JPH082299B2

JPH082299B2 - コラゲナ−ゼ▲ｉ▼及び▲ｉｉ▼の製造法

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Publication number: JPH082299B2
Application number: JP62053766A
Authority: JP
Inventors: 章遠藤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-03-09
Filing date: 1987-03-09
Publication date: 1996-01-17
Anticipated expiration: 2011-01-17
Also published as: JPS63219375A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はコラゲナーゼの製造法に関し、更に詳細には
ストレプトミセス属に属するコラゲナーゼ生産菌を利用
するコラゲナーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

動物の結合組織を構成するコラーゲンは基本単位とし
て、それぞれ95,000の分子量をもつ３本のポリペプチド
鎖から成り、三重らせん構造をとつている。コラーゲン
特有のこのヘリツクス構造は通常のプロテイナーゼに対
して抵抗性を示し、コラゲナーゼによつてのみ作用を受
ける。

コラーゲンを加水分解する動物由来のコラゲナーゼは
おたまじやくしや哺乳動物の組織培養で認められ、特に
後者の酵素はある種の病変、例えば角膜潰瘍、変形関節
炎、歯根膜炎あるいは腫瘍などと関係づけられ注目され
ている。その一方で、現在まで40種類以上の微生物の生
産するコラゲナーゼが発見されているが、精製されたも
のは少ない。嫌気性病原菌のClostridium histolyticu
m,病原性通性嫌気性好塩菌のAchromobacter iophagus
（Vibrio arginolyticus）などからコラゲナーゼが単離
されている。最近になつて、C.histolyticumコラゲナー
ゼは６種類存在すると報告された。

コラゲナーゼは動物組織の細胞分散などの生化学試薬
として利用されているだけでなく、最近では椎間板ヘル
ニアの治療など臨床領域においても、需要性が非常に増
大しつつある。しかし、入手し得るコラゲナーゼは、C.
histolyticumやA.iophagusなどより調製した病原性細菌
由来の限られた標品だけである。しかし、コラゲナーゼ
を量産および臨床利用するためには好気性、非病原性生
物のコラゲナーゼが必要である。

先に本発明者は微生物の生産するコラゲナーゼを臨床
応用するために、土壌より好気的条件下で菌体外にコラ
ゲナーゼを生産する微生物を検索し、Streptomyces sp.
C−51株（微工研条寄第710号）が強いコラゲナーゼ生産
能を有することを見出した（特開昭60−188066号）。さ
らにStreptomyces sp.C−51株の生産するコラゲナーゼ
は培養上清液より限外過濃縮、硫安塩析DEAE−TOYOPE
ARL.DEAE−Cellulofineのカラムクロマトグラフイー、
電気泳動により精製され、２つの活性画分を得た。これ
らコラゲナーゼは未変性コラーゲンおよび変性コラーゲ
ンに対して作用するがカゼインを分解しなかつた。ま
た、反応の至適pHおよび温度、pHおよび温度安定性、ア
ミノ酸組成、各種阻害剤の影響および抗原特異性に関し
て両者に顕著な差は認められなかつた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、これらコラゲナーゼは、優れたコラー
ゲン分解能を有するものの従来の培養法においてはその
生産性が不十分であり、２つの活性画分も各々十分に精
製されたものは得られていない。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者は前記コラゲナーゼの２つの活性画
分（以下コラゲナーゼＩおよびIIと記す）を各々高収率
で製造すべく種々検討したことろ、ストレプトミセス属
に属するコラゲナーゼ生産菌を用い、一定の培養条件で
培養すれば目的が達成されることを見い出し、本発明を
完成した。

すなわち本発明は、ストレプトミセス属に属するコラ
ゲナーゼ生産菌を、炭素源を含有せず、かつゼラチン、
ゼラチンの酵素分解物又はハイドパウダーを含有する培
地で培養し、その培養物からコラゲナーゼＩを採取する
ことを特徴とするコラゲナーゼＩの製造法を提供するも
のである。

また、本発明は、ストレプトミセス属に属するコラゲ
ナーゼ生産菌を、炭素源を含有せず、かつゼラチン、ゼ
ラチンの酵素分解物又はハイドパウダーを含有する培地
で培養し、その培養物からコラゲナーゼIIを採取するこ
とを特徴とするコラゲナーゼIIの製造法を提供するもの
である。

更に、本発明は、ストレプトミセス属に属するコラゲ
ナーゼ生産菌を、炭素源を含有せず、かつゼラチン、ゼ
ラチンの酵素分解物又はハイドパウダーを含有する培地
で培養し、その培養物をpH8未満でインキュベートする
ことによりコラゲナーゼＩをコラゲナーゼIIに変換せし
めることを特徴とするコラゲナーゼIIの製造法を提供す
るものである。

本発明を実施するには、例えばストレプトミセス属に
属するコラゲナーゼ生産菌を栄養源培地上に好気的に培
養し、培養物中に蓄積したコラゲナーゼＩ及びIIを種々
の手段により採取することにより行なわれる。

以下に本発明の実施様態とともに本発明を詳細に説明
する。

Ｉ材料および方法Ｉ−１使用菌株および培養方法菌株は遠藤らによつて土壌より分離されたコラゲナー
ゼ生産株Streptomyces sp.C−51（微工研条寄第710号，
特開昭60−188066号）を用いた。

表１に示した組成（１）の培地100mlを入れた500ml容
坂口フラスコにStreptomyces sp.C−51株を１白金耳植
菌し、30℃で４日間振盪培養した。これを種培養として
表１に示した組成（２）の培地で各種炭素源・窒素源を
加えた培地100mlを入れた500ml容坂口フラスコに５％植
菌し、さらに30℃、20時間振盪培養した。

ここで使用した炭素源または窒素源は、グリセリン
（国産化学）、カザミノ酸（日水製薬）、ポリペプトン
（大五栄養化学）、ゼラチンの酸加水分解物である水溶
性ゼラチンU,H−タイプ（ニツタゼラチン）、ゼラチン
の酵素分解物であるハイマージユＨ−1000P（住友化学
工業）、フラミツクス−EB、フラミツクス−Ｐ（日本化
薬）、ゼラチン（国産化学）、ハイドパウダー（Hide p
owder）（都立皮革技術センター、長南康正氏より恵
与）。

また表１に示した組成（２）の培地で、炭素源・窒素
源としてグルコース、グルコースとゼラチン、グリセリ
ンとゼラチンとを各0.5％ずつ添加した培地で同様に培
養した。

同様に種培養として表１に示した組成（３）の培地を
用い、本培養に組成（４）の培地を用いた。

また、この組成（４）を用いた本培養の培養経過中に
クロラムフエニコール（和光純薬工業）を添加し、さら
に30℃でインキユベートした。

Ｉ−２酵素活性測定法Ｉ−２−１コラゲナーゼ活性測定法天然基質として不溶性コラーゲン、酸可溶性コラーゲ
ン、ゼラチン、アゾコールを用い、合成基質としてPZ−
PLGPR（ｐ−phenylazoben−zyloxycarbonyl−Pro−Leu
−Gly−Pro−Ｄ−Arg）,Z−GPLGP（benzyloxycarbonyl
−Gly−Pro−Leu−Gly−Pro）,Z−GPGGPA（benzyloxyca
rbonyl−Gly−Pro−Gly−Gly−Pro−Ala）を用いて活性
測定した。また合成基質を用いた場合には速度定数も求
めた。

（１）不溶性コラーゲン基質として80メツシユ（0.177mm）以下にそろえた不
溶性コラーゲン（牛アキレス腱由来のコラーゲンタイ
プI,シグマ）を用いてPeterkofskyの方法〔Methods Enz
yrmol.,82、453−471（1982）〕に従つてpH7.6、37℃で
反応させ、遊離した酸可溶性タンパク質をE.F.Hartree
の方法〔Anal.Biochem.,48、422−427（1972）〕または
ニンヒドリン法によつて定量した。

基質溶液は50mM Tris−塩酸緩衝液、pH7.6、5mM塩化
カルシウムを用いて不溶性コラーゲンを最終濃度２％に
なるように調製した。

この基質溶液100μｌに酵素溶液100μｌを加えて37℃
でインキユベートし、反応停止は0.1M酢酸400μｌ添加
することで行なつた。反応終了後、15,000r.p.m.,15分
間の遠心分離を行ない、上清について牛血清アルブミン
を標準としたE.F.Hartreeの方法またはＬ−ロイシンを
標準としたニンヒドリン法によりタンパク質量を測定し
た。

酵素単位は、pH7.6、30℃で１分間に１μmolの酸可溶
性タンパク質を遊離する酵素量を１単位（Ｕ）とした。

（２）酸可溶性コラーゲン基質として酸可溶性牛皮膚コラーゲンタイプIII（シ
グマ）を用いてE.Yoshida,H.Nodaの方法〔Biochem.Biop
hys.Acta 105,562−574（1965）〕に従つて、pH7.6、30
℃で反応を行ない遊離したアミノ基末端アミノ酸残基を
ニンヒドリン法によつて定量した。

基質溶液は10mM酢酸を用いて酸可溶性コラーゲンを最
終濃度0.15％になるように調製した。

この基質溶液0.3mlに0.15M Tris−塩酸緩衝液pH7.6、
1.5M塩化カルシウム0.2mlと酵素溶液0.1mlを加えて30℃
でインキユベートし、反応停止は0.1N塩酸2ml添加する
ことで行なつた。反応終了後、遊離したアミノ基末端ア
ミノ酸残基を同様にニンヒドリン法で定量した。

酵素単位はpH7.6、30℃で１分間に１μmolのロイシン
相当量のアミノ基末端アミノ酸残基を遊離させる酵素量
を１単位（Ｕ）とした。

（３）アゾコール基質としてアゾコール（シグマ）を用いてPeterkofsk
yの方法に従つてpH7.6、37℃で反応させ、遊離したアゾ
色素を530nmの吸光度で定量した。

基質溶液は50mM Tris−塩酸緩衝液pH7.6、5mM塩化カ
ルシウムを用いてアゾコールを最終濃度0.6％になるよ
うに調製した。

この基質溶液250μｌに62.5mM N−エチルマレイミド2
0μｌと酵素溶液230μｌを加えて37℃でインッキユベー
トし、反応停止は10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）
500μｌ添加することで行なつた。反応終了後1.000×
ｇ、５分間遠心分離を行ない、上清について430nmの吸
光度を測定した。

酵素単位はpH7.6、37℃で１分間に１μmolのアゾ色素
を遊離させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。

（４）ゼラチン基質として牛皮ゼラチンタイプIV約60ブルーム（シグ
マ）を用いて、不溶性コラーゲン基質同様に、pH7.6、3
7℃で反応を行ない、遊離したアミノ基末端アミノ酸残
基を酸可溶性コラーゲン基質同様に定量した。

（５） PZ−PLGPR 合成基質としてPZ−PLGPR（ベーリンガーマンハイ
ム）を用い、Ｗnsch,E.,H.G.Heidrichの方法〔Physio
l.Chem.,333,149−151（1963）〕に従つてpH8.0、37℃
で反応させ遊離したPZ−PLを320nmの吸光度より定量し
た。

基質溶液は50mM Tris−塩酸緩衝液pH8.0、4mM塩化カル
シウムを用いてPZ−PLGPRを最終濃度1mMになるように調
製した。

この基質溶液100μｌに酵素溶液100μｌを加えて37℃
でインキユベートし反応停止は0.5％クエン酸400μｌ添
加することで行なつた。反応終了後、酢酸エチル2mlを
加えて抽出し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱
水後320nmでの吸光度を測定した。

酵素単位は１μmolの基質を１分間で分解する酵素量
を１単位（Ｕ）とした。

（６）Ｚ−GPLGPおよびＺ−GPGGPA 合成基質として、Ｚ−GPLGPおよびＺ−GPGGPA（ペプ
チド研究所）を用い、前者はY.Nagaiらの方法〔Bioche
m.Biophys.Acta,37,567（1960）〕に従い、後者はGraβ
mann.W.,Nordwig,A.,の方法〔Physiol.Chem.,322,267
（1960）〕に従つて行なつた。

基質溶液は25mM Tris−塩酸緩衝液、pH8.0、4mM塩化
カルシウムを用いて調製した。

この基質溶液0.1mlに酵素溶液0.1mlを加えて、Ｚ−GP
LGPの場合には37℃、Ｚ−GPGGPAの場合には25℃でイン
キユベートし、反応停止は0.2N塩酸0.2mlで行なつた。
反応終了後、遊離したアミノ基末端アミノ酸残基をＬ−
ロイシンを標準としたニンドリン法によつて定量した。

酵素単位はpH8.0、25℃あるいは37℃で１分間に１μm
olのアミノ基末端アミノ酸残基を遊離させる酵素量を１
単位（Ｕ）とした。

Ｉ−２−２カゼイン分解活性測定法基質としてカゼイン（Casein nach HAMMARSTEN,メル
ク）を用いてE.Yoshida.H.Nodaの方法に従つて行なつ
た。基質のカゼインとpH7.8、30℃で反応して遊離した
酸可溶性チロシン残基を273nmで定量した。

0.1M Tris−塩酸緩衝液、pH7.8で調製した0.6％カゼ
イン4mlと試料溶液0.5mlを混合し、37℃で反応させた。
反応は10％トリクロロ酢酸で停止した。反応終了後、
過し、過液の273nmの吸光度を測定した。

Ｉ−２−３トリプン様酵素活性測定基質としてＮ_α−ベイゾイル−Ｌ−アルギニンｐ−
ニトロアニリド（Ｌ−BAPAN,シグマ）を用いてG.Reinha
rd,F.Hansの方法〔Methods Enzym.Anal.（3rd.Ed）5,11
9−129（1984）に従つてトリプシン様アミダーゼ活性を
測定した。

基質Ｌ−BAPANを用いてpH7.8、25℃で反応させ、遊離
したｐ−ニトロアニリンを405nmの吸光度により定量し
た。

トリエタノールアミン溶液（0.2Mトリエタノールアミ
ン,pH7.8、20mM Ca²⁺）0.75mlと試料溶液0.05mlを混合
し、５分間放置した。その溶液にトリエタノールアミン
溶液で調製した4mM L−BAPNA0.20mlを加え、25℃、10分
間、405nmの吸光度の増加を測定した。

Ｉ−３精製方法Ｉ−３−１培養Ｉ−１の項同様に表１に示した組成（３）の培地を用
いて種培養を行ない表１に示した組成（４）の培地20l
を入れた30l容ジヤーフアーメンター（TS−Ｎ型培養装
置、高杉製作所）に植菌し、30℃、通気量20l/min、撹
拌回転数250r.p.mの条件下で20時間培養を行なつた。

Ｉ−３−２限外過濃縮 30l容ジヤーフアーメンターで20時間培養して得た培
養液について図１に示したように精製を進めた。操作は
全て４℃で行なつた。

まず、その培養液を過して培養上清液を限外過
（UF）モジユールAIL−1010、分画分子量10,000（旭化
成）を用いて限外過濃縮した。

Ｉ−３−３硫酸アンモニウムによる塩析前項で得た濃縮液よりコラゲナーゼ活性画分である硫
酸アンモニウム35−75％飽和沈澱物を得た。

濃縮液に硫酸アンモニウムを35％飽和になるように加
え、その沈澱物を遠心分離によつて除去した。その上清
液に硫酸アンモニウムを75％飽和になるように加えた。
その沈澱物を遠心分離によつて取り、5mM Tris−塩酸緩
衝液、pH7.6、1mM塩化カルシウムに溶解し、同緩衝液で
透析した。

Ｉ−３−４ DEAE−トヨパール650Mカラムによる陰イオ
ン交換クロマトグラフイー弱塩基性陰イオン交換体DEAE−トヨパール650M〔C
l^-〕（東洋曹達工業）をカラムサイズ4.0×13cmに5mM T
ris−塩酸緩衝液、pH7.6、1mM塩化カルシウムで充填し
た。これに前項で得た全量を吸着させ、同緩衝液で洗浄
した後、同緩衝液に0.2、0.3、1M塩化ナトリウムを加え
た溶液で段階的で流速380ml/h（30.5ml/h・cm²）で溶出
し、20ml/tubeで分画した。

これより得たコラゲナーゼ活性の高い画分をダイアフ
ローメンブランフイルターYM−10、分画分子量10,000
（アミコン）によつて限外過濃縮した。

Ｉ−３−５セルロフアインGC−200−ｍカラムによる
ゲル過分画範囲（分子量）10,000−120,000のセルロフアイ
ンGC−200−ｍ（生化学工業）をカラムサイズ1.9×95cm
に20mM MOPS−水酸化ナトリウム緩衝液、pH7.6、4mM塩
化カルシウム、0.2M塩化ナトリウムで充填した。前項で
得た全量について同緩衝液で流速13.7ml/h（4.8ml/h・c
m²）で溶出し、15ml/tubeで分画した。これより得たコ
ラゲナーゼ活性の高い画分をダイアフローメンブランフ
イルターYM−10により限外過濃縮し、50mM Tris−塩
酸緩衝液、pH8.0、4mM塩化カルシウムで透析した。

Ｉ−３−６ Mono Q HR5/5カラムによる陰イオン交換ク
ロマトグラフイ− 前項で得た粗精製物をFPLC（Fast Protein,Polypepti
de,Polynucleotide,Liquid Chromatography）システム
を用いて、強塩基性陰イオン交換体Mono Q HR5/5カラム
（フアルマシア）に50mM Tris−塩酸緩衝液、pH8.0、4m
M塩化カルシウムで吸着、洗浄した。その後、同緩衝液
に35mM塩化ナトリウムを加えた溶液によつて、流速0.5m
l/minで溶出し、0.5ml/tubeで分画した。この操作のみ2
0℃で行なつた。これより得た２つの活性画分をそれぞ
れ４℃でダイアフローメンブランフイルターYM−10で限
外過濃縮し、5mM MOPS−水酸化ナトリウム緩衝液、pH
7.6、1mM塩化カルシウムで透析した。

Ｉ−４タンパク質の定量 Lowry,O.H.らの方法に従つてタンパク質量を測定し
た。標準タンパク質として牛血清アルブミンを用いた。

Ｉ−５電気泳動Ｉ−５−１ポリアクリルアミドゲル電気泳動ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）はB.J.Davi
sの方法〔Ann.N.Y.Acad.Sci.,121,404（1964）〕により
行なつた。ゲルは2mm厚のスラブゲルとし、分離ゲルはp
H9.5、アクリルアミド濃度7.0％に調製した。泳動は４
℃で行なつた。ゲルの染色はコマジーブリリアントブル
ーR250（半井化学薬品）によるタンパク質染色または過
ヨウ素酸−フクシン試薬による糖質染色（PAS染色）で
行なつた。

また、APGEを行なつた試料のコラゲナーゼ活性および
タンパク質量を定量するためには以下の操作を行なつ
た。

APGEを行なつたゲルを取り出し、２−3mm間隔で切り
出し、50mM Tris−塩酸緩衝液、pH7.6、4mM塩化カルシ
ウム400μｌによつて切り出したゲル切片から抽出し、
その抽出液について、合成基質PZ−PLGPRを用いたコラ
ゲナーゼ活性測定を行なつた。

また、タンパク質を定量するためにコマジーブリリア
ントブルーによつてゲルを染色し、デンシトメーター、
島津クロマトスキヤナCS−930（島津製作所）を用いて
染色したゲルの570nmの吸光度を測定した。

Ｉ−５−２ SDS−ポリアクリルアミド電気泳動 SDS−ポリアクリルアミド電気泳動はDavisの方法によ
つて行なつた。ゲルは1mm厚のスラブゲルを用い、分離
ゲルのポリアクリルアミド濃度は8.5％に調製した。

SDS−PAGEによる分子量測定はミオシン（205KDa）、
βーガラクトシダーゼ（116KDa）、ホスホリラーゼＢ
（97KDa）、牛血清アルブミン（66KDa）、オブアルブミ
ン（45KDa）、炭酸デヒドロゲナーゼ（29KDa）を含む分
子量マーカー（シグマ）の相対的移動度から計算して行
なつた。ゲルはコマジーブリリアントブルーで染色し
た。

また、SDS−PAGEを用いて試料のゼラチン分解活性の
分析をC.Heussen,E.B.Dowdleの方法〔Anal.Biochem.,10
2,196−202（1980）〕に従つて行なつた。分離ゲルは、
0.1％ゼラチンを含む8.5％ポリアクリルアミドゲルに調
製した。４℃で泳動後、取り出したゲルを室温、１時間
2.5％トライトンＸ−100中で振盪し、SDSを除去し、0.1
M Tris−塩酸緩衝液、pH7.6、4mM塩化カルシウム中、37
℃、３〜４時間インキユベートした。そのゲルをコマジ
ーブリリアントブルーで染色した。

Ｉ−６アミノ酸分析アミノ酸分析は、自動アミノ酸分析機（Hitachi Mode
l 835amino acid analyzer,833A data processor）を用
いて行なつた。

試料タンパク質は真空下で0.2％フエノールを含む6N
塩酸で110℃、24時間加水分解して調製した。

この分析方法では、システイン、トリプトフアンは検
出できず、アスパラギン、グルタミンはアスパラギン
酸、グルタミン酸として定量した。

Ｉ−７免疫化学実験部分精製したコラゲナーゼ（セルロフアインGC−200
−ｍカラムクロマトグラフイーによる活性画分）200μg
protein/mlと同量の（フロイントの完全アジユバイド
（デイフコ）を混合し、その1mlを3kgウサギ（♂）の背
部皮下に注射した。

１週間おきに３回注射し、最後の注射後、２週間で血
清を分離し、−20℃で保存した。

抗原として、Streptomyces sp.C−51株のコラゲナー
ゼとC.histolyticum（シグマ）およびA.iophagus（ベー
リンガーマンハイム）を用いてオクタロニー法で行な
つた。

以上の材料および方法を用いることによつてコラゲナ
ーゼＩ及びIIを製造することができるが、次に最適培養
条件及び精製方法を検討した。

II 培養条件の検討従来、Streptomyces sp.C−51株のコラゲナーゼを生
産させる培地として、ゼラチン0.3％、ペプトン1.0％、
酵母エキス0.2％、リン酸水素二ナトリウム0.2％、炭酸
ソトリウム0.25％、硫酸マグネシウム0.04％を用いてい
た。

この従来の生産培地を用いたときよりも、より高いコ
ラゲナーゼ活性を得るための条件を検討するため、以下
の実験を行なつた。

II−１炭素源および窒素源の検討コラゲナーゼ生産に対する炭素源、窒素源の影響を調
べた。

表１に示した組成（２）の培地に各種炭素源、窒素源
を0.5％添加し、30℃、20時間培養したときのコラゲナ
ーゼ生産の変化を表２に示した。この結果のコラゲナー
ゼ活性は基質としてPZ−PLGPRを用いた測定方法より求
めた。

この結果より、炭素源よりも窒素源を添加した場合の
ほうがコラゲナーゼ活性が高かつた。特にゼラチン、ゼ
ラチン酵素分解物又はハイドパウダー添加した場合に最
もコラゲナーゼ活性が高く、従来の生産培地を用いた場
合よりも５−10倍のコラゲナーゼ活性が得られた。

次の炭素源のコラゲナーゼ活性の誘導について検討し
た（図２）。その結果、グルコースよりもグリセリンを
添加したほうがコラゲナーゼ活性がより高く誘導された
が、これら炭素源を添加せずにゼラチンのみを培地に添
加したときのほうがコラゲナーゼ活性が高かつた（表
２）。

このことから、炭素源、特にグルコースはコラゲナー
ゼ生産を抑制し、著しく遅らせることがわかつた。

以上より、コラゲナーゼ生産のために使用する培地
は、炭素能を添加せず、ゼラチン、ゼラチン酵素分解物
又はハイドパウダーを添加した培地が特に好ましい。ま
た炭素源、特にグリセリンを添加した培地ではコラゲナ
ーゼ生産能は低くなるが菌体量の増加が高かつたので、
種培養のために使用する培地は、ゼラチン、ゼラチン酵
素分解物又はハイドパウダーとグリセリンを添加した培
地が好ましい。

II−２ゼラチンまたはゼラチン酵素分解物（フラミツ
クスＰ）によるコラゲナーゼ誘導培地に添加するゼラチン、フラミツクスＰの濃度変化
によるコラゲナーゼ生産能への影響を検討した（図３
（１）および（２））。ゼラチンまたはフラミツクスＰ
を0.3あるいは0.5％添加した培地（表１（４））で培養
し、そのときのコラゲナーゼ活性、カゼイン分解活性、
トリプトシン様アミダーゼ活性の変化を調べた。

その結果、コラゲナーゼ活性について従来の生産培地
を用いた培養とほとんど変化のない培養20時間前後に最
大に達し、わずかにゼラチンよりもフラミツクスＰを添
加したときのほうが高く誘導されたが、ゼラチンとフラ
ミツクスＰの添加濃度によるコラゲナーゼ誘導の変化は
ほとんどなかつた。それに対し、カゼイン分解活性は、
培養経過とともに増加し、ゼラチンまたはフラミツクス
Ｐを0.3％より0.5％添加した培地のほうが多く生産され
た。また、トリプトシン様アミダーゼ活性は、どの場合
にでもほとんど生産されなかつた。

以上の結果より、最も好ましい培養条件は非特異的蛋
白分解酵素活性が低い、コラゲナーゼ活性を高く誘導す
る条件は表１に示した組成（４）の培地でゼラチンまた
はフラミツクスＰを0.3％添加した培地で、培養時間20
時間であることがわかつた。

また、このゼラチン、フラミツクスＰを0.3％添加し
た培地で培養し、12、20、28時間培養した培養上清から
硫安35−75％飽和画分を得て、30mM Tris−塩酸緩衝液p
H7.6、1mM塩化カルシウムに溶解、透析後PAGEによるタ
ンパク質の分析を行なつた（図４）。図４のレーン１〜
３はゼラチン添加培地で12、20、28時間培養した結果で
レーン４〜６はフラミツクスＰ添加培地で12、20、28時
間培養した硫安分画物の結果である。

この結果より、ゼラチン、フラミツクスＰのどちらを
添加した場合にも培養12時間ではコラゲナーゼＩが生産
されているが、コラゲナーゼIIは生産されず、さらに培
養を続けると、コラゲナーゼIIの生産が観察された。ま
たコラゲナーゼ活性が最大に達する培養20時間でコラゲ
ナーゼＩおよびIIの生産量も最大となつていることがわ
かつた。これによりコラゲナーゼＩとIIは、培養時間を
コントロールすることにより各々を選択的に採取でき
る。

II−３クロラムフエニコールのコラゲナーゼ生産への
効果いろいろな培養時期に添加したクロラムフエニコール
のコラゲナーゼ生産に対する影響を調べるために、次の
操作を行なつた。

Streptomyces sp.C−51株を表１のフラミツクスP0.3
％添加した組成（４）の培地で培養し、培養０、８、1
2、20時間後にそれぞれクロラムフエニコールをStrepto
myces sp。Ｃ−51株最小致死量（５μg/ml）添加し、さ
らに30℃でインキユベートを行ない、それらの培養液に
ついて、基質としてPZ−PLGPRを用いるコラゲナーゼ活
性測定を行なつた（図５）。

図４よりStreptomyces sp。Ｃ−51株のコラゲナーゼ
はゼラチンやフラミツクスＰによつて誘導されることが
わかつたが、図５の結果よりタンパク質合成阻害剤のク
ロラムフエニコールの処理によつてStreptomyces sp.C
−51株のコラゲナーゼの生産が止められることがわかつ
た。

図５において12時間培養した培養液と培養12時間後に
クロラムフエニコール５μg/mlを添加し、さらに30℃、
８時間インキユベートした培養液から硫安35−75％飽和
画分を得た。その分画物についてＩ−５−１の項に従
い、コラゲナーゼＩおよびIIの活性量、タンパク質量の
分析を行なつた（図6A,6B）。

図４同様に培養12時間ではコラゲナーゼＩは生産され
ているが、コラゲナーゼIIはほとんど生産されていない
ことがわかつた（図6A）。これに比べ、培養12時間後に
クロラムフエニコール添加して、８時間インキユベート
するとコラゲナーゼＩは減少し、コラゲナーゼIIは増加
することがわかつた（図6B）。

また、PAGEによるコラゲナーゼIIの活性量およびタン
パク質量の変化を定量した結果クロラムフエニコール添
加して８時間後、コラゲナーゼIIはタンパク質量、活性
具ともに約２倍に増加していることがわかつた。

従つて、クロラムフエニコールを添加して培養を行な
うことがコラゲナーゼＩ又はIIを選択的に採取するのに
特に好ましいものである。

III 精製方法従来のコラゲナーゼの精製方法は従来の生産培地で培
養した培養上清液より、限外過濃縮、硫安塩析、DEAE
−トヨパールとDEAE−セルロフアインカラムクロマトグ
ラフイーおよび電気泳動により行なうものであつた。

しかし、生産培地の変更など培養条件が変わつたこと
より従来の方法では精製ができなくなつたので、最終的
に電気泳動を用いない精製方法の改良および検討を行な
つた。

その結果、表１の0.3％フラミツクスＰ添加した組成
（４）の培地を用いて培養した培養上清液36lから図１
の精製方法を用いて最終的に精製度138倍、回収率18％
でコラゲナーゼＩおよびIIが得られた（表３）。

次に各精製過程の結果を示す。

培養上清液36lを限外過濃縮によつて630mlにまで濃
縮した。これより塩析により硫安35〜75％飽和画分を得
た。その硫安分画物を透析後、5mM Tris−塩酸緩衝液pH
7.6、1mM塩化カルシウムで平衡化したDEAE−トヨパール
650Mのカラム（4.0×13cm）に吸着させた。そのカラム
を同緩衝液で洗浄後、同緩衝液に塩化ナトリウム0.2、
0.3、1M加えた緩衝液で展開し、溶出液を20ml/tubeで分
画した（図７）。この活性画分（フラクシヨンNo27−3
4）160mlが得られ、限外過濃縮により11.8mlに濃縮し
た。

この濃縮液を20mM MOPS−水酸化ナトリウム緩衝液、p
H7.6、4mM塩化カルシウム、0.2M塩化アントリウムで平
衡化したセルロフアインGC−200−ｍのカラム（1.9×95
cm）にのせ、同緩衝液で展開し溶出液を15ml/tubeで分
画した（図８）。この活性画分（フラクシヨンNo22−4
6）375mlを限外過濃縮により5.1mlに濃縮し、50mM Tr
is−塩酸緩衝液、pH8.0、4mM塩化カルシウムで透析し
た。

この活性画分を50mM Tris−塩酸緩衝液、pH8.0、4mM
塩化カルシウムで洗浄したMono Q HR5/5のカラム（0.5
×5cm）に吸着させた。そのカラムを同緩衝液で洗浄
後、同緩衝液に35mM塩化ナトリウムを加えた緩衝液で展
開し溶出液を0.5ml/tubeで分画した（図９）。これより
２つの活性画分が得られその活性画分（フラクシヨンNo
22−27および34−44）30mlおよび66mlを限外過濃縮に
よつて、それぞれ5mlに濃縮し、5mM MOPS−水酸化ナト
リウム緩衝液、pH7.6、1mM塩化カルシウムで透析し、−
30℃で保存した。

図10Aは各精製段階で得られた活性画分をPAGEによつ
て分析した結果である。レーン１は硫安35−75％分画
物、レーン２はDEAE−トヨパールクロマトグイラフイー
活性画分、レーン３はセルロフアイGCクロマトグラフイ
ー活性画分、レーン４および５はMono Qクロマトグラフ
イー活性画分であ。

このように、Mono Q HR5/5のカラムクロマトグラフイ
ーによつて精製された２つの画分は電気泳動的に単一で
あつたので、その活性画分フラクシヨンNo22−27をコラ
グナーゼＩ、フラクシヨンNo34−44をコラゲナーゼIIの
最終精製標品として用いた。

また、セルロフアインGC−200−ｍのカラムクロマト
グラフイーによつてコラゲナーゼから他のタンパク質お
よびカゼイン分解活性が除去されたことがわかつた（図
10A,レーン３、表３）。

精製したコラゲナーゼＩおよびIIを電気泳動後、過ヨ
ウ素酸−フクシン試薬による糖質染色した結果を図10B
（レーン１および２）に示した。この染色法によつても
最終精製標品が単一であることがわかつた。

また、糖染色されたことより、コラゲナーゼＩおよび
IIは糖タンパク質であると推定された。そこで標品のコ
ラゲナーゼＩおよびIIについてグルコースを標準物質と
してフエノール・硫酸法による糖質定量を行なつた。そ
の結果、検出限界（コラゲナーゼＩおよびIIの１モル当
たりタンパク質量の1/1000）以上であつた。

IV 諸性質斯くして得られたコラゲナーゼＩおよびIIの酵素学的
諸性質について以下に示す。

（１）分子量精製標品（II−２で得たもの、以下同じ）についてSD
S−PAGEを行なつた結果、コラゲナーゼＩは単一の鋭い
バンドを示した（図11,レーン）がコラゲナーゼIIは幅
の広いバンドを示した（図11,レーン４）。

また、試料の調製を５％メルカプトエタール存在下で
行なつたときの結果は、非存在下の場合と同じであつた
（図11,レーン3,5）。

コラゲナーゼＩおよびIIの分子量について分子量マー
カー（図11,レーン１）の移動度と比較して計算した結
果、コラゲナーゼＩは83,000、コラゲナーゼIIは69,000
〜89,000の分子量をもつと推定された。

また、SDSによつて変性を受けていないコラゲナーゼ
の分子量を調べるためにセフアデツクスＧ−150、セル
ロフアインGC−200−ｍおよびTSK−ゲルG3000SWカラム
によるゲル過を試みた。しかし、どの場合にもコラゲ
ナーゼＩ、IIはカラムに吸着し、塩化ナトリウム０〜1M
を含む各種緩衝液を用いてもほとんど溶出されなかつた
（回収率＜10％）。このため、ゲル過によつてネイテ
イブなコラゲナーゼの分子量を知ることはできなかつ
た。

SDS−PAGAのメルカプトエタノール処理による分子量
に変化がみられないことより、コラゲナーゼＩおよびII
はジスルフイド結合によるサプニツトを形成しないこと
がわかつた。しかし、ネイテイブなコラゲナーゼの分子
量がわからないことからも他の結合によるサブユニツト
形成については不明である。

（２） pHおよび温度の影響精製標品のコラゲナーゼ活性に対する至適pHを調べる
ために基質としてＺ−GPLGPを用いてpH3−11、30℃にお
いて活性測定を行なつた。

ここで用いた緩衝液は酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液
（pH3.5〜5.5）、Tris−マレイン酸緩衝液（pH5.5〜8.
5）、炭酸−ホウ酸−塩化カリウム緩衝液（pH8.5〜1
1）。

その結果、コラゲナーゼＩ、IIとのpH8〜９の至適pH
を示した（図12A）。

次にコラゲナーゼ活性に対する至適温度を調べた。基
質として未変性コラーゲンを用いると、この基質が40℃
以上で急激に変性し、測定できなかつので、基質として
Ｚ−GPLGPを用いて25〜60℃（pH7.5）でコラゲナーゼ活
性測定を行なつた。

その結果、コラゲナーゼの至適温度は35〜40℃である
ことがわかつた。（図12B）。

（３）基質特異性天然基質として不溶性コラーゲン、酸可溶性コラーゲ
ン、ゼラチン、アゾコールを用いて、コラゲナーゼＩお
よびIIによる加水分解を行ない基質特異性を求めた。基
質として不溶性コラーゲン、酸可溶性コラーゲン、ゼラ
チンを用いた場合には、μmol product/min/mg enzyme
protein、アゾコールを用いた場合には、mg product/mi
n/mg enzyme prot1inとして表した。

その結果は、表４に示したが、コラゲナーゼＩはどの
基質を用いた場合にもコラゲナーゼIIより高い活性を示
した。

Clostridium histolyticumコラゲナーゼによつて加水
分解される合成オリゴペプチドのPZ−PLGPR、Ｚ−GPLGP
およびＺ−GPGGPAを基質といて用いてコラゲナーゼＩと
IIによる加水分解を行ない、コラゲナーゼＩとIIの基質
特異性（μmol hydrolyzed/min/mg enzyme protein）を
求めた。

その結果、コラゲナーゼＩ、IIそれぞれPZ−PLGPRに
対して117.6と115.3、Ｚ−GPLGPに対して23.3と64.7、
Ｚ−GPGGPAに対して85.2と15.31であつた。

また、ラインウイーバーバークの逆数プロツト法によ
り、コラゲナーゼＩとIIの合成基質に対するミハエリス
定数Kmおよび触媒定数Kcatを求めた（表５）。

（４）酵素阻害剤の効果コラゲナーゼＩとIIに対する各種酵素阻害剤の効果に
ついて検討した。この活性測定には基質としてPZ−PLGP
RあるいはＺ−GPLGPを用いる方法で行なつた。

酵素阻害剤として金属キレート剤のEDTAとｏ−フエナ
ントロリン、ジスルフイド結合還元剤のＬ−システイン
とメルカプトエタノール、チオール酵素阻害剤（アルキ
ル化剤）のヨードアセトアミドとＮ−エチルマイレイミ
ド、セリンプロテアーゼ阻害剤のジイソプロピルフルオ
ロリン酸を用いた。

コラゲナーゼＩ、IIに対してともにEDTAと０−フェナ
ントロリンは1mMで100％の阻害、Ｌ−システインとメル
カプトエタノール10mMで60〜70％の阻害を示した。しか
し、ヨードアセトアミド（10mM）、Ｎ−エチルマレイミ
ド（5mM）、ジイソプロピルフルオロリン酸（1mM）は阻
害を示さなかつた。

また、EDTA（1mM）処理したコラゲナーゼに２価の金
属イオンを添加して活性の回復を調べたところ、コラゲ
ナーゼＩ、IIともCa²⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺によって強い
活性の回復が観察された。その強く活性を回復される順
序はCo²⁺＞Ca²⁺＞Mg²⁺＞Mn²⁺であり、1mM Co²⁺でコラゲ
ナーゼは110％、コラゲナーゼIIでは155％の活性の回復
を示し、1mM Ca²⁺では、コラゲナーゼＩ、IIとの100％
の活性回復を示した。

（５）アミノ酸分析コラゲナーゼＩとIIのアミノ酸組成は表６に酵素タン
パク（分子量80,000）１分子当たりの残基数で示した。

この結果よりコラゲナーゼＩとIIのアミノ酸組成は非
常に似ていることがわかつた。

しかし、両コラゲナーゼとのCys,Trpをこの方法で測
定することはできなかつた。

（６）免疫化学実験コラゲナーゼＩとIIの抗原特異性とこれらコラゲナー
ゼとC.histolyticumおよびA.iophagusコラゲナーゼ間の
免疫化学的関連性を調べるためにオクタロニー法によ
る、免疫拡散法を行なつた。

コラゲナーゼＩとIIを含む部分精製物に対するウサギ
抗血清を用いてコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼII、コラ
ゲナーゼＩとIIを含む部分精製物C.histolyticumおよび
A.iophagusコラゲナーゼについてオクタロニー法を行な
つた結果を図13に示した。

抗血清（図13、ウエルＲ）と標品コラゲナーゼＩおよ
びIIは単一の沈降線を形成した（図13、ウエルA,B）
が、C.histolyticumおよびA.iophagusコラゲナーゼとの
間には沈降線を形成しなかつた（図13、ウエルC,V）。

また、抗血清とコラゲナーゼＩとIIを含む部分精製
物、標品のコラゲナーゼＩおよびIIの間に形成された沈
降線は１本でかつ融合した（図13、ウエルS,A,B）。

以上よりコラゲナーゼＩとIIは抗原特異性が同じであ
り、ISEIC.histolyticumおよびA.iophagusコラゲナーゼ
とは抗原特異性が異なることがわかつた。

ＶコラゲナーゼのＩのIIへの変更アミノ酸組成が近似し、抗原特異性が同じであるが、
分子量や基質特異性などが異なるコラゲナーゼＩとIIの
関連性について検討した。

図４より培養中はじめに、コラゲナーゼＩが生産さ
れ、その後コラゲナーゼIIが生産された結果と図６より
クロラムフエニコールによりタンパク合成が停止してい
る中で、コラゲナーゼIIが生成された結果、また抗原特
異性ならびにアミノ酸組成の結果よりコラゲナーゼIIは
コラゲナーゼＩが菌体外に生産されてから分解または修
飾された産物ではないかと推定された。

そこで、コラゲナーゼＩとIIの関連性を解明する目的
でコラゲナーゼの自己消化、コラゲナーゼＩよりIIの生
成について検討した。

Ｖ−１自己消化（１）コラゲナーゼＩの自己消化精製コラゲナーゼＩをpH3〜10において30℃で20時間
インキユベートした。その試料について30mM Tris 塩酸
緩衝液、pH7.6、1mM塩化カルシウムで透析後、PAGEを行
なつた結果を図14に示した。図示14のレーンおよび２は
コラゲナーゼＩおよびIIの標品であり、レーン３〜10は
それぞれpH3、４、５、６、７、８、９、10においてコ
ラゲナーゼＩをインキユベートした結果である。pH3、
４においては、コラゲナーゼが沈澱し、PAGEによる分析
ができなかつた。pH5ではコラゲナーゼＩがコラゲナー
ゼＩおよびIIとも異なるタンパク質に100％変換し、ま
たpH6〜10においてはコラゲナーゼ１は自己消化を起こ
しているが、その量はわずかであつた。このことより、
コラゲナーゼＩの自己消化ではコラゲナーゼIIは生成さ
れないことがわかつた。

同様にpH3〜10で30℃、20時間インキユベートしたコ
ラゲナーゼ１の合成基質PZ−PLGPRに対する活性とPAGE
後のデンシトメーターによるコラゲナーゼＩとIIのタン
パク質量を測定した結果（図15）、pH6〜９、30℃、20
時間のインキユベートで、インキユベート前のコラゲナ
ーゼＩに比べてコラゲナーゼ活性が70−85％残存するこ
とがわかつた。またpH5で処理したコラゲナーゼＩから
生成されたタンパク質にもインキユベート前のコラゲナ
ーゼＩの約60％のコラゲナーゼ活性が存在することがわ
かつた。

またpH5でのコラゲナーゼＩからの生成物についてSDS
−PAGEを行なつた（図16A,レーン４）。図16Aのレーン
１は分子量マーカー、レーン２および３は標品のコラゲ
ナーゼＩおよびIIである。

この結果pH5処理で生成されたコラゲナーゼ活性をも
つタンパク質の分子量は74,000−94,000であり、その平
均分子量はコラゲナーゼＩの分子量83,000にほぼ一致し
た。

標品のコラゲナーゼＩおよびIIとコラゲナーゼＩから
pH5で生成されたタンパク質についてゼラチン含有SDS−
PAGEを用いた活性染色を行なつた結果（図16B,レーン１
〜３）によつてもコラゲナーゼＩからpH5で生成された7
4−94KDaタンパク質に活性があることが示された。

（２）コラゲナーゼIIの自己消化精製したコラゲナーゼIIをpH7.6、30℃で80時間まで
インキユベートした。この試料について合成基質PZ−PL
GPRを用いたコラゲナーゼ活性を測定したPAGEによるタ
ンパク質量および活性の分析を行なつた。

このインキユベートの結果、コラゲナーゼ活性はイン
キユベート前のコラゲナーゼIIの20％にまで減少し（図
17B）、新たに２つのタンパク質が現われた（図17A）。

この新たに生成されたタンパク質にコラゲナーゼ活性
が存在するか調べるために、コラゲナーゼIIを30と70時
間インキユベートした試料について、PAGEによる分析を
行なつた。

この結果を図18に示したが、インキユベート前のコラ
ゲナーゼIIについて同様の操作で求めたコラゲナーゼ活
性を100として、それに対する相対活性で表わした。こ
れより新たに生成された２つのタンパク質ともコラゲナ
ーゼ活性をもつことがわかつた。

コラゲナーゼＩおよびIIの自己消化によつて生成れた
コラゲナーゼ活性を有するタンパク質は、培養を28時間
行なつたときには生産されなかつた（図４）。よつてpH
7〜８である培養条件において生産されてきたコラゲナ
ーゼに関して自己消化は生じていないかあるいはほとん
ど起きていないと考えられる。

Ｖ−２コラゲナーゼＩからコラゲナーゼIIの生成（１）硫安分画物のpH7.6でのインキユベート II−２の項と同じ条件で培養を行なうと、はじめにコ
ラゲナーゼＩのみが生産され、その後、コラゲナーゼII
が生産された（図４）。このコラゲナーゼＩのみが生産
された培養上清液の硫安35〜75％飽和塩析物を5mM Tris
−塩酸緩衝液、pH7.6、1mM塩化カルシウムで透析し、そ
の硫安分画物を30℃でインキユベートした。そのインキ
ユベート時のコラゲナーゼ活性変化を合成基質PZ−PLGP
Rを用いた測定により調べ、またコラゲナーゼＩ、IIの
タンパク質量の変化をPAGEによる分析で調べた。

この結果、コラゲナーゼＩは減少し、逆にコラゲナー
ゼIIが増加し、生成されたコラゲナーゼIIのタンパク質
量と活性量はインキユベート12時間後に最大となつた
（図19）。

このインキユベート０、12時間の硫安分画物について
PAGEによるコラゲナーゼＩとIIのコラゲナーゼ活性の変
化を調べた結果を図20AおよびＢに示した。

この結果より、コラゲナーゼＩのみ含む硫安分画物の
インキユベートによつてコラゲナーゼIIがタンパク質量
だけでなく、活性量としても増加したことがわかつた。

（２）硫安分画物のpH3−９でのインキユベート上記と同じ硫安分画物をpH3−９において30℃、40時
間までインキユベートし、30mM Tris−塩酸緩衝液、pH
7.6、1mM塩化カルシウムで透析した。その試料について
PAGEを行ない、コラゲナーゼIIのタンパク質量を定量し
た（図21）。この結果はインキユベート前の硫安分画物
のコラゲナーゼＩを同様の方法で定量したときのタンパ
ク質を100とし、それに対する相対量として表わした。

pH3および４でインキユベートしたときは、コラゲナ
ーゼが沈澱したので、コラゲナーゼIIの生成を定量する
ことはできなかつた。図21の結果より、pHが低下するほ
どコラゲナーゼIIの生成量と生成速度が高く、pH5では1
0時間でコラゲナーゼＩがなくなり、インキユベート前
のコラゲナーゼＩのタンパク質量と同じ量のコラゲナー
ゼIIが生成され、そのコラゲナーゼIIの生成速度も最大
となつた。

またpH5で精製したコラゲナーゼＩから生成された74
−94KDaのタンパク質（図16）は、この硫安分画物をイ
ンキユベートしたときには観察されなかつた。

同様にpH5と６において、コラゲナーゼＩのみ含まれ
た硫安分画物を30℃で100時間までインキユベートし、P
AGEによつて、コラゲナーゼIIの活性量とタンパク質量
を分析した結果を図22に示した。この結果はpH5で100時
間インキユベートしたとき生成されたコラゲナーゼIIの
タンパク質量と活性量を100とし、それに対する相対量
で表わした。

この結果より、pH5および６でコラゲナーゼＩのみを
含む硫安分画物（コラゲナーゼIIを含まない）のインキ
ユベートによつて、コラゲナーゼＩがコラゲナーゼIIへ
変換することがわかつた。また、生成されたコラゲナー
ゼIIの活性量とタンパク質量に相関性が見られた。

以上の結果より、コラゲナーゼIIは生産菌フリー系に
おいても生成されることが示された。

なお、これらの実験でコラゲナーゼ自体の影響を除去
するために、EDTA10mMでコラゲナーゼを阻害してインキ
ユベートを行なつたが、この条件ではコラゲナーゼが沈
澱し、分析することができなかつた。

（３）コラゲナーゼIIを生成する因子の検討標品のコラゲナーゼＩの自己消化によつてはコラゲナ
ーゼIIの生成は検出されなかつたので、コラゲナーゼII
を生成する因子について検討した。また、精製したコラ
ゲナーゼＩからpH5で生成された74−94KDaのタンパク質
をpH7、30℃で20時間インキユベートしてもコラゲナー
ゼIIの生成は観察されなかつた。

各精製過程で得られたコラゲナーゼを含まない画分と
標品のコラゲナーゼＩとpH5またpH7で30℃、20時間イン
キユベートした。コラゲナーゼを含まない画分としてDE
AE−トヨパールのカラムクロマトグラフイーで得られ
た、非吸着および0.2、1M塩化ナトリウム溶出画分、セ
ルロフアインGCのカラムクロマトグラフイーで得られた
フラクシヨンNo7〜８、11〜12画分を用いた。

pH7.6においては、コラゲナーゼＩをコラゲナーゼを
含まないどの画分とインキユベートしてもコラゲナーゼ
IIの生成は観察されなかつた。また、インキユベート時
間を40時間の延長してもコラゲナーゼIIは生成されなか
つた。

pH5においてはコラゲナーゼＩ（図23,レーン）をDEAE
−トヨパールによる非吸着画分（図23,レーン３）、セ
ルロフアインGCによるフラクシヨンNo7〜８（図23,レー
ン６）およびNo11〜12（図23,レーン９）と30℃、20時
間インキユベートした結果、それぞれコラゲナーゼII
（図23,レーン２）の生成が観察され（図23,レーン５、
８、11）、コラゲナーゼＩはなくなり、インキユベート
前のコラゲナーゼＩのタンパク質量と同量のコラゲナー
ゼIIが生成された。

また、コラゲナーゼIIの生成の見られた、コラゲナー
ゼを含まない画分だけをpH5で同様にインキユベートし
てもコラゲナーゼは生成されてこなかつた（図23,レー
ン４、７、10）。

これより、pH5においてコラゲナーゼIIを生成する因
子はDEAE−トヨパールのカラムクロマトグラフイーの非
吸着画分とセルロフアインGCのカラムクロマトグラフイ
ーの非活性画分に含まれていることがわかつた。

これらコラゲナーゼIIを生成させる画分にはカゼイン
分解活性が存在する。DEAE−トヨパールによる非吸着画
分には0.17μmol tyrosine/mg protein（U/mg）セルロ
フアインGCによる２つの非活性画分にはそれぞれ0.025
および0.024U/mgのカゼイン分解活性が含まれていた。

このことから、pH5においてコラゲナーゼIIを生成す
る因子は、カゼイン分解活性をもつ酵素による作用であ
ると推定された。

そこで、100℃、５分間の処理をしたDEAE−トヨパー
ルの非吸着画分と精製したコラゲナーゼＩまたは精製し
たコラゲナーゼＩからpH5で生成されたタンパク質（以
下74−94KDaタンパク質とした）と30℃、10時間インキ
ユベートした（図24A）。

図24Aのレーン５はDEAE−トヨパール非吸着画分２×1
0^-3Ｕ（レーン４）と標品コラゲナーゼ120μｇ（レーン
１）を、レーン６は加熱処理した同非吸着画分と標品の
コラゲナーゼＩをpH5でインキユベートした結果で、レ
ーン７および８はレーン５、６同様に標品のコラゲナー
ゼＩの代わりに74−94KDaタンパク質10μｇ（レーン
３）を用いてpH5でインキユベートした結果で、レーン
９および10はレーン７、６同様にpH7でインキユベート
した結果でる。

この結果より、未処理のDEAE−トヨパール非吸着画分
を用いた場合にはコラゲナーゼII（図24A,レーン２）が
生成されたが、加熱処理したDEAE−トヨパール非吸着画
分ではコラゲナーゼIIが生成されなかつた（図24A,レー
ン６、８、10）ので、コラゲナーゼIIを生成する因子は
酵素による消化作用であるとわかつた。またpH7でその
因子により精製したコラゲナーゼＩからコラゲナーゼII
が生成されないが、74−94KDaタンパク質からコラゲナ
ーゼIIが生成されることがわかつた。（図24A,レーン1
0）。

次にMicrobial metalloproteinases（EC3、４、24、
４）のStreptomyces griceus中性プロテイナーゼであ
る。プロテイナーゼＥ（科研製薬）のコラゲナーゼＩか
らコラゲナーゼIIを生成する作用について検討した（図
24B）。

図24Bのレーン５およびレーン６はプロテイナーゼE4
×10^-3Ｕ（レーン４）をpH5および７で30℃、10時間イ
ンキユベートした結果で、レーン７およびレーン８はプ
ロテイナーゼE4×10^-3Ｕと精製したコラゲナーゼI20μ
ｇ（レーン１）をpH7および５で、30℃、10時間インキ
ユベートした結果で、レーン９およびレーン10はレーン
７、８同様にはプロテイナーゼE4×10^-3Ｕと74−94KDa
タンパク質10μｇ（レーン２）をインキユベートした結
果である。

このように、プロテイナーゼＥによつても、pH5にお
いてのみ、コラゲナーゼＩおよび74−94KDaタンパク質
からコラゲナーゼII（図24B,レーン３）が生成されるこ
とがわかつた。

〔発明の効果〕

本発明によつてコラーゲンに異常のある疾患に対して
有用なコラゲナーゼＩおよびIIを高収率、高純度で製造
することができる。またコラゲナーゼＩ、IIは、従来電
気泳動法によらなければ精製できなかつたが、本発明に
より、電気泳動法を使用せず大量に高純度のものを製造
することが可能となつた。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明によるコラゲナーゼの精製工程フローチ
ヤートを示す図面である。図２は、種々は栄養源を用い
た場合の培養時間とコラゲナーゼ活性の関係を示す図面
である。図３（１）および図３（２）は、ゼラチン又は
フラミツクスＰ（Ｆ−Ｐ）を種々の濃度で添加した場合
の培養時間とコラゲナーゼ活性との関係を示す図面であ
る。図４は、ゼラチン又はフラミツクスＰ添加培地で培
養した場合の硫安分画物のポリアクリルアミドゲル電気
泳動図である。図５は、クロラムフエニコール（５μg/
ml）を添加した培養した場合のインキユベート時間とコ
ラゲナーゼ活性との関係を示す図面である。図6Aおよび
6Bは、クロラムフエニコール（５μg/ml）を添加して12
時間インキユベートした場合の電気泳動易動度とコラゲ
ナーゼ活性との関係を示す図面である。図７は、本発明
の精製過程のうちDEAE−トヨパールカラムクロマトグラ
フイーの結果を示す説明図であり、図８は同セルロフア
インGC−200−ｍカラムクロマトグラフイーの結果を示
す説明図であり、図９は同Mono Q HR5/5カラムクロマト
グラフイーの結果を示す説明図である。図10Aは本発明
の種々の精製過程におけるPAGE−電気泳動図であり、図
10Bはその糖質染色図である。図11は本発明コラゲナー
ゼのSDS−PAGE電気泳動図である。図12Aは本発明コラゲ
ナーゼのpHとコラゲナーゼ活性との関係を示し、図12B
は、同温度とコラゲナーゼ活性との関係を示す図面であ
る、図13は種々のコラゲナーゼとコラゲナーゼＩおよび
IIを含む部分精製物に対する抗血清との間のオクタロニ
ー試験結果を示す図面である。図14はコラゲナーゼＩを
種々のpHでインキユベートした試料の電気泳動図であ
る。図15はコラゲナーゼＩを種々のpHでインキユベート
した場合のコラゲナーゼ活性の変化を示す図面である。
図16Aは、コラゲナーゼＩをpH5で30℃、20時間インキユ
ベートした試料のSDS−PAGE電気泳動図を示す図面をで
あり、図16Bはこれを活性染色した状態を示す図であ
る。図17AはコラゲナーゼIIをpH7.6、30℃でインキユベ
ートした試料の電気泳動図を示し、図17Bは、そのイン
キユベート時間とコラゲナーゼ活性との関係を示す図面
であり、図18は同電気泳動易動度とコラゲナーゼ活性と
の関係を示す図である。図19は、コラゲナーゼ精製過程
の硫安分画をpH7.6でインキユベートした場合のコラゲ
ナーゼ活性の変化、コラゲナーゼＩからコラゲナーゼII
への変換を示す図面であり、図20Aおよび図20Bは同イン
キユベート０時間後および20時間後の試料を電気泳動さ
せた場合の易動度とコラゲナーゼ活性を示す図面であ
る。図21および図22は硫安分画を種々のpHでインキユベ
ートした場合のインキユベーシヨン時間とコラゲナーゼ
IIの生成量を示す図面である。図23は本発明コラゲナー
ゼ精製過程における種々のフラクシヨン中でコラゲナー
ゼＩをpH5.0、30℃にて20時間インキユベートした試料
のPAGE−電気泳動図である。図24AはDEAE−トヨパール
非吸着画分とコラゲナーゼＩ又は74−94KDaを30℃、10
時間インキユベートした試料の電気泳動図である。図24
BはコラゲナーゼＩ又は74−94KDaをプロナーゼＥ処理し
た試料の電気泳動図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ストレプトミセス属に属するコラゲナーゼ
生産菌を、炭素源を含有せず、かつゼラチン、ゼラチン
の酵素分解物又はハイドパウダーを含有する培地で培養
し、その培養物からコラゲナーゼＩを採取することを特
徴とするコラゲナーゼＩの製造法。
【請求項２】ストレプトミセス属に属するコラゲナーゼ
生産菌を、炭素源を含有せず、かつゼラチン、ゼラチン
の酵素分解物又はハイドパウダーを含有する培地で培養
し、その培養物からコラゲナーゼIIを採取することを特
徴とするコラゲナーゼIIの製造法。
【請求項３】ストレプトミセス属に属するコラゲナーゼ
生産菌を、炭素源を含有せず、かつゼラチン、ゼラチン
の酵素分解物又はハイドパウダーを含有する培地で培養
し、その培養物をpH8未満でインキュベートすることに
よりコラゲナーゼＩをコラゲナーゼIIに変換せしめるこ
とを特徴とするコラゲナーゼIIの製造法。