JPH082308B2

JPH082308B2 - ａｒａＢプロモーターを含有する複製可能な発現ビヒクル

Info

Publication number: JPH082308B2
Application number: JP61500818A
Authority: JP
Inventors: ライ，チウヌー; リー，チヤー‐ホウ; リン，ユン‐ロン; レイ，ダン; ウイルコツクス，ゲイリー
Original assignee: INTAANASHONARU JENETEITSUKU ENG Inc
Current assignee: INTAANASHONARU JENETEITSUKU ENG Inc
Priority date: 1985-01-28
Filing date: 1986-01-24
Publication date: 1996-01-17
Anticipated expiration: 2011-01-17
Also published as: DE3689598T2; FI94774C; EP0211047A4; FI863891A0; ATE153377T1; DE3650625T2; WO1986004356A1; EP0460709B1; DE3650625D1; JPH0829112B2; JPH0767684A; NO175870B; JPS62501538A; EP0211047A1; ATE101203T1; FI94774B; NO175870C; EP0211047B1; EP0460709A1; NO863806D0

Description

【発明の詳細な説明】関連出願この出願は、1985年１月28日に出願された米国特許第
695,309号の一部継続出願である。

技術分野本発明は、組換えDNA工学および、形質転換された宿
主における異種遺伝子の発現にaraBプロモーターを使用
することに関する。さらに、この特許は、殺菌性ペプチ
ドであるセクロピンおよびその類縁物質をコードしてい
る遺伝子の修飾、クローニング、および発現に関するも
のである。

技術的背景 DNA分子にコードされている遺伝情報は、DNAのｍ−RN
Aへの転写およびそれに続くｍ−RNAのポリペプチドまた
は蛋白質への翻訳を含む一連の過程で発現される。ポリ
ペプチドを形成するための、コード化された情報の発現
は、RNAポリメラーゼが結合し、転写を開始させるDNA上
の領域、即ちプロモータ部位で開始される。異種遺伝子
の発現のための組換えDNA法に使用されるプロモーター
には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）やラクトー
ス（β−ガラクトシダーゼ）のプロモーター系〔チヤン
グ（Chang）ら、ネイチヤ−（Nature）、275:615（197
8）；イタクラ（Itakura）ら、サイエンス（Scienc
e）、198:1056（1977）；ゴーデル（Goeddel）ら、Natu
re、281:544（1979）〕および、トリプトフアン（trp）
プロモーター系〔Goeddelら、ヌクレイツク・アシツド
・リサーチ、8:4057（1980）:EPO特許出願公開第003677
6号〕が含まれる。他の知られたプロモーターには、バ
クテリオフアージλプロモーター、(P_L)および(P_R)、hu
t、コリシンE₁、ガラクトース、アルカリフオスフアタ
ーゼ、キシロースＡおよび、tacなどがある。

araB遺伝子とそのプロモーター（araB）は、Ｌ−アラ
ビノースオペロン中に位置している。エシエリヒアコリ
（大腸菌）（Escherichia coli）およびサルモネラチ
フイムリウム（Salmonella typhimurium）のＬ−アラ
ビノースオペロン（ara BAD）は、研究されている。S.
チフイムリウム中のＬ−アラビノースオペロンは、特に
興味深い。その配列は、以下に開示されている：ホルウ
イツ（Horwitz,A.）らの“S.チフイムリウムLT2中のara
BAD−araCコントロール領域のDNA配列”、ジーン（Gen
e）、14:309−319（1981）および、リン（Lin,H.−C.）
らによる“S.チフイムリウムLT2のaraBADオペロン、I.a
raBのヌクレオチド配列および、その生成物リブロキナ
ーゼの一次構造"Geni、34:111−122（1985）;II.“araA
のヌクレオチド配列および、その生成物Ｌ−アラビノー
スイソメラーゼの一次構造"Gene、34:123−128（198
5）;III.“araDとその側面領域のヌクレオチド配列およ
び、その生成物Ｌ−リブロース−５−フオスフエイト−
４−エピメラーゼの一次構造"Gene、34:129−134（198
5）などの一連の文献に開示されている。araBADオペロ
ンは、Ｌ−アラビノースの初期代謝に関与している３つ
の構造遺伝子を含んでいる〔リー、ヤー−ハウ（Lee,Ja
r−How）らの“S.チフイムリウムLT2ara突然変異の遺伝
子的特徴付け”、ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー
（J.of Bacteriology）、158:344−46（1984）〕。Ｌ−
アラビノースは、araA遺伝子産物であるＬ−アラビノー
スイソメラーゼにより、まず、Ｌ−リブロースに変換さ
れる。それから、Ｌ−リブロースは、araB遺伝子産物で
あるリブロキナーゼによりＬ−リブロース−５−フオス
フエイトにリン酸化される。araD遺伝子産物であるＬ−
リブロース−５−フオスフエイト−４−エピメラーゼ
は、Ｌ−リブロース−５−フオスフエイトのＤ−キシロ
ース−５−ホスフエイトへの変換を触媒し、次いでこの
後者がペント−スリン酸化系路に入る。araBADオペロン
は、インジユーサー（誘導酵素）であるＬ−アラビノー
スとaraC調節遺伝子産物によつて調和をもつてコントロ
ールされる。

本明細書および請求の範囲に記載した１つの態様で
は、araBプロモーターを、セクロピンをコードしている
遺伝子と機能的に連結し、セクロピンタンパク質の発現
のため適当な宿主に挿入しているので、セクロビンにつ
いての背景技術文献を概観することは価値あることであ
る。

セクロピア蛾と数種の鱗翅類のこん虫の免疫機構は、
主として、最近抗菌ペプチド類として見出されたセクロ
ピン類が関与している有効な体液性応答によつて特徴付
けられる〔ボーマン、H.G.（Boman,H.G.）とステイナ
ー、Ｈ（Steiner,H.）のカレント・トピツクス・イン・
ミクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Current
Topics In Microbiology And Immunology）、94/95:75
−91（1981）〕。３つの主要なセクロピン、Ａ、Ｂおよ
Ｄが免疫性血液とリンパから精製されており、それらの
配列が明らかにされた〔ステイナー（Steiner）らのネ
イチヤー（Nature）、292:246−248（1981）；キユー
（Qu）らのヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（European Journal of Biochemistry）、12
7:219−224（1982）；フルトマルク、Ｄ（Hultmark,D）
のイビツド（ibid）127:207−217（1982）；およびフル
トマルクの米国特許第4,355,104号〕。これらすべての
セクロピンは、互いに高度の配列ホモロギー（相同性）
をもつた小さな塩基性ペプチドである。アンセレア・ペ
ルニー（Antheraea pernyi）〔A.P.〕とハイロフオラ
・セクロピア（Hylophora cecropia）〔H.C.〕由来の
セクロピンＢおよびＤのアミノ酸配列は以下の通りであ
る：セクロピンは、その構造が蜂毒液であるメリチンに似
ているが、メリチンよりも広い抗菌スペクトラムを有し
ていて、培養肝細胞、羊の赤血球、または、こん虫細胞
を溶解しない。上に示したように、全てのヤクロピンの
カルボキシ末端は封鎖されていて、ヤクロピンＡの場合
は、封鎖している基は、１級アミド基である〔アンドリ
ユー（Andreu）らのプロシーデイングス・オブ・ザ・ナ
シヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ、USA（P
roceedings of the National Academy of Sciences,US
A）、80:6475−6479（1983）〕。ヤクロピンＡとその数
種の関連ペプチドは、近年、固相法によつて合成されて
いて、それらは、化学的および物理的判定規準では、天
然のヤクロピンＡとまつたく識別できない（Andreuら、
同上）。

興味あることに、カルボキシ末端のテトラペプチドイ
ミドは、E.コリに対しての抗菌活性にとつてさほど重要
性をもつていないが、試験した他の３つの細菌では、抗
菌活性はセクロピンＡの抗菌活性より３％から20％低下
した。

セクロピンは、グラム陰性菌およびグラム陽性菌など
を含む様々な細菌に対して抗菌性を有している。セクロ
ピンの作用機序に関して得られた資料により、セクロピ
ンは、細菌の細胞質膜を破壊することが判明した〔スタ
イナー（Steiner）らのNature、292:246−248（198
1）〕。その文献より、細菌種が異なればセクロピンに
対する感受性も異なり、各々のセクロピンが固有の活性
スポクトラムを有することは明白である。たとえば、バ
シルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）は、セ
クロピンＡとＢに対して高感受性であるが、セクロピン
Ｄに対しては比較的耐性である。グラム陰性菌もグラム
陽性菌もセクロピンに対して、μモル濃度の範囲で感受
性を示すことがわかつた。セクロピンに対する感受性の
高い細菌は、E.コリ、シユードモナス・アエルギノサ
（Pseudomonas areruginosa）、S.マルセスセンス（Se
rratia marsescens）、キセノルハブダス・ネマトフイ
ルス（Xenorhabdus nematophilus）、B.メガテリウム
（B.megatherium）および、ミクロコツカス・ルテウス
（Micrococcus Iuteus）である。セクロピンＡおよび
Ｂは全部で12個のアミノ酸置換を示すが、９種の異なる
細菌種に対する活性は非常に似ている。このことは、多
くのアミノ酸を、ペプチドの生物活性を変えることなく
置換し得ることを示している。同様に、中国のオーク絹
蛾（A.pernyi）から得られるセクロピンＢと南アメリカ
絹蛾（H.cecropia）から得られるセクロピンＢとは、４
つの部位で異つている。しかし、その内の３つの置換
は、H.cecropia A形に存在する対応アミノ酸の置換であ
る。４番目の置換は、H.cecropia AとＢが異なつている
部位でのものであり、保存的置換である。よつて、保存
的アミノ酸置換によつてつくられたセクロピンの特異な
誘導体が、その生物活性を持ち続けることは明らかであ
る。セクロピンＤでみられるような悲保存的置換は、ペ
プチドの活性を変えてしまう可能性がある。セクロピン
Ｄは、セクロピンＡおよびＢとほとんど同程度のE.コリ
に対する活性をもつているが、他の８種の細菌種に対し
ては、明らかに活性が低くなつている。

セクロピンやその類縁体の高い有用性および、組換え
DNA法によつてタンパク質を生産できるという大きな展
望から、遺伝子組換え法によるセクロピンの生産系を提
供することは価値あることであると考えられる。

発明の開示 araBプロモーターを、生物活性産物をコードしている
ヘテロローガス（異種）遺伝子と機能的に結合させるな
どしてaraBプロモーターを組換えDNA分子に於けるプロ
モーターとして使用し得ることがわかつた。ヘテロロー
ガス遺伝子の発現をコントロールするのにaraBプロモー
ターを使用することは、多くの付帯的な有利さがある。
araBプロモーターコントロール系はしつかりと統制され
る。araBプロモーターはＬ−アラビノースで誘導し得
る。例えば、生産されるポリペプチド類は培養培地にＬ
−アラビノースを添加するまでは合成されない。即ち、
Ｌ−アラビノースの悲存在下では、ポリペプチドを生成
するヘテロローガス遺伝子の発現はない。Ｌ−アラビノ
ースで誘導されることにより、araBプロモーターで開始
されるメツセンジヤーRNAの一部としてポリペプチドが
転写される。いつたん誘導されれば、ポリペプチドは迅
速に、かつ効率的に生産される。さらに、発酵期間は他
の系と比較して短い。重要なことは発現の程度が増大す
ること、即ち、ヘテロローガスポリペプチドの生産が非
常に改良されることであり、従つて産業上利用すること
を望ましいものにしている。最後に、発現された融合ポ
リペプチドは、宿主細胞内で細胞封入体を形成し、これ
は、サイズ増大しているにもかかわらず非常に安定であ
り、ヘテロローガスタンパク質の精製が容易である。

従つて本発明は、宿主内で発現し得るポリヌクレオチ
ド分子であつて、該宿主にとつてヘテロローガスな遺伝
子と機能的に結合しているaraBプロモーターの配列を含
有しているポリヌクレオチド分子を提供するものであ
る。ポリヌクレオチド（類）をコードしているヘテロロ
ーガス遺伝子は、生物学的に活性である（生物活性を有
する）。本発明はまた、該ポリヌクレオチド分子を含有
している、複製および発現可能なビヒクル、該ビヒクル
で形質転換された宿主、および、最終的な発現およびヘ
テロローガスなペプチド（類）を回収するために該宿主
を培養するための発酵法を提供するものである。

本発明はまた、組換えDNA法によりセクロピンペプチ
ドおよびその類似体を生産するための方法、およびその
方法に使用する手段を提供するものである。セクロピン
（類）は上記araBプロモーターまたはその他のプロモー
ターを使つて発現させることができる。

特に本発明は、セクロピン様殺菌作用を有するペプチ
ドをコードしている遺伝子配列を提供するものである。
単独で、あるいは他のペプチドまたはアミノ酸残基と一
緒にセクロピンペプチドを含有しているもつと長い配列
の一部として提供されるこれらの遺伝子配列は、それら
の発現宿主としてのE.coli（大腸菌）に最も受け入れら
れ易くする様にコンピユータを使つた方法で設計するの
が理想的である。

具体的には、本発明は、異なつたポリペプチドをコー
ドしている第２遺伝子配列と機能的に結合しているセク
ロピンをコードしている第１遺伝子配列の融合配列であ
る遺伝子構築物であつて、セクロピン感受性宿主内で発
現し得る遺伝子構築物を提供するものである（ここで、
異なつたポリペプチドとは、セクロピン感受性宿主に対
する該発現された融合産物の殺菌作用を抑制し得るもの
である）。

本発明のもう１つの目的は、誘導し得るプロモーター
配列に機能的に結合しているセクロピンをコードしてい
る遺伝子配列を含有している、セクロピン感受性宿主内
で発現し得る遺伝子構築物を提供するものである。

本発明はまた、上記遺伝子構築物を含有している複製
および発現可能なビヒクル、該ビヒクルで形質転換され
た宿主、および該ビヒクル、構築物ならびに宿主を使つ
てセクロピンを生産する方法を提供するものである。

更に本発明は、セクロピンとポリペプチドとの融合タ
ンパク質であつて、細菌宿主に対する殺菌作用が減少し
たタンパク質を提供するものである。

セクロピンをコードしている遺伝子配列は、発現宿主
としての大腸菌に最も受け入れられやすくする様に、好
ましくはコンピユータを使つた方法で設計する。また、
自己相補性を最小にし、挿入を容易にするために配列の
内部または外側に制限エンドヌクレアーゼ部位を避ける
様にあるいは設ける様に、そして所望の発現ビヒクルと
の相補性を最小にする様に設計する。ポリヌクレオチド
配列をこの様な最適な状態にすることにより、本発明
は、大抵の場合、セクロピン源として用いられる各種の
天然の遺伝子とは構造的に異なつている合成配列を提供
する。

図面の簡単な説明第１図は大腸菌内での発現に使用する合成遺伝子およ
びセクロピンＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
を示す。

第２図はプラスミドpMH6およびM13mp9からのプラスミ
ドpING1の組立てを示している。pING1はaraBおよびaraC
遺伝子の両者を持つている。この図はまた、プラスミド
pING1からのプラスミドpCA1A、pCA1BおよびpCA1′の組
立てをも示している。

第３図はpMH6およびpCA1A、pCA1B並びにpCA1′からの
プラスミドpCA3′、PCA3A、PCA3BおよびPCA2′並びにPC
A2Aの組立てを示している。pCA1（またはpCA1Aおよび1
B）、pCA2′（またはpCA2A）およびpCA3′（またはpCA3
AおよびpCA3B）間の違いは、セクロピンＡ遺伝子と、ar
a遺伝子間のBam HI部位との間の種々の長さにあり、pCA
1′（またはpCA1Aおよび1B）では500bp、pCA2′（また
はpCA2A）では1253bp、およびpCA3′（またはpCA3Aおよ
び3B）では1550bpである。

第４図はプラスミドp10Cの組立を示している。

第５図はpCA3AからのプラスミドpCA3A−−１の組立を
示している。この図はまた、pCA3A−−１およびp19C
（第４図）からのプラスミドpCA3Dの組立をも示してい
る。

第６図はセクロピンＡ、大腸菌内で発現させるための
第２の化学的に合成された遺伝子のヌクレオチド配列お
よびアミノ酸配列を示している。

第７図は野性型およびミユータント（突然変異）セク
ロピンＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示し
ている：ここで、（１）はCA野性型（pCA3D）、（２）はCAミユータントＡ（pCA3A）、（３）はCAミユータントＢ（pCA3B）であり、ミユーテーシヨンの位置を示している。

第８図はaraB−hTGF融合体を含有しているプラスミド
phTGF5の組立を示す。

第９図はプラスミドpTGF58の組立を示す。

第10図はヒトの合成カルシトニン遺伝子を持つている
２つのプラスミドp115およびp318の組立を示している。

第11図は、融合ポリペプチド、リブロキナーゼ−ヒト
カルシトニン（hCT）の遺伝子を含んでいるプラスミドp
HCT1の組立を示す。

第12図はカルシトニン−ペプチド遺伝子のクローニン
グおよび発現のためのビヒクルとして用いられるプラス
ミドpING1の組立を示している。pING1はaraBおよびaraC
遺伝子を含んでいる。

定義以下の記載に於いては、組換えDNA技術で用いられる
多くの用語が多数使用されている。明細書および請求の
範囲を明瞭にかつ統一的に理解できる様に、またこの様
な用語の範囲を明確にする為にも、以下に用語の定義を
行なう。

オペロンポリペプチド発現のための構造遺伝子および
その発現を調節しているコントロール領域を含んでいる
遺伝子。

オペレーター特定のリプレツサーと相互作用し得るDN
A配列であり、その相互作用により隣接遺伝子（群）の
機能がコントロールされる。

プロモーター RNAポリメラーゼが結合し、隣接遺伝子
（群）の転写を開始させる、コントロール領域内のDNA
配列。

アクチベーター RNAポリメラーゼによるRNA合成の開始
に必要なタンパク。

イニシエーターアクチベーターが相互作用するDNA配
列であり、これにより隣接遺伝子がコントロールされ
る。

ポリヌクレオチド分子糖と燐酸残基の交互連結で構成
される骨格により互いに連結しているヌクレオチドの線
状配列であり、本明細書に於いては、DNAおよびRNAポリ
マーの両者を含んでいる。

構造遺伝子鋳型またはメツセンジヤRNAを介して、特
定のペプチドに特徴的なアミノ酸配列をコードしている
DNA配列。

ヘテロローガス（異種）遺伝子外来性の、即ち宿主と
は異なる供給体に由来する遺伝子であるか、または化学
的に合成された遺伝子であり、宿主とは異なる種の供給
体を含んでいる。この遺伝子は、発現ビヒクルによる形
質転換を受ける生物によつて通常生産されないポリペプ
チドをコードしている。

生物活性（生物学的に活性）本明細書に於いては、生
物系内で生じる目的の効果を達成する性質またはそのプ
ロセスを意味する。

機能的な結合本明細書では、プロモーターがヘテロロ
ーガス遺伝子によつてコードされているポリペプチドの
発現の開始をコントロールすることを意味している。

発現構造遺伝子によりポリペプチドが生産されるプロ
セスを発現という。これには、遺伝子のメツセンジヤー
RNA（mRNA）への転写とmRNAのポリペプチドへの翻訳が
含まれる。

クローニングビヒクル宿主細胞内で複製し得るプラス
ミドまたはフアージDNAまたはその他のDNA配列であり、
DNAの必須の生物学的機能を失なうことなく、決定可能
な様にそのDNA配列を切断し得る１つまたはそれ以上の
エンドヌクレアーゼ認識部位によつて特徴づけられ、か
つ、形質転換細胞の同定に使用するのに適当な表現型選
択マーカーを含んでいるものをいう。マーカーは、例え
ばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性であ
る。「ベクター」という用語がクローニングベクターの
代りに用いられることがある。

発現コントロール配列構造遺伝子と機能的に結合され
た場合、この構造遺伝子の発現をコントロールまたは調
節するヌクレオチド配列。これにはフアージラムダの主
要なオペレーターおよびプロモーター領域、lac系、trp
系、fd外皮タンパク質のコントロール領域、および原核
性または真核性細胞の遺伝子の発現コントロールするこ
とが知られているその他の配列が含まれる。

発現ビヒクルクローニングビヒクルに似たビヒクルで
あるが、通常ある種の調節配列のコントロール下で、宿
主内に於いて、与えられた構造遺伝子を発現することが
できるビヒクルをいう。

宿主複製可能な発現ビヒクルの受容体となる全ゆる生
物を意味し、これには細菌および酵母が含まれる。

セクロピン本明細書および請求の範囲を通じて、当業
界で認められている殺菌活性測定法で測定した場合、イ
ンビボまたはインビトロで該活性が認められる、全ゆる
昆虫類由来のポリペプチドを含んでいる。

本発明に於いてセクロピンという用語は、適当な系で
殺菌活性を示す、天然セクロピンの全ゆる類似体、同族
体、ミユータント、異性体または誘導体についても用い
られる。この用語は更に、天然のアミノ酸より少ない数
のフラグメント、例えば天然のセクロピンまたはその類
似体の部分的フラグメントをも意味する。更にまた、こ
の用語は、天然のセクロピンまたはその類似体の配列
と、１またはそれ以上のその周辺アミノ酸、好ましくは
カルボキシ末端のアミノ酸、を含んでいる、セクロピン
様殺菌活性を有する産物をも意味する。また、この用語
は、天然のアミノ酸より少ない数のセクロピンである
が、殺菌活性を示すものも含むものとする。

ある種のセクロピンをこの定義の範囲内に入れるホモ
ロギー（相同性）の程度は、殺菌活性に関与しているセ
クロピンの領域に応じてかわる。この定義の範囲内に入
る為には、殺菌活性を示すのに必須である領域は高いホ
モロギーを示すが、殺菌作用を示す構造を維持したり、
リセプター結合を行なうの関与しない配列は、比較的低
いホモロギーを示すものであつてもよい。更に、機能的
に類似している側鎖を置換しても、臨界領域は殺菌活性
を示し、本明細書で定義した意味でホモローガスであ
る。「機能的に類似」という用語は、側鎖の優勢な特
性、例えば塩基性、中性または酸性、立体障害の有無な
どをいう。一般に、セクロピンとして定義されるペプチ
ドは、本明細書の「技術的背景」の項に示したセクロピ
ン類と実質的に相同（ホモローガス）である領域を含ん
でいる。カルキシ末端領域に比較してアミノ末端領域で
のホモロギーはさほど必要ではない。

「殺菌作用（活性）」という用語は、先に定義した活
性を意味し、それは天然のセクロピン種の活性より大き
くても、あるいは小さくてもよい。具体的には、天然種
の約１％から、天然のセクロピンの活性より実質的に高
い（例えば10倍、100倍またはそれ以上）活性の範囲の
殺菌作用を持つたセクロピンペプチドが含まれる。

本発明を実施する最良の方法 1.araBプロモーター本発明は、宿主にとつてヘテロローガス（異種）遺伝
子に機能的に結合させたaraＢプロモーターの配列を含
んでいる該宿主内で発現し得るポリヌクレオチド分子を
提供するものである。異種遺伝子は、生物活性をもつポ
リペプチドをコードしている。本発明はまた、araBプロ
モーターと関連する構成を提供するものである。araＢ
プロモーターは、誘導プロモーターである。即ち、コー
ドされたポリペプチドを生成するための異種遺伝子の発
現は、Ｌ−アラビノースの添加により開始され、誘導さ
れる。Ｌ−アラビノースは、araC遺伝子の産物であるア
クチベーターと相互作用し、araBの発現を調節する。こ
れは、lac、trp、λP_L およびtacのようなネガテイブコ
ントロール系とは逆にポジテイブコントロール系であ
る。Ｌ−アラビノースの添加がなければ、異種ポリペプ
チドは発現または合成されない。ひとたび誘導されれ
ば、生物活性ポリペプチドである生産物は、迅速に、能
率的に製造される。これらポリペプチド生産物は、典型
的には、宿主細胞中で細胞封入体として形成される。細
胞封入体は、細胞密度の増加と共に急速に増大する。細
胞封封入体は、宿主再鵜中では、非常に安定に存在す
る。この特徴により、再現性よく高収率で生産され、発
酵の監視が容易になる。進行中の発酵を終わらせるため
の正確な決定は、細胞封入体の大きさと飽和した増殖に
基づいて簡単に行なうことができる。

S.チフイムリウム中のaraBプロモーターは、以下のヌ
クレオチド配列を有している： araB遺伝子の一部分であるaraBプロモーターは、Ｌ−
アラビノースオペロン中に位置している。Ｌ−アラビノ
ースオペロン（araBAD）は、E.コリとS.チフイムリウム
で分離された。しかし、本発明の実施においては、araB
プロモーターの供給源を、これら２つに限定するもので
はない。他の供給源は、Ｌ−アラビノースオペロンをコ
ードしている遺伝子を含んだどんな細菌にでも求められ
る。これらaraBプロモーターの供給源には、シユードモ
ナス、シトロバクター、キサントモナスおよび、エルウ
イニアの細菌群が含まれる。

更に、araBプロモーターは、天然起源よりもむしろ、
例えば実験室での操作によつて合成されてもよい。換言
すれば、この概念は、人工的に合成されたもの、あるい
は、人工的に減成された産物をも意味している。このよ
うに、天然のaraBプロモーターの完全な配列が、ある生
物種のゲノムDNA中に組込まれて存在していても、その
生物のゲノムDNAから分離されたaraBプロモーターに相
当する分離された配列は、先導ポリペプチドに相当する
隣接配列、および開始並びに停止信号が付いていようと
いよまいと、天然に存在するものではなく、“合成”さ
れたものと考える。その上、遺伝子コードには同義性が
あるので、そのアミノ酸配列がわかつていても、必ずし
も、また、決定的には、それをコードしている天然の遺
伝子配列を決める訳にはいかない。

どんな合成配列を作成する場合でも、最善の方法は４
つかまたはそれ以上の過程からなり、それは、araBプロ
モーターの合成に適用できると共に、異種ポリペプチド
を含むペプチド配列の合成にも適用できる。まず、所望
の配列に対し、その配列中の各アミノ酸に対する可能な
DNAコドンのリストをつくる。そして、これらコドン
を、細菌または酵母で使用される頻度に従つて順番に並
べる。コドンの予備的順序は、酵母については、ベネツ
シエン（Bennetzen）とハル（Hall）とのジヤーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Bio
logical Chemistry）、257:3026−3031（1982）、細菌
については、フイールス（Fiers）、W.ネイチヤー（Nat
ure）、260、500（1976）の文献に基いて行なつてよ
い。さらに、これら文献の技術以上の精密な配列化を推
薦する。

どのコドンを選択するかに影響する第２の要因は、ク
ローニング過程に於いて制限酵素の使用を容易になる様
な、遺伝子クローニング過程で使用する制限酵素部位が
存在するか存在しないかという点である。公知であるエ
ンドヌクレアーゼ部位の配列（ひとつの部位が４〜６個
のヌクレオチドで成り立つている）を“宿主に好まれ
る”一次配列と比較することで、この要因を最も適正化
できる。制限酵素であるエンドヌクレアーゼ部位のリス
トは、たとえば、ロバート（Roberts）、R.J.のヌクレ
イツク・アシツド・リサーチ（Nucleic Acid Researc
h）、11:1（1983）、r135−r137に開示されている。

特定のコドンの選択に影響を与える３番目の要因は、
合成されたDNAフラグメントの内部の二次構造を最小限
にする必要があることである。それは、折りたたまれて
しまい、近接したDNAフラグメントとのアニーリングが
阻止されることを避けるためである。この要因には、意
図した遺伝子中の互いに隣接し合つているセグメントを
除き、セグメントが、互いに過度に相補的となることを
避ける様に配列設計を検索することである。相補性を調
べること（即ち、その回避）は、設計された遺伝子配列
と提供される複製ビヒクル（プラスミドやフアージ）の
間でも実施することができる。

最適化させる４番目の要因は、転写が早く終わるのを
避けるために、特に、GC塩基対の豊富な配列が前にある
場合は、AT塩基対の豊富な配列（約５またはそれ以上）
を回避するとである。

コドンの選択に影響を与える５番目の要因は、情報を
安定させるためにRNase部位を避けることである。

最後に、もし、２つの可能なコドンのいずれを使用し
てもよい場合は、微生物ゲノム中で発現を最大にするも
のを使用するのが適当である〔たとえば、フイールス
（Fiers）らのNsature260、500、（1976）；米国特許第
4,366,246号、６巻、を参照〕。

細菌や酵母での発現を最も効果的にするために、必要
な比較を行なうようコンピユーターにプログラムするこ
とが最も好ましい。

本発明の具体例をひとつ挙げれば、誘導araBプロモー
ターを生物活性をもつポリペプチドをコードしている遺
伝子配列に機能的に連結させる。そして、得られた遺伝
子構築物を発現ビヒクルに導入するか、または、その一
部とする。次いで発現ビヒクルを適当な宿主を形質転換
するために使用する。その宿主を、発育を最適にするよ
うに選ばれた培養条件下で発酵する。araBプロモーター
は、異種遺伝子の発現を開始させる様にプロモーターを
誘導するＬ−アラビノースで処理されるまでは不活性で
ある。その働きの順序は、mRNAへの遺伝子の転写とそれ
に続くポリペプチド産物への翻訳である。

本発明におけるもう一つの具体例では、araBプロモー
ターを生物活性をもつ異種ポリペプチドをコードしてい
る遺伝子配列に機能的に連結し、そして、この遺伝子配
列をもう一つのポリペプチドをコードしている２番目の
遺伝子配列に連結させる。発現により、融合体、即ち２
番目のポリペプチドのアミノ酸配列と所望の異種ポリペ
プチドのアミノ酸配列を含む前駆体タンパク質であつて
所望のアミノ酸配列に隣接した選択的開裂部位を含有し
ているタンパク質が得られる。

開裂部位は、従来技術で知られている好ましいいずれ
の部位でもよいが、メチオニンが好ましい。所望の異種
遺伝子は、実際に選ばれた開裂部位に相当する開裂部位
を、その内部に持つていないことが好ましい。他の知ら
れている開裂部位には、Asn−Gly、Asp−Pro、Lys、Ar
g、およびLys−Argがある。

融合または前駆体タンパク質の選択的開裂は、主とし
て、発現ビヒクルの複製環境の外で行なう。この翻訳後
の段階で、選択的処理により融合または前駆体タンパク
質が切断される。たとえば、メチオニンを開裂部位とす
る場合、融合または前駆体タンパク質は、所望の異種ポ
リペプチドを切断するために、臭化シアノジエンで処理
される。他の知られた開裂部位の場合、切断のための処
置にはヒドロキシルアミン、酸、トリプシンおよび、Ly
s−Arg開裂酵素などが使用される。

融合した、機能的に連結した遺伝子を調製する方法、
および、細菌中でそれを発現させる方法は公知のもの
で、たとえば、米国特許第4,366,246（その引用は割愛
する）に開示されている。

本明細書に記載された遺伝子構築物と方法は、細菌宿
主において異種ポリペプチドを発現させるのに使用でき
る。

例えば、E.coli K12 294株（ATCC31446）およびMC106
1株（ATCC39450）は特に有用である。使用し得るその他
の微生物株としてE.coli X1776（ATCC 31537）が挙げら
れるが、これに限られない。上記の株の他、E.coli W31
10（F^-，ラムダ⁻，プロトトロフイツク（ATCC2732
5））およびその他の腸内細菌群、例えばS.typhimurium
またはSerrati marcescens、および各種のシユードモナ
ド種を用いることもできる。

一般に、宿主細胞と相容性（適合性）のある種由来の
レプリコンおよびコントロール配列を含んでいるプラス
ミドベクターが、これらの宿主との関連で用いられる。
ベクターは通常、複製部位と共に、形質転換された細胞
に表現型選択性を付与し得る特定の遺伝子を持つてい
る。たとえば、E．coliは通常、E．coli種由来のプラス
ミド、pBR322〔ボリバー（Bolivar）ら、ジーン（Gen
e）、2:95（1977）〕を使つて形質転換される。pBR322
はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を
含んでおり、形質転換された細胞を同定するための容易
な手段となる。このpBR322プラスミドまたはその他の微
生物プラスミドは、微生物によつて、それ自身のタンパ
ク質を発現するのに使用し得るプロモーターを含んでる
か、あるいは含む様に改良されなければならない。

araBプロモーターは、生物活性を有するヘテロローガ
ス（異種）ポリペプチドまたはタンパク質をコードして
いる遺伝子配列と機能的に結合することができる。この
様なポリペプチドまたはタンパク質の例には酵素、ホル
モン、ヘモグロビン、抗体、構造タンパク質、α−、β
−およびγ−インターフエロン、インターロイキン、イ
ンスリンおよび組織プラスミノーゲンアクチベーターな
どが含まれる。特定の例としてヒト腫瘍成長因子、カル
シトニンおよびセクロピンが挙げられる。

形質転換された宿主を、当技術分野で知られている方
法に従つて発酵し、培養して最適の細胞増殖を達成する
ことができる。下記の本発明による好ましい発酵法およ
び生産方法を使つてヘテロローガスポリペプチドを大量
に生産することができる。さらに、ヘテロローガス遺伝
子と機能的に結合させたaraBプロモーターを使うことに
より、ヘテロローガス遺伝子の発現程度が増大する。

好ましい発酵法は以下の通りである。形質転換された
宿主、好ましくは細菌、より好ましくはE．coliを、細
菌の増殖に必要な栄養物質を含んでいる培養培地に入れ
る。この様な物質には、炭素および窒素源、鉱物、アミ
ノ酸、プリン類、ピリミジン類およびビタミン類などが
含まれる。好ましい培養培地はまた、表現型マーカー耐
性に必要な量の代謝産物を含んでおり、この様な代謝産
物としては例えばテトラサイクリンまたはアンピシリン
が挙げられる。最大増殖率が得られる様に選択した培養
条件下で宿主を増殖させる。温度条件は宿主によるが、
通常最適範囲は約30℃〜約40℃であり、形質転換された
E．coliについては37℃が最も好ましい。酸素も培地に
供給する。後期指数的成長相まで宿主を増殖させてから
新しい培養培地に移す。

次いで宿主を生産（production）培養培地に接種す
る。この工程中、細菌は、もはや分裂しないが生存して
いる飽和密度濃度に達するまで分裂と生長をつづける。
飽和密度に達するのに十分な時間は培地、宿主の遺伝子
型、温度および空気導入度によつてかわる。

当初、生産工程での発酵および培養条件は、先に培養
工程で述べた条件と同じである。ただし、溶存酸素が増
殖中に消費されるので、最小溶存酸素（D.O.）を30％に
維持するために、撹拌と空気導入率を増大させる。好ま
しいpH域は約６〜８である。上記の生産培地のpHは、
E．coliの増殖に最適な6.5−6.8に絶えず自己調節され
る。従つて、E．coli宿主の場合は、培地pHの酸および
塩基調節は不要である。しかし、他の宿主については、
培地pHの調節は必要となろう。最適細胞密度に達したら
（E．coliについては光学密度▲OD¹⁰ ₆₀₀▼）、ヘテロロ
ーガス遺伝子を誘導してポリペプチドが生産される様
に、Ｌ−アラビノースを添加する。既述した様に、ポリ
ペプチドは、宿主内に於いて細胞封入体を形成する。こ
のペプチドは、過または沈殿の様な既知の方法で回収
する。得られた、発現されたヘテロローガスペプチドが
融合タンパク質である場合は、その融合タンパク質を回
収し、形質転換後工程で処理し、所望のヘテロローガス
ポリペプチドを分離することができる。次いでこのヘテ
ロローガスポリペプチドを回収し、既知の方法で精製す
る。araB プロモーターは、便宜上、セクロピンを含んでいる
本発明の各種態様に関連して記載されているが、araBプ
ロモーターは、生物活性を有する全ゆるポリペプチドま
たはタンパク質をコードしている遺伝子配列に機能的に
結合させてもよいと理解されなければならない。

2.セクロピン感受性宿主を使用するセクロピンの微生物
学的製造法本発明の１つの目的は、セクロピン感受性宿主を使用
してセクロピンを微生物学的に製造する方法を提供する
ことにある。本発明の１つの思想は、セクロピンをコー
ドしている遺伝子配列を発現させると共に、その生産物
の殺菌作用を回避する。または遅らせることにある。

１つの態様に於いては、セクロピンをコードしている
遺伝子配列を誘導し得るプロモーターに連結し、得られ
た遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入する。次いでこの
発現ビヒクルを使つて適当な宿主を形質転換し、この宿
主を、プロモーターが活性化されない通常の条件下で発
酵させる。適当な時期が経過したら、例えば細胞が定常
期になつたら、例えば塩濃度、光、代謝産物の存在また
は非存在、金属などの外部環境因子を変えることにより
プロモーターを誘導する。この変化により、セクロピン
遺伝子配列のmRNAへの転写、次いでその翻訳が起こり殺
菌性のセクロピンが得られる。得られたセクロピンは殺
菌性があり細菌宿主を破壊するが、この様な破壊は発酵
サイクルの後期まで起らない。調節されたプロモーター
の例は、ラムダ−P_LおよびP_R、lac、gal、trp、ara、hu
tなどである。

第２の好ましい態様においては、セクロピンをコード
している遺伝子配列を機能的に、該セクロピン以外のポ
リペプチドに結合させ、セクロピンおよび付加したポリ
ペプチドの両アミノ酸配列から成り、かつ目的のセクロ
ピンアミノ酸配列に隣り合つて選択的な切断部位を含有
する、融合あるいは前駆体タンパク質が発現によつて得
られるようにするならば、得られた融合タンパク質は殺
菌性ではないということが見い出された。次いで、殺菌
活性のセクロピンを翻訳後に選択切断して単離すること
ができる。

最も一般的には、発現担体の複製環境外で、たとえば
微生物培養物を集めた後に切断を行なう。従つてこの付
加的なポリペプチドは、細胞外切断までの間、セクロピ
ンからその殺菌効果を失なわしめ、十分長期にわたつて
宿主を生存させて高レベルの目的生産物を生じさせる。
このセクロピンは、余分のポリペプチドを切り落とす際
に用いる選択的切断部位に対応する内部切断部位を欠い
ていることが好ましいが、これは必ずしも絶対条件では
ない。セクロピンはメチオニンを含有していないので、
セクロピン配列に隣り合つたメチオニンの所で臭化シア
ン切断するのが有効である。

この余分のポリペプチドをコードしている遺伝子配列
をセクロピンの構造遺伝子より先に転写させるのが好ま
しいが、セクロピンのＣ末端に隣り合つた位置で余分の
ポリペプチドを発現させることも可能であるので、必ず
しもこうである必要はない。

この余分の隣接ポリペプチドの性質には限定はなく、
既知の構造、酵素、ホルモンまたはその他の生理学的な
関連タンパク質の一部、全部または繰り返し単位のいず
れであつてもよい。また、非機能的なポリペプチドであ
つてもよい。いずれの特定の理論に拘束されることもな
く、融合タンパク質を長くすると全体のポリペプチドの
立体配置を変えることによつてセクロピンの殺菌性をど
ういうわけか“遮蔽する”ものと本発明者等は考えてい
る。余分な隣接ポリペプチドをコードしている遺伝子配
列は、好ましくはその長さが少なくとも約300塩基対以
上であるべきであり、より好ましくは約400bpから5kbで
あり、最も好ましくは400bp〜2kbである。これは、好ま
しくは約100〜1700アミノ酸残基の余分のポリペプチド
に対応する。

多数の余分のポリペプチドを、所望のセクロピンペプ
チド配列に融合することができる。このポリペプチド遺
伝子配列は、有機合成によつて（この場合、最適方法が
推奨されるであろう）調製することができるが適当なmR
NAの逆転写のような方法によつて調製されることもある
であろう。ポリペプチドの遺伝子配列と構造セクロピン
ペプチドの遺伝子配列との酵素的結合をcDNAの調製後に
行なう。酵素的結合は、制限エンドヌクレアーゼ認識部
位の２本鎖の１つからなる接着末端を供給するか、ある
いは平滑ライゲーシヨンのどちらかによつて行なうこと
ができる。余分のポリペプチドの例はベーターガラクト
シダーゼあるいはリブロキナーゼ（araB遺伝子によつて
コードされている）である。酵素および構造タンパク質
が好ましい。用いることが可能なその他の産物は、以下
に挙げる遺伝子によつてコードされている産物である：
aceAあるいはaceB、araA、araB、araC、araD、argG、ar
oB、lacA、serA、purA、trpA、trpB、trpC、trpD、trp
E、tyrA等。この余分のポリペプチドは普通グリコシル
化されていない。araBプロモーターが好ましいプロモー
ターであるが、ラムダP_LおよびP_R、lac、gal、trp、hut
およびその他のaraプロモーターなどのその他のプロモ
ーターを用いることができる。

本発明のさらに別の態様においては、セクロピン遺伝
子配列を、融合産物においてセクロピンの殺菌活性を阻
害あるいは不活性化することができる余分のポリペプチ
ドの配列に機能的に結合させ、さらに誘導プロモーター
に結合させる。この方法では、融合タンパク質法で得ら
れる効果と誘導プロモーターの使用で得られる効果の両
方を都合よく、かつ同時に利用することができる。

本発明はセクロピン感受性の宿主（たとえば、細菌宿
主）においてセクロピンを産生させる方法に関するもの
であるが、本発明で調製した遺伝子構築物およびその関
連方法を、その他の非セクロピン感受性宿主においてセ
クロピンを発現させるために用いることもできる。これ
らの非セクロピン感受性宿主には酵母および哺乳動物細
胞培養物が含まれる。有用な酵母、哺乳動物宿主および
ベクターは当業界ではよく知られており、言及がなされ
ている（たとえば、欧州特許公開0093619、1983年11月
９日発行）。細菌性宿主には、araBプロモーターを有す
る既述の宿主、ならびにシユードモナス（Pseudomona
s）、シトロバクター（Citrobacter）、クサントモナス
（Xanthomonas）およびエルビニア（Erwinia）などの属
の細菌宿主が含まれる。

araBプロモーターを有する上記のような宿主と共存し
うるすべてのプラスミドベクターを用いることができ
る。

別の好ましいセクロピン用プロモーターはラムダ(P_L)
である。セクロピン用遺伝子構築物および余分のポリペ
プチドを、バクテリオフアージラムダ(P_L)の左側のプロ
モーターの制御下に置くことができる。このプロモータ
ーは制御されうる持つとも強力な既知プロモーターの１
つである。制御はラムダリプレツサーによつて発揮さ
れ、隣接制限部位が知られている。CI遺伝子の温度感受
性対立遺伝子を、セクロピンの完全配列を含有するベク
ターあるいは別のベクター上に配置することができる。
温度が42℃まで上昇したときに、このリプレツサーは不
活性化され、プロモーターはその最大レベルで発現され
る。これらの条件下で産生したmRNA量は、P_Lプロモータ
ー由来の新しく合成したRNAを約10％含有する細胞を生
じるに十分であるはずである。この方法において、機能
的なセクロピン融合構築物配列がリボソーム結合配列に
隣接し、そしてラムダP_Lプロモーターから種々の距離に
あるクローンバンクを作成することが可能である。次い
でこれらのクローンをスクリーニングし、最大の収量を
与えるクローンを選別することができる。

また、このセクロピン配列の発現を、形質転換されて
いない状態では微生物にホモローガス“相同”であつて
もよい他のレギユロンの制御下で行なうこともできる。
たとえば、E.コリの染色体DNAはラクトースあるいはlac
オペロンを含有し、これは酵素ベーターガラクトシダー
ゼを同化することによつてラクトース消化を仲介する。
このlac制御要素を、E.コリに感染するバクテリオフア
ージラムダplac5から得ることができる。このフアージ
のlacオペロンを、同一の細菌種から形質導入して得る
ことができる。本発明の方法に用いるのに適したレギユ
ロンを、微生物本来のプラスミドDNAから得ることがで
きる。このlacプロモーター−オペレーター系をIPTGで
誘起することができる。

本発明において特に興味深いことは、セクロピンペプ
チドをコードしている合成ポリヌクレオチド配列を提供
することである。本発明の好ましい態様においては、セ
クロピンペプチドの合成配列（隣接配列があつてもなく
ても）を、その発現体が種々の宿主（たとえば酵母およ
び細菌、特に後者）と共存しうるように最適なものにす
る。特に、E.コリにおいて供与配列すべての発現を最適
化することは極めて重要である。従つて、上記のような
最適化操作を行なつた後には、隣接配列を有するかある
いは有しないセクロピンペプチドの実際の遺伝子配列
は、通常、元の種における天然の配列とは異なつてい
る。

さらに、融合産物のための所望の遺伝子の設計には、
メチオニン（臭化シアンで切断可能）、トリプトフアン
（ｏ−ヨードソ安息香酸で切断可能）、グルタミン酸
〔スタフ（Staph.）プロテアーゼで切断可能〕等の切断
部位のアミノ酸のためのコドンを導入するのが好まし
い。

本発明のある態様においては、融合産物の所望のDNA
配列におけるコドンのすべてについて、特定部位の突然
変異誘発によつて意図した所で突然変異誘発を行なうこ
とができる。従つて、所望のDNA配列を合成した後に、
切断しうる部位をこの配列に導入することができる。特
定部位の突然変異誘発は既知であり、ワレイス等が言及
している〔（Wallace et al.）、サイエンス（Scien
c）、209:1396〜1400（1980）、参考のために本明細書
中に入れた〕。

セクロピンペプチドにおいて潜在的なＣ−末端残基に
続いているアミノ酸残基あるいは残基群には、上記のよ
うに、先導ポリペプチド（それが存在する場合）と同一
または異なる構造および種々の長さのさらに別のポリペ
プチド（“トレイリング（trailing）”ポリペプチド）
が続いていてもよい。このような場合、Ｃ−末端アミノ
酸残基とトレイリングポリペプチド配列の間に同一また
は異なる選択切断部位を与えるのが都合よい。これらの
切断部位は、先導ポリペプチドとセクロピンペプチドの
構造遺伝子との間に存在するものと同一であつて、同一
でなくてもよい。

換言すれば、余分のポリペプチドは先導ポリペプチ
ド、トレイリングポリペプチドまたはその両者として存
在することができる。

所望のセクロピンペプチドの構造遺伝子をそのまま発
現用担体に挿入しようとする場合は、この遺伝子の前に
は“開始”コドンが存在し、そしてトレイリング配列が
続いている場合には、１またはそれ以上の終止あるいは
停止コドンが存在する。発現産物がセクロピンペプチド
およびポリペプチドの一部あるいは全体の両者からなる
融合タンパク質であるときには、この開始コドンはポリ
ペプチドのＮ−末端の前に置かれていてよい（ポリペプ
チドが先導である場合）。

ポリヌクレオチドの合成法は当業界でよく知られてい
る。参照文献としては、たとえばイタクラ等〔Itakura
et al.、ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・サ
サエテイ（Journal of American Chemical Society）、
97:3727（1975）のトリエステル法がある。

本発明方法によつて得たセクロピンを、特定の応用分
野に向けられた広範な抗微生物剤として用いることがで
きる。このような応用分野には、たとえば加工食品製品
の防腐剤〔対象微生物：（１）クロストリジウム・ボツ
リナム（Clostridium botulinum）、（２）ラクトバシ
リ（Lactobacilli）、（３）ミクロコツチ（Micrococc
i）〕；口腔内衛生製品の抗カリエス剤〔対象微生物：
ストレプトコツカス・ミユータンス（Streptcoccus mut
ans）〕；膣酵母感染の治療に有用な薬物〔対象微生
物：カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）〕お
よび防臭剤中の抗微生物剤〔対象微生物：（１）ミクロ
コツチ（Micrococci）、（２）ジフテロイズ（Diphther
oids）〕としてセクロピンを使用することが含まれる。
上記の応用分野についてのセクロピン様ペプチドの相対
的な効果を、セクロピンペプチドの１つに対するいずれ
かの微生物の感受性を測定することによつて、当業者は
容易に概算することができる。試験管内で用いられる同
一の細菌スクリーニングを用いて投与量および濃度を決
めることができる。

ここまで、本発明を一般的に記載したが、特定の実施
例について言及することにより本発明はさらによく理解
されるであろう。この実施例は説明のためにだけ挙げた
ものであつて、他に指定がない限り本発明を限定しよう
とするものではない。

方法アミノ酸組成減圧下、110℃で24時間、5.5MのHCl〔ピアース（Pier
ce）〕を用いてセクロピンポリペプチドの加水分解を行
なつた。試料を減圧下、40℃で乾燥し、ベツクマン・モ
デル6300試料緩衝液（Beckman Model、低pHクエン酸
塩）200μｌ中に再懸濁した。

ベツクマン・モデル6300分析機を用いてアミノ酸分析
を行なつた。ポストカラム（Postcolumn）ニンヒドリン
を検知に用いた。ヒユーレツト・パツカード（Hewlet P
ackard、HP）積分器モデル3390を用いてデータを記録し
た。個々のピークを540および440nmにおけるシグナルの
合計として記録した。それぞれのアミノ酸を含有するベ
ツクマン標準を用いて積分器を補正し、マツコウクジラ
ミオグロビン〔アプライド・バイオシステムズ（Applie
d Biosystems）〕を用いて検量が正確であることを確認
した。

タンパク質の配列決定アプライド・バイオシステムズ・モデル470Aタンパク
質シークエネーター（アミノ酸配列分析装置）を、すべ
てのタンパク質配列決定に用いた。配列決定法の細目は
フンカピラー−フツド（Hunkapiller−Hood）のプログ
ラムに従つた。この系には、メタノール性HClによる切
断を用いる非減圧プログラムを用いた。

PTHの測定データ供与用のHPモデル3390A積分器を備えたHPモデ
ル1090A HPLCを用いてPTHの測定を行なつた。IBMシアノ
−プロピロカラムをPTHアミノ酸の分離に用いた。緩衝
液は５％テトラヒドロフランを含有する30mMのNaHAc（p
H5.1）であつた。流速は1ml/分、温度は37℃であつた。

減圧下で乾燥した後、試料を33％アセトニトリル水溶
液30μｌで30分間溶解した。使用したPTH標準はピアー
ス・ケミカル社（Pierce Chemical Co.）から入手し
た。

実施例１合成セクロピンＡ（CA）遺伝子の合成およびクローニ
ング A.CA遺伝子の合成 CAをコードする遺伝子を、高度に発現されたイー・コ
リ蛋白に通常みられるコドンを導入するようにコンピユ
ータでデザインした。該遺伝子の末端に4bp分の突出部
を入れ、それぞれSalＩおよびEcoRI部位リゲート（結
合）できるようにした。各種サイズの融合蛋白を構築で
きるように、SalＩ部位のつぎにBamHI部位を含めた。さ
らに、コンピユータープログラムを用いて、前述したよ
うな最適の方法を採択した。その遺伝子を23〜37塩基長
さの８個のオリゴヌクレオチドに分割した。

その８個の一本線DNAフラグメントを、イトウらの固
相ホスホトリエステル法〔Nucleic Acids Research8
巻、5491（1982）〕によつて合成した。

下記のような種々の変更および改良を行なつた。

（１）カツプリング反応をゆるやかに振盪させながら37
℃で40分間行なつた。

（２）最終カツプリング反応後、DNAの脱保護基を行な
うために、DNA樹脂（10mg）を0.5M2−ピリジンアルドキ
シム−テトラメチルグアニジニウムのピリジン−水（8:
2v/v）溶液（2ml）と振盪させながら37℃で60分間反応
させた。溶液を合せ、蒸発させたのち、密封アンプル中
でNH₄OH（28％、3ml）にて60℃で36時間処理した。アン
モニアを蒸発させたのち、溶液をエーテルで３回抽出
し、ついで蒸発させた。DNAを精製するために、その残
渣を50mMトリエチルアンモニウム重炭酸塩pH7.5（TEA
B）0.1mlに溶かし、セフアデツクスＧ−50のカラム（１
×50cm）に通した。1mlずつのフラクシヨンを採取し
た。主に260nmに鋭い吸収ピークを有する最初の数フラ
クシヨンに目的物質が含まれていた。これらのフラクシ
ヨンを蒸発させ、ついで高速液体クロマトグラフイ（HP
LC）にてさらに精製した。このHPLC精製は、ボンダパツ
ク（Bondapak）C18（Waters社）カラムにて10mM酢酸ト
リエチルアンモニウム緩衝液（pH7.8）中アセトニトリ
ル（10〜40％）のリニアグラジエントを用いて55℃で行
なつた。そのDMT基を80％酢酸（0.1ml）にて室温で25分
間処理して加水分解し、ついで蒸発、さらに水0.1mlを
加えて蒸発させて酢酸を完全に除去した。

B.CA遺伝子のリゲイシヨンによる組立て化学的に合成したフラグメント１〜８の５′OH末端
を、別々に、下記組成の溶液（10μｌ）中でりん酸化し
た。

70mMトリス−HCl（pH7.6） 10mM MgCl₂ 5mMジチオスレイトール 66μＭガンマー32P−ATP（１μCi） DNA400ngおよび T4ポリヌクレオチドキナーゼ２単位この反応は25℃で15分間行ない、10mM非標識ATP1mlを
加えてさらに15分間反応を続けた。純度をチエツクする
ために、りん酸化DNA10％を、7M尿素の存在下にポリア
クリルアミドゲル（15％）電気泳動にて標準的な方法で
分析した。

りん酸化DNAフラグメント２、３、４、５、６および
７の400ngを95℃で５分間加熱してT4ポリヌクレオチド
キナーゼを不活化した。ついでこれに、非りん酸化フラ
グメント１および８の400ngを加え、95℃でさらに５分
間加熱し、ついで25℃までゆつくり（10分間当り１℃）
と冷却した。この８個のDNAフラグメントを全量100μｌ
にて66Mmトリス−HCl（pH7.5）、6.6mM MgCl₂、10mMジ
チオスレイトール、0.4mM ATPおよびT4DNAリガーゼ２単
位の存在下に25℃で２時間リゲートした。

C.プラスミドpING1、pCA1A、pCA1BおよびpCA1′の構築その構築工程を第２図に示す。

pMH6はホルビツツらの文献〔Horwitz,A.H.et al,Gen
e,14,309−319（1981）〕に記載されており、M13mp9は
市販されている。

1.上記Ｂ工程で得られたCA遺伝子のフラグメントを、予
め制限酵素エンドヌクレアーゼSalＩおよびEcoRIで処理
したプラスミドpING1にリゲートし、ついで制限酵素エ
ンドヌクレアーゼSmaＩで消化してpING1を保持する形質
転換体を減じた。

2.SmaＩ処理プラスミドをイー・コリMC1061に導入（形
質転換）した。

3.CA遺伝子フラグメントを保有するプラスミドを含むコ
ロニーを、合成DNAフラグメント７（第１図）をプロー
ブとして用いてコロニーハイブリダイゼーシヨンにより
同定した。CAフラグメントを含む３個の別々のコロニー
が1000コロニー中に見つかつた。単離したプラスミドを
各々SalＩおよびEcoRIで消化し切取つたフラグメントの
サイズをチエツクした。CA挿入体の塩基列分析を、サン
ジヤーら〔Sanger et al,PNAS,74,5463−5467（197
7）〕のジデオキシ鎖末端法の変法〔Wallace et al,Gen
e,16,21−26（1981）〕によつて行なつた。２個の配列
を決定し、第７（２）および７（３）図に示した。これ
らの配列を含むプラスミドをpCA1AおよびpCA1B（第２
図）と命名した。これらの配列はそれぞれ第７（２）お
よび７（３）図中に矢印で示す位置で天然のCA配列とは
異なつていた。

天然体の配列を生ぜしめるために種々の方法、例えば
pCA1AおよpCA1Bをin vivoまたはin vitroで組換える
方法、または追加の独立したクローンをスクリニングす
る方法などを用いることができる。所望の天然型配列を
含むプラスミドをpCA1′（第２図）と命名した。

以下の記載において、プライム符号（′）を付したプ
ラスミドは天然型CA配列のものを意味し、プライム符号
のないプラスミドはミユータントpCA1AまたはpCA1Bから
誘導されたものを意味する。

D.プラスミドpCA2′、pCA2A、pCA3′、pCA3AおよびpCA3
Bの構築これを第３図に示す。pCA1（またはpCA1AまたはpCA1
B）をBamHIで消化し、ポリメラーゼおよびdTNPで処理し
たのち、SstＩ消化に付して、フラグメント１を得る。
このものは一方の端が平滑末端で他の末端にSstＩ突出
部を担持している。このフラグメントを、pMH6をNarＩ
消化、平滑末端形成およびSstＩ処理に付して得られる
フラグメントT4リゲーシヨンにて結合させ、pCA3′（ま
たはpCA3またはpCA3B）を得る。このフラグメント１を
また、pMH6をHgiAI消化、平滑末端形成およびSstＩ処理
に付して得られるフラグメントとT4リゲーシヨンにて結
合させ、pCA2′（またはpCA2A）を得る。

上記結合生成物を用いてイー・コリMC1061を形質転換
させて所望の生成物を得る。前記ミニ分解法によりプラ
スミドを単離する。単離プラスミドをそれぞれBamHIお
よびPstＩで消化する。BamHIフラグメントの正しいサイ
ズおよび方向を有する各グループのプラスミドをpCA2
（またはpCA2A）およびpCA3′（またはpCA3AまたはpCA3
B）と命名する。

E.araＢ−CA融合蛋白の発現プラスミドpCA1A、pCA2A、pCA3A、pCA3BおよびpCA3D
（注:pCA3Dは、以下、野生型CA含有プラスミドpCA3′を
示すためにも用いる）中にaraＢ−CA融合遺伝子を含有
するイー・コリ細胞を、1.5％トリプトン、1.0％酵母エ
キスおよび0.5％NaCl（TYE）ならびにアンピシリン50μ
g/mlを含む培地中37℃で生育させた。細胞密度OD₆₀₀＝
0.2にて培養物をＬ−アラビノース最終濃度0.5％にて処
理し、araＢ−CA融合蛋白の発現をもたらし、細胞密度
がOD₆₀₀＝1.5〜1.7に達したときに、ベツクマンJS−4.2
ローター中４℃、4000rpmにて20分間遠心分離により収
集した。該細胞を原培養液量の半分倍量の50mMりん酸緩
衝液（pH6.6）に再懸濁させて洗浄した。プラスミドpCA
1A、pCA2AおよびpCA3Aを含有する洗浄した細胞ペレツト
を1/10量のりん酸緩衝液および１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）で抽出し、10％ポリアクリルアミドSDS変性
ゲルにて分析した。この分析により、プラスミドpCA3A
含有イー・コリ培養液はpCA1AまたはpCA2Aで形質転換し
た培養液のいずれよりも多量のaraＢ−CA蛋白の生成が
認められた。

F.プラスミドpCA3A、pCA3BおよびpCA3Dを含有する誘導
イー・コリ細胞の分画工程Ｅで得られた洗浄ペレットを原量の1/10量のりん
酸緩衝液に再懸濁し、０℃に冷却し、フレンチ圧力セル
中で細胞を破砕した。ローター中で４℃、4000rpmで20
分間遠心分離して細胞中の成分を分離した。得られた上
清液および4000rpm分離ペレツトを10％ポリアクリルア
ミドSDS変性ゲルにて分析したところ、pCA3A、3Bおよび
3DのaraＢ−CA融合蛋白のすべて4Kペレツト中に見出さ
れた。

G.合成CAの精製（ａ）臭化シアンによる開裂 1.上記最終工程で得られたaraＢ−CA融合蛋白を含有す
る該4Kペレツトフラクシヨンを90％ギ酸と混合し、蛋白
含量0.7〜1.1mg/mlの70％ギ酸溶液を得た。10倍量（重
量）の臭化シアン（アセトニトリル中1gm/ml含有液）を
加えた。その反応液を窒素でフラツシユし、室温で一夜
培養した。

2.ギ酸および臭化シアンを窒素気流下に除去した。残渣
を70％ギ酸に溶かし、さらに２回、窒素気流下で乾燥し
た。

3.0.1％トリフルオロ酢酸水溶液を加え、開裂したCA
を、タンパク質1mg/mlの濃度で完全に溶解した。

（ｂ）臭化シアンフラグメントの高速液体クロマトグラ
フイー臭化シアン開裂融合タンパク質をHPLCでクロマトグラ
フし、分子のCA部分由来のフラグメントを回収した。Ｃ
−18逆相カラム〔ウオーターズ（Waters）〕を用いた。
水中0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）（バツフアーＡ）お
よびアセトニトリル中0.1％TFA（バツフアーＢ）によ
り、グラデイエントを行つた。開始溶出液は20％バツフ
アーＢを含有していた；試料注入から２分後に、60分間
に及ぶ20％Ｂから60％Ｂへのグラデイエントを開始し
た。流速は1ml/分であつた。溶離像（プロフイール）を
280nmにおいて監視した。溶離した臭化シアン開裂融合
タンパク質のクロマトグラムにおける種々のピークを集
めて後述（実施例４）の細菌活性試験に付した。

H.突然変異セクロピンポリペプチドをコードするpCA3A 核酸配列およびアミノ酸配列は第７図に示されてい
る。

実施例２他の突然変異体セクロピンポリペプチドの例示実施例１、Ｆ−Ｇに記載の如く、プラスミドpCA3Bの
細胞を分画し、CA配列を検出し、合成CAを精製、分析し
た。表IIに示したアミノ酸組成および配列データーは、
第２のクローンも突然変異体セクロピンをコードしてい
るCA遺伝子配列を含有していることを示している。

核酸配列およびアミノ酸配列は第７図に示されてい
る。

実施例３野生型セクロピンＡをコードしているプラスミドpCA3
Dの組立て組立て図は第４および第５図に示されている。

A.p19Cの組立て 1.プラスミドpING1をエンドヌクレアーゼFok１、次いで
BamHIで完全消化した；生じた消化をフエノール／クロ
ロホルム（比1:1）抽出によつて停止させ、水性残渣を
エーテルで洗浄した後、バイオーゲル（Bio−Gel^R）ｐ
−10カラムに通してフエノール／クロロホルムを除去し
た。Fok１消化の結果、“CTAC"5′突出部（オーバーハ
ング）が生じた。この76塩基対のBamHI、Fok１フラグメ
ントはaraＢプロモーターを含有している。

2.N末端に“GATG"5′突出部、Ｃ末端にATTTの突出したE
coRI部位を生成させるために、２個のDNAフラグメントN
o.1およびNo.5をNo.nn−１およびnn−５（配列は第６図
に記載）で置き換える外は実施例１、ステツプＢに記載
の方法と同様の方法を用いて新規なCA遺伝子フラグメン
ト（第６図参照）を組立てた。

3.pBR322をエンドヌクレアーゼBamHIおよびEcoRIで完全
に消化した。生じた消化を前記の如くにして停止させ
た。

4.上記ステツプ１で得たBamHI−Fok１フラグメントと、
上記ステツプ２で得た新規なCA遺伝子を、pBR322の大き
い方のBamHI−EcoRIフラグメントにリゲートさせた。

5.リゲート産物をエンドヌクレアーゼHindIIIで消化
し、pBR322を担つている形質転換体の数を減じた。

6.このHindIII処理プラスミドでイー・コリMC1061を形
質転換した。

7.CA遺伝子フラグメントを担つているプラスミドを含有
するコロニーを、合成DNAフラグメント７（第６図）を
プローブとして用いるコロニーハイブリダイゼーシヨン
により同定した。1,000個のコロニー中に、CAフラグメ
ントを含有している３個の独立したコロニーが見い出さ
れた。単離した各プラスミドをBamHIおよびEcoRI消化に
対し、正しいフラグメントを放出し得るプラスミドをp1
9Cと命名した。サンガーら（Sanger et al.）のジデオ
キシ鎖末端決定法〔PNAS、74:5463−6467（1977）〕を
幾分改良した方法〔ワラスら（Wallace et al.）、ジー
ン（Gene）16:21−26（1981）〕により、CA挿入体のヌ
クレオチド配列を分析したp19CはCA遺伝子の正確な配列
を含有していた。CA遺伝子は、araBプロモーターの下流
側に直結しており、両者の間にはaraB暗号配列が存在し
ていなかつた。

B.pCAOの組立て 1.過剰量の制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBamHIに
より消化することによつてp19CのBamHI−EcoRIフラグメ
ントを切り取つた。また、このプラスミドをPvuI消化に
付し、次のリゲーシヨン工程において、切り取つたフラ
グメントがプラスミドとリリゲート（再結合）する機会
を減少させた。

2.ステツプA.7で得たBamHI−EcoRIフラグメントを、制
限エンドヌクレアーゼBamHIおよびEcoRIで予め処理して
おいたプラスミドpINGにリゲートさせた後、pING1を担
つている形質転換体の数を減少させるために制限エンド
ヌクレアーゼSmaＩで消化した。

3.SmaＩ−処理プラスミドをイー・コリMC1061に導入
（トランスホーム）した。

4.CA遺伝子フラグメントを担つているプラスミドを含有
するコロニーをプラスミドの特性化によつて同定した。
単離した各プラスミドをBamHIおよびEcoRIで消化し、切
り取つたフラグメントのサイズを調べた。正しいサイズ
を有するプラスミドをpCAOと命名した。ジデオキシ鎖末
端決定法によりCA挿入体のヌクレオチド配列決定を行つ
た。pCAOはCA遺伝子の正しい配列を含有していた。この
pCAOは完全なaraＢ制御遺伝子を含有しており、CA遺伝
子は、セクロピンＡをaraB−CA融合タンパク質を生成さ
せずに直接発現する様、araBプロモーターの後方に直結
して存在していた。

C.プラスミドpCA3A− −１の組立てこの組立ての目的は、１個のXmn １部位を除くため
に、pCA3AからAvaＩ−PvuII領域を欠失させることにあ
る。この欠失により、イー・コリ細胞内でのプラスミド
のコピー数を増加させることもできる。

1.pCA3AをエンドヌクレアーゼAvaＩおよびＩおよびPvuI
Iで消化した後、dNTPの存在下、DNAポリメラーゼＩのク
レノウフラグメントで充填し、平滑末端を形成させた。

2.ステツプ１で得たプラスミドを再リゲートし、元のpC
A3Aを含む形質転換体の数を減少させるためにAvaＩとPv
uIIで消化した。

3.このAvaＩ、PvuII処理プラスミドをイー・コリMC1061
に導入した。

4.AvaＩ−PvuII領域を欠失したプラスミドを含有してい
るコロニーを、合成DNAフラグメント５′−TCATCAGCGTG
GTCG−３′をプローブとして用いるコロニーハイブリダ
イゼーシヨンによつて同定した。50コロニー中に、Ava
Ｉ−PvuII欠失を伴なつた46個の独立のコロニーが見い
出された。単離した各プラスミドXmaＩで消化し、切除
フラグメントのサイズを調べた。正しいサイズを有する
プラスミドの１つをpCA3A− −１と命名した。

D.プラスミドpCA3Dの最終的な組立て p19Cは野生型セクロピンＡ配列を含有しているが、ar
aBとの融合タンパク質を生成するために、そのＮ末端に
おける通常の制限部位を欠除されている。

pCA3Aは突然変異体araB−CA融合タンパク質を生成さ
せるためにCA遺伝子のＣ末端付近に存在している２個の
塩基対が欠失されている。

これらの２個のプラスミドを結合させ、araBと融合し
た野生型CA遺伝子を有するプラスミドを組立て、araB−
CA融合タンパク質を生産する。

この組立て模式図を第５図に示す。

1.プラスミドp19C（1ug）をエンドヌクレアーゼXmn１で
完全に消化し、65℃で10分間加熱することにより消化を
停止させた。

2.プラスミドpCA3A− −１（0.1ug）をエンドヌクレア
ーゼXmn１で完全に消化し、65℃で10分間加熱すること
により消化を停止させた。

3.ステツプD.1およびD.2で得たDNAを混合し、リゲート
させた。

4.リゲート産物をPvuIIで消化し、p19Cを担つた形質転
換体の数を減少させた。

5.PvuII−処理プラスミドをイー・コリMC1061に導入し
た。

6.野生型araB−CA遺伝子を担つたプラスミドを含有して
おり、araB−CA融合タンパク質を生産し得るコロニー
を、前記の如きDNA配列決定法により同定した。分析し
た７個のコロニーの内、野生型の配列を有する１個のコ
ロニーを得、pCA3Dと命名した。

核酸配列およびアミノ酸配列を第７図に示す。

実施例４殺菌活性の検定被検生物の生存し得る細胞約10⁷を含有するTYE培地6m
lを用いて寒天平板（直径8cm）を調製した。この平板
に、直径2mmのウエルをパンチ形成した。被検物質を50m
Mりん酸バツフアー（pH6.6）に溶かし、各ウエルに３μ
ｌづつ適用した。25℃で一夜インキユベーシヨンした
後、ウエル周囲の阻止帯またはかさ（halo）の直経を測
定した。かさ形成の標準を求めるために、CA1−33タン
パク質を用いた。ウエルにCA1−33を1ugおよび3ug入れ
ると、イー・コリ株JF568を注入した培地上でそれぞ
れ、直径8mmおよび11mmのかさが生じた。臭化シアン消
化pCA3A araB−CA融合タンパク質10μｇおよび30μｇは
それぞれ、直径7mmおよび18mmのかさを形成した。

HPLCで分画した臭化シアン消化融合タンパク質をもこ
の検定法に適用した。様々なピークを試験したところ、
１つの特異的なピークが生物活性を示した。他の細菌株
および酵母株もこの検定法により試験した。臭化シアン
で消化した、あるいは消化していない融合タンパク質試
料をイー・コリ株JF568の試験において記載した量で適
用し、形成されたかさの直径を測定した。

得られたセクロピン全てに関して得られた結果を表IV
に示す。

実施例５セクロピンおよび腫瘍増殖因子の発酵による生産この実施例では、大腸菌内における、araBプロモータ
ーのコントロール下でのα−TGF（腫瘍増殖因子）およ
びセクロピンの発酵による製造について記載する。イー
・コリ株MC1061はaraB−α−TGFを制御するプラスミド
に支持されたaraBプロモーター（pTGF58）、あるいは、
araB−セクロピン融合遺伝子を制御するプラスミドに支
持されたaraBプロモーター（pCA3D）を含有している。
培養を、アンピシリン（0.1g/l）含有TYE培養培地100ml
中、37℃、250rpmにおいて増殖させた。培養を指数的生
長相（約200Klett単位、赤色フイルター）まで増殖させ
た。次いで培養を調製したてのTYE培地900mlの入つた4l
の遮断（バツフル）振盪フラスコに移した。さらに３時
間インキユベーシヨンを続けた後、生産培地9lに接種し
た。生産培地は表Ｖに記載した成分を含有している。

表Ｖ最初、生産用発酵条件を37℃、800rpm、および1vvm
（１分間当りの容器容量）にセツトした。増殖時期には
溶存酸素が消費されるので、それに応じて、最少溶存酸
素（D.O.）を30％に維持するために攪拌速度と通気率を
増加した。この培地のpHは終始、イー・コリの増殖に適
したpH6.5−6.8に自律調節されていたので、培地のpHを
酸または塩基で調節する必要はなかつた。生産培地への
接種から約４時間後、細胞密度はO.D.₆₀₀=10となり、こ
の時点でＬ−アラビノース（50g）を加えてセクロピン
融合タンパク質の合成を誘導した。発現ベクターの安定
性をさらに確かなものとするために、O.D.₆₀₀=20の時点
でブロス中にアンピシリン1gを補給した。

α−TGFおよびセクロピン−araB融合タンパク質は、
いずれもイー・コリ細胞の不溶性画分中にのみ位置して
いた。顕微鏡的検査により、この不溶性の封入体は、誘
導後１時間後に細胞内に形成され、発酵の間中安定的に
維持されることが分つた。95％以上の細胞が、細胞密度
が増加し続けるのに伴ない、迅速に大きくなる封入体を
少くとも１個含有していた。細胞塊の収率は１当り1
3.1g（乾重量）であつた。細胞塊の約30％が融合タンパ
ク質であつた。

実施例６ araB−hTGF融合タンパク質の発現がS.チフイムリウム
araBプロモーターの制御下に起こるイー・コリベクター
の組立て araBプロモーターはaraC遺伝子産物により、正の制御
を受ける。Ｌ−アラビノースとaraCタンパク質との相互
反応によりaraBプロモーターの発現に必要な活性化因子
（アクテイベーター）が生成される。S.チフイムリウム
（S. typhimurium）araBおよびaraCの遺伝子を含有する
プラスミドを用いてaraB−hTGF（ヒト腫瘍増殖因子α）
発現ベクターを組立てた。プラスミドの組立て方法を第
８図に示す。最終的なプラスミドphTGF5は548アミノ酸
のタンパク質をコードしているaraB−hTGF融合物を含有
している。phTGF5を含有しているイー・コリ株MC1061
を、カゼイン加水分解物（0.5％）とチアミン（1ug/m
l）を補充した最小グリセリン（１％）培地中で増殖さ
せた。培地の密度がA600＝0.2に達したとき、Ｌ−アラ
ビノースを１％になる様に加え、５時間インキユベーシ
ヨンを続けた後、培養物を収集（収穫）した。全細胞性
タンパク質の約10％を表わす55KDalタンパク質がSDS−P
AGEによつて検出された。

実施例７ araB−hTGF遺伝子に付加した転写ターミネーター３′ 転写ターミネーターは、RNAポリメラーゼに転写を終
了させるDNA配列である。araB−hTGF遺伝子の３′末端
に転写ターミネーターを置くことにより、その転写ター
ミネーターから下流の所望しない遺伝子産物の発現が阻
止される。第９図に示したプラスミド構築法参照。最終
的なプラスミドphTGF58は、araB−hTGF遺伝子の３′−
末端に挿入されたイー・コリrrnB遺伝子転写ターミネー
ターを含んでいる。phTGF58またはphTGF5（親プラスミ
ド）のいずれかを含んでいるテー・コリMC1061株から分
離された、部分的に純化したaraB−hTGFタンパク質を、
SDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後比較す
ると、腫瘍な夾雑タンパク質、ベーターラクタマーゼ、
はphTGF58−含有細胞に於いて、有意に減少していた。

実施例８ araBプロモーターおよびカルシトニン A.ヒトカルシトニン遺伝子（hCT）カルシトニンまたはチロカルシトニン（CT）は、甲状
腺から分泌される低カルシウムホルモンにつけられた名
称である。CTは、骨吸収活性を減少させる。CTはまた、
腎臓に作用して尿中カルシウムを増大させ、燐酸を減少
させる。血中カルシウムが高まるとCTが急速に放出され
るのは、CTの主目的は、高等動物を急性高カルシウム症
状から保護することにあることを示している。CTにおけ
る研究は、ペゲツト病（Paget's disease）のコントロ
ール、促進された骨改像の問題、における使用を調べる
ことである。

カルシトニンのヒト遺伝子の配列は、次の通りである
〔クレイグ（Craig）ら、ネーチヤー（Nature）、295 3
45−347（1982）〕。

B.誘導領域、araB構造遺伝子およびhCT遺伝子を保持し
ているプラスミドの構築第10図にその構築を示したプラスミドp115は、正しい
カルシトニン遺伝子配列を含んでいる。このプラスミド
を、第11図に示す様に、エンドヌクレアーゼMstＩおよ
びPstＩで消化し、カニシトニン遺伝子を切り取つた。
切り取つたフラグメントをaraB構造遺伝子を保持してい
るプラスミド（プラスミドpING1、第12図参照）に結合
させた。

pING1構築の出発物質として、無傷のaraCおよびaraB
を含んでいるプラスミドpMH6〔ホルビツツ（Horwitz）
ら、ジーン（Gene）、14、309−319（1981）〕を使用し
た。構築法を第12図に示した。このプラスミドpMH6を制
限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびSalＩで消化し（これ
は、それぞれaraBおよびaraA遺伝子を切断する）、1.9k
bのSalＩ−EcoRＩフラグメントをM13mp9〔ビエイラ（Vi
eira）およびメツシング（Messing）、ジーン（Gen
e）、19 259−268（1982）〕からの16塩基対のSalＩ−E
coRIフラグメントで置換し、pING1を生成させた。araB
遺伝子のリーデイングフレームは、pING1のEcoRI部位へ
lacZ遺伝子を融合することにより決定された。SmaＩお
よびMstＩ制限エンドヌクレアーゼは共に平滑末端フラ
グメントを生成するので、pING1の760塩基対フラグメン
トをプラスミド＃115からのMstＩ−PstＩフラグメント
で置き換えてphCT1を生成させた。プラスミド＃115は、
MstＩ−PstＩフラグメント内に位置する化学合成された
hCTを持つている。MstＩおよびSmaＩ末端の結合でhcT遺
伝子をaraB遺伝に融合し、araB−hCTタンパク融合物を
作成した。

C.phCT1を含有するイー・コリ細胞の増殖 phCT1を含んでいる。形質転換イー・コリ細胞を、振
盪しながら、10⁸-10⁹/ml密度になるまで、37℃で増殖さ
せ、さらに１〜６時間増殖させる間、Ｌ−アラビノース
（１％wt/vol）を添加することにより、araB−カルシト
ニン融合タンパク質の合成を誘導した。収集した細胞を
超音波処理（５秒、３回）し、araB−カルシトニンの濃
度を、抗−hCT抗体を使つてELISA法により分析した。

上記の発明は、理解を助ける目的で例示によつて詳しく
述べたが、請求の範囲によつて限定されこそすれ、その
発明の範囲内に於いてそれを変化および改良し得ること
はいうまでもない。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者リン，ユン‐ロンアメリカ合衆国カリフオルニア90064、ロスアンジエルス、クラークソン・ロード 11446番 (72)発明者レイ，ダンアメリカ合衆国カリフオルニア91316、エンシノ、リンドリー・アベニユー4610番 (72)発明者ウイルコツクス，ゲイリーアメリカ合衆国カリフオルニア90265、マリブ、シーホーン・ドライブ3637番 (56)参考文献Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．292，Ｐ．246− 248（1981) Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．14，Ｐ．309−319 （1981) 「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ，Ｅｄ. Ｒｏｄｏｒｉｇｕｅｓｅｔａｌ，ＰｒａｅｇａｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐ. 183−194（1982)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】与えられた宿主において発現可能なポリヌ
クレオチド分子を有する複製可能な発現ビヒクルであっ
て、以下の塩基配列を有するaraBプロモーターの配列を
含有し、該プロモーターは、（１）酵素、ホルモン、抗体、ヘモグロビン、構造タン
パク質、α、β又はγインターフェロン、インターロイ
キン、インスリン又は組織プラスミノーゲンアクチベー
ターからなる群から選ばれるポリペプチドであるが、タ
ウマチンではない、生物活性を有するポリペプチド、又
は（２）該生物活性を有するポリペプチドと付加的なポリ
ペプチドからなる融合タンパク質であって、両ペプチド
が隣接する位置に選択的開裂部位を有する融合前駆体タ
ンパク質をコードしている遺伝子であって該プロモーターに対し
てヘテロローガスな遺伝子と機能的に結合しているプロ
モーターであることを特徴とする、複製可能な発現ビヒ
クル。
【請求項２】ビヒクルが、プラスミド又はバクテリオフ
ァージである第１項に記載の複製可能な発現ビヒクル。
【請求項３】生物活性を有するポリペプチドが、ヒトの
カルシトニン、ヒト腫瘍成長因子又はセクロピンである
第１項又は第２項に記載の複製可能な発現ビヒクル。
【請求項４】開裂部位が、メチオニン、スパラギン−グ
リシン、アスパラギン酸−プロリン、リジン、アルギニ
ン又はリジン−アルギニンである第１項ないし第３項の
内のいずれか１つに記載の複製可能な発現ビヒクル。
【請求項５】与えられた宿主において発現可能なポリヌ
クレオチド分子を有する複製可能な発現ビヒクルであっ
て、以下の塩基配列を有するaraBプロモーターの配列を
含有し、該プロモーターは、（１）酵素、ホルモン、抗体、ヘモグロビン、構造タン
パク質、α、β又はγインターフェロン、インターロイ
キン、インスリン又は組織プラスミノーゲンアクチベー
ターからなる群から選ばれるポリペプチドであるが、タ
ウマチンではない、生物活性を有するポリペプチド、又
は（２）該生物活性を有するポリペプチドと付加的なポリ
ペプチドからなる融合タンパク質であって、両ペプチド
が隣接する位置に選択的開裂部位を有する融合前駆体タ
ンパク質をコードしている遺伝子であって該プロモーターに対し
てヘテロローガスな遺伝子と機能的に結合しているプロ
モーターであることを特徴とする、複製可能な発現ビヒ
クルで形質転換された細菌宿主。
【請求項６】大腸菌、ネズミチフス菌（サルモネラ・チ
フイムリウム）又は霊菌（セラチア・チフイムリウム）
である第５項に記載の細菌宿主。