子を含む：Lefebvreら、前掲を参照のこと）のいづれか
から出発して、イントロンのＰＣＲ増幅及び配列分析
は、従来述べられているものの他に（Lefebvreら、前掲
による）ＳＭＮとＣ−ＢＣＤ５４１との間に３つの相違
を示した。これらにはイントロン６における２塩基の変
化（−４５bp／エクソン７、ａｔｇｔ、テロマー；ａｔ
ａｔ、セントロマー）及びイントロン７における塩の変
化（＋１００bp／エクソン７、ｔｔａａ、テロマー；ｔ
ｔａｇ、セントロマー、及び位置＋２１４bp／エクソン
７、ｔｔａｔ、テロマー；ｔｔｇｔ、セントロマー、図
１２及び１３）。両遺伝子を含むＹＡＣクローン（ＹＡ
Ｃ９２０Ｃ９）における及びコントロール集団における
両バージョンの存在は、これらの置換が、多形性に基づ
くものでなく、遺伝子座特異性であることを示す。ＰＣ
Ｒ増幅したイントロン７の一本鎖コンホメーション多形
性（ＳＳＣＰ）分析に基づくバンドシフトは、ＳＭＮ及
びそのセントロマー対応物（Ｃ−ＢＣＤ５４１）の容易
なる識別を可能とした（図１８参照のこと）。
【０１４０】プロモーター機能にとって潜在的に有能な
配列を同定するため、ＳＭＮ及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝
子のエクソン１のまわりの領域の統合を特性決定した。
制限地図化、サザンブロットハイブリダイゼーション及
びＰＣＲ増幅に基づき、エクソン１及びＣ２７２マーカ
ー（Ｄ５Ｆ１５０Ｓ１，Ｄ５Ｆ１５０Ｓ２）をＬ−１３
２ファージの同一のＢｇｌII−ＥｃｏＲＩ制限フラグメ
ントの上に載せた（図１１）。Ｃ２７２ｆプライマー及
びエクソン１の中で選んだリバースプライマーを用いる
ＰＣＲ増幅を行い、そして増幅生成物を直接配列決定し
た。配列分析は、Ｃ２７２マーカーに対応する（ＣＡ）
リピートが推定ＡＴＧ翻訳開始部位から４６３bp上流に
位置することを示した（図１４）。対比配列分析は、Ｓ
ＭＮ遺伝子の５′末端とそのセントロマー対応物（Ｃ−
ＢＣＤ５４１）との間に相違がないことを示した。更
に、配列分析は以下の転写因子にとっての推定結合部位
の存在を示した：ＡＰ−２，ＧＨ−ＣＳＥ２，ＤＴＦ−
１，Ｅ４ＦＩ，ＨｉＮＦ−Ａ，Ｈ４ＴＦ−１，β−ＩＦ
Ｎ，ＳｐＩ（図１４；Faisstら、Nucleic Acids Res.,
20：3-26 (1992))。
配列を同定するため、ＳＭＮ及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝
子のエクソン１のまわりの領域の統合を特性決定した。
制限地図化、サザンブロットハイブリダイゼーション及
びＰＣＲ増幅に基づき、エクソン１及びＣ２７２マーカ
ー（Ｄ５Ｆ１５０Ｓ１，Ｄ５Ｆ１５０Ｓ２）をＬ−１３
２ファージの同一のＢｇｌII−ＥｃｏＲＩ制限フラグメ
ントの上に載せた（図１１）。Ｃ２７２ｆプライマー及
びエクソン１の中で選んだリバースプライマーを用いる
ＰＣＲ増幅を行い、そして増幅生成物を直接配列決定し
た。配列分析は、Ｃ２７２マーカーに対応する（ＣＡ）
リピートが推定ＡＴＧ翻訳開始部位から４６３bp上流に
位置することを示した（図１４）。対比配列分析は、Ｓ
ＭＮ遺伝子の５′末端とそのセントロマー対応物（Ｃ−
ＢＣＤ５４１）との間に相違がないことを示した。更
に、配列分析は以下の転写因子にとっての推定結合部位
の存在を示した：ＡＰ−２，ＧＨ−ＣＳＥ２，ＤＴＦ−
１，Ｅ４ＦＩ，ＨｉＮＦ−Ａ，Ｈ４ＴＦ−１，β−ＩＦ
Ｎ，ＳｐＩ（図１４；Faisstら、Nucleic Acids Res.,
20：3-26 (1992))。
【０１４１】ヒトＳＭＮ遺伝子の単離及び特定決定の他
に、ＳＭＮ遺伝子のマウス同族体もクローニングした。
ヒトＳＭＮ遺伝子とげっ歯類との交差種保存性がLefebv
reら前掲に示され、そしてマウスＳＭＮ遺伝子の単離に
役立った。プローブとしてヒトＳＭＮ ｃＤＮＡを利用
するマウス胎児ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
は、２つの重複するマウスｃＤＮＡクローンの単離を可
能にした。クローンの配列分析は、８６４bpのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）を示した（図１５）。
ＯＲＦは、ヒトＳＭＮアミノ酸配列と８３％の相同性を
有する（図１６）２８８個のアミノ酸の推定タンパク質
（図１５）をコードする。
に、ＳＭＮ遺伝子のマウス同族体もクローニングした。
ヒトＳＭＮ遺伝子とげっ歯類との交差種保存性がLefebv
reら前掲に示され、そしてマウスＳＭＮ遺伝子の単離に
役立った。プローブとしてヒトＳＭＮ ｃＤＮＡを利用
するマウス胎児ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
は、２つの重複するマウスｃＤＮＡクローンの単離を可
能にした。クローンの配列分析は、８６４bpのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）を示した（図１５）。
ＯＲＦは、ヒトＳＭＮアミノ酸配列と８３％の相同性を
有する（図１６）２８８個のアミノ酸の推定タンパク質
（図１５）をコードする。
【０１４２】単離されたヒト又はマウスのＳＭＮのいづ
れであろうと、その遺伝子はｐＵＣ１８，ｐＢｒ３２
２，ｐＵＣ１００，λｇＨＩ，λ１８−２３，λＺＡ
Ｐ，λＯＲＦ８等の如くの様々なプラスミドに挿入でき
る。遺伝子を別のプラスミドベクターに挿入するための
方法はSambrookら前掲に記載されている。様々な微生物
が、ベクターを形質転換させてＳＭＮ遺伝子を生成する
のに使用できる。例えば、宿主微生物には、限定するこ
となく、酵母、ＣＨＯ細胞、Ｅ．コリ、バチルス・スブ
チリス等が含まれる。
れであろうと、その遺伝子はｐＵＣ１８，ｐＢｒ３２
２，ｐＵＣ１００，λｇＨＩ，λ１８−２３，λＺＡ
Ｐ，λＯＲＦ８等の如くの様々なプラスミドに挿入でき
る。遺伝子を別のプラスミドベクターに挿入するための
方法はSambrookら前掲に記載されている。様々な微生物
が、ベクターを形質転換させてＳＭＮ遺伝子を生成する
のに使用できる。例えば、宿主微生物には、限定するこ
となく、酵母、ＣＨＯ細胞、Ｅ．コリ、バチルス・スブ
チリス等が含まれる。
【０１４３】一旦組換えたら、ヒトＳＭＮタンパク質又
はマウスＳＭＮタンパク質は当業界公知の方法により宿
主培養物から更に精製できる。
はマウスＳＭＮタンパク質は当業界公知の方法により宿
主培養物から更に精製できる。
【０１４４】ＳＭＮタンパク質を組換的に生成する他
に、本発明はポリクローナル及びモノクローナル抗体を
製造することに関連する。これらの方法はSambrookら、
前掲により明示されている通り、当業界に公知である。
モノクローナル抗体は Kohlerand Milstein, Nature, 2
56 : 495 (1975)；Eur.J.Immunol., 6 : 511 (1976)又
はHarlow and Lane Antibodies, a Laboratory Manual
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
New York (1988)の手順により獲得でき、そして、例え
ばＳＭＡ及びその他の運動ニューロン障害の診断に利用
できる。
に、本発明はポリクローナル及びモノクローナル抗体を
製造することに関連する。これらの方法はSambrookら、
前掲により明示されている通り、当業界に公知である。
モノクローナル抗体は Kohlerand Milstein, Nature, 2
56 : 495 (1975)；Eur.J.Immunol., 6 : 511 (1976)又
はHarlow and Lane Antibodies, a Laboratory Manual
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
New York (1988)の手順により獲得でき、そして、例え
ばＳＭＡ及びその他の運動ニューロン障害の診断に利用
できる。
【０１４５】ポリクローナルウサギ抗血清もアミノ末端
及びカルボキシ末端を含むＳＭＮアミノ酸配列の任意の
部分に対応する合成ペプチドに対して作製されうる。よ
り詳しくは、以下のペプチドが図１に記載のアミノ酸に
基づいて合成できる：
及びカルボキシ末端を含むＳＭＮアミノ酸配列の任意の
部分に対応する合成ペプチドに対して作製されうる。よ
り詳しくは、以下のペプチドが図１に記載のアミノ酸に
基づいて合成できる：
【０１４６】
【化１７】
【０１４７】この合成ペプチドはキーホール・リンペッ
ト・ヘモシアニン（ＫＬＨ）の如くの担体タンパク質
に、所望の配列に合成付加できうるアミノ−又はカルボ
キシ−人工システイン残基を介して複合させることがで
きうる。システイン残基をその合成ペプチドを担体タン
パク質に複合させるリンカーとして使用してよい。合成
ペプチドをＫＬＨに複合するのに用いる手順は Greenら
Cell, 28：477 (1982)に記載されている。
ト・ヘモシアニン（ＫＬＨ）の如くの担体タンパク質
に、所望の配列に合成付加できうるアミノ−又はカルボ
キシ−人工システイン残基を介して複合させることがで
きうる。システイン残基をその合成ペプチドを担体タン
パク質に複合させるリンカーとして使用してよい。合成
ペプチドをＫＬＨに複合するのに用いる手順は Greenら
Cell, 28：477 (1982)に記載されている。
【０１４８】約５０〜１００μｇ、好ましくは１００μ
ｇの合成抗原をバッファーの中に溶かし、そして等容量
のフロインドの完全アジュバントで乳化させる。約０．
０２５ml〜０．５mlの乳化抗原アジュバントをウサギに
筋肉内的又は皮内的に注射できる。４〜６週間後に、そ
のウサギをブーストにかけ、そして各ブースター注射の
７〜１０日後に２０〜４０mlの血液を採血する。次いで
その血清をＲＩＡ，ＥＬＩＳＡ又は免疫沈殿を用いて抗
原の存在について試験する。陽性抗体画分は例えばGoud
swaaldら Scand.J.Immunol. 8：21 (1978) の方法に従
い、プロテインＡに対する吸着によって精製できる。
ｇの合成抗原をバッファーの中に溶かし、そして等容量
のフロインドの完全アジュバントで乳化させる。約０．
０２５ml〜０．５mlの乳化抗原アジュバントをウサギに
筋肉内的又は皮内的に注射できる。４〜６週間後に、そ
のウサギをブーストにかけ、そして各ブースター注射の
７〜１０日後に２０〜４０mlの血液を採血する。次いで
その血清をＲＩＡ，ＥＬＩＳＡ又は免疫沈殿を用いて抗
原の存在について試験する。陽性抗体画分は例えばGoud
swaaldら Scand.J.Immunol. 8：21 (1978) の方法に従
い、プロテインＡに対する吸着によって精製できる。
【０１４９】より詳しくは、上記の組換技術によって調
製した抗原又は合成的に作った抗原約２０〜５０μｇを
約１００mlのバッファーの中に希釈し、そして等量のフ
ロインドの完全アジュバントを乳化させる。約３０〜６
０、好ましくは５０μｌの乳化抗原−アジュバントをマ
ウスに４箇所において皮下注射する。４〜６週後、その
マウスを５〜１０μｇの抗原を含む約１００μｌのバッ
ファーの腹腔内注射によりブーストにかける。このマウ
スをブースター注射の７〜１０日後に中尾静脈から採血
し、そしてその血清を標準の方法を利用して試験した。
次いで血液を抗体力価が低下するまで３〜４日毎に採血
した。
製した抗原又は合成的に作った抗原約２０〜５０μｇを
約１００mlのバッファーの中に希釈し、そして等量のフ
ロインドの完全アジュバントを乳化させる。約３０〜６
０、好ましくは５０μｌの乳化抗原−アジュバントをマ
ウスに４箇所において皮下注射する。４〜６週後、その
マウスを５〜１０μｇの抗原を含む約１００μｌのバッ
ファーの腹腔内注射によりブーストにかける。このマウ
スをブースター注射の７〜１０日後に中尾静脈から採血
し、そしてその血清を標準の方法を利用して試験した。
次いで血液を抗体力価が低下するまで３〜４日毎に採血
した。
【０１５０】上記のモノクローナル又はポリクローナル
抗体を用いてＳＭＡ障害を検査するのに、ウェスタンブ
ロット（１又は２次元）又はＥＬＩＳＡにより、組織、
血漿、血清、脊髄流体等を利用してよい。これらの方法
は当業界に公知であり、そしてSambrookら、前掲に記載
されている。
抗体を用いてＳＭＡ障害を検査するのに、ウェスタンブ
ロット（１又は２次元）又はＥＬＩＳＡにより、組織、
血漿、血清、脊髄流体等を利用してよい。これらの方法
は当業界に公知であり、そしてSambrookら、前掲に記載
されている。
【０１５１】運動ニューロン障害を有する可能性のある
ＳＭＡ並びにＡＬＳ、ＡＣＭ及びＰＬＳ患者の検査のた
めの方法も本発明に含まれる。この方法は、ＳＭＡを有
すると予測される患者の試料からＤＮＡを抽出すること
を含む。この試料は血清、血漿、脊髄流体等であってよ
い。当業界に公知の方法によりＤＮＡを抽出した後、Ｓ
ＭＮ遺伝子のエクソン７及び８由来のプライマーをその
ＤＮＡの増幅のために用いる。
ＳＭＡ並びにＡＬＳ、ＡＣＭ及びＰＬＳ患者の検査のた
めの方法も本発明に含まれる。この方法は、ＳＭＡを有
すると予測される患者の試料からＤＮＡを抽出すること
を含む。この試料は血清、血漿、脊髄流体等であってよ
い。当業界に公知の方法によりＤＮＡを抽出した後、Ｓ
ＭＮ遺伝子のエクソン７及び８由来のプライマーをその
ＤＮＡの増幅のために用いる。
【０１５２】プライマーによる増幅後、増幅生成物をＳ
ＳＣＰ（一本鎖コンホメーション多形性）に委ねる。
ＳＣＰ（一本鎖コンホメーション多形性）に委ねる。
【０１５３】次いでゲルをオートラジオグラフィーにか
け、ＳＭＡが試料中に存在しているかを調べる。
け、ＳＭＡが試料中に存在しているかを調べる。
【０１５４】より詳しくは、ＳＭＡに係る先天性多発性
関節拘縮症（ＡＭＣ）の１２例において、１２人の患者
のうちの６人がＳＭＮ遺伝子を欠くことが発見された。
関節拘縮症（ＡＭＣ）の１２例において、１２人の患者
のうちの６人がＳＭＮ遺伝子を欠くことが発見された。
【０１５５】様々な地理上の起源の８人の男性及び４人
の女性を含む全部で１２人無縁の患者を研究のために選
んだ。これらの患者は、彼らが以下に該当することの基
準に基づいて選んだ： （１）身体の少なくとも２箇所の領域の先天的関節拘縮
（Stern , JAMA, 81：1507-1510 (1923)参照のこと）； （２）筋肉萎縮及び眼球外振幅のない反射消失を伴う全
身筋肉虚弱化； （３）筋電図が脱神経及び低下した運動活動電位振幅を
示す；並びに （４）貯蔵物質又はその他の構造的異常の徴候のない脱
神経を一貫して伴う筋肉生検(Munstat, Neuromuscular
Disorders , 1 : 81 (1991))。
の女性を含む全部で１２人無縁の患者を研究のために選
んだ。これらの患者は、彼らが以下に該当することの基
準に基づいて選んだ： （１）身体の少なくとも２箇所の領域の先天的関節拘縮
（Stern , JAMA, 81：1507-1510 (1923)参照のこと）； （２）筋肉萎縮及び眼球外振幅のない反射消失を伴う全
身筋肉虚弱化； （３）筋電図が脱神経及び低下した運動活動電位振幅を
示す；並びに （４）貯蔵物質又はその他の構造的異常の徴候のない脱
神経を一貫して伴う筋肉生検(Munstat, Neuromuscular
Disorders , 1 : 81 (1991))。
【０１５６】この研究は、１２人の患者の末梢血液白血
球、リンホブラストイド細胞系又は筋肉組織から抽出し
たＤＮＡに基づくジヌクレオチド・リピート・ポリモル
フィズム・分析及びＳＭＮ遺伝子分析（実施例参照のこ
と）より成る。
球、リンホブラストイド細胞系又は筋肉組織から抽出し
たＤＮＡに基づくジヌクレオチド・リピート・ポリモル
フィズム・分析及びＳＭＮ遺伝子分析（実施例参照のこ
と）より成る。
【０１５７】この研究由来のデーターを以降の表１にま
とめる。
とめる。
【０１５８】診断は、ひどい緊張低下、眼球外運動を除
く動きのなさ及び少なくとも２箇所の関節での拘縮を特
徴とする不均一な表現型を誕生時に行った。冒された関
節及びひどい体位性欠陥の数は子供間で異なり、それを
表１に示す。低下した胎児の運動は１２人の患者のうち
の７人（７／１２）において認められた。新生児の呼吸
困難は１２人の患者のうち９人（９／１２）に見い出さ
れ、小顎症に係る顔面麻痺は１２人の患者のうち４人
（４／１２）において認められた。ほとんどの場合、１
２人のうちの８人（８／１２）が生後１ヶ月以内で死亡
した。４人の新生児はまで生存している。子供及び父親
が冒されており、ＡＭＣの常染色体優勢形態が示唆され
る家族１２を除き、家族歴はなかった。
く動きのなさ及び少なくとも２箇所の関節での拘縮を特
徴とする不均一な表現型を誕生時に行った。冒された関
節及びひどい体位性欠陥の数は子供間で異なり、それを
表１に示す。低下した胎児の運動は１２人の患者のうち
の７人（７／１２）において認められた。新生児の呼吸
困難は１２人の患者のうち９人（９／１２）に見い出さ
れ、小顎症に係る顔面麻痺は１２人の患者のうち４人
（４／１２）において認められた。ほとんどの場合、１
２人のうちの８人（８／１２）が生後１ヶ月以内で死亡
した。４人の新生児はまで生存している。子供及び父親
が冒されており、ＡＭＣの常染色体優勢形態が示唆され
る家族１２を除き、家族歴はなかった。
【０１５９】表１は、１２人の患者のうちの６人（６／
１２）（症例１〜６）における両突然変異染色体上でＳ
ＭＮ遺伝子が欠損していることを示す。そのうち、６人
の患者のうちの３人（３／６）が一方の親アレル上のマ
ーカーＣ２１２及びＣ２７２により検出される両遺伝子
座に係る大きな遺伝的欠損を有し、他方の親アレルは図
１７に示している通り、予測の２つでなく１つの遺伝子
のみを有する。
１２）（症例１〜６）における両突然変異染色体上でＳ
ＭＮ遺伝子が欠損していることを示す。そのうち、６人
の患者のうちの３人（３／６）が一方の親アレル上のマ
ーカーＣ２１２及びＣ２７２により検出される両遺伝子
座に係る大きな遺伝的欠損を有し、他方の親アレルは図
１７に示している通り、予測の２つでなく１つの遺伝子
のみを有する。
【０１６０】ＳＭＮエクソンの分析はＳＭＮ遺伝子が欠
損を示さない患者において遺伝子内突然変異を示さない
（症例７〜１２）。遺伝子分析は、家族における障害遺
伝子（症例９）が染色体５ｑ１３に連結されていないこ
とを示し、なぜなら冒された及び健康な子孫の両者が同
一の５ｑ１３ハロタイプを有するからである。これらの
データーは、ＳＭＮ遺伝子が欠損を示さない患者の遺伝
子が５ｑ１３ ＳＭＡ遺伝子座と連結していないことを
強く裏付ける（症例７〜１２）。
損を示さない患者において遺伝子内突然変異を示さない
（症例７〜１２）。遺伝子分析は、家族における障害遺
伝子（症例９）が染色体５ｑ１３に連結されていないこ
とを示し、なぜなら冒された及び健康な子孫の両者が同
一の５ｑ１３ハロタイプを有するからである。これらの
データーは、ＳＭＮ遺伝子が欠損を示さない患者の遺伝
子が５ｑ１３ ＳＭＡ遺伝子座と連結していないことを
強く裏付ける（症例７〜１２）。
【０１６１】現在まで、関節拘縮症はＳＭＡ専用の基準
として認められている（Munsat, 前掲）。しかし、１２
人の患者のうちの６人（６／１２）におけるＳＭＮ遺伝
子の欠損の観察は、神経原性起源の関節拘縮症がＳＭＡ
に関連し、そしてこのサブグループ及びＳＭＡがアレル
障害であることを強く示唆する。しかし、神経原性のＡ
ＭＣは遺伝的に異種の症状であり、なぜなら障害遺伝子
は１２人の患者のうちの６人（６／１２）におけるＳＭ
Ｎ遺伝子座に連結していなかったからである。染色体５
ｑの排除もLuntら、J.Med.Genet. 29 : 273(要約)(199
2) に記載の通り、２人のＡＭＣ−ＳＭＡ患者を有する
一の家族において示された。
として認められている（Munsat, 前掲）。しかし、１２
人の患者のうちの６人（６／１２）におけるＳＭＮ遺伝
子の欠損の観察は、神経原性起源の関節拘縮症がＳＭＡ
に関連し、そしてこのサブグループ及びＳＭＡがアレル
障害であることを強く示唆する。しかし、神経原性のＡ
ＭＣは遺伝的に異種の症状であり、なぜなら障害遺伝子
は１２人の患者のうちの６人（６／１２）におけるＳＭ
Ｎ遺伝子座に連結していなかったからである。染色体５
ｑの排除もLuntら、J.Med.Genet. 29 : 273(要約)(199
2) に記載の通り、２人のＡＭＣ−ＳＭＡ患者を有する
一の家族において示された。
【０１６２】従って、ジヌクレオチド・リピート・ポリ
モルフィズム・分析及びＳＭＮ遺伝分析により、ＡＭＣ
の臨床診断はＳＭＮ遺伝子のなさ又は分断により確認で
きた。本発明は生存患者又は子宮内のいづれかのＡＭＣ
を検査する方法を提供する。
モルフィズム・分析及びＳＭＮ遺伝分析により、ＡＭＣ
の臨床診断はＳＭＮ遺伝子のなさ又は分断により確認で
きた。本発明は生存患者又は子宮内のいづれかのＡＭＣ
を検査する方法を提供する。
【０１６３】本発明の更なる別の態様は、図４及び５、
図１２及び１３に示すヌクレオチド配列又は図１５のマ
ウスＳＭＡに基づく特異的なオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いるＳＭＡの検査にある。もし患者が総合的にＳ
ＭＮ遺伝子を欠くなら、特異的なプローブとのハイブリ
ダイゼーションは起こらない。ハイブリダイゼーション
条件は使用する試料のタイプに依存して変わりうる。か
かるハイブリダイゼーション分析は、当業界に公知であ
り、且つSambrookら前提に記載のストリンジェンシー条
件下で行うことが好ましい。このオリゴヌクレオチドプ
ローブは酵素、放射能等の如くのあらゆる手段でラベル
できうる。ラジオラベル化プローブを利用することが好
ましい。
図１２及び１３に示すヌクレオチド配列又は図１５のマ
ウスＳＭＡに基づく特異的なオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いるＳＭＡの検査にある。もし患者が総合的にＳ
ＭＮ遺伝子を欠くなら、特異的なプローブとのハイブリ
ダイゼーションは起こらない。ハイブリダイゼーション
条件は使用する試料のタイプに依存して変わりうる。か
かるハイブリダイゼーション分析は、当業界に公知であ
り、且つSambrookら前提に記載のストリンジェンシー条
件下で行うことが好ましい。このオリゴヌクレオチドプ
ローブは酵素、放射能等の如くのあらゆる手段でラベル
できうる。ラジオラベル化プローブを利用することが好
ましい。
【０１６４】本発明の別の態様において、ヒトＳＭＮ遺
伝子はＳＭＡ又は関連の運動ニューロン障害に苦しむ患
者に直接インビボ投与するための、又は骨髄細胞、上皮
細胞、線維芽細胞にインビトロ投与し、次いで患者に投
与するためのウィルス又は非ウィルスベクターと一緒に
利用できうる。例えば Resenfeldら、Science (1991)
252 、頁 431〜434 を参照のこと。
伝子はＳＭＡ又は関連の運動ニューロン障害に苦しむ患
者に直接インビボ投与するための、又は骨髄細胞、上皮
細胞、線維芽細胞にインビトロ投与し、次いで患者に投
与するためのウィルス又は非ウィルスベクターと一緒に
利用できうる。例えば Resenfeldら、Science (1991)
252 、頁 431〜434 を参照のこと。
【０１６５】本発明は胎児におけるＳＭＮ遺伝子の欠陥
又はＳＭＮ遺伝子全体の欠失を検査する方法を提供す
る。妊婦から採取した羊水を本発明に係る方法に従って
ＳＳＣＰ分析にかける。
又はＳＭＮ遺伝子全体の欠失を検査する方法を提供す
る。妊婦から採取した羊水を本発明に係る方法に従って
ＳＳＣＰ分析にかける。
【０１６６】
【実施例】実施例１ １２１Ｂ８，５９５Ｃ１１及び９０３Ｄ１ ＹＡＣクロ
ーンからのファージライブラリーの構築。Ｃ２１２，Ｃ
２７２及びＣ１６１により検出されるテロマー遺伝子座
を含むＹＡＣクローン５９５Ｃ１１、又はこれらのマー
カーにより検出されるセントロマー遺伝子座を含むＹＡ
Ｃクローン１２１Ｂ８、又は両遺伝子座を含む９０３Ｄ
１ＹＡＣクローンからの全酵母ＤＮＡを精製し、そして
Ｓａｕ３Ａで部分消化した。１２〜２３kbのサイズ範囲
のＤＮＡを０．５％のSeaplaque ＧＴＧアガロースゲル
電気泳動後に切り出し、そしてβ−アガロース消化後に
エタノールで沈殿させた。Ｓａｕ３Ａ部位の部分フィル
・インの後、ＤＮＡをバクテリオファージＦＩＸ III
（Stratagene）の部分的に補完したＸｈｏＩ部位におい
て、サブクローニングした。マイクロサテライトＤＮＡ
マーカーＣ２１２（Ｌ−５１），Ｃ２７２（Ｌ−５１，
Ｌ−１３２），Ｃ１７１（Ｌ−５，Ｌ−１３），Ｃ１６
１（５９５Ｂ１）、１１Ｍ１（Ｌ−１１），ＡＦＭ５７
ｘｄ１０（Ｌ−１３１）を含むλクローンをＥｃｓＲＩ
もしくはＨｉｎｄIII のいづれか又はその両者で消化
し、そしてｐＵＣ１８プラスミドベクターの中にサブク
ローニングした。マーカーＣ２１２（ｐ３２２），Ｃ２
７２（１３２ＳＥ１１），Ｃ１６１（Ｈｅ３），ＡＦＭ
５７ｘｄ１０（１３１ｘｂ４）及びＣＭＳ１（ｐ１１Ｍ
１）を含むファージ由来のサブクローンをプローブとし
て用いた。
ーンからのファージライブラリーの構築。Ｃ２１２，Ｃ
２７２及びＣ１６１により検出されるテロマー遺伝子座
を含むＹＡＣクローン５９５Ｃ１１、又はこれらのマー
カーにより検出されるセントロマー遺伝子座を含むＹＡ
Ｃクローン１２１Ｂ８、又は両遺伝子座を含む９０３Ｄ
１ＹＡＣクローンからの全酵母ＤＮＡを精製し、そして
Ｓａｕ３Ａで部分消化した。１２〜２３kbのサイズ範囲
のＤＮＡを０．５％のSeaplaque ＧＴＧアガロースゲル
電気泳動後に切り出し、そしてβ−アガロース消化後に
エタノールで沈殿させた。Ｓａｕ３Ａ部位の部分フィル
・インの後、ＤＮＡをバクテリオファージＦＩＸ III
（Stratagene）の部分的に補完したＸｈｏＩ部位におい
て、サブクローニングした。マイクロサテライトＤＮＡ
マーカーＣ２１２（Ｌ−５１），Ｃ２７２（Ｌ−５１，
Ｌ−１３２），Ｃ１７１（Ｌ−５，Ｌ−１３），Ｃ１６
１（５９５Ｂ１）、１１Ｍ１（Ｌ−１１），ＡＦＭ５７
ｘｄ１０（Ｌ−１３１）を含むλクローンをＥｃｓＲＩ
もしくはＨｉｎｄIII のいづれか又はその両者で消化
し、そしてｐＵＣ１８プラスミドベクターの中にサブク
ローニングした。マーカーＣ２１２（ｐ３２２），Ｃ２
７２（１３２ＳＥ１１），Ｃ１６１（Ｈｅ３），ＡＦＭ
５７ｘｄ１０（１３１ｘｂ４）及びＣＭＳ１（ｐ１１Ｍ
１）を含むファージ由来のサブクローンをプローブとし
て用いた。
【０１６７】実施例２ パルス・フィールド・ゲル電気泳動分析 高分子量のＤＮＡを、上記の通りコントロール及び患者
から樹立したEpstein-Barrウィルス形質転換リンホブラ
ストイド細胞系又はＹＡＣクローンから、アガロースプ
ラグにおいて単離した。プラグを１０〜２０min.vol.づ
つのＴＥで３０分、２回すすいだ。このプラグを、０．
１mg／mlのＢＳＡ(Pharmacia) を含む０．３mlの適当な
制限酵素バッファーで４℃で３０分平衡にした。次いで
過剰のバッファーを除き、そしてプラグを一回の反応当
り４０Ｕの制限酵素で１６ｈ適温でインキュベートし
た。ＤＮＡを制限酵素ＢｓｓＨII，ＥａｇＩ，Ｓｆｉ
Ｉ，ＳａｃＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃII，ＳｐｅＩで消化し
た。ＤＮＡフラグメントの分離はＣＨＥＦ− III−ＤＲ
ＰＧＦＥ装置（Biorad) を用いて行った。５０〜１２
００kbのフラグメントを１％のアガロースSeakemを通じ
て、２００Ｖ、２４ｈ、１４℃で、３０〜７０分のラン
ピングパルス時間を用い、０．５×ＴＢＥランニングバ
ッファーで電気泳動させることにより分離した。５〜１
００kbのフラグメントの分離は２００Ｖ、１９ｈ、１４
℃で、５−２０分のランピングパルス時間を用い、０．
５×ＴＢＥバッファーで電気泳動させることにより行っ
た。０．２５ＮのＨＣｌで２０分処理した後、パルスに
かけたフィールドゲルを０．４ＭのＮａＯＨ、０．４Ｍ
のＮａＣｌの中で２０ｈかけて Hybond N+ Nylon膜 (Am
ersham) にブロットした。プローブを順に同じフィルタ
ーにハイブリダイズして正確なデーターを確実なものと
した。ハイブリダイゼーションは上記の通りに実施し
た。
から樹立したEpstein-Barrウィルス形質転換リンホブラ
ストイド細胞系又はＹＡＣクローンから、アガロースプ
ラグにおいて単離した。プラグを１０〜２０min.vol.づ
つのＴＥで３０分、２回すすいだ。このプラグを、０．
１mg／mlのＢＳＡ(Pharmacia) を含む０．３mlの適当な
制限酵素バッファーで４℃で３０分平衡にした。次いで
過剰のバッファーを除き、そしてプラグを一回の反応当
り４０Ｕの制限酵素で１６ｈ適温でインキュベートし
た。ＤＮＡを制限酵素ＢｓｓＨII，ＥａｇＩ，Ｓｆｉ
Ｉ，ＳａｃＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃII，ＳｐｅＩで消化し
た。ＤＮＡフラグメントの分離はＣＨＥＦ− III−ＤＲ
ＰＧＦＥ装置（Biorad) を用いて行った。５０〜１２
００kbのフラグメントを１％のアガロースSeakemを通じ
て、２００Ｖ、２４ｈ、１４℃で、３０〜７０分のラン
ピングパルス時間を用い、０．５×ＴＢＥランニングバ
ッファーで電気泳動させることにより分離した。５〜１
００kbのフラグメントの分離は２００Ｖ、１９ｈ、１４
℃で、５−２０分のランピングパルス時間を用い、０．
５×ＴＢＥバッファーで電気泳動させることにより行っ
た。０．２５ＮのＨＣｌで２０分処理した後、パルスに
かけたフィールドゲルを０．４ＭのＮａＯＨ、０．４Ｍ
のＮａＣｌの中で２０ｈかけて Hybond N+ Nylon膜 (Am
ersham) にブロットした。プローブを順に同じフィルタ
ーにハイブリダイズして正確なデーターを確実なものと
した。ハイブリダイゼーションは上記の通りに実施し
た。
【０１６８】実施例３ ＹＡＣライブラリースクリーニング ＣＥＰＨからのＹＡＣライブラリーをマイクロサテライ
トＣ２１２，Ｃ２７２，Ｃ１７１，ＣＭＳ１及びＣ１６
１によるＰＣＲによりスクリーニングした。ＹＡＣゲノ
タイプを変性ポリアクリルアミドゲル上でのＰＣＲ生成
物の電気泳動により樹立した。ＹＡＣのサイズはパルス
・フィールド・ゲル電気泳動により推定した。
トＣ２１２，Ｃ２７２，Ｃ１７１，ＣＭＳ１及びＣ１６
１によるＰＣＲによりスクリーニングした。ＹＡＣゲノ
タイプを変性ポリアクリルアミドゲル上でのＰＣＲ生成
物の電気泳動により樹立した。ＹＡＣのサイズはパルス
・フィールド・ゲル電気泳動により推定した。
【０１６９】実施例４ サザンブロット分析 ＤＮＡサンプルを末梢血液白血球又はリンホブラストイ
ド細胞系のいづれかから抽出した。ＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII ，ＢｇｌII，ＸｂａＩ，Ｐｖｕ
II，ＸｍｎＩ，ＲｓａＩ，ＰｓｔＩ，ＢａｍＨＩにより
消化し、サザンブロッティングのために０．８％のアガ
ロースゲルで電気泳動することにより分離し、そして放
射性ラベルプローブとハイブリダイズさせた。
ド細胞系のいづれかから抽出した。ＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII ，ＢｇｌII，ＸｂａＩ，Ｐｖｕ
II，ＸｍｎＩ，ＲｓａＩ，ＰｓｔＩ，ＢａｍＨＩにより
消化し、サザンブロッティングのために０．８％のアガ
ロースゲルで電気泳動することにより分離し、そして放
射性ラベルプローブとハイブリダイズさせた。
【０１７０】実施例５ ジヌクレオチド・リピート・多形性 ゲノタイプデーターをＣ２１２（Ｄ５Ｆ１４９Ｓ１，−
Ｓ２），Ｃ２７２（ＤＦ５１５０Ｓ１，−Ｓ２）及びＣ
１６１（ＤＦ５１５３Ｓ１，−Ｓ２）ジヌクレオチドリ
ピートのために獲得した。増幅条件は下記の通りとし
た：９４℃での変性、５５℃でのアニーリング、及び７
２℃での伸長（１min づつ、３０サイクル）。ジヌクレ
オチドリピート多形性の検出のために用いた手順は公知
である。
Ｓ２），Ｃ２７２（ＤＦ５１５０Ｓ１，−Ｓ２）及びＣ
１６１（ＤＦ５１５３Ｓ１，−Ｓ２）ジヌクレオチドリ
ピートのために獲得した。増幅条件は下記の通りとし
た：９４℃での変性、５５℃でのアニーリング、及び７
２℃での伸長（１min づつ、３０サイクル）。ジヌクレ
オチドリピート多形性の検出のために用いた手順は公知
である。
【０１７１】実施例６ ｃＤＮＡクローン及びＤＮＡ配列決定 λｇｔ１０ヒト胎児脳ライブラリーの２百万個の組換体
を製造者（Clontech)に従ってプレート培養した。プリ
ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは
１０％の硫酸デキストランナトリウム、１ＭのＮａＣ
ｌ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．５、０．０
０５ＭのＥＤＴＡ及び１％のＳＤＳと、２００mg／mlの
剪断ヒト胎盤ＤＮＡ(Sigma）との中で６５℃で１６時間
行った。このフィルターを０．１×ＳＳＥＰ−０．１％
のＳＤＳの中で６５℃で洗い、そしてオートラジオグラ
フィーを２４時間行った。陽性ｃＤＮＡクローンのＤＮ
Ａを精製し、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてＭ１３バクテ
リオファージの中にサブクローニングした。一本鎖ＤＮ
ＡをDye Deoxy(商標）ターミネーター・サイクル・シー
ケンシング・キットを用い、Applied Biosystems, Inc.
より供給のプロトコールに従って配列決定し、そしてＡ
ＢＩモデル３７３Ａ ＤＮＡ自動シーケンサーで分析し
た。ｃＤＮＡの３′末端とそのポリ（Ａ）+ テールとを
獲得するため、リンホブラストイド細胞系ｃＤＮＡライ
ブラリーのＰＣＲ増幅をこのクローンの３′末端に相補
性の特異的なプライマー及びｃＤＮＡライブラリーのベ
クターアームに特異的なプライマーを用い、従来記載の
通りに行った(Fouriner B., Saudubray, J.M., Benicho
u B.ら、1994 J.Clin.Invest. 94 : 526-531)。特異的
なＰＣＲ生成物をDye Deoxy(商標）ターミネーター・サ
イクル・シーケンシング・キットを用い、Applied Bios
ystems, Inc.により供給されたプロトコールに従い直接
配列決定し、そしてＡＢＩモデル３７３Ａ ＤＮＡ自動
シーケンサーで分析した。
を製造者（Clontech)に従ってプレート培養した。プリ
ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは
１０％の硫酸デキストランナトリウム、１ＭのＮａＣ
ｌ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．５、０．０
０５ＭのＥＤＴＡ及び１％のＳＤＳと、２００mg／mlの
剪断ヒト胎盤ＤＮＡ(Sigma）との中で６５℃で１６時間
行った。このフィルターを０．１×ＳＳＥＰ−０．１％
のＳＤＳの中で６５℃で洗い、そしてオートラジオグラ
フィーを２４時間行った。陽性ｃＤＮＡクローンのＤＮ
Ａを精製し、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてＭ１３バクテ
リオファージの中にサブクローニングした。一本鎖ＤＮ
ＡをDye Deoxy(商標）ターミネーター・サイクル・シー
ケンシング・キットを用い、Applied Biosystems, Inc.
より供給のプロトコールに従って配列決定し、そしてＡ
ＢＩモデル３７３Ａ ＤＮＡ自動シーケンサーで分析し
た。ｃＤＮＡの３′末端とそのポリ（Ａ）+ テールとを
獲得するため、リンホブラストイド細胞系ｃＤＮＡライ
ブラリーのＰＣＲ増幅をこのクローンの３′末端に相補
性の特異的なプライマー及びｃＤＮＡライブラリーのベ
クターアームに特異的なプライマーを用い、従来記載の
通りに行った(Fouriner B., Saudubray, J.M., Benicho
u B.ら、1994 J.Clin.Invest. 94 : 526-531)。特異的
なＰＣＲ生成物をDye Deoxy(商標）ターミネーター・サ
イクル・シーケンシング・キットを用い、Applied Bios
ystems, Inc.により供給されたプロトコールに従い直接
配列決定し、そしてＡＢＩモデル３７３Ａ ＤＮＡ自動
シーケンサーで分析した。
【０１７２】実施例７ ＲＮＡの単離及びノーザンブロット分析 コントロール及びＳＭＡ患者のリンホブラスト細胞系由
来のｍＲＮＡを QuickPrep mRNA精製キット(Pharmacia)
により、供給者の手順に従って単離した。全ＤＮＡはC
homczynski and Sacchi (Analytic Biochemistry , 162
：156-159 (1987)) に記載の一段ＲＮＡ単離法に従っ
て調製した。全ＲＮＡ調製品をＲＱ１−ＤＮＡｓｅ(Pro
mega) で処理して全ての夾雑ゲノムＤＮＡを除去した。
ノーザンブロットをｍＲＮＡ及び全ＲＮＡから、メチル
水酸化水銀を含む１．５％のSeakemアガロースゲルを通
じる電気泳動により作り、そして２０×ＳＳＣ中の正帯
電膜に移し、そして８０℃で２時間加熱した。32Ｐ−ラ
ジオラベルＤＮＡプローブを製造者（Boehringer) に従
うランダムプライミング法により合成し、そして５×Ｓ
ＳＥＰ、１％のＳＤＳ、５×のDenhardtの中で６５℃で
１６時間かけてハイブリダイズさせた。その膜を０．１
×ＳＳＥＰ、０．１％のＳＤＳの最終ストリンジェンシ
ーで６５℃で１０分かけて洗った。オートラジオグラフ
ィーは−８０℃で、増強スクリーン及びKodak ＸＡＲフ
ィルムを用いて２〜１０日かけて行った。ｍＲＮＡの量
をｂ−アクチンｃＤＮＡプローブで標準化した。オート
ラジオグラフをコンピューター化デンシトメーター(Hoe
ffer Scientific Insturments,San Francisco) で６０
０nmでスキャンした。複数のヒト組織由来のポリＡ＋Ｒ
ＮＡをもつノーザンブロットをClontechから購入した。
来のｍＲＮＡを QuickPrep mRNA精製キット(Pharmacia)
により、供給者の手順に従って単離した。全ＤＮＡはC
homczynski and Sacchi (Analytic Biochemistry , 162
：156-159 (1987)) に記載の一段ＲＮＡ単離法に従っ
て調製した。全ＲＮＡ調製品をＲＱ１−ＤＮＡｓｅ(Pro
mega) で処理して全ての夾雑ゲノムＤＮＡを除去した。
ノーザンブロットをｍＲＮＡ及び全ＲＮＡから、メチル
水酸化水銀を含む１．５％のSeakemアガロースゲルを通
じる電気泳動により作り、そして２０×ＳＳＣ中の正帯
電膜に移し、そして８０℃で２時間加熱した。32Ｐ−ラ
ジオラベルＤＮＡプローブを製造者（Boehringer) に従
うランダムプライミング法により合成し、そして５×Ｓ
ＳＥＰ、１％のＳＤＳ、５×のDenhardtの中で６５℃で
１６時間かけてハイブリダイズさせた。その膜を０．１
×ＳＳＥＰ、０．１％のＳＤＳの最終ストリンジェンシ
ーで６５℃で１０分かけて洗った。オートラジオグラフ
ィーは−８０℃で、増強スクリーン及びKodak ＸＡＲフ
ィルムを用いて２〜１０日かけて行った。ｍＲＮＡの量
をｂ−アクチンｃＤＮＡプローブで標準化した。オート
ラジオグラフをコンピューター化デンシトメーター(Hoe
ffer Scientific Insturments,San Francisco) で６０
０nmでスキャンした。複数のヒト組織由来のポリＡ＋Ｒ
ＮＡをもつノーザンブロットをClontechから購入した。
【０１７３】実施例８ 逆転写酵素ベースＰＣＲ増幅及びスクリーニング 各ＰＣＲ増幅をランダムヘキサマープライムした逆転写
酵素(Promega) から合成した一本鎖ｃＤＮＡに基づき２
０mlの最終容量で行った。このＰＣＲ反応は２ピコモル
の前進及び逆行プライマー並びに１unitのＴａｑポリメ
ラーゼを、Perkin Elmer／Cetur により推奨の反応バッ
ファーの中に含む。ＰＣＲ増幅のためのパラメーター
は、９４℃で１min 、５５℃で１min 、７２℃で１min
の３０サイクル、それに続く７２℃で１０min の最終伸
長時間より成る。ＰＣＲ生成物をアクリルアミドゲルか
ら切り出し、そして１００mlのＴＥバッファーの中で溶
出させた。希釈フラグメントを、直接配列決定の前に同
じプライマーで再増幅させた。このＰＣＲ増幅生成物を
アクリルアミドゲルから切り出し、そして１００mlのＴ
Ｅバッファーの中で溶出させた。この希釈フラグメント
を再増幅させ、次いでDye Deoxy(商標）ターミネーター
・サイクル・シーケンシング・キットを用い、Applied
Biosystems, Inc.より供給のプロトコールに従って直接
配列決定した。そしてＡＢＩモデル３７３Ａ ＤＮＡ自
動シーケンサーで分析した。ｃＤＮＡ配列の中の６セッ
トのプライマーを配列分析のためのＤＮＡ生成物を増幅
するために用いた。
酵素(Promega) から合成した一本鎖ｃＤＮＡに基づき２
０mlの最終容量で行った。このＰＣＲ反応は２ピコモル
の前進及び逆行プライマー並びに１unitのＴａｑポリメ
ラーゼを、Perkin Elmer／Cetur により推奨の反応バッ
ファーの中に含む。ＰＣＲ増幅のためのパラメーター
は、９４℃で１min 、５５℃で１min 、７２℃で１min
の３０サイクル、それに続く７２℃で１０min の最終伸
長時間より成る。ＰＣＲ生成物をアクリルアミドゲルか
ら切り出し、そして１００mlのＴＥバッファーの中で溶
出させた。希釈フラグメントを、直接配列決定の前に同
じプライマーで再増幅させた。このＰＣＲ増幅生成物を
アクリルアミドゲルから切り出し、そして１００mlのＴ
Ｅバッファーの中で溶出させた。この希釈フラグメント
を再増幅させ、次いでDye Deoxy(商標）ターミネーター
・サイクル・シーケンシング・キットを用い、Applied
Biosystems, Inc.より供給のプロトコールに従って直接
配列決定した。そしてＡＢＩモデル３７３Ａ ＤＮＡ自
動シーケンサーで分析した。ｃＤＮＡ配列の中の６セッ
トのプライマーを配列分析のためのＤＮＡ生成物を増幅
するために用いた。
【０１７４】実施例９ コンピューター補助分析 ５４１Ｃ由来のヌクレオチド及びタンパク質配列の両者
との配列相同性分析を、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴを用
い、ＣＩＴＩ２ French ネットワークを介して行った
（Dessen P., Fondrat C., Velencien C., Mugnoer C.,
1990, CABIOS ;6 : 355-356)。
との配列相同性分析を、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴを用
い、ＣＩＴＩ２ French ネットワークを介して行った
（Dessen P., Fondrat C., Velencien C., Mugnoer C.,
1990, CABIOS ;6 : 355-356)。
【０１７５】実施例１０ ＳＳＣＰ分析 一本鎖コンホメーション多形性（ＳＳＣＰ）分析のた
め、末梢白血球（２００ng）由来のＤＮＡを、２００μ
ＭのｄＮＴＰ、１unitのＴａｑポリメラーゼ(Gibco-BR
L) 及び０．１μｌの32Ｐ ｄＣＴＰ（１０mCi ／ml、
ＮＥＮ）を含む２５μｌの増幅混合物中の未ラベルプラ
イマー（２０μＭ）を用いるＰＣＲ増幅にかけた。増幅
させたＤＮＡを等容量のポリアミド添加色素（９５％の
ポリアミド、２０mMのＥＤＴＡ、０．０５％のブロモフ
ェノールブルー、０．０５％のキシレンシアノール）と
混合した。このサンプル（５μｌ）を９５℃で１０分変
性させ、そしてポリアクリルアミドゲル(Hydroling ME
D, Bioprobe) に載せ、そして４℃で１８〜２４ｈ、４
Ｗで電気泳動させた。ゲルを３ＭＭ Whatman紙に移し、
乾かし、そしてKodak Ｘ−ＯＭＡＴフィルムで２４時間
かけてオートラジオグラフィーにかけた。エクソン７オ
リゴヌクレオチドＲ１１１
め、末梢白血球（２００ng）由来のＤＮＡを、２００μ
ＭのｄＮＴＰ、１unitのＴａｑポリメラーゼ(Gibco-BR
L) 及び０．１μｌの32Ｐ ｄＣＴＰ（１０mCi ／ml、
ＮＥＮ）を含む２５μｌの増幅混合物中の未ラベルプラ
イマー（２０μＭ）を用いるＰＣＲ増幅にかけた。増幅
させたＤＮＡを等容量のポリアミド添加色素（９５％の
ポリアミド、２０mMのＥＤＴＡ、０．０５％のブロモフ
ェノールブルー、０．０５％のキシレンシアノール）と
混合した。このサンプル（５μｌ）を９５℃で１０分変
性させ、そしてポリアクリルアミドゲル(Hydroling ME
D, Bioprobe) に載せ、そして４℃で１８〜２４ｈ、４
Ｗで電気泳動させた。ゲルを３ＭＭ Whatman紙に移し、
乾かし、そしてKodak Ｘ−ＯＭＡＴフィルムで２４時間
かけてオートラジオグラフィーにかけた。エクソン７オ
リゴヌクレオチドＲ１１１
【０１７６】
【化１８】
【０１７７】５４１Ｃ７７０
【０１７８】
【化１９】
【０１７９】を利用した。エクソン８の相違を含むＤＮ
Ａ配列を増幅するため、オリゴヌクレオチド５４１Ｃ９
６０
Ａ配列を増幅するため、オリゴヌクレオチド５４１Ｃ９
６０
【０１８０】
【化２０】
【０１８１】５４１Ｃ１１２０
【０１８２】
【化２１】
【０１８３】を利用した。
【０１８４】実施例１１ ヒトＳＭＮ遺伝子のクローニング ＹＡＣクローン５９５Ｃ１１由来の全酵母ＤＮＡをSamb
rookら前掲の方法を介して精製し、そして制限酵素Ｓａ
ｕ３Ａにより部分消化した。１２〜２３kDのサイズ範囲
のＤＮＡを０．５％のSeaplaque ＧＴＧアガロースゲル
電気泳動後に切り出し、そしてβ−アガロース消化の後
にエタノールで沈殿させた。Ｓａｕ３Ａ部の部分的フィ
ル・インの後、ＤＮＡをバクテリオファージＦＩＸII
（Stratagene）の部分補完ＸｈｏＩ部位でサブクローニ
ングした。
rookら前掲の方法を介して精製し、そして制限酵素Ｓａ
ｕ３Ａにより部分消化した。１２〜２３kDのサイズ範囲
のＤＮＡを０．５％のSeaplaque ＧＴＧアガロースゲル
電気泳動後に切り出し、そしてβ−アガロース消化の後
にエタノールで沈殿させた。Ｓａｕ３Ａ部の部分的フィ
ル・インの後、ＤＮＡをバクテリオファージＦＩＸII
（Stratagene）の部分補完ＸｈｏＩ部位でサブクローニ
ングした。
【０１８５】全長ＢＣＤ５４１ ｃＤＮＡを、Sambrook
ら、前掲に記載の条件下でＦＩＸIIファージライブラリ
ーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。
ら、前掲に記載の条件下でＦＩＸIIファージライブラリ
ーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。
【０１８６】名称Ｍ−１３２，Ｌ−５及びＬ−１３のこ
れらのファージは、ＨｉｎｄIII ，ＥｃｏＲＩ及びＢｇ
ｌIIを用いる制限地図化（図１１参照）及びサザンブロ
ット分析による確認に従い、全ＳＭＮ遺伝子に広がって
いた。
れらのファージは、ＨｉｎｄIII ，ＥｃｏＲＩ及びＢｇ
ｌIIを用いる制限地図化（図１１参照）及びサザンブロ
ット分析による確認に従い、全ＳＭＮ遺伝子に広がって
いた。
【０１８７】このファージを次に実施例８に記載の通り
にして配列決定した。遺伝子が配列決定できたら、それ
をｐＵＣ１８ベクターにクローニングし、そして大量に
組換生産し、それを更なる利用のために精製した。
にして配列決定した。遺伝子が配列決定できたら、それ
をｐＵＣ１８ベクターにクローニングし、そして大量に
組換生産し、それを更なる利用のために精製した。
【０１８８】実施例１２ マウスＳＭＮ遺伝子のクローニング マウスの胎児ｃＤＮＡライブラリーをSambrookら、前掲
に従い、プローブとしてヒトＳＭＮ ｃＤＮＡのコード
配列を用いてスクリーニングにかけた。
に従い、プローブとしてヒトＳＭＮ ｃＤＮＡのコード
配列を用いてスクリーニングにかけた。
【０１８９】マウスＳＭＮの全配列を有する２つの重複
マウスｃＤＮＡクローンが見い出され、それはｐＵＣ１
８ベクター及びＭ１３ベクターにクローニングされた後
に実施例８に記載の配列決定法により示された。
マウスｃＤＮＡクローンが見い出され、それはｐＵＣ１
８ベクター及びＭ１３ベクターにクローニングされた後
に実施例８に記載の配列決定法により示された。
【０１９０】実施例１３ 遺伝子導入マウス 複数の正常ＳＭＮ遺伝子又はエクソン７を欠くＳＭＮ遺
伝子を含む遺伝子導入マウスを Leeら、Neuron, 13；97
8-988 (1994)に従う方法により製造した。この遺伝子導
入マウスを、本発明に記載のプローブを用いてサザン及
び／又はノーザンブロットを介して、又は本発明に記載
の抗体によるウェスタンブロットでのスクリーニングを
介して、ＳＭＮ遺伝子又はエクソン７を欠くＳＭＮ遺伝
子の過剰発現について試験し、そして選択した。
伝子を含む遺伝子導入マウスを Leeら、Neuron, 13；97
8-988 (1994)に従う方法により製造した。この遺伝子導
入マウスを、本発明に記載のプローブを用いてサザン及
び／又はノーザンブロットを介して、又は本発明に記載
の抗体によるウェスタンブロットでのスクリーニングを
介して、ＳＭＮ遺伝子又はエクソン７を欠くＳＭＮ遺伝
子の過剰発現について試験し、そして選択した。
【０１９１】異常なＳＭＮ遺伝子を含む遺伝子導入マウ
スを、Kuhnら、Science , 269 ；1427-1429 (1995)及び
Bredley, Current Opinion in Biotechnology 2；823-
829(1991)に記載の通りにして、突然変異したＳＭＮ遺
伝子を用いる相同的組換法により獲得した。次いでこの
遺伝子導入マウスを、本発明に記載のプローブを用いる
サザン及び／又はノーザンブロットを介してＳＭＮ遺伝
子の過剰発現について試験及び選択するか、又は本発明
に記載の抗体により異常なＳＭＮ遺伝子についてスクリ
ーニングした。
スを、Kuhnら、Science , 269 ；1427-1429 (1995)及び
Bredley, Current Opinion in Biotechnology 2；823-
829(1991)に記載の通りにして、突然変異したＳＭＮ遺
伝子を用いる相同的組換法により獲得した。次いでこの
遺伝子導入マウスを、本発明に記載のプローブを用いる
サザン及び／又はノーザンブロットを介してＳＭＮ遺伝
子の過剰発現について試験及び選択するか、又は本発明
に記載の抗体により異常なＳＭＮ遺伝子についてスクリ
ーニングした。
【０１９２】実施例１４ ポリクローナル抗体 以下の配列
【０１９３】
【化２２】
【０１９４】を有する１００μｇの合成抗原をバッファ
ーの中に溶かし、そして等容量のフロインドの完全アジ
ュバントで乳化させた。０．５mlの乳化合成抗原−アジ
ュバントをウサギに筋肉内注射した。５週間後、そのウ
サギをブーストにかけ、そして各ブースター注射の８日
後に２０〜４０mlの血液を採血した。その血清をＲＩＡ
を用いて抗原の存在について試験した。
ーの中に溶かし、そして等容量のフロインドの完全アジ
ュバントで乳化させた。０．５mlの乳化合成抗原−アジ
ュバントをウサギに筋肉内注射した。５週間後、そのウ
サギをブーストにかけ、そして各ブースター注射の８日
後に２０〜４０mlの血液を採血した。その血清をＲＩＡ
を用いて抗原の存在について試験した。
【０１９５】以下の合成抗原
【０１９６】
【化２３】
【０１９７】を用いて同じ方法によりポリクローナル抗
体も調製した。
体も調製した。
【０１９８】実施例１５ 遺伝子療法 Ragotら、Nature, Vol.361 (1993)に記載のアデノウィ
ルス構築体を用い、正常ＳＭＮ遺伝子をその中に挿入
し、そしてこの遺伝子を欠く患者に筋肉内注射した。そ
の患者を上記の実施例１０記載のＳＳＣＰ分析を利用し
てモニターした。
ルス構築体を用い、正常ＳＭＮ遺伝子をその中に挿入
し、そしてこの遺伝子を欠く患者に筋肉内注射した。そ
の患者を上記の実施例１０記載のＳＳＣＰ分析を利用し
てモニターした。
【０１９９】
【表１】
【図１】クローンＴ−ＢＣＤ５４１のＳＭＮコード領域
のアミノ酸配列。
のアミノ酸配列。
【図２】ＳＭＮコード領域及びクローンＣ−ＢＣＤ５４
１の５′及び３′隣接領域のヌクレオチド配列。コード
領域に下線を付した。
１の５′及び３′隣接領域のヌクレオチド配列。コード
領域に下線を付した。
【図３】図２の続きであり、Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子の
イントロン６から出発してエクソン８までの配列を含
む。下線を付した配列はエクソン７及び８である。イン
トロン６及び７の配列をｃＤＮＡ領域を増幅するオリゴ
ヌクレオチドとして選択しており、エクソン７内のＴ−
ＢＣＤ５４１遺伝子とＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子との識別
が可能となっている。Ｔ−ＢＣＤ５４１とＣ−ＢＣＤ５
４１ ｃＤＮＡとの相違ヌクレオチドの位置をイタリッ
ク体で示す。
イントロン６から出発してエクソン８までの配列を含
む。下線を付した配列はエクソン７及び８である。イン
トロン６及び７の配列をｃＤＮＡ領域を増幅するオリゴ
ヌクレオチドとして選択しており、エクソン７内のＴ−
ＢＣＤ５４１遺伝子とＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子との識別
が可能となっている。Ｔ−ＢＣＤ５４１とＣ−ＢＣＤ５
４１ ｃＤＮＡとの相違ヌクレオチドの位置をイタリッ
ク体で示す。
【図４】ＳＭＮコード領域並びにクローンＴ−ＢＣＤ５
４１の５′及び３′隣接領域。コード配列に下線を付し
た。エクソンの番号を配列の上に表示した。星印は各エ
クソンの始まりを示す。イタリック体で示すヌクレオチ
ドはＣ−ＢＣＤ５４１とＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子との相
違である。
４１の５′及び３′隣接領域。コード配列に下線を付し
た。エクソンの番号を配列の上に表示した。星印は各エ
クソンの始まりを示す。イタリック体で示すヌクレオチ
ドはＣ−ＢＣＤ５４１とＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子との相
違である。
【図５】図４の続きであり、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子の
イントロン６からエクソン８の終りまでの配列を示す。
エクソン７及び８の配列に下線を付した。
イントロン６からエクソン８の終りまでの配列を示す。
エクソン７及び８の配列に下線を付した。
【図６】マーカーＣ２１２，Ｃ２７２，Ｃ１７１，ＡＦ
Ｍ１５７ｘｄ１０及びＣ１６１のヌクレオチド配列。
Ｍ１５７ｘｄ１０及びＣ１６１のヌクレオチド配列。
【図７】プローブがハイブリダイズする複数の遺伝子座
を示す本発明において利用した様々なプローブ。
を示す本発明において利用した様々なプローブ。
【図８】生存ＳＭＮ遺伝子を含むテロマー要素。
【図９】近くに地図化されるプローブ１３２ＳＥ１１に
よる遺伝子量のめざましい低下。
よる遺伝子量のめざましい低下。
【図１０】トランケートＳＭＮタンパク質のアミノ酸配
列。
列。
【図１１】ヒトＳＭＮ遺伝子のゲノム構造の模式図。ゲ
ノムクローンの表示及び位置を同図の上に示す。Ｌ−１
３２，Ｌ−５及びＬ−１３はＳＭＮ遺伝子全体に広がる
ゲノムクローンを示し、一方、Ｌ−５１はエクソン１の
一部しか広がらない。マイクロサテライト及びＤＮＡマ
ーカーをゲノム地図の上に示す。Ｂ，Ｈ及びＥはＢｇｌ
II，ＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩをそれぞれ示す。Ｃ２
１２，ｐ３２２，Ｃ２７２，１３２ＳＥ１１及びＣ１７
１は種々のマーカーを示す。１，２ａ，２ｂ，３，４，
５，６，７及び８はＳＭＮ及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子
のエクソンを表わす。Ｌ−１３２の全配列をエクソン１
からエクソン２ＡまでのＰＣＲ増幅により得た。
ノムクローンの表示及び位置を同図の上に示す。Ｌ−１
３２，Ｌ−５及びＬ−１３はＳＭＮ遺伝子全体に広がる
ゲノムクローンを示し、一方、Ｌ−５１はエクソン１の
一部しか広がらない。マイクロサテライト及びＤＮＡマ
ーカーをゲノム地図の上に示す。Ｂ，Ｈ及びＥはＢｇｌ
II，ＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩをそれぞれ示す。Ｃ２
１２，ｐ３２２，Ｃ２７２，１３２ＳＥ１１及びＣ１７
１は種々のマーカーを示す。１，２ａ，２ｂ，３，４，
５，６，７及び８はＳＭＮ及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子
のエクソンを表わす。Ｌ−１３２の全配列をエクソン１
からエクソン２ＡまでのＰＣＲ増幅により得た。
【図１２】イントロン及びエクソンを含む全ヒトＳＭＮ
遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。翻訳され
るヌクレオチド配列を上欄に示し、対応のアミノ酸をそ
の下に示す。ポリアデニル化シグナルは太字で示す。矢
印の頭はイントロン６及び７、並びにエクソン７及び８
の中でのＳＭＮとＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子との間の一塩
基相違の位置を示す。イタリック字体はイントロン７に
おける相違の検出のために選んだオリゴヌクレオチドの
位置を示す。（* ) は停止コドンの位置を示す。
遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。翻訳され
るヌクレオチド配列を上欄に示し、対応のアミノ酸をそ
の下に示す。ポリアデニル化シグナルは太字で示す。矢
印の頭はイントロン６及び７、並びにエクソン７及び８
の中でのＳＭＮとＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子との間の一塩
基相違の位置を示す。イタリック字体はイントロン７に
おける相違の検出のために選んだオリゴヌクレオチドの
位置を示す。（* ) は停止コドンの位置を示す。
【図１３】図１２の続き。
【図１４】ヒトＳＭＮ遺伝子のコード領域の上流のヌク
レオチド配列を示し、ＡＰ−２，ＧＨ−ＣＳＥ２，ＤＴ
Ｆ−１，Ｅ４ＦＩ，ＮＩＮＦ−Ａ，Ｈ４ＴＦ−１，β−
ＩＦＮ及びＳｐＩの転写因子のための推定結合部位の存
在を示す。太字はＣ２７２マーカーに対応するジヌクレ
オチドリピート（ＣＡ）を示す。
レオチド配列を示し、ＡＰ−２，ＧＨ−ＣＳＥ２，ＤＴ
Ｆ−１，Ｅ４ＦＩ，ＮＩＮＦ−Ａ，Ｈ４ＴＦ−１，β−
ＩＦＮ及びＳｐＩの転写因子のための推定結合部位の存
在を示す。太字はＣ２７２マーカーに対応するジヌクレ
オチドリピート（ＣＡ）を示す。
【図１５】マウスＳＭＮ ｃＤＮＡのヌクレオチド及び
アミノ酸配列。（* ) は停止コドンの位置を示す。
アミノ酸配列。（* ) は停止コドンの位置を示す。
【図１６】ヒトＳＭＮ（上）及びマウスＳＭＮ（下）の
アミノ酸配列の対比分析。
アミノ酸配列の対比分析。
【図１７】家族６の遺伝子分析。レーンＡは、父親から
唯一遺伝されたプロバンドとしてのマイクロサテライト
マーカーＣ２７２により認められた遺伝した母系欠損の
証拠を示す。レーンＢ及びＣはＳＭＮ（ベタ塗り矢印）
並びにそのセントロマーコピー（白抜き矢印）のＰＣＲ
増幅したエクソン７（レーンＢ）及び８（レーンＣ）の
ＳＳＣＰ分析を示す。「Ｆ」は父親、「Ｍ」は母親、そ
して「Ａ」は冒された幼児を示す。
唯一遺伝されたプロバンドとしてのマイクロサテライト
マーカーＣ２７２により認められた遺伝した母系欠損の
証拠を示す。レーンＢ及びＣはＳＭＮ（ベタ塗り矢印）
並びにそのセントロマーコピー（白抜き矢印）のＰＣＲ
増幅したエクソン７（レーンＢ）及び８（レーンＣ）の
ＳＳＣＰ分析を示す。「Ｆ」は父親、「Ｍ」は母親、そ
して「Ａ」は冒された幼児を示す。
【図１８】ＰＣＲイントロン７の一本鎖コンホメーショ
ン多形性（ＳＳＣＰ）分析上でのバンドシフトを示し、
そしてＳＭＮ（ベタ塗り矢印）及びそのセントロマー対
応物Ｃ−ＢＣＤ５４１（白抜き矢印）の同定を可能にし
た。
ン多形性（ＳＳＣＰ）分析上でのバンドシフトを示し、
そしてＳＭＮ（ベタ塗り矢印）及びそのセントロマー対
応物Ｃ−ＢＣＤ５４１（白抜き矢印）の同定を可能にし
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Claims (39)
- 【請求項１】 図４及び５の配列に対応するｃＤＮＡ配
列を有するヒトＳＭＮ遺伝子Ｔ−ＢＣＤ５４１。 - 【請求項２】 下記の配列に対応するイントロン配列を
含んで成る請求項１記載のＳＭＮ遺伝子： −イントロンｎ°６に関する ５′AATTTTTAAATTTTTTGTAGAGACAGGGTCTCATTATGTTGCCCAG
GGTGGTGTCAAGCTCCAGGTCTCAAGTGATCCCCCTACCTCCGCCTCCCA
AAGTTGTGGGATTGTAGGCATGAGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAG
CCTAATAATTGTTTTCTTTGGGATAACTTTTAAAGTACATTAAAAGACTA
TCAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCT
TGTGAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCT
ATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTTATTTTCCTTACA
G ３′ −イントロンｎ°７に関する ５′GTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACT
TTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACAGTTAAAAAGTTCAGATG
TTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGA
TGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGAATTCTC
ATACTTAACTGGTTGGTTATGTGGAAGAAACATACTTTCACAATAAAGAG
CTTTAGGATATGATGCCATTTTATATCACTAGTAGGCAGACCAGCAGACT
TTTTTTTATTGTGATATGGGATAACCTAGGCATACTGCACTGTACACTCT
GACATATGAAGTGCTCTAGTCAAGTTTAACTGGTGTCCACAGAGGACATG
GTTTAACTGGAATTCGTCAAGCCTCTGGTTCTAATTTCTCATTTGCAG
３′。 - 【請求項３】 プローブとして使用する図４及び５の配
列と、ストリンジェンシー条件においてハイブリダイズ
可能である、請求項１又は２のいづれか１項記載のＳＭ
Ｎ遺伝子。 - 【請求項４】 ＳＭＮ遺伝子の変異体であって、図２及
び３の配列に対応するｃＤＮＡ配列を有するＣ−ＢＣＤ
５４１遺伝子である、変異体。 - 【請求項５】 図４及び５の配列に対応するｃＤＮＡで
ある、請求項１〜３のいづれか１項記載のＳＭＮ遺伝子
のｃＤＮＡ配列であるヌクレオチド配列。 - 【請求項６】 図４及び５の配列のうちのヌクレオチド
３４〜９１５を含んで成る、請求項１〜３のいづれか１
項記載のＳＭＮ遺伝子をコードする配列。 - 【請求項７】 図２及び３の配列のヌクレオチド３４〜
９１５を含んで成る、請求項４記載のＳＭＮ遺伝子の変
異体をコードする配列。 - 【請求項８】 以下の配列のいづれかに含まれている、
又は以下の配列のいづれかに対応する、請求項１〜３の
いづれか１項記載のＳＭＮ遺伝子のイントロン配列、 −イントロン６ ５′AATTTTTAAATTTTTTGTAGAGACAGGGTCTCATTATGTTGCCCAG
GGTGGTGTCAAGCTCCAGGTCTCAAGTGATCCCCCTACCTCCGCCTCCCA
AAGTTGTGGGATTGTAGGCATGAGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAG
CCTAATAATTGTTTTCTTTGGGATAACTTTTAAAGTACATTAAAAGACTA
TCAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCT
TGTGAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCT
ATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTTATTTTCCTTACA
G ３′ −イントロン７ ５′GTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACT
TTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACAGTTAAAAAGTTCAGATG
TTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGA
TGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGAATTCTC
ATACTTAACTGGTTGGTTATGTGGAAGAAACATACTTTCACAATAAAGAG
CTTTAGGATATGATGCCATTTTATATCACTAGTAGGCAGACCAGCAGACT
TTTTTTTATTGTGATATGGGATAACCTAGGCATACTGCACTGTACACTCT
GACATATGAAGTGCTCTAGTCAAGTTTAACTGGTGTCCACAGAGGACATG
GTTTAACTGGAATTCGTCAAGCCTCTGGTTCTAATTTCTCATTTGCAG
３′。 - 【請求項９】 図１又は図１０の生存運動ニューロン
（ＳＭＮ）タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配
列。 - 【請求項１０】 少なくとも約９個のヌクレオチドを含
んで成り、そして請求項１〜９のいづれか１項記載の配
列内を構成しているか、又は請求項１〜９のいづれか１
項記載の配列と所定の条件においてハイブリダイズする
ことを特徴とするヌクレオチド配列。 - 【請求項１１】 図１５の配列に対応するｃＤＮＡ配列
を有するマウスＳＭＮ遺伝子。 - 【請求項１２】 プローブであることを特徴とする、請
求項１０又は１１に記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項１３】 第二のプライマーと共に使用したとき
に、請求項１〜９のいづれか１項記載の配列を増幅する
ことのできるプライマーであることを特徴とする、請求
項１０記載のヌクレオチド配列。 - 【請求項１４】 下記の配列から選ばれる、請求項１３
記載のヌクレオチド配列： ５′AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA ３′ ５′TAAGGAATGTGAGCACCTTCCTTC ３′ ５′GTAATAACCAAATGCAATGTGAA ３′ ５′CTACAACACCCTTCTCACAG ３′。 - 【請求項１５】 −図４及び５の配列のうちのヌクレオ
チド９２１〜１４６９を構成する配列の中に含まれてい
るプライマーのペアー及び／又は −下記の配列を含んで成るプライマーのペアー ５′AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA ３′ ５′TAAGGAATGTGAGCACCTTCCTTC ３′を含んで成ること
を特徴とする、請求項１３記載のプライマーのセット。 - 【請求項１６】 −以下の配列を有するプライマーのペ
アー： ５′AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA ３′ ５′TAAGGAATGTGAGCACCTTCCTTC ３′ −以下の配列を含んで成るプライマーのペアー： ５′GTAATAACCAAATGCAATGTGAA ３′ ５′CTACAACACCCTTCTCACAG ３′ −以下の配列のいづれかを有するプライマーのペアー： ５′AGG GCG AGG CTC TGT CTC A ３′ ５′CGG GAG GAC CGC TTG TAG T ３′； ５′GCC GGA AGT CGT CAC TCT T ３′ ５′GGG TGC TGA GAG CGC TAA TA ３′； ５′TGT GTG GAT TAA GAT GAC TC ３′ ５′CAC TTT ATC GTA TGT TAT C ３′； ５′CTG TGC ACC ACC CTG TAA CAT G ３′ ５′AAG GAC TAA TGA GAC ATC C ３′； ５′CGA GAT GAT AGT TTG CCC TC ３′ ５′AG CTA CTT CAC AGA TTG GGG AAA G ３′； ５′CTC ATC TAG TCT CTG CTT CC ３′ ５′TGG ATA TGG AAA TAG AGA GGG AGC ３′； ５′CAC CCT TAT AAC AAA AAC CTG C ３′ ５′GAG AAA GGA GTT CCA TGG AGC AG ３′； ５′GAG AGG TTA AAT GTC CCG AC ３′ ５′GTG AGA ACT CCA GGT CTC CTG G ３′； ５′TGA GTC TGT TTG ACT TCA GG ３′ ５′GAA GGA AAT GGA GGC AGC CAG C ３′； ５′TTT CTA CCC ATT AGA ATC TGG ３′ ５′CCC CAC TTA CTA TCA TGC TGG CTG ３′； ５′CCA GAC TTT ACT TTT TGT TTA CTG ３′ ５′ATA GCC ACT CAT GTA CCA TGA ３′； ５′AAG AGT AAT TTA AGC CTC AGA CAG ３′ ５′CTC CCA TAT GTC CAG ATT CTC TTG ３′； ５′AGA CTA TCA ACT TAA TTT CTG ATC A ３′ ５′TAA GGA ATG TGA GCA CCT TCC TTC ３′； ５′AGA CTA TCA ACT TAA TTT CTG ATC A ３′ ５′GTA AGA TTC ACT TTC ATA ATG CTG ３′； ５′CTT TAT GGT TTG TGG AAA ACA ３′ ５′GGC ATC ATA TCC TAA AGC TC ３′； ５′GTA ATA ACC AAA TGC AAT GTG AA ３′ ５′CTA CAA CAC CCT TCT CAC AG ３′；and ５′GGT GTC CAC AGA GGA CAT GG ３′ ５′AAG AGT TAA CCC ATT CCA GCT TCC ３′ を含んで成るプライマーのセット。 - 【請求項１７】 請求項１〜１１のいづれか１項記載の
配列と反転相補性の配列であるアンチセンスヌクレオチ
ド配列。 - 【請求項１８】 図１のアミノ酸配列を含んで成る単離
されたヒト生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質。 - 【請求項１９】 トランケートされ、且つ図１０及び１
１のアミノ酸配列を含んで成る請求項１８記載のタンパ
ク質。 - 【請求項２０】 図１５のアミノ酸配列を含んで成る、
単離されたマウス生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパ
ク質。 - 【請求項２１】 運動ニューロン障害のインビトロ検査
のためのキットであって： −請求項１５又は１６のいづれか１項記載のプライマー
のセット； −増幅反応のための試薬；及び −増幅生成物の検出のためのプローブ； を含んで成るキット。 - 【請求項２２】 請求項１２記載のプローブを含んで成
る、運動ニューロン障害のインビトロ検査のためのキッ
ト。 - 【請求項２３】 ＳＭＡの検査のための請求項２１又は
２２記載のキット。 - 【請求項２４】 請求項１〜１１のいづれか１項記載の
配列を含んで成ることを特徴とする、クローニング又は
発現ベクター。 - 【請求項２５】 運動ニューロン向性を有することを特
徴とする請求項２４記載のベクター。 - 【請求項２６】 例えばポリオウィルス、アデノウィル
ス又はヘルペスウィルスであることを特徴とする、請求
項２５記載のベクター。 - 【請求項２７】 レトロウィルスベクターであることを
特徴とする、請求項２４記載のベクター。 - 【請求項２８】 請求項２４〜２７のいづれか１項記載
のベクターにより形質転換されていることを特徴とす
る、宿主細胞、例えば骨髄細胞、繊維芽細胞、上皮細
胞。 - 【請求項２９】 請求項１〜１１のいづれか１項記載の
配列、及び運動ニューロンに対する向性を有するポリペ
プチドをコードすることのできる配列を含んで成ること
を特徴とする、組換ヌクレオチド配列。 - 【請求項３０】 脊髄筋萎縮、任意の栄養性外側硬化症
及び一次外側硬化症を含む運動ニューロン障害の検査の
ための方法であって： （ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する； （ｂ）前記ＤＮＡを請求項１５又は１６のいづれか１項
記載のプライマーにより増幅させる； （ｃ）この増幅したＤＮＡをＳＣＣＰにかける； （ｄ）このゲルをオートラジオグラフィーにかける；そ
して （ｅ）運動ニューロン障害の有無を検出する； 工程を含んで成る方法。 - 【請求項３１】 前記運動ニューロン障害が脊髄筋萎縮
である、請求項３０記載の方法。 - 【請求項３２】 前記工程（ｃ）及び（ｄ）を、Ｂｓｒ
Ｉ酵素による消化の工程に置き換える、請求項３０記載
の方法。 - 【請求項３３】 脊髄筋萎縮を検査するための方法であ
って、 （ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する； （ｂ）前記ＤＮＡを、ストリンジェンシー条件において
図４及び５のＤＮＡ配列全体又はその一部を含んで成る
ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる；そして （ｃ）形成された可能性のあるハイブリドを検出する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項３４】 前記プローブが放射性ラベルされてい
る、請求項３３記載の方法。 - 【請求項３５】 図１のＳＭＮタンパク質に対して、又
は図１０のタンパク質に対して、又は図１５のタンパク
質に対して誘導したモノクローナル抗体又はポリクロー
ナル抗血清。 - 【請求項３６】 先天性多発性関節拘縮症（ＡＭＣ）を
検査するための方法であって： （ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する； （ｂ）前記ＤＮＡをＳＭＮ遺伝子のエクソン７又はエク
ソン８由来の未ラベルプライマーを用いるＰＣＲを介し
て増幅させる； （ｃ）この増幅させたＤＮＡをＳＣＣＰにかける； （ｄ）このゲルをオートラジオグラフィーにかける；そ
して （ｅ）先天性多発性関節拘縮症の有無を検出する； 工程を含んで成る方法。 - 【請求項３７】 図１３の単離されたヌクレオチド配
列。 - 【請求項３８】 図１のヒトＳＭＮタンパク質又は図１
０のトランケートタンパク質のみを発現する遺伝子導入
マウス。 - 【請求項３９】 図１の突然変異したＳＭＮタンパク質
を発現する遺伝子導入マウス。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR94402353.0 | 1994-10-19 | ||
| EP94402353A EP0708178A1 (en) | 1994-10-19 | 1994-10-19 | Survival motor neuron (SMN) gene: a gene for spinal muscular atrophy |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007271610A Division JP4723550B2 (ja) | 1994-10-19 | 2007-10-18 | 生存運動ニューロン（ｓｍｎ）遺伝子；脊髄筋萎縮 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08228785A true JPH08228785A (ja) | 1996-09-10 |
| JP4283345B2 JP4283345B2 (ja) | 2009-06-24 |
Family
ID=8218049
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30634995A Expired - Lifetime JP4283345B2 (ja) | 1994-10-19 | 1995-10-19 | 生存運動ニューロン（ｓｍｎ）遺伝子：脊髄筋萎縮 |
| JP2007271610A Expired - Fee Related JP4723550B2 (ja) | 1994-10-19 | 2007-10-18 | 生存運動ニューロン（ｓｍｎ）遺伝子；脊髄筋萎縮 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007271610A Expired - Fee Related JP4723550B2 (ja) | 1994-10-19 | 2007-10-18 | 生存運動ニューロン（ｓｍｎ）遺伝子；脊髄筋萎縮 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US6080577A (ja) |
| EP (1) | EP0708178A1 (ja) |
| JP (2) | JP4283345B2 (ja) |
| AT (1) | ATE301191T1 (ja) |
| AU (1) | AU702252B2 (ja) |
| CA (1) | CA2160937C (ja) |
| DE (1) | DE69534351T2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008099696A (ja) * | 1994-10-19 | 2008-05-01 | Inst National De La Sante & De La Recherche Medicale | 生存運動ニューロン（ｓｍｎ）遺伝子；脊髄筋萎縮 |
| JP2012530715A (ja) * | 2009-06-17 | 2012-12-06 | アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド | 被験体におけるｓｍｎ２スプライシングのモジュレーションのための組成物および方法 |
| JP2016052309A (ja) * | 2009-05-02 | 2016-04-14 | ジェンザイム・コーポレーション | 神経変性障害のための遺伝子治療 |
| JP2023529855A (ja) * | 2020-06-02 | 2023-07-12 | ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド” | Ｓｍｎ１タンパク質をコードするコドン最適化した核酸およびその使用 |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5792833A (en) * | 1994-12-22 | 1998-08-11 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | E2 binding proteins |
| US6130064A (en) * | 1998-02-24 | 2000-10-10 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human SMN-like protein |
| EP1082433A4 (en) * | 1998-05-29 | 2003-01-02 | Human Genome Sciences Inc | Interleukins 21 and 22 |
| EP0999270A1 (en) * | 1998-10-09 | 2000-05-10 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method of regulating SMN gene expression |
| US20060088842A1 (en) * | 2004-02-13 | 2006-04-27 | Khue Vu Nguyen | RT-PCR-based cloning of human SMN, the SMA determining gene, and the construction of its expression plasmids |
| TW200613562A (en) * | 2004-10-26 | 2006-05-01 | Yi-Ning Su | Methods for smn genes and spinal muscular atrophy carriers detection |
| US20060286167A1 (en) * | 2005-05-02 | 2006-12-21 | Jane Staunton | Compositions and methods for the treatment of neurodegenerative diseases |
| WO2007133812A2 (en) * | 2005-12-30 | 2007-11-22 | Philadelphia Health & Education Corporation, D/B/A Drexel University College Of Medicine | Improved carriers for delivery of nucleic acid agents to cells and tissues |
| WO2011032109A1 (en) * | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Sma Foundation | Biomarkers for spinal muscular atrophy |
| CA2817256A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding rnas |
| US9920317B2 (en) | 2010-11-12 | 2018-03-20 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding RNAs |
| EP2718466B1 (en) * | 2011-06-07 | 2018-08-08 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Materials and method for identifying spinal muscular atrophy carriers |
| US10837014B2 (en) | 2012-05-16 | 2020-11-17 | Translate Bio Ma, Inc. | Compositions and methods for modulating SMN gene family expression |
| SG11201407483YA (en) | 2012-05-16 | 2014-12-30 | Rana Therapeutics Inc | Compositions and methods for modulating smn gene family expression |
| EA201492116A1 (ru) | 2012-05-16 | 2015-05-29 | Рана Терапьютикс, Инк. | Композиции и способы для модулирования экспрессии mecp2 |
| EP2983676B1 (en) | 2013-04-12 | 2019-03-20 | The Curators of the University of Missouri | Smn2 element 1 antisense compositions and methods and uses thereof |
| JP2016531570A (ja) | 2013-08-16 | 2016-10-13 | ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド | ユークロマチン領域を標的とするオリゴヌクレオチド |
| WO2015051283A1 (en) | 2013-10-04 | 2015-04-09 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis |
| AU2014340149B2 (en) | 2013-10-22 | 2020-12-24 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | CNS delivery of mRNA and uses thereof |
| US10436802B2 (en) | 2014-09-12 | 2019-10-08 | Biogen Ma Inc. | Methods for treating spinal muscular atrophy |
| WO2016070060A1 (en) | 2014-10-30 | 2016-05-06 | The General Hospital Corporation | Methods for modulating atrx-dependent gene repression |
| WO2016149455A2 (en) | 2015-03-17 | 2016-09-22 | The General Hospital Corporation | The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1) |
| CN120505310A (zh) | 2020-02-28 | 2025-08-19 | Ionis制药公司 | 用于调节smn2的化合物和方法 |
| US20250011812A1 (en) | 2021-11-23 | 2025-01-09 | University Of Massachusetts | Gene therapy for spinal muscular atrophy |
| WO2024220403A2 (en) * | 2023-04-17 | 2024-10-24 | University Of Massachusetts | Neuron specific promoters for aav gene transfer |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5192659A (en) * | 1989-08-25 | 1993-03-09 | Genetype Ag | Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes |
| AU8196791A (en) * | 1990-06-27 | 1992-01-23 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Methods for detecting spinal muscular atrophy type i and types ii/iii and marker therefor |
| EP0708178A1 (en) * | 1994-10-19 | 1996-04-24 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Survival motor neuron (SMN) gene: a gene for spinal muscular atrophy |
| US5792833A (en) * | 1994-12-22 | 1998-08-11 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | E2 binding proteins |
-
1994
- 1994-10-19 EP EP94402353A patent/EP0708178A1/en not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-10-19 US US08/545,196 patent/US6080577A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-19 CA CA002160937A patent/CA2160937C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-19 AU AU34369/95A patent/AU702252B2/en not_active Expired
- 1995-10-19 JP JP30634995A patent/JP4283345B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-19 AT AT95402335T patent/ATE301191T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-10-19 DE DE69534351T patent/DE69534351T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-07-02 US US09/109,082 patent/US7033752B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-09-12 US US11/222,810 patent/US20060089490A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-11-22 US US11/603,305 patent/US20070166737A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-18 JP JP2007271610A patent/JP4723550B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-04-28 US US13/096,574 patent/US8394932B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-02-04 US US13/758,754 patent/US8962269B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008099696A (ja) * | 1994-10-19 | 2008-05-01 | Inst National De La Sante & De La Recherche Medicale | 生存運動ニューロン（ｓｍｎ）遺伝子；脊髄筋萎縮 |
| US10369193B2 (en) | 2009-05-02 | 2019-08-06 | Genzyme Corporation | Gene therapy for neurodegenerative disorders |
| US12350311B2 (en) | 2009-05-02 | 2025-07-08 | Genzyme Corporation | Gene therapy for neurodegenerative disorders |
| US11975043B2 (en) | 2009-05-02 | 2024-05-07 | Genzyme Corporation | Gene therapy for neurodegenerative disorders |
| JP2016052309A (ja) * | 2009-05-02 | 2016-04-14 | ジェンザイム・コーポレーション | 神経変性障害のための遺伝子治療 |
| US11911440B2 (en) | 2009-05-02 | 2024-02-27 | Genzyme Corporation | Gene therapy for neurodegenerative disorders |
| JP2018148927A (ja) * | 2009-05-02 | 2018-09-27 | ジェンザイム・コーポレーション | 神経変性障害のための遺伝子治療 |
| JP2018184423A (ja) * | 2009-06-17 | 2018-11-22 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． | 被験体におけるｓｍｎ２スプライシングのモジュレーションのための組成物および方法 |
| JP2020073498A (ja) * | 2009-06-17 | 2020-05-14 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． | 被験体におけるｓｍｎ２スプライシングのモジュレーションのための組成物および方法 |
| JP2022025131A (ja) * | 2009-06-17 | 2022-02-09 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド | 被験体におけるｓｍｎ２スプライシングのモジュレーションのための組成物および方法 |
| JP2024012416A (ja) * | 2009-06-17 | 2024-01-30 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド | 被験体におけるｓｍｎ２スプライシングのモジュレーションのための組成物および方法 |
| JP2017061497A (ja) * | 2009-06-17 | 2017-03-30 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． | 被験体におけるｓｍｎ２スプライシングのモジュレーションのための組成物および方法 |
| JP2015131828A (ja) * | 2009-06-17 | 2015-07-23 | アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド | 被験体におけるｓｍｎ２スプライシングのモジュレーションのための組成物および方法 |
| JP2012530715A (ja) * | 2009-06-17 | 2012-12-06 | アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド | 被験体におけるｓｍｎ２スプライシングのモジュレーションのための組成物および方法 |
| JP2023529855A (ja) * | 2020-06-02 | 2023-07-12 | ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド” | Ｓｍｎ１タンパク質をコードするコドン最適化した核酸およびその使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20130323759A1 (en) | 2013-12-05 |
| JP4723550B2 (ja) | 2011-07-13 |
| US20070166737A1 (en) | 2007-07-19 |
| CA2160937A1 (en) | 1996-04-20 |
| DE69534351T2 (de) | 2006-06-08 |
| EP0708178A1 (en) | 1996-04-24 |
| DE69534351D1 (de) | 2005-09-08 |
| US7033752B1 (en) | 2006-04-25 |
| JP2008099696A (ja) | 2008-05-01 |
| US8962269B2 (en) | 2015-02-24 |
| US6080577A (en) | 2000-06-27 |
| ATE301191T1 (de) | 2005-08-15 |
| US8394932B2 (en) | 2013-03-12 |
| AU3436995A (en) | 1996-05-02 |
| CA2160937C (en) | 2010-02-02 |
| AU702252B2 (en) | 1999-02-18 |
| US20060089490A1 (en) | 2006-04-27 |
| JP4283345B2 (ja) | 2009-06-24 |
| US20110294226A1 (en) | 2011-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4723550B2 (ja) | 生存運動ニューロン（ｓｍｎ）遺伝子；脊髄筋萎縮 | |
| JP3715314B2 (ja) | 結節硬化症２遺伝子及びその利用 | |
| US20030190639A1 (en) | Genes involved in intestinal inflamatory diseases and use thereof | |
| EP0711833B1 (en) | Survival motor neuron (SMN) gene: a gene for spinal muscular atrophy | |
| Lin et al. | Identification, chromosomal assignment, and expression analysis of the human homeodomain-containing gene Orthopedia (OTP) | |
| US5262529A (en) | Diagnosis of hereditary retinal degenerative diseases | |
| US5840491A (en) | DNA sequence encoding the Machado-Joseph disease gene and uses thereof | |
| CA2373466C (en) | Application of aprataxin gene to diagnosis and treatment for early-onset spinocerebellar ataxia (eaoh) | |
| US6175000B1 (en) | Nucleic acids encoding human trithorax protein | |
| US5770432A (en) | Obesity associated genes | |
| EP1038015B1 (en) | Mood disorder gene | |
| JPH10506529A (ja) | ヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子 | |
| WO2000011016A1 (en) | Dysferlin mutations | |
| AU2306201A (en) | Methods for dectecting mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy | |
| JP2002508177A (ja) | オリゴフレニン１と称される新規の遺伝子、その発現生成物、並びにその診断及び治療的用途 | |
| CA2080309A1 (en) | Mutations in ryanodine receptor causative of human malignant hyperthermia |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060228 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20060518 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20060523 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060831 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070619 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071018 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20071122 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080212 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080509 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080514 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080812 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081216 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090115 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20081225 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090217 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090319 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120327 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120327 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130327 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140327 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |