JPH082296B2 - 組換えＤＮＡ法により形質転換された宿主生物及び前記形質転換宿主生物からα―ガラクトシダーゼを製造する方法 - Google Patents

組換えＤＮＡ法により形質転換された宿主生物及び前記形質転換宿主生物からα―ガラクトシダーゼを製造する方法

Info

Publication number
JPH082296B2
JPH082296B2 JP62503901A JP50390187A JPH082296B2 JP H082296 B2 JPH082296 B2 JP H082296B2 JP 62503901 A JP62503901 A JP 62503901A JP 50390187 A JP50390187 A JP 50390187A JP H082296 B2 JPH082296 B2 JP H082296B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
galactosidase
host organism
guar
enzyme
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP62503901A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH01500242A (ja
Inventor
オベルベーケ，ニコラース
ヨハネス フェリンガー，アーサー
グリン ヒューズ，スチーブン
Original Assignee
ユニリバー ナームローゼ ベンノートシヤープ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB868630255A external-priority patent/GB8630255D0/en
Priority claimed from GB868630719A external-priority patent/GB8630719D0/en
Priority claimed from GB878710139A external-priority patent/GB8710139D0/en
Priority claimed from GB878711061A external-priority patent/GB8711061D0/en
Priority claimed from GB878712318A external-priority patent/GB8712318D0/en
Application filed by ユニリバー ナームローゼ ベンノートシヤープ filed Critical ユニリバー ナームローゼ ベンノートシヤープ
Publication of JPH01500242A publication Critical patent/JPH01500242A/ja
Publication of JPH082296B2 publication Critical patent/JPH082296B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、α−ガラクトシダーゼ酵素の群からの特定
の種類の酵素の新規な製造方法に関する。α−ガラクト
シダーゼ酵素は、サツカライドの他の部分にα−結合し
たガラクトースを含有するサツカライドからガラクトー
スを分離する能力を有する。α−ガラクトシダーゼ酵素
は広範囲の生物（微生物からヒトまで）にその存在が知
られているが、その一部についてのみ、最近の構造が明
らかにされたにすぎない。たとえば、Saccharomyces ca
rlsbergensis（Liljestrm,1985;Sumner−Smithほか、
1985）、ヒト酵素（Bishopほか、1986）およびE.coliか
らのmel遺伝子（Liljestrｍ＆Liljestrm,1987）で
ある。後二者は、本出願の最初の優先権主張日以後に刊
行されたものである。
本発明の原因となつた研究中に、Ｓ．carlsbergensis
酵素およびE.coli酵素は、以下に述べる特定の使用に適
していないことが明らかにされた。ヒトα−ガラクトシ
ダーゼは入手できないので試験できなかつたが、以下に
記載した実験（本明細書中の例４および表参照）から考
慮して、このヒト酵素もその特定な使用には適していな
いと考えて間違いないものと思われる。
すなわち、きわめて限られた数のα−ガラクトシダー
ゼ酵素プレパレーシヨンしか、１−４結合β−Ｄ−マン
ノピラノシル単位の主鎖に付着した１−６結合α−Ｄ−
ガラクトピラノシル単位を含有させるガラクトマンナン
のガラクトース含量を低下させる方法に使用するのに適
していない（McClearyほか、1984;EP−Ａ−0 121 96
0）。この方法においては、ガラクトマンナンは、ガラ
クトマンナン２〜70％を含有する水和プレパレーシヨン
の形でインキユベートされる。本明細書において％は、
とくに指示のない限り重量％である。この方法で、ガラ
クトース含量が低下し、ヒトおよび動物の食料品および
化粧用プレパレーシヨンに使用できるガラクトマンナン
が得られる。しかしながら、これらのきわめて特異的な
α−ガラクトシダーゼ酵素の化学構造は未知である。
とくにEP−Ａ−0 121 960号に記載された方法では、
ガラクトース含量が好ましくは27％から10％の間に低下
したガラクトマンナンが生成する。この場合、ガラクト
マンナンの相互作用性はかなり改善される。ガラクトー
スを高含量に含有するグアー（Cyamopsis tetragonolob
a）、ルツエルン（Medicago sativa）およびコロハ（Tr
igonella foenumgraecum）から得られるガラクトマンナ
ンがEP−Ａ−0 121 960号に記載された方法における出
発原料として使用できる例に挙げられている。これらは
改良された性質を有するガラクトマンナンを生成し、非
処理グアーガムに比べて、とくに他のポリサツカライド
とゲル化する性質など、より好ましい性質を有するたと
えばイナゴマメ（carob）ガムの代用として使用でき
る。産出の少ない穀物であり、またイナゴマメは一般に
再植されることがないため、イナゴマメガムは価格が上
昇し、欠乏してきていることから、イナゴマメガムを使
用する工業においては、その代用品の導入は歓迎される
ところである。
EP−Ａ−0 121 960号に記載された方法では、特異的
なα−ガラクトシダーゼ活性を有し、高々弱いβ−マン
ナナーゼ活性を有する酵素プレパレーシヨンが用いられ
る。すべてが同等に有効ではないが、適当な酵素は植物
起源のもの（たとえばルツエルン、コロハ、コーヒー豆
またはグアーの種子）であり、また細菌（たとえばBaci
lluscereus，Escherichia coli）または菌（たとえばA
spergillusまたはSaccharomyces）培養物から得られ
る。ガラクトマンナンを適当な酵素プレパレーシヨン
と、そのガラクトース含量が低下するまでインキユベー
シヨンしたのち、得られた生成物は、そのままとくに寒
天、カラゲーナンおよびキサンタンのような他のポリサ
ツカライドと配合されこれらの材料との相剰的相互作用
の利点を生かして使用されるか、またはそのように使用
する前に精製してもよい。
EP−Ａ−0 121 960号には、以下のα−ガラクトシダ
ーゼが実施例中に記載されている。
−グアーの種子のα−ガラクトシダーゼII （McCleary,1983参照） −Aspergillus nigarからのα−ガラクトシダーゼ（Bah
l＆Agrawal,1969参照） −ルツエルン（Medicago sativa）の発芽種子からのα
−ガラクトシダーゼ（例13参照） −コロハ（Trigonella foenum-graecum）の発芽種子か
らのα−ガラクトシダーゼ（例13参照） EP−Ａ−0 121 960号に記載されたα−ガラクトシダ
ーゼによる処理により、グアーからのグアランや他のガ
ラクトース含量の高いガラクトマンナンに比べ改良され
たガラクトマンナンが得られるが、α−ガラクトシダー
ゼの利用性は現在のところかなり限られていて、したが
つてその価格はかなり高い。
さらに、好ましいグアーのα−ガラクトシダーゼ酵素
がグアーの発芽種子から単離されても、望ましくないβ
−マンナナーゼ（ガラクトマンナンのマンナン鎖を切断
する;McCleary,1983参照）を完全に除去しなければなら
ないため、繁雑な操作による注意深い精製が必要であ
る。
したがつて、ガラクトマンナンのガラクトース含量を
低下させ、しかもガラクトマンナンのマンナン骨格を切
断しすぎることがないα−ガラクトシダーゼプレパレー
シヨンを製造する方法が望まれている。
α−ガラクトシダーゼによつてガラクトマンナンのガ
ラクトース含量を低下させる他の従来技術についてはEP
−Ａ−0 121 960号の第２頁および第３頁に記載されて
いる。この記載を本明細書に参考として導入する。
本発明は、１−４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単位
の主鎖にα−Ｄ−ガラクトピラノシル単位が結合したガ
ラクトマンナンから、１−６結合−α−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル単位を切り離す能力をもつα−ガラクトシダー
ゼの製造方法を提供する。
本発明によれば、α−ガラクトシダーゼは組換えDNA
法によつて製造される。すなわち、所望のα−ガラクト
シダーゼの性質を有する蛋白質をコードする遺伝子を宿
主生物中にクローニングし、形質転換宿主生物またはそ
の子孫にその遺伝子を発現させ、生成した蛋白質を所望
によりさらに処理したのち、所望のα−ガラクトシダー
ゼ特性を有するポリペプチドを得る。
発現を微生物中で行う場合には、天然材料から、β−
マンナナーゼを含まないα−ガラクトシダーゼを回収す
るために困難な単離方法を用いることなく、新しい発酵
法でα−ガラクトシダーゼを製造できる。
実質的にβ−マンナナーゼを含まないα−ガラクトシ
ダーゼの製造は、天然の植物を用いるより微生物を用い
ることにより著しく容易になる。培養条件をβ−マンナ
ナーゼの産生が完全に抑制されるように選んだり、β−
マンナナーゼを全く産生できない微生物（突然変異体）
を使用ることが可能だからである。
しかしながら、別法として、植物又は組換えDNA技術
によって形質転換された植物組織培養体、またはその子
孫中でグアーα−ガラクトシダーゼまたは類似の活性を
示すα−ガラクトシダーゼの製造の可能性はある。
現在までのところ、所望のα−ガラクトシダーゼ特性
を有する蛋白質のアミノ酸配列も、そのような蛋白質を
コードする遺伝子のヌクレオチド配列もわかつていな
い。
本発明者らは、以下に例示するような、所望のα−ガ
ラクトシダーゼの特性を有する蛋白質をコードする遺伝
子の単離に成功した。また、本発明者らは、この遺伝子
をクローニングベクター、いわゆる組換え発現プラスミ
ドに導入することができた。そしてそれを使用して、そ
の遺伝子を微生物Saccharomyces cerevisiae、以前には
Kluyveromyces lactisとして知られていたKluyveromyce
s marxianus var.lactis,Bacillus subtilisおよびHans
enula polymorpha、ならびに植物Nicotiana tabacumお
よびそのプレパレーシヨン中で発現させることに成功し
た。合成された生成物が細胞内に留まるか、あるいは細
胞外に存在するかは、使用した発現プラスミドに依存す
る。
α−ガラクトシダーゼ酵素の活性は、最初、McCleary
（1983）によつて述べられているようにｐ−ニトロフエ
ニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（PNPG）とのインキ
ユベーシヨンによつて、また植物もしくは組織について
は以下の例11に述べるように４−メチルウムベリフエリ
ル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドとのインキユベーシヨ
ンによつて明らかにされた。さらに、生成した製品も、
天然のグアー植物からの酵素の場合と実質的に同様にグ
アーガムのガラクトース含量を低下させる活性を示すこ
とを証明した。
したがつて、本発明の一態様は、蛋白質またはその前
駆体をコードするヌクレオチド配列が挿入されている組
換えベクターであつて、宿主生物を形質転換するとその
宿主生物中でそのヌクレオチド配列の発現が可能になる
組換えベクターに関する。この場合の蛋白質はα−ガラ
クトシダーゼ活性を有し、１−４結合β−Ｄ−マンノピ
ラノシル単位の主鎖に付加した１−６結合α−Ｄ−ガラ
クトピラノシル単位を切断してガラクトマンナンのガラ
クトース含量を低下させることができる蛋白質である。
この場合の前駆体は、その蛋白質のたとえば移転を容易
にするような１個もしくは２個以上のオリゴペプチドも
しくはポリペプチドを有する蛋白質を含む。
グアー種子からのα−ガラクトシダーゼに対して産生
する抗体と陽性免疫交差反応を示す数種のα−ガラクト
シダーゼも１−４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単位の
主鎖に結合した１−６結合α−Ｄ−ガラクトピラノシル
単位を切断してガラクトマンナンのガラクトース含量を
低下できること、しかしながら、グアー種子からのα−
ガラクトシダーゼに対して産生した抗体に陰性免疫交差
反応を与える他のα−ガラクトシダーゼは所望の能力を
もたないことが明らかにされた。
さらに、α−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオ
チド配列は、生成したα−ガラクトシダーゼが所望の能
力を失うことなく、遺伝子操作によつて修飾できること
が明らかにされた。
したがつて、ヌクレオチド配列は、 （ａ） 上述の特異的能力を有するα−ガラクトシダー
ゼをコードする天然のヌクレオチド配列、 （ｂ） グアー種子からのα−ガラクトシダーゼに対し
て産生される抗体と陽性免疫交差反応を示すα−ガラク
トシダーゼをコードするヌクレオチド配列 （ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）と同一または上述の特異
的能力をなお保持しているその修飾体のいずれかである
α−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子操作ヌクレオ
チド配列 からなる群より選ぶことができる。
たとえば、遺伝子は、α−ガラクトシダーゼを産生さ
せる微生物により適合するコドンを用いて作成すること
ができる。その場合、α−ガラクトシダーゼをコードす
るヌクレオチド配列であるいわゆるα−ガラクトシダー
ゼ遺伝子は、天然のα−ガラクトシダーゼと同じα−ガ
ラクトシダーゼをコードする。両酵素は同じアミノ酸組
成を有するからである。しかし、特異的α−ガラクトシ
ダーゼ活性をなお保持する修飾酵素であるその修飾体を
コードする遺伝子を作成することも可能である。組換え
DNA技術を応用して、たとえば熱安定性および／または
比活性等の性質が改良されたα−ガラクトシダーゼの修
飾体をコードする遺伝子操作遺伝子を製造することも可
能である。
本発明はとくに、以下のアミノ酸配列 を含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むベク
ターを提供するものである。
グアー種子のα−ガラクトシダーゼをコードする天然
の遺伝子の使用を望む場合は、本明細書に示す操作によ
つて見出された二本鎖相補性DNA（ds−cDNA）を用いる
のが好ましい。このds−cDNAのプラス鎖は第６図に示し
たヌクレオチド配列307〜1398を有し、上に示したアミ
ノ酸配列１〜364のコドンに相当する。
選ばれた宿主生物に適当なベクターは、 （ａ） α−ガラクトシダーゼまたはその前駆体をコー
ドする二本鎖DNA（ds−DNA） （ｂ） （ａ）のds−DNAのプラス鎖の暗号領域の３′
末端に結合し、所望により選ばれた宿主生物に適当な転
写終結配列が続く翻訳停止コドン （ｃ） （ａ）のds−DNAのプラス鎖の上流に位置す
る、選択された宿主生物に適当な発現レギユロン （ｄ） ds−DNAがα−ガラクトシダーゼの成熟型をコ
ードし、その型がメチニン残基で開始しない場合、
（ａ）のds−DNAのプラス鎖の暗号領域の５′末端に結
合する翻訳開始ATGトリプレツト （ｅ） （ａ）のds−DNAの、選ばれた宿主生物のゲノ
ムおよび／または選ばれた宿主生物に適当な複製のオリ
ジンおよび所望により選択マーカーへの挿入を容易にす
るヌクレオチド配列、ならびに （ｆ） 所望によりα−ガラクトシダーゼの前駆体型の
前駆体部分をコードするds−DNA から構成されることが好ましい。
本発明の他の態様は、前述の組換えベクターの導入に
より、好ましくはβ−マンナナーゼを実質的に含まない
α−ガラクトシダーゼの産生能を有している形質転換宿
主生物、およびその子孫に関する。宿主生物は、植物ま
たはその部分たとえばSolanaceaとくにNicotiana、また
は動物もしくはヒト細胞であつてもよいが、細菌たとえ
ばBacillus、かびたとえばAspergillus、酵母たとえばS
accharomyces，Kluyveromyces，HansenulaおよびPichia
のような微生物も使用できる。本発明は以下の宿主生
物、Saccharomyces cerevisiae，Kluyveromyces marxia
nus var.Iactis，Bacillus subtilis，Hansenula polym
orphaおよびNicotiana tabacumを用いて実施された。遺
伝子は、これまで多数の異なる宿主生物中で発現されて
きたことから、それが他の各種宿主生物中でも発現する
と期待することは現実に即している。たとえば、Pichia
pastoris，Saccharomyces carlsbergensis，Aspergill
us nigerおよびAspergillus nidulansなどの例を挙げる
ことができる。
しかしながら、本発明の主要な態様は１−４結合β−
Ｄ−マンノピラノシル単位の主鎖に結合した１−６結合
α−Ｄ−ガラクトピラノシル単位を切断することにより
ガラクトマンナンのガラクトース含量を低下させること
ができるα−ガラクトシダーゼを製造する方法におい
て、前述の形質転換宿主生物を、培養中または培養後の
誘導に際してα−ガラクトシダーゼを産生するような条
件下に培養し、ついでα−ガラクトシダーゼを集めるこ
とを特徴とする方法に関する。この態様の場合、α−ガ
ラクトシダーゼは宿主生物から分泌され、ついでα−ガ
ラクトシダーゼの回収は発酵ブイヨンからの細胞の除
去、次に所望により得られた溶液の濃縮によつて行われ
ることが好ましい。
本発明はまた、ガラクトマンナンの水性プレパレーシ
ヨンを、β−マンナナーゼを実質的に含まないα−ガラ
クトシダーゼとインキユベーシヨンすることにより、ガ
ラクトマンナンのガラクトース含量を低下させる方法を
提供する。このような方法は、たとえばEP−Ａ−0 121
960によつて公知である。しかしながら、本発明の方法
は、前段に述べた方法によつて製造されたα−ガラクト
シダーゼを使用することを特徴とするものである。本発
明は、ガラクトマンナンを修飾するための公知方法を経
済的により魅力があるものとするような価格および量で
α−ガラクトシダーゼを提供するものである。
最後に、本発明は、前述の方法によつて製造されたガ
ラクトース含量の低いガラクトマンナンを用い、所望に
よりこれを１種または２種以上の他の増粘剤またはゲル
化剤、たとえばアラビアゴム、トラガカント、寒天、ア
ルギン、カラゲナン、フアーセララン、ペクチン、ゼラ
チン、デンプンおよび改良ガムたとえばカルボキシメチ
ルセルロースと混合する食品、動物用飼料または化粧品
の製造方法に関する。
最後に挙げた２つの態様は、 （１） α−ガラクトシダーゼを生成できる形質転換
宿主生物を使用する本発明の方法によつて製造されたα
−ガラクトシダーゼの、ガラクトマンナンのガラクトー
ス含量低下のための使用 （２） ガラクトース含量の高いガラクトマンナンを本
発明の方法によつて製造されたα−ガラクトシダーゼで
処理して得られるガラクトース含量低下ガラクトマンナ
ンの、食品、動物用飼料または化粧品の製造のための使
用、 と表現することもできる。
本発明の要約および技術的記述の概略 本発明の様々な態様は広範な研究の結果である。これ
らを以下に概括し、詳細は実施例で述べる。
本発明の一態様は、ガラクトマンナンのたとえば１−
４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単位の主鎖に結合され
た１−６結合α−Ｄ−ガラクトピラノシル単位を切断す
ることにより、ガラクトマンナンのガラクトース含量を
実質的に低下できるα−ガラクトシダーゼ酵素のヌクレ
オチド配列およびアミノ酸配列の解明に関する（例１参
照）。
この酵素活性が発芽グアー種子の内乳中に存在するこ
とは知られていた。しかしながら、グアー種子中のどの
細胞がこのα−ガラクトシダーゼ酵素の産生に関与して
いるのかは明らかではなかつた。
グアー種子の発芽に関する顕微鏡的研究と、種皮およ
び／または胚除去後の内乳分解の観察が相まつて、酵素
は内乳自身の中で製造されるという仮説が導かれた。糊
粉細胞が最も有力な候補とされた（例１のセクション1.
1）。
この仮説は確認されねばならなかつた。したがつて、
mRNAが糊粉細胞から精製された。発芽した種子から20時
間にわたつて分泌された内乳はそのままではRNAの精製
に使用できなかつた。ポリサツカライドがゲル形成によ
り、著しくカオトロピツクな試薬を用いてもRNAの抽出
を妨害した。この問題を解決するために、本発明者ら
は、内乳ポリサツカライドを分解するために外から加え
た酵素を使用した。条件を注意深く調整しないと、糊粉
細胞中のRNAが操作中に分解することが明らかにされ、
これは糊粉細胞自体により産生するRNase酵素によるも
のと考えられた。精製RNAについてα−ガラクトシダー
ゼをコードするmRNAの存在を、 −α−ガラクトシダーゼ特異性抗体と反応する蛋白質
についてin vitro翻訳および分析 −mRNAと、α−ガラクトシダーゼに特異的なオリゴヌ
クレオチド混合プローブとのハイブリダイゼーシヨン
（これらの特異的プローブを構築するために、精製蛋白
質の小部分のアミノ酸配列を決定した） によつて解析した。
両解析の結果、α−ガラクトシダーゼをコードするmR
NAが糊粉細胞中に存在することが明らかにされた（例
１、セクション1.2）。
mRNAは、α−ガラクトシダーゼ特異的オリゴヌクレオ
チド混合プローブを用い、標準方法によつてグアーα−
ガラクトシダーゼcDNAクローンをクローニングするため
に使用した（例１、セクション1.3および1.4）。
グアーα−ガラクトシダーゼcDNAクローンのヌクレオ
チド配列を決定し、アミノ酸配列を誘導した。精製蛋白
質について決定したNH2末端アミノ酸配列はヌクレオチ
ド配列から誘導したアミノ酸配列と同一であることが明
らかにされ、さらにα−ガラクトシダーゼは成熟蛋白質
の前に47個のアミノ酸残基をもつ前駆体として合成され
ることが示された（例１、セクション1.5）。
本発明の他の態様は、各種宿主によるグアーα−ガラ
クトシダーゼの新規製造経路の可能性に関する。本発明
は前述のような特異的能力を有するα−ガラクトシダー
ゼ酵素の新規製造方法を提供する。２種の微生物宿主に
ついての実験で、経済的に興味あるレベルがすでに達成
されていることが示され、数種の他の宿主生物（微生物
および植物の両者）でも可能性が明らかにされている。
例示のために、本発明者らは、Saccharomyces，Kluyv
eromyces，Bacillus，HansenulaおよびNicotiana中でこ
の酵素を産生できるプラスミドを構築した。
S.cerevisiaeの場合の例としては、１つはpURY2703と
いうプラスミドで、酵母GAPDHプロモーターを成熟α−
ガラクトシダーゼのみをコードする遺伝情報に融合させ
た。他のプラスミドpURY2705は、GAPDHプロモーター
を、インベルターゼシグナル配列::成熟α−ガラクトシ
ダーゼからなるハイブリツド遺伝子に融合させた。両プ
ラスミドとも、ｐ−ニトロフエニル−α−Ｄ−ガラクト
ピラノシドに対して活性なS.cerevisiae中で酵素の産生
が起こつた。しかしながら、pURY2705の生成物はpURY27
03の生成物と異なり、酵母細胞の外部に出現できた。さ
らに、ウエスターン法での解析により、pURY2705からの
生成物は植物酵素と同じ分子量を有していたのに対し、
pURY2703の生成物はわずかに低い分子量を示した（例２
参照）。
プラスミドpURY2705を係留した酵母細胞から、1ml中
α−ガラクトシダーゼ10単位が存在するように粗抽出液
を調製した。このような粗プレパレーシヨンはグアーガ
ムのガラクトース含量を低下させることが可能であつ
た。（例３参照）。
Saccharomycesについての他の例としては、酵母細胞
の炭素源としてのガラクトース上での生育により誘導さ
れるGAL7プロモーターを、インベルターゼシグナル配
列::成熟α−ガラクトシダーゼからなるハイブリツド遺
伝子に融合してプラスミドpUR2706およびpUR2730を構築
した。
両プラスミド間の差は、pUR2706が、271bpのクローン
化GAL 7 DNAフラグメントを使用したのに対し、pUR2730
ではGAL7プロモーターをin vitroで合成したオリゴヌク
レオチドから得た点である。プラスミドpUR2706はガラ
クトース上での生育により誘導すると、酵素の酵母細胞
による産生が起こつた。酵素は生育培地中に5,000U/lま
で分泌させ、正しく処理し、グリコシル化する（例９参
照）。
発酵ブイヨンから酵母細胞を濾去し、ブイヨンを10倍
に濃縮した。このような粗濃縮液は、グアー種子から精
製した酵素と比較して全く同じに、グアーガムのガラク
トース含量を低下させることができた（例10参照）。
グアー種子からのα−ガラクトシダーゼに対して産生
される抗体との陽性免疫交差反応とガラクトマンナンの
ガラクトース含量低下能との間に関係が存在するとの知
見については例４で説明する。
α−ガラクトシダーゼ遺伝子がS.cerevisiae中のみでな
く、他の微生物中でも発現できることを例示するため、
各種微生物、すなわち、 （ａ） Kluyveromyces marxianusvar.lactis （ｂ） Hansenula polymorphaおよび （ｃ） Bacillus subtilis 中で酵素を産生できるプラスミドを構築した。
（ａ） Kluyveromyces marxianusvar.lactis中でのα
−ガラクトシダーゼの製造 S.cerevisiaeプラスミドpURY2705中にKluyveromyces
自動複製システム（すなわちKARS2）と選択マーカー（t
rp−１遺伝子）の両者を導入することによりpUR2405と
呼ばれるプラスミドを生成した。株K.marxiausvar.lact
is株SD−11（lac−４、trp−１）の酵母細胞をプラスミ
ドpUR2405で形質転換した。生育後、形質転換株の細胞
抽出液は、このプラスミドをもたない同一株と異なり、
人工基質PNPGを加水分解できる蛋白質を含有していた。
さらに、粗細胞抽出液のウエスターン法解析でグアーα
−ガラクトシダーゼ抗血清と特異的反応を示し、グアー
α−ガラクトシダーゼ酵素の存在が明らかであつた（例
５参照）。これらの実験から、形質転換Kluyveromyces
がグアーα−ガラクトシダーゼ酵素を産生することが示
される。
（ｂ） Hansenula polymorpha中でのα−ガラクトシダ
ーゼの製造 H.polymorphaが、たとえばMOXプロモーターまたはDHA
Sプロモーターのような誘導可能なプロモーターを特異
的に用いて外来性生成物を産生する可能性についてはす
でに確認されている。H.polymorpha中で複製可能でleu-
突然変異を補充できるベクターYEp13に基づいてpUR3510
と呼ばれるプラスミドが構築された。このベクター中に
は以下の構築体:MOXプロモーター−インベルターゼシグ
ナル配列−成熟α−ガラクトシダーゼ−MOXターミネー
ターが配置された。株H.polymorphaL1（leu1−１）の酵
母細胞がプラスミドpUR3510で形質転換された。MM寒天
板上、グリセロールを炭素源として生育させたのち、細
胞を削り取り、細胞抽出液を調製した。形質転換株の細
胞抽出液は人工基質pNPGを加水分解できる蛋白質を含有
したが、このプラスミドをもたない同一株にはその蛋白
質は認められなかつた。さらに粗細胞抽出液のウエスタ
ーン法での解析で、グアーα−ガラクトシダーゼ抗血清
と特異的反応を示し、グアーα−ガラクトシダーゼの存
在が明らかであつた（例８参照）。これらの実験は、形
質転換Hansenulaがグアーα−ガラクトシダーゼ酵素を
産生することを示している。
（ｃ） α−ガラクトシダーゼ遺伝子が真核微生物中の
みでなく、原核微生物中でも発現できることを示すため
に、Bacillus subtilis中で酵素を産生できるプラスミ
ドを構築した。
α−アミラーゼシグナル配列::成熟α−ガラクトシダ
ーゼからなるハイブリツド遺伝子の前にSPO2プロモータ
ーを配置したpUR2601と呼ばれるプラスミドを調製した
（第６図）。
このプラスミドを係留したB.subtilis細胞を培養した
ところ、培地中に特定の生育期に、pNPGに対する活性を
有する蛋白質が存在した。至適生育培地および生育条件
を選んで発酵槽中で培養すると、生育培地１中に1760
単位が認められた。ウエスターン法で解析すると、グア
ーα−ガラクトシダーゼ抗血清と特異的に反応し、生育
培地中にグアーα−ガラクトシダーゼの存在が示され
た。しかしながら、分子量は植物酵素の場合より少し小
さかつた。NH2末端の配列決定から、α−アミラーゼシ
グナル配列は完全に正しく除去されていて、この差はBa
cillus酵素がグリコシル化されないという事実によるも
のである。
これらの実験から、形質転換Bacillusはグアーα−ガ
ラクトシダーゼを産生するのみでなく、それを生育培地
中に分泌することが明らかである。さらにBacillusによ
つて製造された酵素がグアーガムのガラクトース含量を
低下させることも見出された（例７）。
α−ガラクトシダーゼ遺伝子が微生物内のみでなく、
植物内でも発現できることを例示するため、この酵素を
Nicotiana tabacum、すなわちカルス培養物、根培養
物、懸濁培養物および全植物中で産生できるプラスミド
を構築した。すなわち、全グアープレ−プロ−α−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を含有する植物発現ベクターを構築
した（pUR8001）。このベクターをNicotiana植物または
そのプレパレーシヨン中にAgrobacterium tumefaciens
誘導ベクターを介して挿入した。その結果、カルス培養
物、毛根培養物、葉および懸濁組織培養物中に、活性な
α−ガラクトシダーゼ酵素が産生された。さらにウエス
ターン法解析により、タバコ組織中に産生されたα−ガ
ラクトシダーゼ酵素がグアー糊粉細胞中に産生された酵
素と同じ分子量をもつことが明らかにされた（例11参
照）。
本発明の各種態様を以下の実施例に例示するが、これ
は本発明を限定するものではない。実施例は以下の主題
に関するものであり、例１および４はさらに項目に分か
れている。
例１ ガラクトマンナンのガラクトース含量を低下できるα−
ガラクトシダーゼ酵素をコードする遺伝情報の単離およ
び特性 1.1.グアー種子中のα−ガラクトシダーゼ産生細胞の同
定 1.2.糊粉細胞からのmRNAの精製および解析 1.3.グアー種子からの糊粉細胞のmRNAからcDNAライブラ
リーの構築 1.4.グアーα−ガラクトシダーゼ遺伝情報を含有するク
ローンの選択 1.5.グアーα−ガラクトシダーゼcDNAクローンのヌクレ
オチド配列の決定およびα−ガラクトシダーゼ酵素のア
ミノ酸配列の誘導 例２ 遺伝子操作Saccharomyces cerevisiaeによるグアーα−
ガラクトシダーゼの製造 例３ 遺伝子操作S.cerevisiaeにより製造されたα−ガラクト
シダーゼによるガラクトマンナンのガラクトース含量の
低下 例４ 各種α−ガラクトシダーゼ酵素の免疫学的関係とガム修
飾能 4.1.α−ガラクトシダーゼ酵素源 4.2.遺伝子操作微生物：Saccharomyces cerevisiae ，Kluyveromyces marxianusvar.lactis，Han
senula polymorphaおよびBacillus subtilisにより製造
された酵素 4.3.オクテルロニー二重拡散法で解析した免疫学的関係 4.4.ウエスターン法で解析した免疫学的関係 4.5.α−ガラクトシダーゼ酵素のガラクトマンナン中ガ
ラクトース含量低下能 例５ 遺伝子操作Kluyveromyces marxianusvar.lactisによる
グアーα−ガラクトシダーゼの製造 例６ 遺伝子操作Bacillus subtilisによるグアーα−ガラク
トシダーゼの製造 例７ 遺伝子操作B.subtilisにより製造したα−ガラクトシダ
ーゼ酵素によるガラクトマンナン中ガラクトース含量の
低下 例８ 遺伝子操作Hansenula polymorphaによるグアーα−ガラ
クトシダーゼの製造 例９ GAL7プロモーターを用いた遺伝子操作Saccharomyces cerevisiae によるグアーα−ガラクトシ
ダーゼの製造 例10 GAL7プロモーターを用いた遺伝子操作S.cerevisiae により製造したα−ガラクトシダーゼ酵素
によるガラクトマンナン中ガラクトース含量の低下 例11 特定のNicotiana種における遺伝子操作植物および植物
組織による、グアールα−ガラクトシダーゼの製造 本明細書はさらに、表、文献一覧表、使用した略号の
一覧表、図面の説明および第１図〜第21図を包含する。
例１ ガラクトマンナンのガラクトース含量を低下能を有する
α−ガラクトシダーゼ酵素をコードする遺伝情報の単離
と特性 1.1.グアー種子中のα−ガラクトシダーゼ産生細胞の同
定 グアーガムの修飾に好ましい酵素は、グアーの種子の
内乳から精製されるα−ガラクトシダーゼ酵素であるこ
とは明らかにされている（McClearyほか、1984;EP−Ａ
−0 121 960号）ので、ここではこの特異的酵素の説明
に重点を置く。
グアーは内乳をもつマメ類である。種子内乳は、細胞
層、糊粉、および主としてガラクトマンナンからなる貯
蔵物質から構成されている。ガラクトマンナンは最初、
細胞壁ポリサツカライドとして蓄積されるが、種子の発
芽の際に分解する。他のマメ類と同様、貯蔵蛋白質は子
葉に含有され、これが内乳内に含まれる。内乳をもつマ
メ類の発芽および貯蔵部の動員に関する研究は、類縁の
マメ類のコロハおよびルツエルンについて行われている
（総説はMeier＆Reid,1982がある）。膨化させると（水
に浸漬させる）、酵素は内乳中に放出され、２つの主な
酵素活性はα−ガラクトシダーゼとβ−マンナナーゼで
あることが明らかにされている。これらの結果は、酵素
がコロハ種子の発芽の際に糊粉細胞中で合成されること
を示唆しているが、本発明者らの知る限りでは、結論的
な証拠は今日まで得られていない。
グアーとコロハの類似性から、本発明者らはグアーの
種子もこれらの酵素を糊粉細胞で合成しているとして間
違いないものと考えた。
まず、本発明者らは、グアー種子の発芽を顕微鏡的方
法で研究した。
種子を鋭いカミソリで1mmのデイスクにスライスした
のち0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）中2.5％
グルタルアルデヒドに、３℃で６時間固定した。この物
質を次に同じ緩衝液を用い数回取りかえて洗浄したの
ち、0.1Mカコジル酸塩緩衝液中１％四酸化オスミウムに
より室温で４時間、固定後処理を行つた。組織はエタノ
ールによつて脱水し、Spurrsエポキシ樹脂中に包埋し
た。重合は70℃で24時間実施した。薄片化はReichert U
ltracutマイクロトーム上、ガラスナイフを用いて実施
した。薄片は１〜２ミクロンの厚さに切断し、きれいな
ガラススライド上の蒸留水の水滴上に浮かべ、熱板上に
置いて60℃で乾燥した。染色は１％トルイジンブルーＯ
を用いて行い、薄片はDPXマウンタント（BDHから）上に
据えた。Leitz Ortholux顕微鏡上、位相及び干渉差レン
ズの両者を用いて顕微鏡写真を撮影した。厚い種皮の強
い複屈折を強調するために偏光を用いた。
発芽していないグアー種子の断面図を第１図に示し
た。グアーでは一部の内乳種子にみられるような、糊粉
による細胞の単一可干渉性層の形成は認められなかつ
た。層は種々の点に示されているように、２、３、４ま
たはさらに多数の細胞からなつている。発芽が進むと、
内乳は次第に軟くなつて切断は困難になる。種子が発芽
して48時間後には、内乳の構造はすつかり破壊されてし
まうが、糊粉細胞の外層は安定な細胞間マトリツクス内
に破壊されないで残つている。しかし、細胞の内容は欠
失しているようにみえる。この段階で、糊粉層と残りの
内乳の間に明らかな破壊があつて、内乳の分解は糊粉の
付近で最も強かつたことが示唆される。これは、内乳消
化の酵素は糊粉層から放出されたことを示すものであろ
う。内乳分解の進行は、発芽時の種皮の欠如によつて変
化しなかつた。また、膨化後に胚を除去しても、同様な
内乳の軟化が観察された。これは、種皮も胚も内乳の破
壊には関与していないことを示唆している。これは、そ
れが内乳の分解に関わる酵素、α−ガラクトシダーゼお
よびβ−マンナナーゼの産生にも関与していないと考え
てよいと思われる。
これらの結果は、グアー種子中でも、α−ガラクトシ
ダーゼまたはその前駆体が糊粉細胞中で産生され、つい
でこれらの細胞から貯蔵ポリサツカライド層に分泌され
るとする仮説と一致する。しかしながら、この仮説の結
論的証拠は、α−ガラクトシダーゼ酵素またはα−ガラ
クトシダーゼをコードするmRNAのいずれかが、糊粉細胞
中に存在することを示すことによつてのみ得られる。蛋
白質の存在を明らかにすることには問題が考えられたの
で（急速な分泌、同定できない前駆体型）、本発明者ら
は、糊粉細胞中におけるα−ガラクトシダーゼコードmR
NAの存在を分析しなければならなかつた。
1.2.糊粉細胞からのmRNAの精製および解析 α−ガラクトシダーゼをコードするmRNAの存在を調べ
るため、糊粉細胞のmRNA含量の解析に以下の計画を採用
した。
−内乳中に存在する大部分のポリサツカライドを含ま
ない糊粉細胞の単離 −糊粉細胞からmRNAの精製 −mRNAのin vitro翻訳、精製α−ガラクトシダーゼに
対して産生した抗体を用いて蛋白質生成物の単離、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動による解析 −部分的に確立したアミノ酸配列に基づくα−ガラク
トシダーゼ特異的オリゴヌクレオチドプローブによるmR
NAのノザン法ハイブリダイゼーシヨン 1.2.1.糊粉細胞の単離 グアー種子（市販の変種King Guar var seah 90;殺黴
剤処理、Crown Quality Seed Co.,Texasから購入）を10
％Chloros（漂白剤、有効塩素４％）で１時間殺菌し
た。次に、種子を滅菌水道水で洗浄し、頻回に水を取り
かえて５時間膨化させ（種皮からの色素が遊出する結
果、水は褐色になる）、透明なマーガリンチユーブ内に
含まれる水道水/1％アガロースのゲルの表面に置いて発
芽させる。発芽は20時間進行させる。
ついで種子を個々に解体した。まず、種皮を、マイク
ロパイルの領域に孔をあけてはいだ。次に内乳を、２個
の子葉の縁に広がる内乳の薄い部分を穏やかにさいて胚
から分離した。ついで内乳を半分に分けた。
これらの発芽内乳から直接RNAを精製する試みは、最
も強力なオカトロピツク試薬（たとえばグアニジニウム
チオシアネート）を用いた場合でも、内乳は全く加工で
きないゲルを生じるため、失敗した。
したがつて、ポリサツカライド物質から糊粉細胞をさ
らに分離することが必要であつた。
そこで、外部から加えた酵素プレパレーシヨンによつ
てポリサツカライドの分解を試みることに決定した。
半分ずつに分けた内乳を、Gamborg B5培地（Gibco）
に溶解し、12％シユクロースを補充した酵素溶液に浮遊
させた。インキユベーシヨンは22℃で実施した。
内乳の内容の完全な消化は肉眼的にモニタリングが可
能で、使用した酵素およびその濃度の両者に依存した。
消化が進むに従つて、内乳は次第にその半球型の形状を
失い、軟く、可撓性になつた。多数の市販酵素を様々な
濃度で試験した。Onazuka R10（Kinki Honsha Co.Lt
d）、Gammanase（NOVO）およびDriselase（Fluka）であ
る。初期の研究によつて濃厚な市販酵素プレパレーシヨ
ンに暴露すると、糊粉細胞はプラズマ分離を起こして死
亡することがわかつていたので、酵素プレパレーシヨン
を高濃度で使用できるように清浄化した。これはベンゾ
イル化透析チユーブ（Sigma）を用いた透析によつて実
施した。酵素は12％シユクロース含有B5培地中に溶解し
（10％）、使用前に18〜24時間、同一培地に対して４℃
で透析した。次に酵素を用いて内乳を消化した。これら
の中、10％の濃度ではDriselaseが最も有効であるよう
に思われた。７〜８時間インキユベーシヨン後、内乳は
丸まつて、支持ポリサツカライド組織はすべて消化され
てしまつた。糊粉が丸くなつた点が消化の終点とした。
丸くなつた糊粉のサンプルを顕微鏡で調べ（壊死）、ま
たFDA染色を用いてその生存能をチエツクした（フルオ
レセインジアセテート染料、Hoechst,アセトン中5mg/5m
lを使用直前に培地で1/50に希釈した）。至適酵素処理
（10％酵素、７〜８時間インキユベーシヨン）で、非生
存、壊死細胞はわずか（20％未満）であつた。これらの
細胞からのRNAプレパレーシヨンは、リボゾームRNAの統
合性から判断して、RNAはよく保存されていたことを示
していた。
所望の外観（白色、円形）の糊粉層を個々に消化培地
から採取し、同じ浸透圧で５回洗浄して、残つたポリサ
ツカライドを除去した。最後に液体窒素中に落として保
存した。顕微鏡用に調製したこの物質の薄片は、糊粉２
〜３個の細胞厚で、細胞は酵素プレパレーシヨンによる
消化に抵抗したマトリツクス中に包埋されていた。
1.2.2.糊粉細胞からのRNAの精製 凍結糊粉物質をドライアイスの温度に維持した乳鉢と
乳棒で粉砕した。粉砕物質を、分解緩衝液（50mM Tris
−HCl pH8.0、２％ザルコシル）１容＋フエノール（1M
Tris−HCl pH8.0と平衡化）２容中で解凍させた。混合
し、遠心分離した（10分、5,000rpm）のち、このフエノ
ール抽出を水相上で２回反復した。最後に、3M酢酸ナト
リウム（NaAC）pH5.4を1/10容とエタノール2.5容を加え
たのち、−20℃で核酸を一夜沈殿させた。
定性分析には、RNAを沈殿させ、STE緩衝液（100mM Na
Cl,10mM Tris−HCl pH7.5,1mM EDTA）に溶解し、１分間
煮沸し、直ちに氷上で冷却した。等容のサンプル緩衝液
〔10M尿素、10％シユクロース、Ｅ緩衝液（40mM Tris−
HAC pH7.6,20mM NaAC,20mM EDTA）中0.02％ブロモフエ
ノールブルー〕を加えた。サンプル（３〜10μｇ）をア
ガロース−尿素ゲル（1.8％アガロース、Ｅ緩衝液中5M
尿素）上電気泳動に付した。RNAバンドはエチジウムブ
ロミド（0.5μg/ml）で15分間染色し、長波長紫外線に
暴露して可視化した。
さらに精製するためには、STE緩衝液に溶解した好ま
しくはRNAに１容の8M LiClを加えて沈殿させ、氷上で一
夜インキユベーシヨンした。10分間10,000rpmで遠心分
離して沈殿を集めた（この工程は、DNAとまだプレパレ
ーシヨン中に存在するポリサツカライドの大部分を除去
する）。RNAペレツトを0.1％ザルコシルを含むSTE緩衝
液に溶解し、260nmの吸収を測定して濃度を決定し、1/1
0容の3M NaAC pH5.4および2.5容のエタノールを添加し
たのち、一部を−20℃で保存した。
ポリアデニル化mRNA（ポリ−A RNA）の精製には、2.5
mgのRNAをEppendorf管中に沈殿させ、300μｌのH2Oに溶
解し、５分間65℃に加熱し、氷水上で冷却し、ついで10
mM Tris−HCl pH7.5、1M NaClを含有する混合物300μｌ
を加え、0.1％ザルコシルを加えた。
予め３回Ｏ緩衝液（10mM Tris−HCl,pH7.5,1mM EDTA,
0.5M NaCl,0.1％ザルコシル）で洗浄したオリゴ−dTセ
ルロース（T2型、Collaborative Research）50mgにRNA
を加えた。
少なくとも４時間、室温で上下回転させてインキユベ
ーシヨンしたのち、混合物を、シリコン処置グラスウー
ルのプラグを含む青色Eppendorf1mlピペツトチツプ上に
層にした。流出液中のRNA濃度を測定し、カラムをOD260
の吸光が0.05未満になるまでＯ緩衝液で洗浄した。
カラムに結合したポリ−A RNAを最後に10mM Tris−HC
1 pH7.5、1mM EDTAおよび0.1％ザルコシルを含有する混
合物６×100μｌを加えて溶出した。ポリ−A RNAの量は
通常、総RNAの１％で、260nmにおける吸光を測定して定
量された。
1.2.3.ポリ−A RNAのin vitro翻訳 Wheat Germ TranslationシステムをNew England Nucl
earから入手し、その指示書に従つて、放射性プレカー
サーとして35S−メチオニン（1066Ci/mmol）を用いて操
作を行つた。翻訳生成物は、Edensほか（1982）の記載
のように、ポリアクリルアミドゲル上で分離したのちオ
ートラジオグラフイーで分析した。
翻訳生成物はそのまま、またはMcCleary（1983）の記
載のようにして精製したα−ガラクトシダーゼ蛋白質で
ウサギを免疫処置して産生させたα−ガラクトシダーゼ
特異的抗血清とインキユベーシヨンしたのち適用した。
抗血清と反応した蛋白質をプロテインＡ−セフアロース
（Pharmacia）との沈殿により、Edensほか（1982）の記
載にようにして分離した。
糊粉細胞から精製したmRNAによつてコードされる種々
の蛋白質のうち、α−ガラクトシダーゼ特異的抗体と反
応する蛋白質の存在が示された（第２図）。この蛋白質
の見掛けの分子量は44kdである。
1.2.4.α−ガラクトシダーゼ特異的オリゴヌクレオチド
プローブとのノザキ法ハイブリダイゼーシヨン 1.2.4.1.オリゴヌクレオチドプローブ α−ガラクトシダーゼをコードするmRNAのプローブと
して、本発明者らはNH2−末端の一部および内部ペプチ
ド（第３図参照）について確立されたアミノ酸列に基づ
くオリゴヌクレオチドを使用した。精製された蛋白質か
ら、Ｎ末端アミノ酸配列解析では、Beck−man890Cスピ
ニングカツプ蛋白質シクエンサーを用い、Edman分解（E
dman ＆ Begg、1967）によつて直接決定する。内部ペプ
チドは精製蛋白質をシアゲンブロミドとトリプシンで分
解したのち同様に配列を決定し、ついでそのペプチドを
カラムクロマトグラフイーにより他のペプチドから精製
し、均質にした。確立されたアミノ酸配列に基づき、そ
のアミノ酸をコードするすべての可能なヌクレオチド配
列が誘導された。可能なヌクレオチド配列のすべてまた
は一部を含むデオキシ−オリゴヌクレオチド（いわゆる
混合プローブ）をDNAシンセサイザー（Applied Biosyst
ems）上、ホスフアイト法（Matteuci ＆ Caruthers、19
81）を用いて合成した。オリゴヌクレオチドは16％また
は20％ポリアクリルアミドゲル上で精製した（Maniatis
ほか、1982）。
通常、精製オリゴヌクレオチドの0.1〜0.3μｇを、50
mM Tris−HCl−pH7.5、10mM MgCl2、0.1mM EDTA、10mM
ジチオスレイトール（DTT）、70μCi γ−32P−ATP（30
00Ci/mmol,Amersham）、10単位のポリヌクレオチドキナ
ーゼ（Amersham）中、最終容量15μｌ、37℃で30分間イ
ンキユベーシヨンして標識した。10μｌの0.5M EDTA pH
8.0で反応を終結させ、フエノール／クロロホルム（1:
1）で抽出した。水相を、TE緩衝液（10mM Tris−HClpH
8.0および1mM ESTA）で平衡化した2.5mlのSephadex G25
カラム（使い捨てシリンジ）を通した。250μｌのフラ
クシヨンを集め、これから最初の２個の放射性フラクシ
ヨン、通常フラクシヨン４および５を集めた。
1.2.4.2.ノザン法ハイブリダイゼーシヨン 精製RNAをホルムアルデヒドの存在下に報告されたよ
うにして（Lehrachほか、1977）電気泳動によつて分離
した。10mM Tris−HClpH7.5、1mM EDTA、0.1M NaClおよ
び0.1％SDSの混合物１μｌに１μｇ溶解したRNAの５μ
ｌに、ホルムアルデヒド（BDH Chemicals）10μｌ、濾
過ホルムアルデヒド（Merck）3.3μｌと10×MOPS緩衝液
（0.2M MOPS pH7.0、10mM EDTA）２μｌを加えた。サン
プルを70℃に15分間加熱し、氷上で冷却し、１％アガロ
ースゲルに適用した（１％アガロースを水73ml中に煮沸
溶解させ、65℃に冷却したのち10×MOPS緩衝液10mlおよ
びホルムアルデヒド16.5mlを加えた）。
電気泳動は１×MOPS緩衝液中、30〜40mAで３〜５時間
実施した。RNAはエチジウムブロミド（0.1M酢酸アニモ
ニア中１μg/ml）で30分間染色して可視化し、蒸留水中
で30〜60分間脱色し、長波長紫外光に暴露した。
次に、RNAを、Gene Screen Plus（Dupont NEN）に、
製造者の指示書に従い10×SSC（1.5M NaCl、0.15Mクエ
ン酸ナトリウム）とともに毛細管ブロツトによつて移し
た。移動は20時間続けた。２×SSCで洗浄したのち、膜
を真空下80℃で２時間焼いた。
ハイブリダイゼーシヨンに先立つて、膜を５×SSC、
２×デンハルト（10×デンハルト:0.1％Ficoll、0.1％
ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清アルブミン）、
１％SDSおよび100μg/ml剪断（超音波処理）および変性
（２分間煮沸）ウシ胸腺DNAの混合物中、65℃で４〜５
時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーシヨン
は、32P標識オリゴヌクレオチドプローブを補充した同
一緩衝液中、たえず攪拌しながら30℃で実施した。
このハイブリダイゼーシヨン後に、膜を、５×SSC
（室温で15分間、３回）で、ついで0.1％SDS含有５×SS
Cで、30℃で30分間洗浄した。もつと高い温度でおよび
／または低い塩濃度でのさらに厳格な洗浄を指示に従つ
て実施した。
結果は、プローブMP33が約1,600ヌクレオチドのmRNA
と特異的にハイブリダイズした。この大きさのmRNAは45
kdまでの蛋白質をコードできることを示している（第４
図）。
これらの実験、in vitro翻訳およびノザン法ハイブリ
ダイゼーシヨンから、本発明者らは自分達の仮説が正し
く、α−ガラクトシダーゼは発芽時にグアー種子の内乳
の糊粉細胞中で合成されると結論した。
1.3.グアー種子の糊粉細胞のmRNAからのcDNAライブラリ
ーの構築 cDNA合成の方法は、Gubler ＆ Hoffman（1983）によ
つて報告された方法に基づくものを用いた。10μｌの水
に溶解したポリ−A RNA3μｇを10μｌの水中2.5μｇの
オリゴーdT12〜18（Collaborative Research）と、100
℃に30秒間加熱し、ついで30秒間氷水で冷却してアニー
リングした。相補的鎖を、30μｌのMix I〔使用直前に2
5μｌの新たに調製した２×RT緩衝液（0.1M Tris−HCl
43℃でpH8.3、10mM MgCl2、150mM KCl、20mM DTT、1mA
dATP、1mM dGTP、1mM dCTP、0.2mM TTP）、40〜50単位
逆転写酵素（Anglian Biotechnology）および蒸留水で3
0μｌに調製〕を添加後、43℃で45分間インキユベーシ
ヨンして合成された。反応は氷水中に２分間置いて停止
した。
ついで直ちに、第一鎖150μl Mix II〔使用直前に０
℃にて調製:40mM Tris−HCl pH7.5、10mM MgCl2、75mM
KCl、25μg/mlウシ血清アルブミン（DnaseおよびRNase
を含まない、Bethesda Research Laboratories）〕、２
μｌα−32P−TTP（3000Ci/mmol、Amersham）、40単位D
NAポリメラーゼＩおよび８単位RNase（両者ともAnglian
Biotechnology）を含有する混合物に加えることにより
第二鎖を合成した。反応は11℃で60分間行つた。連結
は、ついで、直接２μｌの20mM ATPおよぴ400単位のT4
−DNAリガーゼ（Biolabs）を加え、18℃で２時間インキ
ユベーシヨンすることにより行われた。反応は20μｌの
0.4M EDTAおよび１μｌの20％SDSを加て停止させた。
得られたds−cDNAを、10mM Tris−HCl pH7.5、0.3M N
aClおよび1mM EDTAで平衡化したSephadex G−50（10μ
ｌカラム）でゲル濾過して精製した。150μｌのフラク
シヨンを集め、放射能はシンチレーシヨン液体を加えな
いで直接各フラクシヨンについて測定し（いわゆるCere
nkovカウンテイング）、DNA含有フラクシヨンを集め
た。ds−cDNAをアルコールで沈殿させ、10mM Tris−HCl
pH7.5、0.3M NaCl、1mM EDTA、0.1％SDSの混合物に溶
融し、同じ緩衝液で平衝化したSepharose CL−4B（Phar
macia）カラム（パスツールピペツト中2ml）上サイズに
より分画した。約100μｌのフラクシヨンを集め、アガ
ローズゲル上電気泳動によりついでオートラジオグラフ
イーによりcDNAの長さを解析した。500bpより大きいds
−cDNAをもフラクシヨンを集め、アルコールで沈殿させ
た。ds−cDNAは水10μｌに溶解させた。
ホモポリマーdC−テイリングは、10μｌのds−cDNA
に、４μl 5×TdT緩衝液（1Mカコジル酸ナトリウムpH7.
0、10mM CoCl2、0.5mM dCTP）、3.4μｌ水、0.6μl 5mM
DTTを加えてることにより実施された。サンプルを37℃
で２分間インキユベーシヨンを行い、２μｌターミナル
トランスフエラーゼ（20単位／μl;Bethesda Research
Laboratories）を補充して37℃で８分間インキユベーシ
ヨンした。反応は１μｌの0.5M EDTAおよび20μｌフエ
ノールを加えい停止させた。混合後、クロロホルム10μ
ｌを加え、混合し、２分間遠心分離した。フエノール層
を再抽出し、水相を集め、エーテルで２回抽出してフエ
ノールを除去し、新しいEppendorf管（ジクロロジメチ
ルヒドロキシシランでコーテイング）に移し、DNAをエ
タノールで沈殿させた。
dC−テイルds−cDNAを10mM Tris−HCl pH7.5、1mM ED
TAおよび0.1M NaCl（アニーリング緩衝液）混合物20μ
ｌ中に溶解した。ds−cDNAをＧ−テイルベクター（PstI
で切断したpBR322とホモポリマーdG−テイル、Dupont N
ENから購入）と、約4ngのds−cDNAに25ngベクターの割
合で用い、最終容量25μｌとし、65℃に10分間加熱し、
ついで４℃に徐々に冷却してアニーリングした。これら
のアニーリングサンプルを用いてE.coli294株（endo
I-、B1 -、rk-、mk+;Beckmanほか、1976）Maniatisほか
（1982）の記載したHanahan法で形質転換した。これに
より３×104クローンのクローバンクが得られた。
1.4.グアーα−ガラクトシダーゼ遺伝情報を含有するク
ローンの選択 形質転換E.coli細胞のサンプルを、テトラサイクリン
（10μg/ml）を含むアガール板上に置いたニトロセルロ
ース濾紙（Millipore HATF型、0.45μｍ）に直接広げ、
一夜37℃でインキユベーシヨンしたのち、濾紙１枚あた
り（３〜５）×103コロニーが存在するようにした。
１枚のマスター濾紙から以下のように２個の同一なレ
プリカが得られた。マスター濾紙を乾燥濾紙上に置き、
マークした。第一のニトロセルロースレプリカ濾紙を新
鮮なＬ−培地アガール板上で湿潤させ、マスター濾紙の
最上部に置いた。４枚の濾紙をレプリカ濾紙上に置き、
注意深くガラススパーテルを用いて下に押しつけた。４
枚の濾紙を除去し、方向標識は正確にレプリカ上にコピ
ーし、レプリカ濾紙をＬ−培地寒天平板上（コロニーを
生育させる）に置き、これを第２のレプリカについても
くり返した。レプリカ濾紙を37℃で、コロニーが肉眼で
見えてくるまで３〜５時間生育させ、クロラムフエニコ
ール（150μg/ml）を含有するＬ−培地寒天平板に移
し、37℃で一夜インキユベートした。マスター濾紙をテ
トラサイクリンを含む寒天平板上に置き、４℃に保存し
た。
レプリカ濾紙上の細胞は15分間、0.5M NaOHと1.5M Na
Clで飽和したWhatmann3MM濾紙多数の上に置き溶菌し
た。乾燥濾紙の上に置いて過剰の液体を濾紙から除去し
たのち、ついで濾紙を1M Tris−HCl pH7.0および1.5M N
aClで飽和した濾紙上に２〜３分間置いて中和を行つ
た。最後に濾紙を３×SSC中に15〜20秒間浸漬し、風乾
し、真空中80℃で２時間焼いた。
（プレ）ハイブリダイゼーシヨンの前に、濾紙を、３
×SSC0.1％SDS中、数回緩衝液を交換して、65℃で61〜2
4時間、完全に洗浄した。洗浄が完了すると、コロニー
プリントは肉眼ではみえなくなつた。プレハイブリダイ
ゼーシヨンは、プレミツクスＡ〔５×SSC、５×デンハ
ルト、0.1％SDS、50mMリン酸ナトリウムpH7.5、１％グ
リシン、25μg/mlウシ胸腺DNA、75μg/mlE.coliDNA（Si
gma III型、両DNAプレパレーシヨンは剪断し、変性させ
た）、500μg/ml tRNA、50％脱イオンホルムアミド〕
中、37℃で２時間実施した。ハイブリダイゼーシヨン
は、ハイブリダイゼーシヨンミツクスＡ（５×SSC、１
×デンハルト、0.1％SDS、20mMリン酸ナトリウムpH7.
5、25μg/mlウシ胸腺DNA、75μg/mlE.coliDNA、500μg/
mltRNA、50％脱イオンホルムアミド）中、プローブMP33
について上述したとほぼ同様にγ−32P−ATPで標識した
オリゴヌクレオチドプローブMP44（第３図）とともに実
施した。ハイブリダイゼーシヨンは一夜30℃で行つた。
次に、濾紙を、６×SSCにより室温で３×15分間、２×S
SC、0.1％SDSで１×15分間、そして最後に予め加温し
た、0.1％SDS含有0.1×SSC中37℃で15分間、洗浄した。
濾紙を乾燥し、−70℃で一夜、Ｘ線フイルムに暴露し
た。両レプリカに対して陽性シグナルを与えたコロニー
をマスター濾紙から採取した。
８個の陽性コロニーから、Birnboim ＆ Doly（1979）
の報告したアルカリ分解法を用いてプラスミドDNAを精
製し、Pst I（Amersham）で消化し、１％アガロースゲ
ル上電気泳動後解析した（Maniatisほか、1982）。すべ
て８個の例で、プラスミドDNAはベクターフラグメント
（4.3kb）を含有し、その７個は、同じ1250 bp DNAフラ
グメントと大きさ300〜500bpの範囲の小フラグメントの
両を含有していた。２個の独立に単離されたクローンを
選び、pUR2302、約1750bpのクローン化挿入体を有する
プラスミド、および約1550bpの挿入体を有するpUR2314
が得られた。プラスミドpUR2302を含有するE.coli294株
をブタペスト条約によるCentraalbureau Voor Schimmel
cultures（CBS）に1986年５月30日に寄託した。予備寄
託番号（provisional beposition number）はCBS267.86
であった。
1.5.グアーα−ガラクトシダーゼcDNAクローンのヌクレ
オチド配列および誘導されたα−ガラクトシダーゼ酵素
のアミノ酸配列の決定 プラスミドpUR2302およびpUR2314をpst Iで消化する
と、ベクターフラグメントのほかに1250bp＋500bpおよ
び1250bp＋300bpのフラグメントがそれぞれ得られた。
これら４種のフラグメントを１％アガロースゲルから切
取つて別個に精製し、電気泳動後、透析バツグに電気溶
出した（Maniatisほか、1982）。精製フラグメントをベ
クターM13mp18（Bethesda Research InC.から購入、Nor
randerほか、1983の記載がある）と連結させ、pst Iで
切断し、連結したサンプルを用いE.coli株JM103（Messi
gほか、1981）を、CaCl2で形質転換し、Ｘ−galおよびI
PTGを補充したＬ−培地上平板培養した（Maniatisほ
か、1982）。
得られた無色のプラークから、一本鎖フアージDNAを
単離し、Sangerジデオキシ鎖ターミネーシヨン法のBigg
inほか（1983）の改良法により、α−35S−dATP（2,000
Ci/mmol）およびクレノウ酵素（Amersham）、ddNTP′ｓ
（pharmacia−PL Biochemicais）、およびdNTP′ａ（Bo
ehringer）を用いて、ヌクレオチド配列を確立するため
に使用した。配列決定反応生成物は、変性ポリアクリル
アミドゲル上、Bigginほか（1983）の報告した緩衝液勾
配を用いて分離した。
ヌクレオチド配列はカスケード様のアプローチを用い
て決定した（第５図参照）。サブクローン化フラグメン
トの境界におけるヌクレオチド配列は、最初ユニバーサ
ルM13配列決定プライマー（Amersham）を用いて決定し
た。配列データがまだ信頼できる最も遠位では、上述の
ようにしてとくに合成した２個の新規な、ひとつは３′
〜５′方向におけるヌクレオチド配列の連続のための、
他のひとつは相補鎖の配列決定のためのプイマーを用い
て、配列決定を継続した。このカスケード様アプローチ
により、両クローンpUR2302およびpUR2314のサブクロー
ンの全ヌクレオチド配列が確立した。内部pst I部位周
辺のヌクレオチド配列は、Chen ＆ Seeburg（1985）の
報告した超コイル配列決定操作によつて決定した。結果
は両pst I−フラグメントが直接結合していることを示
した。
グアーα−ガラクトシダーゼcDNAクローンの全ヌクレ
オチド配列は第６図に示す。プラスミドpUR2302中ヌク
レオチド263に始まりポリ−Ａ尾部までのヌクレオチド
配列（第６図参照）はプラスミドpUR2314の挿入体のヌ
クレオチド配列と同一である。
ヌクレオチド配列の解析（第６図）により、411個の
アミノ酸残基をコードする翻訳読み取り枠と、ヌクレオ
チド位置166の最初のメチオニンおよびヌクレオチド139
9〜1404の２個連続した翻訳停止コドンが明らかにされ
た。これから帰納されたアミノ酸配列を、IUPACの一文
字記号で第６図のヌクレオチド配列の上部に示す。
グアー種子から精製したα−ガラクトシダーゼ酵素の
NH2末端アミノ酸配列は、 AENGLGQTPP…… であつた（前段および第３図参照）。このアミノ酸配列
は、ヌクレオチド307〜336でコードされる（第６図）。
第一に、これらの所見から、成熟α−ガラクトシダーゼ
酵素は364個のアミノ酸残基から構成され、分子量の計
算値は39,777ダルトンと結論できる。これはSDS−ポリ
アクリルアミド電気泳動によつて評価された分子量40,5
00ダルトン（McCleary、1983）とよく一致する。
第二に、天然の酵素は47個のアミノ酸残基で延長され
た（第６図の番号−47〜−１）前駆体の型で合成される
ものと思われる。
内部ペブチドDYLKYDN（第３図参照）が、NH2末端ペプ
チドに加えて、ヌクレオチド配列中に見出された（ヌク
レオチド680〜701）ことから、クアーからのα−ガラク
トシダーゼはクローン化されたと明瞭に結論できる。
例２ 遺伝子操作Saccharomyces cerevisiaeによるグアーα−
ガラクトシダーゼの製造 微生物によるグアーα−ガラクトシダーゼの産生を例
示するため、Saccharomyces cerevisiae中でグアーα−
ガラクトシダーゼを発現させるのに適当なベクターを、
GAPDHプロモーター構造を用いて構築した。
ベクターpURY2703およびpURY2705の遺伝子操作 これらのベクターのベースとしてE.coli−S.cerevisi
aeシヤトルベクターpURY528−03を用いた（Edensほか、
1984、EPO 0 129 268号、第14図；プラスミドpURY528−
03を含有するSaccharomyces cerevisiaeAH22は、1983年
５月19日、Centraal−bureau voor Schimmel cultures,
P.O.Box273,3740A G Baarn.The NetherlandにCBS第8155
号として寄託されている）。これは、S.cerevisiae中で
の発現のために、GAPDEプロモーターの制御下にプレプ
ロタウマチン遺伝子を含有している。策略は次のとおり
である（第７図参照）。すなわち、ベクターpURY528−0
3から、完全プレプロタウマチン遺伝子およびプレプロ
タウマチンATG翻訳開始コドンの23塩基対上流を含むSac
I−Hind IIIフラグメントを欠失させた。
次に、合成フラグメントを加えた。pURY2703の場合は
（第７図参照）、それは上述の23塩基対、翻訳開始コド
ンとしてATG、付加的ala−コドンおよび、ala1に始まり
成熟蛋白質（第６図）のアミノ酸残基31の近くにあるpv
u II部位までの成熟α−ガラクトシダーゼ遺伝子のNH2
末端部分を含有する。これらのアミノ酸残基をコードす
るDNAは酵母の好むコドン（Tuiteほか、1982）で合成し
た。pURY2705の場合は（第７図参照）、それは上述の23
個の塩基対、SUC2（インベルターゼ）シグナル配列（Ta
ussing ＆ Carlson,1983によつて報告されている）、お
よびala1残基からpvu IIまで酵母の好むコドンの成熟α
−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。ヌクレオチド配
列とこれらの合成フラグメントの構築は第８図に示す。
合成オリゴヌクレオチドは上述のようにして（例１）
DNAシンセサイザー（Applied Biosystems）上で作成
し、ポリアクリルアミドゲル上電気泳動によつて精製し
た。溶出したDNAを50μｌのTE（10mM Tris−HCl pH7.
6、1mM EDAT）中に溶解し、ついで260nmにおける光学密
度を測定して濃度を決定した。遊離５′末端をもつ境界
フラグメントは例外として、各フラグメント0.5μｇを
プールし、最終容量100μｌで酵素ポリヌクレオチドキ
ナーゼによりリン酸化した。フエノール抽出後アルコー
ルで沈殿させ、ペレツトを溶解し、境界フラグメント各
0.5μｇを加え、DTTおよびATPを含まないリゲーシヨン
緩衝液中でアニーリングを行つた。アニーリングは70℃
に10分間加熱し、ついで徐々に（２時間）30℃に冷却し
て行つた。DTTおよびATP（最終濃度それぞれ10mMおよび
0.5mM）ならびにT4リガーゼ酵素を加えたのち、15℃18
時間連結を実施した。次に合成フラグメントを２％アガ
ロースゲル上で電気泳動し、所望の長さをもつバンドを
切り取り、電気溶出によつてゲルから単離した。精製し
たフラグメントを適当なベクター（pEMBL9:Denteほか、
1983）に連結し、連結混合物を用いてE.coli株JM103細
胞を形質転換した。これらの形質転換体からプラスミド
を精製し、合成フラグメントをDNA配列決定によつて解
析した。
最後に、成熟α−ガラクトシダーゼ遺伝子の残りの33
3個の残基を加えた。プラスミドpUR2302からは1.4kb pv
u II−Bgl Iフラグメントが得られた。Bgl I部位はHind
III部位に変換されていた（第７図参照）。最後の連結
混合物を用いて、E.coli294株を形質転換した。形質転
換体からプラスミドを精製し、正しい制限酵素パターン
をもつプラスミドを選択したところ、プラスミドpURY27
03（第９図）およびpURY2705（第10図）が得られた。
pURY2703およびpURY2705によるS.cerevisiaeの形質転換
および解析 S.cerevisiaeAH22株（a,leu2,his4,Hinnenほか、1978
参照）の酵母細胞を、Beggs（1978）の報告した操作に
従い、スフエロプラスト法によつて、プラスミドpURY27
03 およびpURY2705で形質転換した。得られたleu+形質
転換酵母コロニーをアガル板上で直接、Buckholz ＆ Ad
ams（1981年）が報告しているように、基質ｐ−ニトロ
フエニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（pNPG、Sigm
a）を加えた溶融寒天で上張りして、α−ガラクトシダ
ーゼ酵素の存在をスクリーニングした。
これは、プラスミドpURY2703をもつ酵母細胞の周囲に
は検知できるレベルのα−ガラクトシダーゼ酵素は存在
しないことを示した。しかしながら、プラスミドpURY27
05をもつ細胞の周囲の黄色の着色は、このプラスミドの
場合、細胞の外部に生物学的に活性な酵素が存在するこ
とを示した。
無傷細胞の解決に続いて、粗細胞抽出液についても解
析した。プラスミドpUR2703およびpUR2705をもつ酵母細
胞を、ヒスチジン（20μg/ml）を補充した酵母最小培地
（アミノ酸を含まない0.67％酵母窒素ベース、Difco;2
％グルコース）上で600nmにおける光学密度が1.0になる
まで生育させた。酵母細胞を収穫し、抽出緩衝液（10mM
Tris−HCl pH8.0、0.1mM EDTA、1mM DTT）中に1mlあた
り細胞1010個の濃度に再懸濁し、凍結−解凍を３回反復
するが、またはフレンチプレツシヤーセルを通して破壊
した。
粗細胞抽出液を抽出緩衝液で適当に希釈し、0.1M酢酸
ナトリウムpH4.5中10mM pURGと、37℃で５分間インキユ
ベーシヨンした。２％炭酸ナトリウム1mlを加えて反応
を停止させた。得られた混合物をEppendorf遠心分離機
で５分間遠心分離して細胞および細胞屑を除いたのち41
0nmでの吸光度を測定した。ｐ−ニトロフエノールの410
nmにおける吸光係数は18.4cm2／μmoleである。α−ガ
ラクトシダーゼ１単位は、37℃、pH4.5において１分間
に基質１μmoleを加水分解する酵素の量と定義される。
結果は、プラスミドpURY2703をもつ酵母細胞108個中
には約（１〜2.5）×10-3単位が存在し、プラスミドpUR
Y2705をもつ酵母細胞108個中には約（３〜５）×10-3単
位が存在することを示した。
免疫学的定量には、いわゆるウエスターン法解析を用
いた。サンプル緩衝液（Edensほか、1982）を粗細胞抽
出液に添加後、５分間煮沸した。
精製蛋白質は２分間のみ加熱したのち、ゲルサンプル
緩衝液に適用した。蛋白質は10％ポリアクリルアミドゲ
ル上、Wyckoffほか（1977）に従い、電気泳動によつて
分離した。
次に蛋白質をゲルからニトロセルロース上に、電気泳
動移動により移した（Burnette、1979参照）。ニトロセ
ルロースをインキユベーシヨン（Ｉ）緩衝液（150mM Na
Cl、5mM EDTA、50mM Tris−HCl pH7.0、0.05％トリトン
Ｘ−100、0.25％ゼラチン）で洗浄し、Ｉ−緩衝液中、
0.1％ BSAおよびグアーから精製したα−ガラクトシダ
ーゼでウサギを免疫処置して産生させた抗血清とインキ
ユベーシヨンした。
インキユベーシヨンは室温で４時間、攪拌下に行つ
た。Ｉ緩衝液で２回、リン酸緩衝食塩溶液pH7.0（PBS）
で洗浄して、吸着されなかった抗体を除去した。抗原に
結合した抗体は125IプロテインＡ（Amersham）と１時間
反応させて検出した。Ｉ−緩衝液で２回、PBSで３回洗
浄したのち、ニトロセルロースを乾燥し、−70℃でＸ線
フイルムに暴露した。
結果は、プラスミドpURY2705をもつ細胞（レーン３）
が、グアーα−ガラクトシダーゼ特異的抗体と陽性反応
を示し、植物酵素（レーン１および２）と同じ分子量を
もつα−ガラクトシダーゼ酵素を産生することを示し
た。プラスミドpURY2703をもつ酵母細胞（レーン４）は
陽性免疫反応を示すα−ガラクトシダーゼ酵素を産出す
るが、分子量はわずかながら低い。プラスミドをもたな
い酵母細胞（レーン５）はグアーα−ガラクトシダーゼ
と免疫学的に関連ある酵素を産生しない。
プラスミドpURY2703およびpURY2705はいずれも、グア
ーから精製したα−ガラクトシダーゼに対して産出され
た抗体と陽性反応を示す酵素的に活性な生成物を産生す
ると結論できる。第一の場合、酵素は、植物酵素よりも
分子量がわずかに低く、細胞の細胞質中に存在する。第
二の場合は、酵素は植物酵素と同じ分子量を有し、酵素
は細胞の外側に存在する（後者の場合は、グリコシル化
と分泌を行うことができる小胞体に蛋白質が標的をもつ
結果と考えられる）。
例３ 遺伝子操作S.cerevisiaeにより製造されたα−ガラクト
シダーゼ酵素によるガラクトマンナンのガラクトース含
量低下 プラスミドpURY2705を係留するS.cerevisiaeAH22株
は、酵母最小培地（YMM、例２参照）上で生育させると
細胞108個あたり（３〜５）×10-3単位のα−ガラクト
シダーゼ酵素を産生する。この産生レベルは、後対数期
までYMM上で生育させた酵母細胞を豊かなYPD培地（２％
グルコース;2％バクトペプトン、Difco;1％酵母エキ
ス、Difco）に移し、約４時間生育させると0.1単位／10
8個細胞まで上昇させることができた。
他の実験では、酵母細胞を200mlYMM中、600nmの光学
密度が1.5になるまで生育させ、１のYPD培地に移し、
さらに30℃で４時間生育させた。細胞を収穫し、抽出緩
衝液4mlに再懸濁し、フレンチプレツシヤーセル（５
回）を通過させた。得られた懸濁液を超遠心（Sorvall
SW60、30,000rpm、１時間、４℃）によつて澄明化し
た。90％より多い酵素活性が澄明な上清に存在した。最
後に澄明な上清を40μｌのRNase（10mg/ml、Boehringe
r）および100μｌのDNase（２単位／μｌ、Amersham）
と37℃で15分間インキユベーシヨンし、粗酵母細胞抽出
液を得た。これは約10単位/mlのα−ガラクトシダーゼ
を含有した。この抽出液をグアーガムのガラクトース含
量を低下させる実験に用いた。McClearyほか、1984;EP
−Ａ−0 121 960号の記載とほぼ同様に操作した。
使用した酵素は： −粗酵母抽出液（例として上述） −Saccharomyces carlsbergensisα−ガラクトシダー
ゼ（比較用） である。後者は次のようにして精製した。
S.carlsbergensis（ATCC9080）を、グルコースをガラ
クトース（20g/l）で置換した改良YMM中、26℃で培養し
た。静止期に細胞を遠心分離で収穫し、上清を濃縮し、
酢酸塩緩衝液（0.1M、pH4.5）に対して透析した。最初
はAmicon DC−２濃縮器で、次はPEG（Sigma製）に対し
て行つた。このプレパレーシヨンをさらに精製すること
なくそのまま使用した。
グアー粉（HerculesからのグアーガムTHI;1g）および
酵素（0.1M酢酸ナトリウムpH4.5、1.5ml中10単位）を、
混合物を微細なパン屑に似た混合物が得られるまで混合
した。これを密閉容器にとり、55℃でインキユベーシヨ
ンした。サンプル（100mg）を指定時間に採取し、反応
は100℃に加熱して停止し、ポリサツカライドのガラク
トース含量を測定した。
これらの結果は、Saccharomyces cerevisiaeによつて
産生された異種グアーα−ガラクトシダーゼがガラクト
マンナンのガラクトース含量を低下させることが可能で
あり、一方、Saccharomyces carlsbergensisによつて産
生された同種酵母α−ガラクトシダーゼが好条件下でも
ガラクトース含量を低下し得ないことを明瞭に示してい
る。
上述の実験（例２および３）は、β−マンナナーゼを
含まず、ガラクトマンナンのガラクトース含量を低下さ
せることができるα−ガラクトシダーゼ酵素が、たとえ
ば例３に使用した酵母Saccharomyces cerevisiaeのよう
な形質転換微生物によつて製造可能なことを示してい
る。
例４ 各種α−ガラクトシダーゼ酵素の免疫学的関係とガム修
飾能 4.1.α−ガラクトシダーゼ酵素源 酵素活性は、至適温度およびpHにおいて、45μｌの反
応容量で、10mMのｐ−ニトロフエニル−α−Ｄ−ガラク
トピラノシド（pNPG）を作用させ、pNPGの加水分解によ
つて定量した。反応は２％炭酸ナトリウム1mlを加えて
停止させた。得られた混合物の吸光度を、必要に応じて
Eppendorf遠心分離機で５分間遠心分離して細胞および
細胞屑を除去したのち、410nmで測定した。ｐ−ニトロ
フエノールの410nmにおける吸光係数は18.4cm2／μmole
である。α−ガラクトシダーゼ１単位は、37℃、pH4.5
において１分間に基質１μmoleを加水分解する酵素の量
と定義される。
E.coli α−ガラクトシダーゼはBoehringerから（cat
N°662038、lot N°1503401）凍結乾燥粉末として（18
mg中50U）得られた。A.niger α−ガラクトシダーゼはS
igmaから（cat N°G9007、lot N°105C/8640）3.5M硫酸
アンモニウム、50mM酢酸ナトリウムpH5.5中懸濁液（2.7
ml中48U）として得られた。緑コーヒー豆α−ガラクト
シダーゼはBoehringerから（cat N°105 023、lot N°1
0118722−20）、3.2M硫酸アンモニウムpH約６中懸濁液
（1.0ml中83U）として得られた。Saccharomyces carls
bergensis（ATCC9080）は、最小培地：アミノ酸を含ま
ない酵母窒素ベース、Difco（6.7g/l）およびガラクト
ース（20g/l）中26℃で培養した。静止期に細胞を遠心
分離で収穫した。上清を濃縮し、酢酸緩衝液（0.1M、pH
4.5）に透析した。最初はAmicon DC−２濃縮器を用い、
ついでポリエチレングリコール（Sigma製）に対して行
つた。このブレパレーシヨンは培養上清１あたり約20
Uを含有していた。
グアーα−ガラクトシダーゼはMaCleary（1983）によ
つて記載されたようにして調製した。ルツエルンおよび
コロハ酵素は、2.5日間（コロハの種子は約100％が、ル
ツエルンの種子は約50％が発芽した）の発芽に関係して
ほぼ同じ経路で製造された。すなわち、酢酸緩衝液中で
ホモゲナイズし、遠心分離し、ナイロンメツシユを通し
て濾過し、50％wv硫酸アンモニウムで沈殿させた。沈殿
を約20mlの0.1M酢酸塩緩衝液（pH4.5）に溶解し、さら
に精製することなくそのまま使用した。この実験計画に
よれば種子200gからコロハ酵素は1050U、ルツエルン酵
素は65U生成した。
イナゴマメの種子はSeiler（1977）の方法を用いて発
芽させた。種子に粗いサンドペーパーで傷をつけて堅い
種皮の一部を除去し、70％エタノール／水中で５分間殺
菌し、脱イオン水に48時間浸漬し、湿つたクロマトグラ
フイー紙上、26℃に９日間置いて発芽させた。発芽した
種子を上述のようにして抽出すると、９個のイナゴマメ
の種子から7Uのα−ガラクトシダーゼが生成した。
4.2.遺伝子操作微生物:Saccharomyces cerevisiae、klu
yveromyces marxianus var. lactis、Hansenula polymo
rphaおよびBacillus subtilisから製造された酵素 グアーα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子情報
を各種ベクター（例２、５、６、８および９参照）に挿
入し、各種微生物の細胞外または細胞内に発現させた。
S.cerevisiaeおよびB.subtilisについては精製酵素プ
レパレーシヨンを使用した。ベクターをもつ細胞は、生
育メジウム中に酵素の分泌を生じるものを用いた。
発酵培地からマイクロ濾過（0.22μｍ）で細胞を除去
したのち、低分子量物質を0.03M Tris−HCl pH8.0で平
衝化したPD−10カラム（Pharmacia）を用い脱塩により
除去した。α−ガラクトシダーゼは、このフラクシヨン
から、MONO−Ｑカラム（HR5/5、Pharmacia）を用いた陰
イオン交換クロマトグラフイーによつて単離した。溶出
は0.03M Tris−HCl pH8.0中NaCl勾配（０〜1M）によつ
て行つた。検出はPharmacia FPLCシステムを用い214/28
0nmで実施した。
α−ガラクトシダーゼ活性を含むフランクシヨン（約
0.3M NaClで溶出）をプールし、脱塩した（PD−10カラ
ム、0.01M酢酸ナトリウムpH4.5で溶出）。
この酵素プレパレーシヨンを真空乾燥によりさらに約
10倍に濃縮した。
K.marxianusvar.lactisおよびH.polymorphaについて
は、粗細胞抽出液を用いた。細胞を適当な条件下にアガ
ール板上で生育させ、収穫し、抽出緩衝液（10mM Tris
pH8.0、0.1mM EDTA、1mM DTT）に懸濁し、凍結−解凍を
３回反復して破壊した。
4.3.アウチテロニー二重拡散によつて解析した免疫学的
関係 酢酸バルビタール緩衝液（Na−バルビタール8.93g、
酢酸ナトリウム・３H2O5.87g;HGlでpH8.2）中１％アガ
ロースＡ（pharmacia）および３％ポリエチレングリコ
ール6000の溶液をマイクロウエーブオーブン中で加熱し
て調製した。この溶液を60℃に冷却し、14mlをガラスス
ライド（8.3×9.4cm）上に注いだ。型（LKB）を用い、
ゲルに径4mmの孔をあけた。抗血清10μｌおよび精製酵
素溶液（リン酸緩衝食塩溶液pH7.0中約10U/mlの濃度）
を適用したのち、湿つたテイシユペーパーを入れた密閉
した箱中、室温で一夜拡散させた。免疫沈殿体を直接測
定するか、またはゲルを数回0.9％NaClで洗浄したのち
水−酢酸−エタノール（4.5:1:4.5）中0.5％クーマツシ
ーブリリアントブルーＲ−250（Biorad）の溶液で染色
した。ゲルは水−酢酸−エタノール（9:2:5）で脱色し
た。
結果（第１表）は、同種グアー酵素とまたコロハおよ
びルツエルンからの酵素と陽性反応を示した。遺伝子操
作S.cerevisiaeによつて製造したグアー酵素も陽性反応
を示した。コーヒー豆から、またA.niger、S.carlsberg
ensisおよびE.coliからの酵素では反応は認められなか
つた。
4.4.ウエスターン法によつて解析した免疫学的関係 この方法の利点は、感受性（0.01U/mlの酵素溶液で分
析できる）および粗プレパレーシヨンに使用できる可能
性である。
粗抽出液にサンプル緩衝液（Edensほか、1982）を添
加後、５分間煮沸した。わずか２分間加熱したのち、ゲ
ルサンプル緩衝液中に精製蛋白質を添加した。蛋白質を
wyckoffほか（1977）に従つて10％ポリアクリルアミド
ゲル上電気泳動によつて分離した。
蛋白質を次にゲルからニトロセルロース上に電気泳動
移動により移した（Burnette、1979参照）。ニトロセル
ロースをインキユベーシヨン（Ｉ）緩衝液（150mM NaC
l、5mM EDTA、50mM Tris−HCl pH7.0、0.05％トリトン
Ｘ−100、0.25％ゼラチン）で洗浄し、Ｉ−緩衝液中、
0.1％BSAおよびグアーから精製したα−ガラクトシダー
ゼでウサギを免疫処置して産生させた抗血清とインキユ
ベーシヨンした。インキユベーシヨンは室温で４時間、
攪拌下に行つた。
Ｉ−緩衝液で２回、リン酸緩衝食塩溶液pH7.0（BPS）
で洗浄して、吸着されなかつた抗体を除去した。抗原に
結合した抗体は125I−プロテインＡ（Amersham）と１時
間反応させて検出した。Ｉ−緩衝液で２回、PBSで３回
洗浄したのち、ニトロセルロースを乾燥し、−70℃でＸ
線フイルムに暴露した。
この方法は12種の異なる原料のα−ガラクトシダーゼ
プレパーシヨンに適用した（第１表参照）。結果は、植
物種からのすべてのα−ガラクトシダーゼ酵素で陽性反
応を示した。
また、グアーα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝
情報で遺伝子操作した微生物からのすべての酵素も陽性
反応を与えた。一方、A.niger、S.carlsbrgergensisお
よびE.coliからの微生物酵素は、グアーα−ガラクトシ
ダーゼに対して産生した抗血清と反応しなかつた。
これらの結果は、コーヒー豆からの酵素の例外を除き
オクテルロニー法の結果を確認するものてあつた。密接
な関連がある植物種からの酵素であるグアーα−ガラク
トシダーゼと何らかの関係があるものと結論できる。
4.5.α−ガラクトシダーゼ酵素の、ガラクトマンナン中
ガラクトース含量低下能 酵素プレパレーシヨン（15〜30U）を100mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液pH4.5（1.5ml）中に溶解した。これをグアー
ガム1gに加えた。混合物が微細なパン屑の感触になるま
で少なくとも１分間激しく混合し、55℃でインキユベー
トした。
この酵素のガラクトマンナンに対する活性を解析する
ため、サンプルを採取し、以下のようにして解析した。
約150mgのパン屑様混合物のサンプルを採取し、秤量
した。酵素を10分間沸騰水浴上に置いて不活性化した。
次に10％水酸化ナトリウム5mlを加え、小さなホモゲナ
イザーを用いてサンプルを分散させた。溶液を25mlと
し、30分間振盪し、再びホモゲナイズし、15分間放置し
た。この処置後、ポリサツカライドを完全に溶解させ、
遊離ガクトース（Boehringerの酵素試験キツトを使用）
および総炭水化物を定量した。総炭水化物の定量にはア
ンスロン法（Morris、1948）を用いた。その改良法（Lo
ewus、1952）は次のとおりである。
アンスロンの酢酸エチル飽和溶液を調製し、少なくと
も１時間静置した。試験溶液25μｌをピペツトで試験管
に取り、蒸留脱イオン水で1mlとした（水はブランク
に、80μｇのガラクトースを標準に使用した）。アンス
ロン飽和酢酸エチル0.2mlを加え、ついで濃硫酸2.5mlを
加えた。激しく混合し、放冷した。吸光度は約30分後に
610nmで読んだ。
結果は本明細書末尾の第１表にまとめる。表から明ら
かなように、植物酵素はすべて、ガラクトマンナン中の
ガラクトース含量を有意に（存在するガクトースの25％
より多くが18時間後に放出された）低下させることがで
きた。グアーα−ガラクトシダーゼ遺伝情報で遺伝子操
作された微生物が産生した酵素も同じ能力を示した。
これらの結果は、グアーからのα−ガラクトシダーゼ
酵素についで、他のα−ガラクトシダーゼ酵素もガラク
トマンナンの修飾に適していることを示している。免疫
学的関係はある示唆を与えるが、グアー酵素と無関係な
酵素がガラクトマンナンを修飾できる可能性は、なお排
除できない。
例５ 遺伝子操作Kluyveromyces maexianus var.lactisによる
α−ガラクトシダーゼの製造 ベクターpUR2405の遺伝子操作 構築計画は第12図に概略を示した。
このベクターのベースはkluyveromyces複製オリジンK
ARS2とその選択マーカーtrp1である。プラスミドpURK52
8−03（Edensほか、1,983）をBgl II（Amersham）で消
化し、こりらの両要素を係留する3.1kb Bgl IIフラグメ
ントを、１％アガロースゲル上電気泳動、ついで透析バ
ツグへの電気溶出により（Maniatisほか、1982）単離し
た。
この精製フラグメントを、Bgl IIで線状にしたプラス
ミドpURY2705（第10図）と連結した。連結したサンプル
を用いて、E.coli株JM103（Messingほか、1981）をCaCl
2法で形質転換し、アンピシリン100μg/mlを補給したＬ
−ブイヨン上で平板培養した（Maniatisほか、1982）。
得られたコロニーから、Birnboim ＆ Doly（1979）の報
告したアルカリ分解法を用いて、プラスミドDNAを精製
した。Bgl IIで消化後、pURY2705のBgl II部位に3.1kb
Bgl IIフラグメントが挿入されたプラスミドを選択し、
プラスミドpUR2405が得られた（第12図）。
K.marxianus var.lactis細胞のpUR2405による形質転換 K.marxianus var.lactisSD11,lac−4,trp−１株（Ede
nsほか,1983）の酵母細胞を、Itoほか（1983）の記載に
従いLiCl法を用いて、プラスミドpUR2405で形質転換し
た。得られたtrp+形質転換体について、グアーα−ガラ
クトシダーゼ酵素の存在を解析した。
YMM上で生育させたのち、細胞を収穫し、抽出緩衝液
（10mM Tris−HCl pH8.0,0.1mM EDTA,1mM DTT）に再懸
濁し、凍結−解凍を３回反復して破壊した。これらの粗
細胞抽出液中の活性α−ガラクトシダーゼ酵素は人工基
質pNPGで、または免疫学的検定法（ウエスターン法）で
検定した。
粗細胞抽出液を抽出緩衝液で適当に希釈し、0.1M酢酸
ナトリウムpH4.5中10mM pNPGと、37℃で５分間インキユ
ベーシヨンした。２％炭酸ナトリウム1mlを加えて反応
を停止させた。得られた混合物をEppendorf遠心分離器
により５分間遠心分離して、細胞および細胞屑を除去し
たのち、410nmで吸光度を測定した。ｐ−ニトロフエノ
ールの410nmにおける吸光係数は18.4cm2／μmoleであ
る。α−ガラクトシダーゼ１単位は、37℃、pH4.5にお
いて１分間に基質１μmoleを加水分解する酵素の量と定
義される。
プラスミドpUR2405をもつ細胞の細胞抽出液は、この
検定で、このプラスミドをもたない酵母細胞の対照プレ
パレーシヨンとは異なり、陽性シグナルを与えた。
免疫学的検定には、いわゆるウエスターン解析法を用
いた。サンプル緩衝液（Edensほか,1982）を粗細胞抽出
液に添加後、５分間煮沸した。
精製蛋白質をわずか２分間加熱したのちゲルサンプル
緩衝液に適用した。蛋白質を、wyckoffほか（1977）の
方法によつて10％ポリアクリルアミドゲル上電気泳動に
よつて分離した。
ついで蛋白質をゲルからニトロセルロース上に、電気
泳動移動により移した（Burnette,1979参照）。ニトロ
セルロースをインキユベーシヨン（Ｉ）緩衝液（150mM
NaCl,5mM EDTA,50mM Tris−HCl pH7.0,0.05％トリトン
ｘ−100,0.25％ゼラチン）で洗浄し、Ｉ−緩衝液中、0.
1％BSAおよびグアーから精製したα−ガラクトシダーゼ
でウサギを免疫処置して産生させた抗血清とインキユベ
ーシヨンした。
インキユベーシヨンは室温で４時間、攪拌下に行つ
た。Ｉ−緩衝液で２回、リン酸緩衝食塩溶液pH7.0（BP
S）で洗浄して、吸着されなかつた抗体を除去した。抗
原に結合した抗体は、125IプロテインＡ（Amersham）と
１時間反応させて検出した。Ｉ−緩衝液で２回,PBSで３
回洗浄したのち、ニトロセルロースを乾燥し、−70℃で
Ｘ線フイルムに暴露した。
結果は、kluyveromyces細胞抽出液中に、植物酵素の
蛋白質と類似の分子量をもつ蛋白質が存在し、またそれ
はS.cerevisiae中プラスミドpURY2705によつて産生され
た蛋白質とも類似することを示した。
例６ 遺伝子操作Bacillus subtilisによるグアーα−ガラク
トシダーゼの製造 α−ガラクトシダーゼ遺伝子が真核細胞中のみでなく
原核微生物中でも発現できることを例示するため、Baci
llus subtilis中で酵素を産生できるプラスミドを構築
した。
ベクターpUR2601の遺伝子操作 構築のベースとしてプラスミドpMS48（Kok,J.ほか,19
85;EP−Ａ−O157 441号51〜57頁）を用いた。プラスミ
ドpURY2703中に存在するグアー成熟α−ガラクトシダー
ゼ遺伝子をα−アミラーゼシグナル配列に融合した。こ
の融合蛋白質をコードする遺伝子は、SPO2プロモーター
の支配下にあつた（第13図参照）。プラスミドpMS48をS
ac IIおよびHind IIIで消化し、SPO2プロモーターとα
−アミラーゼシグナル配列を含有する大ベクターフラグ
メントを精製した。α−ガラクトシダーゼ遺伝子（第９
図参照）を含有するpURY2703の1.5kbSac II−Hind III
フラグメントを精製し、pMS48の大ベクターフラグメン
トと連結させた。この際、α−アミラーゼシグナル配列
は成熟α−ガラクトシダーゼ遺伝子と正確に融合して、
pUR2601と呼ばれるプラスミドを生成した。連結サンプ
ルを用いてB.subtilis株DB104（Kawamura ＆ Doi,198
4）を、プロトプラスト法（Kok,J.ほか,1985,52頁）を
用い、選択にはネオマイシンを利用して形質転換した。
ネオマイシン抵抗性コロニーを採取し、分解工程は４
℃の代わりに37℃で30分間行うほかはBirnboim ＆ Doly
（1979）の方法に従つてDNAを精製し、適当な制限酵素
を用いて消化した。正しくプラスミドpUR2601を係留す
る形質転換体を、pNPG分析およびウエスターン法の両者
で、さらにα−ガラクトシダーゼの産生について解析し
た。
B.subtilisによるグアーα−ガラクトシダーゼ産生の解
析 Bacillusについては、細胞の特定の生育期にのみ異種
蛋白を検知できると報告されている（Grandi,G.ほか,19
86）。したがつて、一夜培養物を1:50に希釈したネオマ
イシン（20μg/ml）を含むＬ−ブイヨン上で生育させ、
数回、生育培地中のα−ガラクトシダーゼの存在をpNPG
で定量した。結果（第14図）は、生育７時間後の生育培
地中、細胞の外側に最大約0.1U/mlのα−ガラクトシダ
ーゼ酵素の存在が認められた。長期培養では酵素濃度は
最小30倍まで低下し、これはプロテアーゼ活性によるも
のと思われた。
プラスミドpUR2601をもつB.subtilis株DB104によるグ
アーα−ガラクトシダーゼの産生を、適当な生育培地お
よび制御メジウム両者を用いてプロテアーゼの産生を抑
制しながら10lのフアーメンター中でさらに研究した。
pUR2601をもつ株DB104の前培養体を振盪フラスコ中、
ネオマイシン（20μg/ml）を補充した培地500ml中で16
時間生育させた。培地の組成は次のとおりとした（g/
l）。
NH4Cl,8;KH2SO4,4;シユクロース,40;NaCl,2;酵母エキ
ス（Difco）（別個に滅菌）,10;MgSO4,7H2O,1;ビタミン
溶液,1;微量金属溶液,1 微量金属溶液の組成（g/l）： CaCl2・２H2O 5.5 FeSO4・７H2O 3.75 MnSO4・H2O 1.4 ZnSO4・７H2O 2.2 CuSO4・５H2O 0.4 CoCl2・６H2O 0.45 Na2MoO4・２H2O 0.26 H3BO3 0.4 KI 0.26 EDTA 45 塩は溶解し、pHは4.0に保持した。
ビタミン溶液の組成（g/l）： ビオチン 0.05 チアミン 5.0 メソイノシツト 4.7 ピリドキシン 1.2 Ｄ−パントテン酸 23.0 メジウム8l（抗生物質は含まない）を10lの発酵槽中,
120℃で20分間滅菌した。
500mlの前培養体を接種して発酵を開始した。温度は3
0±0.1℃に保持した。pHは12.5％NH4OHを添加して6.5に
調整した。溶解酸素張力は気流を1.5〜3.5l/分に制御し
て25％空気飽和以上に保持した。８枚プロペラの回転速
度は500回／分に保つた。
発酵はオンラインの呼吸商測定（酸素の消費と二酸化
炭素の発生）、610nmの光学密度の測定によつて追跡し
た。α−ガラクトシダーゼ活性は30分ごとに測定した。
α−ガラクトシダーゼ活性はバイオマスの生成と密接
に相関した。12時間後に最大α−ガラクトシダーゼ活性
1760U/lが得られた、これは対数増殖期の末期に相当し
た。バイオマス濃度は10.2gであつた。この最大活性に
到達したのち、培養液を＋８℃に冷却して細胞を遠心分
離した。
このように、特定の生育条件を適用することにより、
Bacillusは大量のグアーα−ガラクトシダーゼ酵素を産
生し、分泌する。
免疫学的検定にはいわゆるウエスターン法解析を用い
た。培地にサンプル緩衝液（Edensほか、1982年）を加
えたのち、サンプルを５分間煮沸した。
精製蛋白質は、２分間のみ加熱したのち、ゲルサンプ
ル緩衝液中に適用した。蛋白質はwyckoffほか（1977）
に従い、10％ポリアクリルアミドゲル上電気泳動によつ
て分離した。
次に蛋白質をゲルからニトロセルロース上に電気泳動
移動により移した（Burnette,1979参照）。ニトロセル
ロースをインキユベーシヨン（Ｉ）緩衝液（150mM NaC
l,5mM EDTA,50mM Tris−HCl pH7.0,0.05％トリトンｘ−
100,0.25％ゼラチン）で洗浄し、Ｉ−緩衝液中、0.1％B
SAおよびグアーから精製したα−ガラクトシダーゼでウ
サギを免疫処置して産生させた抗血清とインキユベーシ
ヨンした。
インキユベーシヨンは室温で４時間、攪拌下に行つ
た。Ｉ緩衝液で２回，リン酸緩衝食塩溶液pH7.0（PBS）
で洗浄して、吸着されなかつた抗体を除去した。抗原に
結合した抗体は125IプロテインＡ（Amersham）と１時間
反応させて検出した。Ｉ−緩衝液で２回,PBSで３回洗浄
したのち、ニトロセルロースを乾燥し、−70℃でＸ線フ
イルムに暴露した。
ウエスターン法解析（第15図）では、グアーα−ガラ
クトシダーゼ抗血清の特異的反応を示し、グアーα−ガ
ラクトシダーゼ酵素の存在が証明された。しかしなが
ら、培地中に存在する酵素（レーン５）の分子量は、植
物起源の酵素（レーン１）の分量よりもかずかに低かつ
た。しかし、プラスミドpURY2703をもつ酵母細胞が産生
した酵素（例2,第11図参照）と同一であつた。細胞抽出
液（レーン３）は、メジウム中の酵素と同じ分子量をも
つ主バンドを示した。さらに、低分量のバンドもみら
れ、これは蛋白分解によるものと考えられる。また、わ
ずかに分子量の高いバンドも認められた。これはシグナ
ル配列が処理されなかつた形が最も考えられる。
Ｎ末端配列解析のためのα−ガラクトシダーゼの単離お
よび精製 発酵ブイヨンからマイクロ濾過（0.22μｍ）で細胞を
除去したのち、低分子量物質を、0.03M Tris−HCl pH8.
0で平衝化したPD−10カラム（Pharmacia）を用いて脱塩
により除去した。α−ガラクトシダーゼは、MONO−Ｑカ
ラム（HR5/5,Pharmacia）を用い、陰イオン交換クロマ
トグラフイーによつてさらに単離した。溶出は0.03M Tr
is−HCl pH8.0中NaCl勾配（０〜1M）で行われた。検出
は、Pharmacia FPLCシステムを用い214/280で行つた。
α−ガラクトシダーゼの活性（約0.3M NaClで溶出）を
含むフラクシヨンをプールし、脱塩した（PD−10カラ
ム,0.01M酢酸ナトリウムpH4.5で溶出）。最後の精製
は、広孔Ｃ−４カラム（Bakerbond,4.6*250mm）を用
い、勾配溶液：緩衝液A0.1％TFA（v/v），緩衝液B0.1％
TFA＋60％CH3CN（v/v）,25分で、逆相クロマトグラフイ
ーを行つた。検出はWater HPLCシステムを用い214/254
で行つた。α−ガラクトシダーゼのピーク（55％CH3CN
で溶出）をSpeed Vac Concentrator（SAVANT）で濃縮
し、Ｎ末端配列の解析に使用した。これは、オンライン
PTH−アナライザー（120A）を用いApplied Biosystems
気相シクエンサー（470A型）で実施した。
結果は、B.subtilis産生酵素の最初の７個のNH2末端
残基は、グアー種子から精製した酵素の配列（例１、
２、4,第3B図参照）と同一であつた。
したがつて、本発明者らは、グアーα−ガラクトシダ
ーゼ酵素は分泌され、正しく処理されていると結論し
た。この酵素は、原核生物にその能力がないため、グリ
コシル化されない。
例７ 遺伝子操作B.subtilisによつて製造されたα−ガラクト
シダーゼ酵素によるガラクトマンナンのガラクトース含
量の低下 プラスミドpUR2601を係留する株DB104の細胞で産生さ
れたグアーα−ガラクトシダーゼ（例６参照）につい
て、ガラクトマンナン中ガラクトース含量の低下活性を
試験した。
プレパレーシヨンは、発酵ブイヨンからMONO−Ｑカラ
ムを用いて精製した（例６参照）。
α−ガラクトシダーゼ活性を含むフラクシヨン（約0.
3M NaClで溶出）をプールし、脱塩した（PD−10カラム,
0.01M酢酸ナトリウムpH4.5で溶出）。
酵素プレパレーシヨンを真空乾燥により、さらに約10
倍濃縮した。
McCleary（1983）の記載に従い、グアー種子から精製
したα−ガラクトシダーゼ酵素を対照として使用した。
これらのα−ガラクトシダーゼ酵素がグアーガムのガ
ラクトース含量を低下させる能力を以下のようにして解
析した。
酵素プレパレーシヨン（グアー酵素については25U,B.
subtilis産生酵素については15U）を100mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液pH4.5（1.5ml）に溶解した。これをグアーガム
1gに添加し、混合物が微細なパン屑の感触になるまで少
なくとも１分間激しく攪拌し、55℃でインキユベーシヨ
ンした。
酵素のガラクトマンナンに対する活性を解析するた
め、次のようにサンプルを採取し分析した。約150mgの
『パン屑』混合物を採取して秤量した。沸騰水浴中に10
分間置くことによりその酵素を不活性化した。
ついで、10％水酸化ナトリウム5mlを加え、小型ホモ
ジナイザーを用いてサンプルを分散させた。溶液を水で
25mlとし、30分間振盪し、再びホモゲナイズし、15分間
放置した。この処置後、ポリサツカライドを完全に溶解
し、遊離ガラクトースと総炭水化物の定量の準備をし
た。遊離ガラクトースは定量溶液（0.1ml＋0.1ml水）を
0.2M Tris−HCl pH8.6（2.7ml）に加え、ついで１％w/v
NAD溶液（0.1ml）及び0.2M Tris−HCl pH8.6（0.05ml）
中0.25Uβ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（Sigma）を
加えて定量した。上述の溶液からβ−ガラクトースデヒ
ドロゲナーゼを除いた液をブランクとして、80μｇガラ
クトースを標準として用いた。溶液を37℃で１時間イン
キユベーシヨンし、インキユベーシヨン直後に340nmの
吸光度を測定した。総炭水化物の定量にはアンスロン法
（Morris,1948）を用いた。改良操作（Loewus,1952）は
次のとおりである。
アンスロンの酢酸エチル中飽和溶液を調製し、少くと
も１時間静置した。試験溶液25μｌをピペツトで試験管
に取り、蒸留脱イオン水で1mlとした（水をブランク
に、80μｇのガラクトースを標準に使用した）。アンス
ロン飽和酢酸エチル0.2mlを加え、ついで濃硫酸2.5mlを
加えた。激しく混合し、放冷した。吸光度は約30分後に
610nmで読んだ。
これらの結果から、ポリサツカライドに対する存在ガ
ラクトース％を計算した。
これらの結果は、グアーからの酵素と遺伝子操作B.su
btilis細胞によつて産生された酵素はいずれもグアーガ
ム中ガラクトース含量を低下させることを示している。
さらに驚くべきことに、グリコシル化の欠如はガラク
トマンナンに対する酵素の挙動に悪影響を与えないこと
が明らかにされた。
例８ 遺伝子操作Hansenula polymorphaによるグアーα−ガラ
クトシダーゼの製造 ベクターpUR3510の遺伝子操作 この構築の詳細な計画は第16図に概略を示す。
このベクターのベースは酵母YEp13ベクター（Broach
ほか,1979）であり、選択マーカーはleu2である。この
ベクター中に、上述のMOXプロモーター（Ledeboerほか,
1984），S.cerevisiaeからのインベルターゼシグナル配
列（Taussig ＆ Carlson,1983），成熟α−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（第６図）およびMOXターミネーター（Led
eboerほか,1984）の間の融合を行わせた。
このプラスミドpUR3510を作成する各工程は、以下に
詳述するが、次のとおりである。
ａ）翻訳停止後の非翻訳配列の除去（pUR2303を生成，
第16−１図） ｂ）MOXプロモーターのインベルターゼシグナル配列お
よび成熟α−ガラクトシダーゼとの融合（pUR3501の生
成，第16−２図） ｃ）MOXターミネーターの付加（pUR3505の生成，第16−
３図） ｄ）YEp13ベクター中への導入（pUR3510の生成，第16−
４図） pUR2303の構築（第16−１図） ヌクレオチド1400の翻訳停止後のmRNAの非翻訳部分
（第６図）、ならびにポリA/TおよびG/C尾部を除去する
ために、ヌクレオチド1223〜1233のXmn I部位から（第
６図）翻訳停止までの遺伝子部分をin vitro合成フラグ
メントで置換した。このフラグメントは、二重翻訳停止
を含むα−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列を正確にコー
ドする13のオリゴヌクレオチドから構成された。クロー
ニングの便宜上、さらにSac IおよびHind III部位を翻
訳停止の直後に導入した。
操作は次のとおりである。オリゴヌクレオチドを精製
後、１および13を除いてすべてをリン酸化した。アニー
リングと連結を行つたのち、アガロース電気泳動後正し
い大きさのフラグメントを精製し、予めBam HIとHind I
IIで消化したベクターpEMBL9と連結した。E.coli細胞を
形質転換し、プラスミドDNAを精製した。1.8kbの期待さ
れたBam HI−Hind IIIフラグメントをもつプラスミドに
ついてヌクレオチド配列を解析した。正しい配列を有す
るクローンから、Xmn I−Hind IIIフラグメントを精製
し、プレ−プロ−α−ガラクトシダーゼ遺伝子をコード
するプラスミドpUR2302（第７図）からの1.2kbBam HI−
Xmn IフラグメントおよびBam HIとHind IIIで消化した
ベクターpBR322と、モル比約4:2:1で連結した。
連結混合物でE.coli細胞を形質転換し、アンピシリン
抵抗性，テトラサイクリン感受性形質転換体からプラス
ミドDNAを精製した。精製プラスミドDNAを制限酵素で解
析した。これにより翻訳停止後の非翻訳配列が除去され
た完全グアープレ−プロ−α−ガラクトシダーゼ遺伝子
をコードするプラスミドpUR2303が生成した。
pUR3501の構築（第16−２図） MOXプロモーターとインベルターゼシグナル配列−成
熟α−ガラクトシダーゼの間の正確な融合を実現するた
めに、６個のオリゴヌクレオチドから構成される合成ds
DNAフラグメントを使用した。この合成フラグメントは
MOXプロモーターのHgi AI部位から後の部分（Ledeboer
ほか,1984），S.cerevisiaeからのインベルターゼシグ
ナル配列（Tsussig ＆ Carlson,1983）および成熟α−
ガラクトシダーゼからNco I部位までの最初の10個のア
ミノ酸（第６図）をコードする。暗号領域については、
H.polymorphaの至適コドンを用いるように選択した（Le
deboerほか,1985）。
６個のオリゴヌクレオチドから,1,2,3および４をリン
酸化し、ついでオリゴヌクレオチド０および５を加えた
のちアニーリング、連結を行つた。次の工程は、合成フ
ラグメントと、pUR3102からのSal I−Hgi AI MOXプロモ
ーターフラグメント（Ledeboerほか,1984;第12A図）お
よびM13ベクター（Sal IおよびEco RIで消化し、ついで
脱リン酸化）との連結であつた。この連結混合物でE.co
li細胞を形質転換し、白色プラークを採取した。一本鎖
フアージDNAと二本鎖型を精製した。正しい制限酵素パ
ターン及び合成フラグメントの正確なヌクレオチド配列
を有するクローンから、Sal I−Nco Iフラグメントを精
製し、さらにクローニングを行つた。
このSal I−Nco Iフラグメントを、成熟α−ガラクト
シダーゼをコードするpUR2303からのNco I−Sal Iフラ
グメント（第16−１図）およびSal Iで消化したベクタ
ーpEMBL9と連結し、脱リン酸化した。E.coli細胞を連結
混合物で形質転換し、正しい制限酵素パターンをもつプ
ラスミドを解析し、プラスミドpUR3501を得た。
pUR3505の構築（第16−３図） プラスミドpUR3501の2.6kb Sal Iフラグメントを精製
し、MOXターミネーターフラグメントを含有するプラス
ミドpUR3104中に連結した（Ledeboerほか,1984,第14A
図）。生成した形質転換体からのプラスミドを制限酵素
で、フラグメントの適当なオリエンテーシヨン（MOXプ
ロモーター−インベルターゼシングル配列−α−ガラク
トシダーゼ−MOXターミネーター）について解析し、プ
ラスミドpUR3505を得た。このプラスミドはすでに、H.p
olymorphaゲノム中への（部位指定）挿入に適してい
る。形質転換体は、活性α−ガラクトシダーゼ酵素の存
在により炭素源としてメリビオースで生育する能力を取
得していることが期待される。しかしながら、本発明者
らは、leu−２栄養要求性選択マーカーをもち、H.polym
orpha中で自動複製できるYEp13ベクターの使用を最初に
選択した（Gleesonほか,1986）。
プラスミドpUR3510の構築（第16−４図） 完全プロモーター−遺伝子−ターミネーター配列をプ
ラスミドpUR3505から5.2kb Hind III−Eco RIフラグメ
ントとして精製した。このフラグメントをtet−遺伝子
中に位置するYEp13の唯一のBam HI部位にクローニング
するため、本発明者らはBam HI−Hind IIIおよびBam HI
−Eco RIアダプターを使用した。リン酸化アダプターを
連結したのち、混合物をBam HIで消化し、5.2kbフラグ
メントを精製した。最後に、Bam HIフラグメントをYEp1
3（Bam HIで消化し、脱リン酸化）と連結した。リゲー
ション混合物及びアンピシリン抵抗性、テトラサイクリ
ン感受性クローンから精製したプラスミドDNAでE.coli
細胞を形質転換した。これらから、正しい制限酵素パタ
ーンをもつプラスミド、pUR3510が選択された。
H.polymorphaのpUR3510による形質転換 Hansenula polymorpha株L1（leu1−１）を、Gleeson
ほか（1986）によつて報告された操作を用い、LiClおよ
び環状プラスミドDNAで形質転換した。形質転換体はMM
上グルコースを炭素源とし、ロイシンを用いないで生育
させ選択した。得られたleu+形質転換体についてグアー
α−ガラクトシダーゼ酵素の存在を解析した。
YMM寒天平板上、炭素源としてグリセロールを用いて
生育させ、細胞を収穫し、抽出緩衝液（10mM Tris−HCl
pH8.0,0.1 mM EDTA,1 mM DTT）に懸濁し、凍結−解凍
を３回反復して破壊した。これらの粗細胞抽出液につい
て、活性α−ガラクトシダーゼ酵素を人工基質pNPGで、
また免疫学的定量法（ウエスターン法）で定量した。
粗細胞抽出液を抽出緩衝液で適当に希釈し、0.1M酢酸
ナトリウムpH4.5中10mM pNPGと、37℃で５分間インキユ
ベーシヨンした。２％炭酸ナトリウム1mlを加えて反応
を停止させた。得られた混合物を、Eppendorf遠心分離
器により５分間遠心分離して細胞および細胞屑を除去し
たのち410nmにおける吸光度を測定した。ｐ−ニトロフ
エノールの410nmにおける吸光係数は18.4cm2／μmoleで
ある。α−ガラクトシダーゼ１単位は、37℃,pH4.5にお
いて１分間に基質１μmoleを加水分解する酵素の量と定
義される。
プラスミドpUR3510をもつ細胞の細胞抽出液はこの検
定で陽性シグナルを与えた。一方、このプラスミドを含
まない酵母細胞の対照プレパレーシヨンは反応を示さな
かつた。
免疫学的検定には、いわゆるウエスターン解析法を用
いた。サンプル緩衝液（Edensほか,1982）を粗細胞抽出
液に添加後、５分間煮沸した。
精製蛋白質を、わずか２分間加熱したのちゲルサンプ
ル緩衝液中に適用した。蛋白質をWyckoffほか（1977）
の方法によつて10％ポリアクリルアミドゲル上電気泳動
によつて分離した。
ついで蛋白質をゲルからニトロセルロース上に、電気
泳動移動により移した（Burnette,1979参照）。ニトロ
セルロースをインキユベーシヨン（Ｉ）緩衝液（150mM
NaCl,5mM EDTA,50mM Tris−HCl pH7.0,0.05％トリトン
Ｘ−100,0.25％ゼラチン）で洗浄し、Ｉ−緩衝液中、0.
1％BSAおよびグアーから精製したα−ガラクトシダーゼ
でウサギを免疫処理することにより産生させた抗血清と
インキユベーシヨンした。
インキユベーシヨンは室温で４時間、攪拌下に行つ
た。Ｉ−緩衝液で２回、リン酸緩衝食塩溶液pH7.0（BP
S）で洗浄して、吸着されなかつた抗体を除去した。抗
原に結合した抗体は、125IプロテインＡ（Amersham）と
１時間反応させて検出した。Ｉ−緩衝液で２回,PBSで３
回洗浄したのち、ニトロセルロースを乾燥し、−70℃で
Ｘ線フイルムに暴露した。
結果（第17図）は、プラスミドをもつHansenula細胞
抽出液（レーンＣ）には、植物酵素の蛋白質（レーン
Ｂ）と分子量が同一な蛋白質が存在し、これはまたS.ce
revisiae中プラスミドpURY2705によつて産生された蛋白
質とも同一であることを示した。このプラスミドをもた
ないHansenula細胞は蛋白質を示さなかつた（レーン
Ａ）。
例９ GAL7プロモーターを用いた遺伝子操作S.cerevisiaeによ
るグアーα−ガラクトシダーゼの製造 微生物によるグアーα−ガラクトシダーゼの製造をさ
らに例示するために、GAL7プロモーターを用い、S.cere
visiae中でこの酵素の発現を誘導できるベクターを構築
した。このプロモーターのヌクレオチド配列はすでに報
告されている（Nogi ＆ Fukasawa,1983）。
このプロモーター配列は、誘導条件下すなわち単独炭
素源としてガラクトースを加えた培地上で生育させる
と、GAL7コード酵素の産生が起こる（Hopper Rowe,197
8）。さらに、このプロモーターの、異種遺伝子の発現
誘導のための使用（たとえばE.coliからの公知lacZ遺伝
子）についても報告がある（Tajimaほか,1985;Yargerほ
か,1985）。したがつて、GAL7プロモーターを用い、ハ
イブリツド遺伝子インベルターゼシグナル配列::成熟α
−ガラクトシダーゼの発現を分析した。
ベクターpUR2706および2730の遺伝子操作 これらのベクターのベースは、GAPDHプロモーター−
インベルターゼシグナル配列::成熟α−ガラクトシダー
ゼを含有するシヤトルベクターpURY2705である（例2,第
10図参照）。このベクターから、GAPDHプロモーターは
ほとんど完全に除去され、T.Fukasawa博士（Laboratory
of Molecular Genetics,Keio University School of M
edicine,Tokyo,Japan）から入手したクローン化271bp G
AL7プロモーターフラグメント（Tajimaほか,1985）で置
換されてベクターpUR2706を得るか、あるいはin vitro
合成DNAプロモーターフラグメントで置換されて、pUR27
30を得た。
プラスミドpUR2706は次のようにして構築した（第18
−１図参照）。まず、ベクターpUR2705中のGAPDHプロモ
ーターのSac I部位をBam HI部位に変換した。したがつ
て、ベクターpURY2705をSac Iで消化し、S1エキソヌク
レアーゼとインキユベーシヨンするとブラント末端が創
製され、ついでこれにBam HIリンカー（５′CGGATCCG）
を連結した。連結混合物をE.coli細胞の形質転換に使用
した。
得られた形質転換体からプラスミドDNAを単離し、制
限酵素で解析した。Sac I部位を欠くがBam HI部位を有
するプラスミドを選択した（pURY2705′）。ヌクレオチ
ド配列解析により、Sac I部位のみでなくSac I部位の周
囲の多数のヌクレオチドが除去されていることが明らか
にされた。しかしながら、インベルターゼシグナル配列
の翻訳開始“ATG"は影響を受けていなかつた。結果は以
下の配列であつた。
５−−−ccttgaacttcggatccgATGATGCTT−−−３′
（インベルターゼシグナル配列は大文字で、GAPDHプロ
モーターは小文字で、Bam HIリンカーは下線を付して示
す） このプラスミドpURY2705′をBgl IIおよびBam HIで消
化してGAPDHプロモーターをほぼ完全に除去し、大ベク
ターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し
た。GAL7プロモーターは、プラスミド上に271bp Bam HI
−Bgl IIフラグメントとして存在する（Tajimaほか,198
5）。このフラグメントも、消化後アガロースゲル電気
泳動で精製した。精製した２個のフラグメントを連結
し、連結混合物を用いてE.coli細胞を形質転換した。
Bam HIとBgl IIは同じ粘着端を生成するので、271bp
プロモーターフラグメントは２種の方向に連結できる。
しかしながら、Bam HI粘着端がBgl II粘着端に連結する
場合は、Bam HIによつてもBgl IIによつても認識されな
い配列を生じる。したがつてBam HIおよびBgl II部位の
存否がそのまま、プロモーターの方向性の情報を与え
る。
したがつて、プラスミドDNAを形質転換体から精製
し、これらの制限酵素で解析した。正しい方向にプロモ
ーターフラグメントをもつプラスミドはBgl IIおよびBa
m HI部位を欠くので選択された（pURY2706）。これはGA
L7プロモーター（小文字），Bgl II−Bam HIリンカー
（下線）およびインベルターゼシグナル配列（大文字）
の融合した以下のヌクレオチド配列を生じた。
gaatattccccagatccgATGATGCTT プラスミドpUR2730は次のようにして構築した（第18
−２図参照）。まず、16個のオリゴヌクレオチドからな
るds DNA配列としてGAL7プロモーター配列を合成し、こ
れを合し、さらに例２に他のグループのオリゴヌクレオ
チドについて記載したと同様に操作した。最初の５個は
pEMBL9中のEco RI−Bam HIフラグメントとしてクローン
化し、最後の11個はpEMBL9中のBam HI−Hind IIIフラグ
メントとしてクローン化した。プラスミドDNAは形質転
換体から精製し、制限酵素で解析した。期待された大き
さの挿入体を有するプラスミドの配列を決定し、正しい
ヌクレオチド配列をもつクローンを以後の操作に使用し
た。
GAPDHプロモーターを除去するためには、プラスミドp
UR2705をBgl IIで消化し、脱リン酸化し、ついでSac I
で消化し、10.7kbベクターフラグメントをゲル電気泳動
によつて精製した。GAL7プロモーターをコードする２種
のフラグメントは、上述の２種のpEMBLクローンをBam H
I消化によつて消化し、脱リン酸化し、Bgl IIで消化
し、ついでそれぞれBam HIおよびSac Iで消化したのち
精製した。
ベクターフラグメントは２種のGAL7プロモーターフラ
グメントと連結し、この連結混合物を用いてE.coli細胞
を形質転換した。プラスミドDNAは形質転換体から精製
し、制限酵素で解析した。適当な制限酵素パターンをも
つプラスミドを選択すると、プラスミドpUR2730が得ら
れた。
GAL7プロモーターを用いたSaccharomycesによるグアー
α−ガラクトシダーゼの産生の解析 Saccharomyces株SU10（α,leu 2,ura 3,his 3,cir+;C
entraalbureau vorr Schim melcultures,P.O.Box273,37
40AG Baarn,The NetherlandにCBS第323.87号として寄託
されている）の酵母細胞をスフエロプラスト法（Beggs,
1978）により、プラスミドpURY2706で形質転換した。
生成したleu+形質転換酵母細胞をα−ガラクトシダー
ゼ酵素の存在について解析した。それらをウラシル及び
ヒスチジンを補充した培地で生育させた。次に酵母細胞
を10×大容量YPG培地に移し、静止期まで生育させた。
細胞を発酵ブイヨンから遠心分離または濾過（0.22μm,
Millipore）のいずれかによつて分離した。発酵培地お
よび粗細胞抽出液の両者について、例２に記載したと同
様にしてα−ガラクトシダーゼの存在を分析した。
結果は、発酵ブイヨン1ml中に約５単位が存在し、一
方、この濃度の10％未満が粗細胞抽出液中に存在した。
したがつて、α−ガラクトシダーゼ酵素はかなり高レベ
ルで分泌される。
産生された酵素をさらに詳細に解析するため、α−ガ
ラクトシダーゼを以下のようにして精製した。
プラスミドpUR2706を係留する株SU10の酵母細胞を上
述のようにして培養した。発酵ブイヨンから細胞をマイ
クロ濾過（0.22μｍ）で除去したのち、0.03M Tris−HC
l pH8.0で平衡化したPD−10カラム（Pharmacia）を用い
て脱塩により、低分子量物質を除去した。α−ガラクト
シダーゼはさらに、MONO−Ｑカラム（HR5/5,Pharmaci
a）を用い、陰イオン交換クロマトグラフイーによつて
単離した。溶出は0.03M Tris−HCl pH8.0中、NaCl勾配
（０〜1M）によつて行つた。検出は、Pharmacia FPLCシ
ステムを用い214/280nmで実施した。α−ガラクトシダ
ーゼ活性を含むフラクシヨン（約0.3M NaClで溶出）を
集め、脱塩した（PD−10カラム、0.01M酢酸ナトリウムp
H4.5で溶出）。
このプレパレーシヨンをグアーガムのガラクトース含
量低下のための精製プレパレーシヨンとして用いた（例
10参照）。Ｎ末端配列解析のための最後の精製は、広孔
Ｃ−４カラム（Backerbond,4.6*250mm）を用い、勾配溶
出：緩衝液A0.1％TFA（v/v），緩衝液B0.1％TFA＋60％C
H3CN（v/v）,25分による逆相クロマトグラフイーで実施
した。検出はWater HPLCシステムを用いて214/254nmで
行つた。α−ガラクトシダーゼのピーク（55％CH3CNで
溶出）をSpeed Vac Concentrator（SAVANT）で濃縮し、
Ｎ末端配列解析に用いた。これは、Applied Biosystems
の気相シクエンサー（470A型）によつて実施し、オンラ
インPTH−アナライザー（120A）を用いた。
結果は、NH2末端から配列決定した12個の残基がグア
ーα−ガラクトシダーゼのNH2末端アミノ酸配列と完全
に一致することを示した。インベルターゼシグナル配列
は正しく処理されていて、グアーα−ガラクトシダーゼ
のアミノ酸配列が正確に生成した。
例10 GAL7プロモーターを用いた遺伝子操作S.cerevisiaeに
より製造したα−ガラクトシダーゼ酵素によるガラクト
マンナン中ガラクトース含量の低下 プラスミドpUR2706を係留した酵母細胞株SU10によつ
て製造されたグアーα−ガラクトシダーゼ酵素（例９参
照）について、ガラクトマンナンのガラクトース含量低
下活性を試験した。
２種のプレパレーシヨンを使用した。すなわち、ひと
つは発酵培地からMONO−Ｑカラムを用いて精製したプレ
パレーシヨンである（例９参照）。
α−ガラクトシダーゼ活性を含有するフラクシヨン
（約0.3M NaClで溶出）を集め、脱塩した（PD−10カラ
ム、溶出液0.01M酢酸ナトリウムpH4.5）。
酵素プレパレーシヨンを真空乾燥によりさらに約10倍
に濃縮した。
他は、10,000ダルトン以上の分子量を保持するAmicon
濃縮器を用い、澄明な発酵培地を10倍に濃縮して得られ
た粗濃縮プレパレーシヨンである。
対照としては、McCleary（1983）によつて記述されて
いるグアー種子から精製したα−ガラクトシダーゼ酵素
を用いた。
これらのα−ガラクトシダーゼ酵素のグアーガム中ガ
ラクトース含量の低下能は以下のようにして分析した。
酵素プレパレーシヨン（25U）を100mM酢酸ナトリウム
緩衝液（pH4.5）1.5mlに溶解した。これをグアーガム1g
に加え、混合物が微細なパン粉のような感触になるまで
少なくとも１分間激しく混合し、55℃でインキユベーシ
ヨンした。
この酵素のガラクトマンナンに対する活性の解析に
は、そのサンプルを取り、次のようにして分析した。
パン粉様混合物約150mgのサンプルを取り、秤量し
た。酵素を沸騰水浴中に10分間置いて不活性化した。
次に10％水酸化ナトリウム5mlを加え、サンプルを小
型ホモジナイザーを用いて分散させた。この溶液を水で
25mlにし、30分間振盪し、再びホモジナイズし、15分間
放置した。この処置ののち、ポリサツカライドを完全に
溶解させると、遊離ガラクトース（例７参照）および総
炭水化物が定量できる。総炭水化物の定量にはアンスロ
ン定量（Morris,1948）を使用した。改良操作（Loewus,
1952）は次のとおりである。
アンスロンの酢酸エチル中飽和溶液を調製し、少くと
も１時間静置した。試験溶液25μｌをピペツトで試験管
に取り、蒸留脱イオン水で1mlとした（水をブランクに,
80μｇのガラクトースを標準に使用した）。アンスロン
飽和酢酸エチル0.2mlを加え、ついで濃硫酸2.5mlを加え
た。激しく混合し、放冷した。吸光度は約30分後に610n
mで読んだ。
これらの結果から、ポリサツカライドに対するガラク
トースの存在％を計算した。
これらの結果は、グアーからの酵素と、遺伝子操作酵
母細胞によつて産生された酵素のグアーガム中ガラクト
ース含量低下能には差がないことを示している。
例11 グアーα−ガラクトシダーゼの遺伝子操作植物による
製造:Nicotiana tabacumによる製造 遺伝子操作微生物によるグアー酵素の製造についで、
植物細胞による製造も経済的に興味のある可能性を提供
する。しかしながら、β−マンナナーゼが存在しないと
いう当然の要件に加えて、植物が遺伝子技術法によつて
操作できるものでなければならない。この例ではその例
として、N.tabacumに焦点をあてた。この植物種は、こ
れまで広く遺伝子工学実験に使用されてきたからであ
る。技術が他の植物種にも利用可能になれば、グアーα
−ガラクトシダーゼの製造も容易に他の種に移すことが
できる。
グアーα−ガラクトシダーゼの植物による製造を例示
するために、本発明者らはそのためのベクターを構築
し、そのベクターをNicotiana tabacum中に移した。
グアーα−ガラクトシダーゼをもつ植物発現ベクター
（pUR8001）の構築 成熟酵素に先立つプレープロ部分をコードする配列を
含む全α−ガラクトシダーゼ遺伝子（第６図参照）を導
入することに決定した。さらにA/TおよびG/C尾部を含む
翻訳停止後の非翻訳DNA配列は除去した。最後に全遺伝
子をBam HI部位の側面に置き、植物発現ベクター中カリ
フラワーモザイクウイルス35Sプロモーターとノパリン
シンテターゼ終結配列の間にクローニングした。これら
の遺伝子操作工程を以下に詳述する。
pUR2303の構築（第16−１図） ヌクレオチド1400における翻訳停止後のmRNAの非翻訳
部分の（第６図）ならびにポリA/TおよびG/C尾部を除去
するために、ヌクレオチド1223〜1233におけるXmn I部
位から（第６図）翻訳停止までの遺伝子部分をin vitro
合成フラグメントで置換した。このフラグメントは、二
重翻訳停止を含むα−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列を
正確にコードする13のオリゴヌクレオチドから構成され
た。さらにクローニングの便宜上、翻訳停止の直後にSa
l IおよびHind III部位を挿入した。
操作は次のとおりであつた。オリゴヌクレオチドを精
製後、１および13を除いてすべてをリン酸化した。アニ
ーリングおよびリゲーシヨン後、正しい大きさのフラグ
メントをアガロースゲル電気泳動によつて精製後、予め
Bam HIおよびHind IIIで消化したベクターpEMBL9とリゲ
ートとした。株JM103からのE.coli細胞を形質転換し、
プラスミドDNAを精製した。期待された0.18kbのBam HI
−Hind IIIフラグメントをもつプラスミドをヌクレオチ
ド配列決定法によつて解析した。正しい配列をもつクロ
ーンからXmn I−Hind IIIフラグメントを精製し、プレ
−プロ−α−ガラクトシダーゼをコードするプラスミド
pUR2302からの1.2kb Bam HI−Xmn Iフラグメントおよび
Bam HIとHind IIIで消化したベクターpBR322を、モル比
約4:2:1で一緒にリゲートした。
E.coli細胞をリゲーシヨン混合物で形質転換し、プラ
スミドDNAをアンピシリン抵抗性，テトラサイクリン感
受性形質転換体から精製した。精製プラスミドDNAを制
限酵素で解析した。これにより、翻訳停止後の非翻訳配
列が除去された全グアープレ−プロ−α−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子をコードするプラスミドpUR2303が得られ
た。
pUR2304の構築 プラスミドpUR2303をSal Iで切断し、生成した一本鎖
粘着端をDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと
デオキシヌクレオチドトリホスフエートと処理して充填
した（二本鎖とした）。合成Bam HIリンカー配列〔５′
CCGGATCCGG〕を予めリン酸化したリンカーの１モル過剰
とのリゲーシヨンにより添加した。ついでプラスミドを
Bam HIで消化し、1.2kbフラグメントをゲル電気泳動で
精製し、ベクターpUC9のBam HI部位にリゲーシヨンした
（Vieiraほか,1982）。リゲーシヨン混合物を用いてE.c
oli JM101を形質転換し（Yanisch−Perronほか,198
5），白色のアンピシリン抵抗性コロニーを選択した。
プラスミドDNAは形質転換クローンから調製し、制限酵
素解析に付した。さらに使用するために正しいプラスミ
ドを選択し、pUR2304と命名した。このプラスミドを、
1.2kb Bam HIフラグメント上に存在するα−ガラクトシ
ダーゼコード配列の源として使用した。
植物発現ベクターpUR8001の構築 植物発現ベクターは植物に移すことができるAgrobact
erium tumefaciens中二元ベクター系pBin19（Bevan,198
4）の成分を形成し、E.coliまたはAgrobacterium中での
安定な維持性を付与する広範な宿主範囲レプリコン；細
菌中で機能するカナマイシン抵抗性遺伝子;TDNAの25塩
基対リピートが側面に位置するDNA領域で、１つのBam H
I切断部位を通して結合した、植物中において機能する
カナマイシン抵抗性遺伝子およびカリフラワーモザイク
ウイルスの35 S RNAプロモーターとノパリンシンテター
ゼ遺伝子の転写ターミネーターを含む発現カセットを含
有する領域；このベクターをpRK2013による接合移動（i
n trans）に対して移動可能にする動員部位から構成さ
れている。
発現部位内にα−ガラクトシダーゼ遺伝子を挿入する
ために、このベクターをBam HIで消化し、脱リン酸化
し、ゲル電気泳動により精製した。
1.2kb α−ガラクトシダーゼBam HIフラグメントをpU
R2304から精製し、直線化脱リン酸化ベクターと混合
し、二者をたがいにリゲーシヨンした。リゲーシヨンし
た混合物を用いてE.coli JM101を形質転換し（Yanisch
−Perronほか,1985）、陽性クローンをカナマイシン抵
抗性によつて選択した。プラスミドDNAは数種のクロー
ンから調製し、制限酵素解析を介して１）1.2kb α−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子フラグメントの存在および２）こ
のフラグメントの正しい方向性，すなわち、遺伝子のＮ
末端コード部分が発現カセツトのプロモーター遺伝子に
隣接することをチエツクした。後者の特徴はPst Iの非
対称に配置された切断部位を使用することによつて決定
された。正しい方向性をもつプラスミドが選択された
（pUR8001;第19図参照，E.coli JM101中、Centraalbure
au voor Schimmelcultures,P.O.Box273,N1−3740AG Baa
rn,オランダに寄託番号CBS337.87号にて寄託された）。
タバコ細胞内へのベクターpUR8001の導入 pUR8001を含有するE.coliクローンを、pRK2013を係留
するE.coli株HB101（Boyerほか,1969）およびAgrobacte
rium tumefaciens株LBA4404（Hoekemaほか,1983）と三
者間交配に用いpUR8001をAgrobacterium株に移した。こ
の株はリフアンピシン抵抗性なので、この抗生物質を
カナマイシンと組み合わせて、交配時ドナーに対する逆
選択に使用した。
形質転換カルスの発生 in transでTDNAを植物に移動する機能を有するその本
来TiプラスミドとpUR8001の両者をもつA.tumefaciens L
BA4404の誘導体を単離し、Horschほか（1985）の葉デイ
スク法の誘導体を用いて植物組織中のその発現カセツト
内にα−ガラクトシダーゼ遺伝子を移送するために使用
した。径8mmの葉デイスクを、無菌的に（細菌等を含ま
ない純粋培養を意味する）生育させたNicotiana tabacu
m S R 1（種子はR.Shields,Unilever Research Laborat
ory Colworth House,UKから入手できる）の新たに開い
た葉から切り取つた。このデイスクを無菌条件下に、Le
nnox培地中上記A.tumefaciens誘導体（細胞109個/ml）
の一夜培養中に移した。これを10分間インキユベート
し、取り出し、吸い取つて乾かし、Nicotiana plumbagi
nafolia懸濁培養液2mlを接種した寒天培地（発芽または
カルス形成培地）の表面の無菌フイルター上に軸面を下
に培養した。接種した葉デイスクを26℃で２日間光線内
で培養し、ついで100μg/mlカナマイシンおよび500μg/
mlセフオタキシム（Claforan,Roussell社製）含有選
択培地に移した。カルス培養は維持し、適当な培地中３
週継代間隔で増殖させ、カナマイシンおよびセフオタキ
シムの両者で連続選択した。
形質転換植物の生成 発芽が促進された培養の場合（発芽培地）は、発芽が
A.tumefaciens感染２〜４週後に起こつた。葉デイスク
から芽を切り取り、植物ホルモンは含まないがセフオタ
キシムを含有する培地に移した。芽に根が生じたとき、
再び芽を切断して、セフオタキシムとカナマイシンを含
有するが、植物ホルモンを含まない培地に移した。カナ
マイシン選択下に緑を維持し、さらに根を生じた芽は、
さらにベクター上にあるマーカーの存在を試験して形質
転換されていることが明らかにされた。
α−ガラクトシダーゼ配列は含まないが、植物にノパ
リン産生を付与するベクターBin6（Plant Breeding Ins
titute,Maris Lane,Trumpington,Cambridge CB2 2LQ,UK
のM.Bevan博士から自由に入手できる）を用いた対照形
質転換も上記操作に平行して実施した。
形質転換カルスから液体懸濁培養液の生成 カナマイシン（100μg/ml）およびセフオタキシム（5
00μg/ml）含有カルス形成培地（固体）上で生育した形
質転換カルスの小切片（200mg）を上記抗生物質を含む
液体カルス形成培地（50ml）中に取り、暗所、軌道振盪
機上で培養した。培養液が粘稠になつたらば、無菌条件
下に篩過して均一な細胞懸濁液を調製した。懸濁培養液
は14日間隔で二次培養した。
形質転換植物からの毛根培養物の生成 カナマイシン100μg/ml上で生育した形質転換植物の
葉から葉デイスクを切断した。切断したデイスクをAgro
bacterium rhizogenes R1000（Imperial College,Londo
n,Conrad Lichtenstein博士から入手した）の一夜培養
物と10分間インキユベートした。デイスクを細菌培養液
から回収し、吸い取つて乾燥し、Nicotiana plumbagina
folia供給層上に表を下にして培養した（Agrobacterium
tumefaciensの感染について上述したと同様にして）。
２〜３日後、デイスクをカナマイシン（100μg/ml）お
よびセフオタキシム（500μg/ml）含有毛根培養培地
（固体）上、軸面を下にして培養した。10〜15日後、生
じた根を切断し、100μg/mlのカナマイシンを含有する
毛根培養培地（液体）上に置き、軌道振盪機上で培養し
た。根は約10日ごとに二次培養した。
培地 カルス形成： Murashige ＆ Skoog基礎培地（Flow Laboratories） ３％シユクロース 2mg/lナフチル酢酸（オーキシン） 0.5mg/lベンジルアミノプリン（サイトキニン） （固体培地では必要に応じて寒天） 発芽： Murashige ＆ Skoog基礎培地（Flow Laboratories） ３％シユクロース 0.02mg/lインドール酢酸（オーキシン） 1mg/lベンジルアミノプリン（サイトキニン） （固体培地では必要に応じて寒天） 毛根培養培地 Murashige ＆ Skoog基礎培地（Flow Laboratories） ３％シユクロース 0.1mg/lナフチル酢酸 形質転換植物組織のα−ガラクトシダーゼ産生試験 ａ）直接化学的アツセイ タバコ植物、たとえばカルス、葉または毛根から、氷
冷抽出緩衝液（1ml）中ホモジナイズした組織100〜300m
gを用いて抽出液を調製した。別に、懸濁培養液の上澄
を使用した。抽出液または上澄液40μｌを2mlのアツセ
イ緩衝液〔抽出緩衝液中４−メチルウムベリフエリル−
α−Ｄ−ガラクトシド（Sigma）1mM〕とともに37℃でイ
ンキユベートし、500μｌのサンプルを、0,5,10および1
5分間隔で採取し、0.2M Na2CO3 3mlを加えて停止した。
遊離した４−メチルウムベリフエロンの螢光を、Baird
Nova2スペトロフルオロメーターを用い、スリツト幅セ
ツト10nmにおいて365nmの励起光と、455nmの放射光を測
定し、新たに調製した４−メチルウムベリフエロンの溶
液で検量した。
抽出緩衝液 酢酸ナトリウム（50mM,pH5） EDTA二ナトリウム（1mM） ジチオトレイトール（10mM） トリトンＸ−100（0.1％） この定量法で測定された値を第20図にプロツトした。
この図から、形質転換細胞プレパレーシヨンは、対照プ
レパレーシヨンに比べてはるかに高いα−ガラクトシダ
ーゼ活性を与えることが容易にわかる。対照はグアーα
−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいなかつた。
ｂ）免疫学的検出 （ｉ）サンプル調製 形質転換植物組織（カルスまたは葉）の小片100mgを
1.8mlのエツペンドルフ管中、先端が円錐状のテフロン
乳棒を用い、液体窒素の中で粉砕した。この粉末を２×
標準濃度SDSゲルサンプル緩衝液（Laemmli,1970）200μ
ｌの存在下、穏やかにホモゲナイズしながら解凍した。
標品α−ガラクトシダーゼを含有するグアー内乳のサン
プルを、例１に記載したと同様に制御された同期発芽に
よつて調製した。24時間発芽内乳（抽出液あたり４個）
を上述したと同様に液体窒素中で粉砕し、６×標準濃度
サンプル緩衝液200μｌ中に穏やかにホモゲナイズしな
がら解凍した。ホモジネートを蒸留水で600μｌに希釈
した。全抽出液を５分間煮沸し、ついで10,000gで５分
間遠心分離した。上澄を10％SDSゲル上にロードし、300
Vで３時間、ついで100Vで２時間電気泳動に付した（ロ
ードについては相当する図の説明参照）。ついでゲルを
ニトロセルロースフイルター上、電気ブロツト操作に付
した。ついでフイルターを以下のように処理した。
１）TBS（0.5M NaCl,20mM Tris・HCl,pH7.5）＋１％ヘ
モグロビン中16時間インキユベーシヨン ２）TBS＋１％ヘモグロビン＋0.1％Tween20中のアフイ
ニテイー精製抗α−ガラクトシダーゼの1:100希釈液25m
l中で、３時間インキユベーシヨン（第一抗体） ３）TBS＋１％ヘモグロビン＋0.1％Tween20（２×50m
l）中ついで1M NaCl,20mM Tris−HCl,pH7.5,0.1％Tween
20（４×100ml）中、２時間にわたつて洗浄 ４）TBS,0.1％Tween20,1％ヘモグロビン中、ヤギ抗ウサ
ギワサビペルオキシダーゼ接合体の1:2,000希釈液と、
２時間インキユベーシヨン（第二抗体） ５）1M NaCl,20mM Tris−HCl,0.1％Tween（４×100ml）
中、１時間にわたつて洗浄 ６）蒸留水中で最終リンス ７）標準ワサビペルオキシダーゼ発色試薬と（HRPキツ
トの販売先−Bioradの説明に従つて）２分間インキユベ
ーシヨン 上述の電気免疫ブロツト法（ウエスターン法）によ
り、形質転換カルスC1,F11およびB1は対照プラスミドBi
n6で形質転換されたカルスには存在しない、抗α−ガラ
クトシダーゼと交差反応できる蛋白質材料を含有するこ
とを明らかにできた。さらに、交差反応種は、発芽グア
ー内乳の抽出液中に認められる標品α−ガラクトシダー
ゼと同じ移動度（分子量）を示す。
これは、移入された遺伝子がコードするα−ガラクト
シダーゼのプレ−プロ型がタバコカルスで発現された場
合、成熟型に正しく処理されることを示唆しており、こ
れは、C1,F11およびB1の懸濁培養液の上澄にα−ガラク
トシダーゼ活性が認められたことに基づき、α−ガラク
トシダーゼは形質転換タバコ細胞によつて分泌されると
した本発明者らの結論を支持するものである。
α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する形質転換タバ
コ葉（pUR8001で形質転換）の電気免疫ブロツト法によ
る検討でも、この酵素の成熟処理型に相当する大きさの
α−ガラクトシダーゼ型の発現が同様に認められた。
第１表の説明 12種の起源のα−ガラクトシダーゼ酵素についてオク
テロニー法、ウエスターン法による免疫学的関係ならび
にガラクトマンナンのガラクトース含量を低下させる能
力について検定した。
オクテロニー法では、濃度約10U/mlの酵素プレパレー
シヨンを使用した。ウエスターン法では0.1U/ml〜0.5U/
mlの溶液を５μｌを使用した。
ND:測定せず 参考文献 Backman,K.,Ptashne,M.and Gilbert,W.（1976）,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.73:4174−4178. Bahl,O.P.and Aqrawal,K.M.L.（1969）,J.Biol.Chem.
244:2970−2978. Beggs,J.D.（1978）,Nature 275:104−109. Bevans,M.（1984）,Nucleic Acids Res.12:8711−872
1. Biggin,M.D.,Gibson,T.J.and Hong,G.F.（1983）,Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3963−3965. Birnboim,H.C.and Doly,J.（1979）,Nucleic Acids R
es.７:1513−1523. Bishop,D.F.,Calhoun,D.H.,Bernstein,H.S.,Hantzopo
ulos,P.,Quinn,M.and Desnick,R.J.（1986）,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.83:4859−4863. Boyer,H.W.and Roulland−Dussoix,D.（1969）,J.Mo
l.Biol.41:459−472. Broach,J.,Strathern,J.and Hicks,J.（1979），Gene
８:121−133, Buckholz,R.G.and Adams,B.G.（1981）,Mol.Gen.Gene
t.182:77−81. Burnette,W.N.（1979）,Anal.Biochem.112:195−203. Chen,E.J.and Seeburg,P.H.（1985）,DNA ４:165−17
0. Dente,L.,Cesareni,G.and Cortese,R.（1983）,Nucle
ic Acids Res.11:1645−1655. Edens,L.,Heslinga,L.,Klok,R.,Ledeboer,A.M.,Maat,
J.,Toonen,M.Y.,Visser,C.and Verrips,C.T.（1982）,G
ene 18:1−12. Edens,L.,Ledeboer,A.M.,Verrips,C.T.and van den B
erg,J.A.（1983）,EP−Ａ−0 096 910. Edens,L.,Russell,S.W.,Visser,C.and Verrips,C.T.
（1984）,EP−Ａ−0 129 268. Edman,P.and Begg,G.（1967）,Eur.J.Biochem １:80
−91. Gleeson,M.A.,Ortori,G.S.and Sudbery,P.E.（198
6）,J.Gen.Microbiol.132:3459−3465. Grandi,G.,Del Bue,M.,Palla,E.,Mele,A.,Coletti,E.
and Toma,S.（1986）,Plasmid 16:1−14. Gubler,U.and Hoffman,B.J.（1983）,Gene 25:263−2
69. Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.（1978）,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.75:1929−1933. Hoekema,A.,Hirsch,P.R.,Hooykaas,P.J.J.and Schilp
eroort,R.A.（1983）,Nature 303:179−180. Hopper,J.E.and Rowe,L.B.（1978）,J.Biol.Chem.25
3:7566−7569. Horech,R.B.and Fry,J.E.,Hoffmann,N.L.,Eichholtz,
D.,Rogers,S.G.and Fraley,R.T.（1985）,Science 227:
1229−1231. Ito,H.Fukuda,Y.,Murata,K.and Kimura,A.（1983）,
J.Bacteriol.153:163−168. Kawamura,F.and Doi,R.H.（1984）,J.Bacteriol.160:
442−444. Kok,J.,Maat,J.,van der Vossen,J.P.B.M.and Venem
a,G.（1985）,EP−Ａ−0 157 441. Laemmli,U.K.（1970）,Nature 227:680−685. Ledeboer,A.M.,Maat,J.,Verrips,C.T.,Visser,C.,Jan
owicz,Z.A.and Hollenberg,C.P.（1984）,EP−Ａ−0 17
3 378. Ledeboer,A.M.,Edens,L.,Maat,J.,Visser,C.,Bos,J.
W.,Verrips,C.T.,Janowicz,Z.,Eckart,M.,Roggenkamp,
R.and Hollenberg,C.P.（1985）,Nucleic Acids Res.1
3:3063−3082. Lehrach,H.,Diamond,D.,Wozney,J.M.and Boedtker,H.
（1977）,Biochemistry 16:4743−4751. Liljestrm,P.L.（1985）,Nucleic Acids Res.13:72
57−7268. Liljestrm,P.L.and Liljestrm,P.（1987）,Nucle
ic Acids Res.15:2213−2221. Loewus,F.A.（1952）,Anal.Chem.24:219. Maniatis,T.,Fritsch,E.F.and Sambrook,J.（1982）,
Molecular Cloning.A laboratory manual,Cold Spring
Harbor Laboratory. Matteucci,M.D.and Caruthers,M.H.（1981）,J.Am.Ch
em.Soc.103:3185−3191. McCleary,B.V.（1983）,Phytochemistry 22:649−65
8. McCleary,B.V.,Critchley,P.and Bulpin,P.V.（198
4）,EP−Ａ−0 121 960. Meier,H.and Reid,J.S.G.（1982）,in“Encyclopedia
of Plant Physiology",New Series 13A,Loewus,F.A.an
d Tanner,W.（editors）,pp 418−471. Messing,J.,Crea,R.and Seeburg,P.H.（1981）,Nucle
ic Acids Res.９:309−321. Morris,D.L.（1948）,Science 107:254−255. Nogi,Y.and Fukasawa,T.（1983）,Nucleic Acids Re
s.11:8555−8568. Norrander,J.,Hempe,T.and Messing,J.（1983）,Gene
26:101−106. Proudfoot,N.J.and Brownlee,G.G.（1976）,Nature 2
63:211−214. Seiler,A.（1977）,Planta 134:209−221. Sumner−Smith,M.,Bozzato,R.P.,Skipper,N.,Davies,
R.W.and Hopper,J.E.（1985）,Gene 36:333−340. Tajima,M.,Nogi,Y.and Fukasawa,T.（1985）,Yeast
１:67−77. Taussig,R.and Carlson,M.（1983）,Nucleic Acids R
es.11:1943−1954. Tuite,M.F.,Dobson,M.J.,Roberts,N.A.,King,R.M.,Bu
rke,D.C.,Kingsman,S.M.and Kingsman,A.J.（1982）,EM
BOj.１:603−608. Vieira,J.and Messing,J.（1982）,Gene 19:259−26
8. Wyckoff,M.,Rodbard,D.and Chrambach,A.（1977）,An
al.Biochem.78:459−482. Yanisch−Perron,C.,Vieira,J.and Messing,J.（198
5）,Gene 33:103−119. Yarger,J.G.,Gorman,M.C.and Polazzi,J.（1985）,De
v.Ind.Microbiol.26:181−192. 使用した略号表 EP-A- 最初の優先権主張日または、優先権がない場
合は出願日から約18カ月後に公衆審査のために公開され
たヨーロツパ特許出願 pNPG ｐ−ニトロフエニル−α−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド ATP アデノシントリホスフエート dCTP デオキシシトシントリホスフエート TTP デオキシチミントリホスフエート GAPDH グリセルアルデヒド−３−ホスフエートデヒ
ドロゲナーゼ OD260 260nmにおける光学密度 SDS ドデシル硫酸ナトリウム HAc 酢酸 NaAc 酢酸ナトリウム Ｅ緩衝液 40mM Tris−HAc pH7.6,20mM NaAc,20mM ED
TA Ｏ緩衝液 10mM Tris−HCl pH7.5,1mM EDTA,EDTA,0.5
M NaCl,0.1ザルコシル STE緩衝液 100mM NaCl,10mM Tris−HCl pH7.5,1mM E
DTA MOPS ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸 MOPS緩衝液 0.02M MOPS,pH7.0,1mM EDTA SSC 150mM NaCl,15mMクエン酸ナトリウム YMM アミノ酸を含まない0.67％酵母窒素塩基と2.0％
グルコースを含む酵母最小培地 YPD培地 ２％グルコース,2％バクト−ペプトン（Dif
co）,1％酵母エキス（Difco） YPG培地 ２％ガラクトース,2％バクト−ペプトン（D
ifco）,1％酵母エキス（Difco） FDA染色 フルオレスセイン二酢酸塩染色 他の略号および種々の表現の意味は、Oliver,S.G.＆
Ward,J.M.:A dictionary of genetic engineering,Camb
ridge University Press,1985に記載されている。
pURY2703,pURY2705,pURY2705′およびpURY2706は、そ
れぞれpUR2703,pUR2705,pUR2705′およびpUR2706の同義
語である。
図面の説明 第１図 グアー種子の断面図 Ａ＝種皮 Ｂ＝糊粉細胞 Ｃ＝内乳 Ｄ＝子葉 Ｅ＝薄い内乳層 第２図 鋳型としてグアー種子の糊粉細胞から精製したRNAによ
るin vitro翻訳生成物の分析 酵母からのポリ−A RNAプレパレーシヨン（２μg;レ
ーンＡ）およびグアーからのポリ−A RNA（５μg;レー
ンB,C）を翻訳の鋳型として使用した。翻訳生成物を直
接（レーンA,B）またはα−ガラクトシダーゼ特異抗体
とインキユベーシヨン後（レーンＣ）、ゲルに適用し
た。14C標識蛋白質（Amersham）を分子量標準として用
いた（レーンＤ）。レーンＣの暴露は、−70℃で一夜暴
露した他のサンプルの場合より５倍長くした。
第３図 ペプチドのアミノ酸配列およびそれから誘導されるプロ
ーブのヌクレオチド配列 内部ペプチド（Ａ）とNH2末端配列（Ｂ）をアミノ酸
の一文字記号で示す。混合プローブのヌクレオチド配列
は、それから誘導したアミノ酸配列のすぐ下に示す。混
合位置の記号は、Ｕ＝ＡまたはG;V＝ＴまたはC;X＝A,G,
TまたはC;Y＝ＴまたはＧである。MP33は21マー（128
種）,MP42は14マー（16種）,MP43は14マー（８種）,MP4
4は41マー（128種）である。
第４図 グアーmRNAとオリゴヌクレオチドプローブMP33のノザン
法ハイブリダイゼーシヨン レーンA:グアー種子の糊粉細胞からの５μｇポリ−A
RNA レーンB:グアー種子の糊粉細胞からの５μｇ全RNA 最も厳格な洗浄は５×SSC0.1％SDS中35℃で実施し
た。
E.coliリボソームRNAを分子量標準とした。
第５図 プラスミドpUR2302の制限地図、サブクローンおよび配
列決定策略 A:プラスミドpUR2302の予備制限地図 B:M13ベクターM13mp18およびM13mp19にサブクローニ
ングしたpUR2302およびpUR2314のフラグメント C:pUR2302およびpUR2314の配列を確立するために用い
られる配列決定の詳細な計画。矢印は配列の方向づけを
示す。四角は、様々のオリゴヌクレオチドとの配列決定
反応のためのプライム部位を示す（U:共通M13プライマ
ー；数：配列決定実験のために合成したオリゴヌクレオ
チドプライマー）。下部の線は超らせん配列決定実験を
示す。
ｐ＝Pst I,K＝Kpn I,X＝Xmn I 第６図 グアーα−ガラクトシダーゼcDNAクローンpUR2302の全
ヌクレオチド配列 ５′−３′鎖のヌクレオチド配列を示す。
cDNAクローニング操作で合成されたポリdG/dC尾部を
５′側に示し（ヌクレオチド６〜20参照）、３′部位で
はdG/dC尾部がポリ−Ａ尾部の後に続く（示していな
い）。ポリアデニレーシヨン一致配列（Proudfoot ＆ B
rownlee,1976）は、ヌクレオチドの上に線で印をした。
ヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸配列は、ヌク
レオチド配列の上部に一文字記号で示す。アミノ酸の番
号は成熟蛋白質について＋１から始めた。プレ−プロ配
列におけるアミノ酸には負の番号を付した。
第７図 プラスミドpURY2703およびpURY2705の構築計画 数個のフラグメントの詳細な説明は例２に記述した。
使用した記号： 第８図 予め合成した個々の一本鎖オリゴヌクレオチドフラグ
メントは矢印の間の番号で示す。Ａ（GAPDHプロモータ
ー−成熟α−ガラクトシダーゼ）およびＢ（GAPDHプロ
モーター−インベルターゼシグナル配列−成熟α−ガラ
クトシダーゼ）中の同一番号は、用いた同一の一本鎖オ
リゴヌクレオチドに相当する。
制限酵素切断部位は完全二本鎖フラグメントの上に示
す。翻訳の開始および成熟α−ガラクトシダーゼの最初
の残基は二本鎖配列の下部にそれぞれMetおよびAla1で
示した。
第９図 プラスミドpURY2703の制限地図 GAPDHプロモーター中Bgl II部位含有フラグメントは
カツコ内にキロ塩基対で示したヌクレオチド番号の任意
の開始点である。Sal IとEcoR Iは例外として、制限部
位は消化および二重消化によつて確認された。
記号：第７図の説明参照。ほかに、AAA/TTT,GGG/CCC
はそれぞれdA/dTおよびdG/dC尾部を意味する。
第10図 プラスミドpURY2705K制限地図 GAPDHプロモーター中Bgl II部位はカツコ内にキロ塩
基対で示したヌクレオチド番号の任意の開始点である。
Sal IとEcoR Iは例外として、制限部位は消化および二
重消化によつて確認された。
記号：第９図の説明参照 第11図 pURY2703およびpURY2705を有するS.cerevisiaeのウエス
ターン法での解析 操作の詳細な説明は例２に記載した。
レーン1:グアーから精製したα−ガラクトシダーゼ4n
g レーン2:レーン１に同じ、1ng レーン3:pURY2705をもつ細胞の粗抽出液 レーン4:pURY2703をもつ細胞の粗抽出液 レーン5:プラスミドをもたない細胞の粗抽出液 第12図 プラスミドpUR2405の構築計画 詳細な説明は例５に記載した。使用した記号について
は第７図の説明を参照のこと。白い四角はプラスミドの
模式図中に示した場所のtrp−１遺伝子も意味し、また
酵母ベクターの２μｍオリジン（図に示した）を意味す
る。黒い四角は、suc2（インベルターゼ）シグナル配列
に代えて、図中に示したようにKARS2配列も意味する。
第13図 プラスミドpUR2601の構築計画 詳細な説明は第６図に記載する。pMS48およびpUR2601
中に存在するその部分について用いた記号は第13図中に
説明する。pURY2703およびpUR2601中に存在するその部
分について用いた記号は第７図の説明参照のこと 第14図 振盪フラスコ中で生育したpUR2405を有するB.subtilis
によるα−ガラクトシダーゼの製造 600nmにおける光学密度（OD 600）によつて示される
バイオマスの発生およびpNPGアツセイで定量した生育培
地1ml中に形成したα−ガラクトシダーゼ（Ｕ）を第14
図に示す。プロツトした値は、生育3,5,7および24時間
後に測定した。24時間後にOD600はZeissフオトスペクト
ロメーターで８単位の最大に達した。逆に、α−ガラク
トシダーゼ含量の最大値約0.1U/ml生育培地は、生育７
時間後に認められ、一方、生育24時間後にその含量は生
育培地1ml中わずか0.003Uに低下した。
第15図 pUR2405を有するB.subtilisのウエスターン法解析 操作の詳細な説明は例６に記載する。
レーン1:グアーから精製したα−ガラクトシダーゼ レーン2:pUR2405をもつ細胞の粗抽出液 レーン3:2に同じ レーン4:pUR2405をもつ細胞の生育培地 レーン5:4に同じ 第16図（16−１〜16−４） プラスミドpUR3510の構築計画 各工程の詳細な説明は例８に記載する。とくに指示の
ない限り、使用した記号は第７図に示した記号と同じで
ある。
第17図 pUR3510をもつH.polymorphaのウエスターン法解析 操作の詳細な説明は例８に記載する。
レーンA:H.polymorpha L1細胞の抽出液 レーンB:精製グアーα−ガラクトシダーゼ酵素（10n
g） レーンC:プラスミドpUR3510をもつH.polymorpha L1 第18図 プラスミドpUR2706およびpUR2730の製造計画 詳細な説明は例９に記載する。
第19図 植物発現ベクターpUR8001 各工程の詳細な説明は例11に記載する。とくに指示の
ない限り、使用した記号は第７図に示した記号と同じで
ある。
第20図 pUR8001で形質転換したタバコ植物および組織における
酵素アツセイ 各種植物細胞プレパレーシヨンの抽出液について、人
工基質４−メチルウムベリフエリル−α−Ｄ−ガラクト
ピラノシドを用いて、α−ガラクトシダーゼの存在を分
析した。
次に、α−ガラクトシダーゼをコードしたプラスミド
pUR8001で形質転換した細胞からのプレパレーシヨンに
ついて分析した。ベクターBin6をもつ細胞を対照として
用いた。詳細は例11を参照のこと。
第21図 pUR8001をもつNicotianaのウエスターン法での解析 操作の詳細は例11に説明する。
レーン1:発芽グアー内乳抽出物 レーン2:Bin6をもつカルス抽出物（対照） レーン3:pUR8001をもつカルス抽出物（C1） レーン4:pUR8001をもつカルス抽出物（F11） レーン5:pUR8001をもつカルス抽出物（B1） 矢印は分子量マーカーの位置を示す。上から下へ、92
Kd,68Kd,43Kdおよび25Kdである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｊ 8828−4Ｂ 1/16 Ｋ 8828−4Ｂ 1/19 8828−4Ｂ 1/20 Ｇ 8828−4Ｂ 5/10 15/09 (31)優先権主張番号 ８７１０１３９ (32)優先日 1987年４月29日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ８７１１０６１ (32)優先日 1987年５月11日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ８７００９５５．０ (32)優先日 1987年５月20日 (33)優先権主張国 欧州特許機構（ＥＰ） (31)優先権主張番号 ８７１２３１８ (32)優先日 1987年５月26日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 ヒューズ，スチーブン グリン イギリス国 エヌエヌ９ ６エイジェイ ノーザンツ，シェルベストン，ミドル フ ァーム ハウス （番地なし)

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】１−４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単位
    の主鎖に結合した１−６結合α−Ｄ−ガラクトピラノシ
    ル単位を切断除去することによりガラクトマンナンのガ
    ラクトース含量を低下させる能力を有し、グアー種子か
    らのα−ガラクトシダーゼに対して産生される抗体との
    免疫交叉陽性反応をウエスターン法により示し、好まし
    くは、実質的にβ−マンナーゼを含まないα−ガラクト
    シダーゼを製造する方法において、適当に形質転換した
    宿主生物を、培養中又は培養後誘導時のいずれかにα−
    ガラクトシダーゼが産生されるような条件下で培養し、
    ついでα−ガラクトシダーゼを回収する方法であって、
    前記形質転換宿主生物が （ａ）（ｉ）前記α−ガラクトシダーゼ又はその前駆体
    をコードするヌクレオチド配列（NS1）及び（ii）宿主
    生物中に前記α−ガラクトシダーゼ又はその前駆体をコ
    ードする前記ヌクレオチド配列（NS1）の発現をさせる
    １以上の追加のヌクレオチド配列（NS2）を含有する組
    換えベクター を前記宿主生物に導入することにより産生されるか又は （ｂ）前記（ａ）で産生された形質転換された宿主生物
    の子孫である、 方法。
  2. 【請求項２】α−ガラクトシダーゼは宿主生物から分泌
    され、ついでα−ガラクトシダーゼの回収は、発酵培地
    から細胞を除去し、所望により、次に、得られた培地を
    濃縮することにより行なわれる、特許請求の範囲第１項
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記α−ガラクトシダーゼをコードするヌ
    クレオチド配列は、 （ａ）ガラクトマンナンのガラクトース含量を低下させ
    る能力を有するα−ガラクトシダーゼをコードする天然
    のヌクレオチド配列、 （ｂ）グアー種子からのα−ガラクトシダーゼに対して
    産生される抗体と陽性免疫交差反応を示すα−ガラクト
    シダーゼをコードするヌクレオチド配列及び （ｃ）（ａ）又は（ｃ）のα−ガラクトシダーゼと同一
    であるか又は、ガラクトマンナンのガラクトース含量を
    低下させる能力を依然として有するその修飾体であるα
    −ガラクトシダーゼをコードする遺伝子操作ヌクレオチ
    ド配列 から成る群から選択される、特許請求の範囲第１項に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】ヌクレオチド配列が下記のアミノ酸配列か
    ら成る蛋白質をコードする、特許請求の範囲第１項に記
    載の方法：
  5. 【請求項５】ヌクレオチド配列が下記のヌクレオチド配
    列307−1398を含有し、これは前記アミノ酸配列１−364
    に相当するコドンである、特許請求の範囲第４項に記載
    の方法：
  6. 【請求項６】組換えベクターが、 （ａ）α−ガラクトシダーゼ又はその前駆体をコードす
    る二本鎖DNA（ds−DNA）、 （ｂ）（ａ）のds−DNAのプラス鎖の暗号領域の３′末
    端に結合する翻訳停止コドンと所望によりそれに続く選
    択した宿主生物に適した転写終結配列、 （ｃ）（ａ）のds−DNAのプラス鎖の上流に位置する、
    選択した宿主生物に適した発現レギュロン、 （ｄ）ds−DNAがα−ガラクトシダーゼの成熟型をコー
    ドし、その型がメチオニン残基で開始しない場合は、
    （ａ）のds−DNAのプラス鎖の暗号領域の５′末端に結
    合する翻訳開始ATG−トリプレット、 （ｅ）選択された宿主生物のゲノム中に（ａ）のds−DN
    Aの挿入を容易にするヌクレオチド配列及び／又は、選
    択された宿主生物に適当な複製のオリジン及び所望によ
    り選択マーカー及び （ｆ）所望によりα−ガラクトシダーゼの前駆体型の前
    駆体部分をコードするds−DNA を含有する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】宿主生物が植物又はその部分である、特許
    請求の範囲第１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】宿主生物が微生物である、特許請求の範囲
    第１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】宿主生物が、細菌、カビ及び酵母から成る
    群から選択される、特許請求の範囲第８項に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】宿主生物が、Saccharomyces、Kluyverom
    yces、Bacillus、Hansenula、Pichia、Aspergillus、So
    lanacea及びNicotianaから成る群から選択される、特許
    請求の範囲第１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】宿主生物が、Saccharomyces cerevisia
    e、Saccharomyces carlsbergensis、Kluyveromyces mar
    xianus変種（var.）lactis、Bacillus subtilis、Hanse
    nula polymorpha、Pichia pastoris及びNicotiana taba
    cumから成る群から選択される、特許請求の範囲第10項
    に記載の方法。
  12. 【請求項１２】１−４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単
    位の主鎖に結合した１−６結合α−Ｄ−ガラクトピラノ
    シル単位を切断除去することによりガラクトマンナンの
    ガラクトース含量を低下させる能力を有し、グアー種子
    からのα−ガラクトシダーゼに対して産生される抗体と
    の免疫交叉陽性反応をウエスターン法により示し、好ま
    しくは、実質的にβ−マンナーゼを含まないα−ガラク
    トシダーゼを製造できる形質転換宿主生物であって、前
    記形質転換宿主生物が、 （ａ）（ｉ）前記α−ガラクトシダーゼ又はその前駆体
    をコードするヌクレオチド配列（NS1）及び（ii）宿主
    生物中に前記α−ガラクトシダーゼ又はその前駆体をコ
    ードする前記ヌクレオチド配列（NS1）の発現をさせる
    １以上の追加のヌクレオチド配列（NS2） を含有する組換えベクターを前記宿主生物に導入するこ
    とにより産生されるか又は （ｂ）前記（ａ）で産生された形質転換された宿主生物
    の子孫である 形質転換宿主生物。
  13. 【請求項１３】宿主生物が植物又はその部分である、特
    許請求の範囲第12項に記載の形質転換宿主生物。
  14. 【請求項１４】宿主生物が微生物である、特許請求の範
    囲第12項に記載の形質転換宿主生物。
  15. 【請求項１５】宿主生物が、細菌、カビ及び酵母から成
    る群から選択される、特許請求の範囲第14項に記載の形
    質転換宿主生物。
  16. 【請求項１６】宿主生物が、Saccharomyces、Kluyverom
    yces、Bacillus、Hansenula、Pichia、Aspergillus、So
    lanacea及びNicotianaから成る群から選択される、特許
    請求の範囲第12項に記載の形質転換宿主生物。
  17. 【請求項１７】宿主生物が、Saccharomyces cerevisia
    e、Saccharomyces carlsbergensis、Kluyveromyces mar
    xianus変種（var.）lactis、Bacillus subtilis、Hanse
    nula polymorpha、Pichia pastoris及びNicotiana taba
    cumから成る群から選択される、特許請求の範囲第16項
    に記載の形質転換宿主生物。
JP62503901A 1986-06-03 1987-06-02 組換えＤＮＡ法により形質転換された宿主生物及び前記形質転換宿主生物からα―ガラクトシダーゼを製造する方法 Expired - Lifetime JPH082296B2 (ja)

Applications Claiming Priority (17)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP86200975 1986-06-03
EP86200975.0 1986-06-03
GB868630255A GB8630255D0 (en) 1986-12-18 1986-12-18 Alpha-galactosidase
GB868630719A GB8630719D0 (en) 1986-12-23 1986-12-23 Production of alphagalactosidase
GB878710139A GB8710139D0 (en) 1987-04-29 1987-04-29 Production of alphagalactosidase
GB878711061A GB8711061D0 (en) 1987-05-11 1987-05-11 Alpha-galactosidase
EP8700955.0 1987-05-20
EP87200955 1987-05-20
GB8700955.0 1987-05-26
GB86200975.0 1987-05-26
GB8710139 1987-05-26
GB8712318 1987-05-26
GB8630255 1987-05-26
GB8630719 1987-05-26
GB8711061 1987-05-26
GB878712318A GB8712318D0 (en) 1987-05-26 1987-05-26 Alpha-galactosidase
PCT/EP1987/000296 WO1987007641A1 (en) 1986-06-03 1987-06-02 Production of guar alpha-galactosidase by hosts transformed with recombinant dna methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH01500242A JPH01500242A (ja) 1989-02-02
JPH082296B2 true JPH082296B2 (ja) 1996-01-17

Family

ID=27561917

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62503901A Expired - Lifetime JPH082296B2 (ja) 1986-06-03 1987-06-02 組換えＤＮＡ法により形質転換された宿主生物及び前記形質転換宿主生物からα―ガラクトシダーゼを製造する方法

Country Status (9)

Country Link
US (2) US5082778A (ja)
JP (1) JPH082296B2 (ja)
KR (1) KR930010770B1 (ja)
AT (1) ATE117373T1 (ja)
AU (1) AU602703B2 (ja)
CA (1) CA1339101C (ja)
DE (1) DE3750998T2 (ja)
DK (1) DK55488D0 (ja)
WO (1) WO1987007641A1 (ja)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL80510A0 (en) * 1985-11-08 1987-02-27 Genetics Inst Improved yeast strains
US6846968B1 (en) * 1988-02-26 2005-01-25 Large Scale Biology Corporation Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression
US20040064855A1 (en) * 1988-02-26 2004-04-01 Large Scale Biology Corporation Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression
ATE196505T1 (de) * 1989-07-07 2000-10-15 Unilever Nv Verfahren zur herstellung eines proteins mittels eines durch mehrfachkopie-integrierung eines expressionsvektors tranformierten pilzes
US6004776A (en) * 1989-07-07 1999-12-21 Unilever Patent Holdings, B.V. Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector
WO1992013951A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
US5708141A (en) * 1992-05-11 1998-01-13 Corvas International, Inc. Neutrophil inhibitors
EP0682714A4 (en) * 1992-12-24 1997-06-11 Corvas Int Inc NEW NEUTROPHILIC INHIBITORS.
DK38893D0 (da) 1993-03-31 1993-03-31 Novo Nordisk As Dna
HUT73395A (en) * 1993-05-28 1996-07-29 Du Pont Process for preparing glyoxylic acid/dialkyl aminomethylphosphonate mixtures
US6329191B1 (en) * 1993-08-30 2001-12-11 Hawaii Biotechnology Group, Inc. DNA encoding recombinant coffee bean alpha-galactosidase
EP0721339A4 (en) * 1993-09-08 1997-05-21 New York Blood Center Inc ENZYME - (g) -GALACTOSIDASE RECOMBINANT AND DNA c? CODING THIS ENZYME
GB9320930D0 (en) * 1993-10-12 1993-12-01 Zeneca Ltd Modified fruit
AU4772596A (en) * 1995-01-30 1996-08-21 New York Blood Center, Inc., The Recombinant alpha-galactosidase enzyme
US6770468B1 (en) 1999-09-14 2004-08-03 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Phosphodiester-α-GlcNAcase of the lysosomal targeting pathway
US6642038B1 (en) 1999-09-14 2003-11-04 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. GlcNAc phosphotransferase of the lysosomal targeting pathway
DE19961182B4 (de) * 1999-12-18 2006-01-12 Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt Galactomannan-Oligosaccharide und Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
US7767415B2 (en) 2001-09-25 2010-08-03 Velico Medical, Inc. Compositions and methods for modifying blood cell carbohydrates
US6800472B2 (en) 2001-12-21 2004-10-05 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Expression of lysosomal hydrolase in cells expressing pro-N-acetylglucosamine-1-phosphodiester α-N-acetyl glucosimanidase
US20030124652A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-03 Novazyme Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing high mannose glycoproteins in complex carbohydrate deficient cells
US6905856B2 (en) * 2001-12-21 2005-06-14 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Soluble GlcNAc phosphotransferase
ES2351296B8 (es) * 2009-04-08 2012-07-03 Universidade Da Coruña Cepas de s. cerevisiae capaces de crecer en medios con melibiosa, estaquiosa y rafinosa.

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3122216A1 (de) * 1981-06-04 1982-12-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur herstellung eines mikroorganismus, welcher (alpha)-galactosidase, aber keine invertase bildet, so erhaltener mikroorganismus und seine verwendung
ATE42338T1 (de) * 1982-05-19 1989-05-15 Unilever Nv Hefe des genus kluyveromyces, modifiziert zur expression von preprothaumatin oder seinen verschiedenen allelischen und modifizierten formen oder maturationsformen.
US4548904A (en) * 1982-12-03 1985-10-22 Molecular Genetics Research & Development Protein sequencing method
NL8300698A (nl) * 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
DK147484A (da) * 1983-03-11 1984-09-12 Unilever Nv Oparbejdning af polysaccharider
NZ207925A (en) * 1983-04-25 1988-05-30 Genentech Inc Yeast expression vehicle consisting of a yeast promoter and signal peptide encoding region linked to a heterologus peptide coding region; expression and culture
WO1984004538A1 (fr) * 1983-05-19 1984-11-22 Unilever Nv Ameliorations apportees a l'expression de genes fraichement introduits dans des cellules de levure
NL8400687A (nl) * 1984-03-02 1985-10-01 Unilever Nv Recombinant plasmiden; recombinant plasmiden bevattende bacterien; werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een zuivelproduct; werkwijze voor het bereiden van een eiwit.
EP0423890A3 (en) * 1984-07-27 1991-07-03 Unilever Nv Use of oxidoreductases in bleaching and/or detergent compositions and their preparation by microorganisms engineered by recombinant dna technology
EP0174585A3 (en) * 1984-09-14 1987-12-23 Miles Laboratories, Inc. Promoters and the use thereof in the expression of unfused procaryotic or eucaryotic proteins in yeast
DK153568C (da) * 1985-02-12 1988-12-05 Novo Industri As Alfa-galactomannangalactosidase og middel indeholdende denne
FI861548A0 (fi) * 1986-04-11 1986-04-11 Alko Ab Oy Nya jaeststammar vari med gentekniska foerfaranden infoerts en -galaktosidasgen och foerfaranden foer industriellt utnyttjande av dylika jaeststammar.

Also Published As

Publication number Publication date
KR930010770B1 (ko) 1993-11-10
CA1339101C (en) 1997-07-29
US5296365A (en) 1994-03-22
DE3750998D1 (de) 1995-03-02
ATE117373T1 (de) 1995-02-15
JPH01500242A (ja) 1989-02-02
US5082778A (en) 1992-01-21
AU602703B2 (en) 1990-10-25
AU7513287A (en) 1988-01-11
WO1987007641A1 (en) 1987-12-17
DE3750998T2 (de) 1995-06-22
KR880701284A (ko) 1988-07-26
DK55488A (da) 1988-02-03
DK55488D0 (da) 1988-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH082296B2 (ja) 組換えＤＮＡ法により形質転換された宿主生物及び前記形質転換宿主生物からα―ガラクトシダーゼを製造する方法
ES2326705T3 (es) Produccion de enzimas lisosomicas en sistemas de expresion basados en plantas.
AU638248B2 (en) Potato alpha-amylase genes
JPWO1997002353A1 (ja) 組織特異的なプロモーター
JPWO1998029542A1 (ja) 花器特異的遺伝子およびそのプロモーター配列
PT97965B (pt) Processo para a preparacao de novos fragmentos peptidicos, de sequencias de dna que os codificam,de moleculas de dna que as contem e plantas transgenicas que compreendem tais moleculas
DE60030466T2 (de) Aspergillus niger beta-glukosidase gen, protein, sowie verwendungen derselben
EP0255153B1 (en) Production of guar alpha-galactosidase by hosts transformed by recombinant DNA methods
JPH06500237A (ja) β―１，３―グルカナーゼ活性を有する新規蛋白質をコードする組換えＤＮＡ、このＤＮＡを含む細菌、形質転換植物細胞および植物
US5789657A (en) Potato α-amylase genes
US5446138A (en) Recombinant DNA coding for a protein with endochitinase activity
US6222097B1 (en) Use of ovary-tissue transcriptional factors for altering plant color
US6268546B1 (en) Ovary-tissue transcriptional factors
RU2198219C2 (ru) ФРАГМЕНТ ДНК, ПОЛУЧАЕМЫЙ ИЗ Arabidopsis thaliana, ЕГО СУБФРАГМЕНТ ИЛИ КОМБИНАЦИЯ СУБФРАГМЕНТОВ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ХИМЕРНОЙ ДНК И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ, РЕПЛИКОН (ВАРИАНТЫ)
CA2067176C (en) Recombinant gene coding for a protein having an endochitinase activity
JP2002209462A (ja) トランスジェニック植物種子におけるタンパク質産生
US7700358B2 (en) Coffee mannanase
Xu Isolation and characterization of a triosephosphate isomerase gene and a root-specific gene from rice, and analysis of their regulatory sequences in transgenic tobacco and rice
MXPA97007112A (en) Endo-beta-1,4-glucanase from aspergil
AU2010230078A1 (en) A Method for the Production of a Human Protein in a Plant, in Particular a Human Re-Combinant Lysosomal Enzyme in a Cereal Endosperm