JPH082302B2 - 菌体培養部材及びそれを用いた菌体培養方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は雑菌の透過困難な孔径２μｍ以下の高分子膜
を壁膜として有する菌体培養部材及びそれを用いた菌体
培養方法に関するものである。

〔従来技術〕

酵素活性を安定化して、また水溶性であるにもかかわ
らずくり返して使用を可能にするために、酵素を物理的
または化学的手法で水に不溶化して固体触媒の形で使用
する技術が開発され、Ｌ−アミノ酸、異性化糖、６−ア
ミノペニシラン酸及びリンゴ酸等の工業生産に利用され
ている。さらに固定化酵素の手法を進めて酵素を包含し
たままの微生物菌体（固定化微生物）を利用すれば、抽
出精製操作を省ける、固定化または操作時の安定性がよ
い、多階段酵素系の利用に有利、補酵素やATPなどの供
給が可能、などの利点がある。また、二次代謝産物の生
産のために生菌体の固定化法を用いることができ、さら
に固定化増殖微生物を用いて収量を向上させることも可
能である。

上記のために固定化技術の確立は基本的に重要である
が、担体結合法、橋かけ法及び包括法などがあり、撹拌
層型、充填層型、流動層型及び膜型バイオリアクターと
してプロセス化されている（千畑一郎・土佐哲也、油化
学，31,414（1982），角野立夫・中村裕紀・大竹安友・
森直道,PPM,No.6,28（1987），福井三郎編著、「生体触
媒としての微生物」共立出版（1979）参照）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

好気性菌の発酵生産技術において栄養源及び酵素の拡
散速度が目的とする生産物の生産速度に影響を及ぼす。
一般に栄養源の利用効率は低く、また菌体の増殖や生産
物の生成により培養液の粘性が増大し生合成反応が阻害
され目的とする生産物の生産速度が低下する。糸状菌の
場合特に三次元網目構造を有する菌塊の生成や培養液の
増粘による栄養分や酵素の不足が起こりやすい。また、
培養液から生産物を分離するのに手間がかかるなど改良
の余地が大きい。

つぎに、ゲル内に固定化した菌体・増殖菌体のバイオ
リアクターへの応用技術が開発され、アルコール発酵の
生産性の向上等が報告されている。しかし、菌体を包括
したゲルの調整、ゲルの大きさや強度の調節及び滅菌な
ど煩雑な操作を必要としている。また、生菌体の増殖に
よるゲルの破壊、さらにそのために培養液との混濁によ
る生産物の回収の困難さが生じる。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者らは菌体を安価にかつ簡単に培養できる方法
について鋭意研究を重ねた結果、密封可能な開口部を有
する２μｍ以下で培養液が透過可能な微細孔を多数有す
る高分子膜の袋体と、その袋体内に収容させて用いられ
る菌体を付着支持させる菌体支持体とからなる菌体培養
部材を用いることにより、表面積が大きく気体の過密な
成育やそれに伴う菌塊の生成がないので栄養物や酵素の
供給が充足し、耐久性があってくり返し長期の使用が可
能であり、また増殖菌体だけでなく、休止菌体の使用も
可能であるため生産性が高く、さらに袋体内に菌体があ
るため培養液の滅菌が不要で且つゲルの大きさや強度の
調節及び滅菌等の煩雑なゲル調整操作を必要としないこ
とを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至っ
た。

即ち、本発明によれば、密封可能な開口部を有する孔
径が２μｍ以下でかつ培養液が透過可能な微細孔を多数
有する高分子膜の袋体と、その袋体内に収容させて用い
られる菌体を付着支持させるための菌体支持体からなる
菌体培養部材が提供される。

また、本発明によれば、密封可能な開口部を有する孔
径が２μｍ以下でかつ培養液が透過可能な微細孔を多数
有する高分子膜の袋体内に、菌体とその支持体を収容さ
せた後、その袋体の開口部を密封し、得られた密封袋体
を培養液中に浸漬させて培養することを特徴とする菌体
培養方法が提供される。

本発明における菌体を固定化させる支持体としては、
例えば、不織布、高分子ゲル、ポリウレタンフォーム等
が挙げられる。また、袋体を構成する高分子膜として
は、ポリエチレン等のプラスチックフィルムが挙げられ
る。

〔実施例〕

次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１ ジェラガード3201（延伸ポリエチレンフィルム、孔径
0.4×0.04μｍ）製の縦50、横40mmの三方が閉鎖された
袋の中に縦45、横35mmの不織布（１％Tween80水溶液に
浸漬乾燥したもの）１枚を入れた後、N/1000塩酸水溶液
に１時間以上浸漬した。

この後の、Penicllium spiculiisporum Lehman No.10
−１の菌体約100mgを袋の中に入れ、シーラーを用いて
加熱し袋の入口を封じた。こうして作った袋10枚を、下
記の組成の滅菌しない培地300mlの入った１容広口ポ
リビンに入れ、アルミホイルで口を覆い、通気しながら
往復動振とう培養器（振幅70mm、120階／分往復）にセ
ットして30℃にて６日間培養した。発酵の進行とともに
培養液を著しく発泡した。培養後、袋を切り開いてみる
と不織布の両面にわたって厚さ約0.5mmの菌体がフィル
ム状に付着し重量は1.1gであり、菌体が十分に増殖した
ことが明らかであった。なお袋体外部の培養液中に雑菌
の繁殖は見られなかった。（比較のため同様の培養液の
みを同条件で振とうすると雑菌の黒いカビが繁殖し
た。）また、袋体外部への培養菌体の漏出は認められな
かった。培養中のブドウ糖量はグルコースメーターによ
ると2.4％であった。粘度は調整時の培養液の粘度10cp
から変化がなかった。さらに発酵液にエタノールを加え
1N水酸化ナトリウム100mlを加えて中和後1N塩酸100mlを
加えて中和しクロロホルムにてスピクリスポール酸（4,
5−ジカルボキシ−４−ペンタデカノリド）の開環体
（1,3,4−テトラデカントリカルボン酸）が培養液１
当り1.3g生成した。

〔田淵ら,J.Ferment.Technol.,55,37;43（1977）に準じ
た〕 次に表１により菌体培養部材による実験経過を示し
た。

実施例２ 実施例１と同じジュラガード3501（0.4×0.04μｍ）
に不織布を挟んだ袋の中にPenicllium spicurisporum L
ehman No.10−１を100mgを入れて封じたものを３袋用意
した。培養液300mlを入れた１容広口瓶にこれらの３
袋を入れ、アルミホイルで口を覆い、30℃にて実施例１
と同様にして培養した。実施結果は表１の実験No.2に示
したとおり、６日後の菌体重量は１袋当りNo.1の２倍の
2200mgに達した。この場合、菌体の増殖が顕著で厚さ約
0.7mmのフィルム状にべっとり付着した。実施例１とく
らべてスピクリスポール酸の生産効率が低下した。

比較例１ 実施例１と同じジュラード3501（0.4×0.04μｍ）の5
0×40mmの袋を作り、不織布を入れずに菌体100mgを袋の
中に封じた。６日後開封すると培養開始時とほぼ同僚の
菌体量であった。それ故、菌体を担持し増殖させるため
に不織布を袋の中に入れることが必要であることがわか
った。

実施例３ 実施例１と比較例１の比較から分かるようにジュラガ
ード製の袋の中に不織布のような菌体の支持体を置くこ
とが好ましい。不織布の代わりにアルギン酸カルシウム
ゲルを用いてPenicllium spicurisporumの菌体を担持す
ることも可能であった。すなわち、0.8％アルギン酸水
溶液またはPenicllium spicurisporumの菌体を懸濁した
0.8％アルギン酸水溶液を注射筒から1.5％塩化カルシウ
ム水溶液中に撹拌しながら室温で滴下して、菌体を含
み、または含まないアルギン酸カルシウムのビーズ（直
径約2mm）を得た。菌体を含むゲルはそのままジェラガ
ードの袋に入れ、また空のビーズは菌体とともにジェラ
ガードの袋に入れて封をした後、実施例１と同様にして
培養を行った。６日後菌体の増殖が見られ、ゲルが菌体
の支持に有用であることが示された。さらに、支持体と
してポリウレタンフォームを用いてもよく、菌体を接種
して６日後菌体量は３倍に増殖した。

実施例４ 実施例１により得られた菌体を成育させ不織布上に固
定化した高分子膜バッグ10袋を取り出し、ガラスロート
上に置いて培養液を自然に滴下させて除いた後水洗いを
くり返した。これらのバッグ内に固定化された菌糸体の
酵素系を利用して、基質を含む下表の培地300mlを入れ
た１容広口ポリ瓶を用いてスピクリスポール酸の生合
成（バイオコンバーション）を行った。30℃にて５日間
往復動振とう培養器（振幅70mm、120回／分往復）に
て、菌体をα−ケトグルタル酸からスピクリスポール酸
を生成させた。反応終了後反応液を７℃に冷却した後濾
過水洗いし、得られた残渣を乾燥してエチルエーテル・
エタノール（1:1）液に溶解した。ベンゼンを展開液と
して薄相クラマトグラフィーを行い、スピクリスポール
酸の生成を確認した。

実施例５ Torulopsis bombicola ATCC 22214は酵母でブドウ糖
及びオレイン酸などを炭素源として資化することによ
り、ソホロリピッド:7−Ｌ−〔（２′−Ｏ−β−Ｄ−グ
ルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキソ〕
オクタデセン酸−1,4″−ラクトン類を主成分とし、そ
の関連化合物からなる同族体を生産することが知られて
いる〔N.Kosaric et.al.,J.am.Oil Chem.Soc.,61,1735
（1984）〕。実施例１と同じ手法により菌体を高分子膜
内に担持させた袋を５袋、無滅菌の培養液300mlの入っ
た１広口ポリ瓶中に入れて30℃で６日間通気しながら
振とうして培養した。菌体量は接種時（100mg）の８倍
に増殖していた。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】密封可能な開口部を有する孔径が２μｍ以
   下でかつ培養液が透過可能な微細孔を多数有する高分子
   膜の袋体と、その袋体内に収容させて用いられる菌体を
   付着支持させるための菌体支持体からなる菌体培養部
   材。
2. 【請求項２】密封可能な開口部を有する孔径が２μｍ以
   下でかつ培養液が透過可能な微細孔を多数有する高分子
   膜の袋体内に、菌体とその支持体を収容させた後、その
   袋体の開口部を密封し、得られた密封袋体を培養液中に
   浸漬させて培養することを特徴とする菌体培養方法。