JPH082315B2 - リンホトキシンを含む融合蛋白質 - Google Patents
リンホトキシンを含む融合蛋白質Info
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- JPH082315B2 JPH082315B2 JP63-504508A JP50450888A JPH082315B2 JP H082315 B2 JPH082315 B2 JP H082315B2 JP 50450888 A JP50450888 A JP 50450888A JP H082315 B2 JPH082315 B2 JP H082315B2
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- lymphotoxin
- dna
- antibody
- fusion protein
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
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- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
この発明は、プロテインＡの抗体結合部位を含むポリ
ペプチド及びリンホトキシンのポリペプチドを含んで成
る融合蛋白質、該融合蛋白質をコードするDNA、このDNA
を含んで成るプラスミド、このプラスミドにより形質転
換された大腸菌、及びこの大腸菌を用いて前記融合蛋白
質を製造する方法に関する。
ペプチド及びリンホトキシンのポリペプチドを含んで成
る融合蛋白質、該融合蛋白質をコードするDNA、このDNA
を含んで成るプラスミド、このプラスミドにより形質転
換された大腸菌、及びこの大腸菌を用いて前記融合蛋白
質を製造する方法に関する。
近年、癌細胞に特異的なモノクローナル抗体と制癌物
質とを連結し、このモノクローナル抗体の特異性により
制癌物質を癌組織に集中させようとする、いわゆるター
ゲッティング療法が研究されている。
質とを連結し、このモノクローナル抗体の特異性により
制癌物質を癌組織に集中させようとする、いわゆるター
ゲッティング療法が研究されている。
この様な方法に用いる制癌物質として制癌抗生物質、
植物毒素リシン、ジフテリア毒素等が検討されている
が、ターゲッティング療法の制癌物質としてリンホトキ
シンを使用する試みは行われていない。
植物毒素リシン、ジフテリア毒素等が検討されている
が、ターゲッティング療法の制癌物質としてリンホトキ
シンを使用する試みは行われていない。
癌特異的抗体と制癌物質との連結方法としては、これ
らを直接共有結合せしめる方法、及び制癌物質を封入し
たリポゾームと癌特異的抗体とを結合せしめる方法等が
知られている。
らを直接共有結合せしめる方法、及び制癌物質を封入し
たリポゾームと癌特異的抗体とを結合せしめる方法等が
知られている。
しかしながらプロテインＡの抗体親和性を利用して癌
特異的抗体と制癌物質とを連結してターゲッティング療
法を行う試みは行われていない。
特異的抗体と制癌物質とを連結してターゲッティング療
法を行う試みは行われていない。
プロテインＡと生理活性ペプチドとの融合蛋白質を調
整することはすでに知られている（WO 84/03103）が、
これは主として生理活性ペプチドのアフィニティ精製、
及び免疫抗原の調整のために用いられている。
整することはすでに知られている（WO 84/03103）が、
これは主として生理活性ペプチドのアフィニティ精製、
及び免疫抗原の調整のために用いられている。
制癌物質を癌特異的な抗体に化学的に連結してターゲ
ッティング療法に利用する従来の方法では制癌物質が癌
細胞に入りにくいという欠点があった。これに対して、
リンホトキシンは癌細胞表面のレセプターを介して癌細
胞を選択的且つ直接的に殺すことが知られている。従っ
て、本発明は、この様な有利な性質を有するリンホトキ
シンを制癌物質として使用して、ターゲッティング療法
等、有効な癌療法を行うための手段を提供しようとする
ものである。
ッティング療法に利用する従来の方法では制癌物質が癌
細胞に入りにくいという欠点があった。これに対して、
リンホトキシンは癌細胞表面のレセプターを介して癌細
胞を選択的且つ直接的に殺すことが知られている。従っ
て、本発明は、この様な有利な性質を有するリンホトキ
シンを制癌物質として使用して、ターゲッティング療法
等、有効な癌療法を行うための手段を提供しようとする
ものである。
上記の目的を達成するため、本発明は、プロテインＡ
の抗体結合部位を含むポリペプチドとリンホトキシンの
ポリペプチドとを含んで成り、リンホトキシンが本来有
する生物学的活性、すなわち制癌作用、及びプロテイン
Ａが本来有する抗体との結合能力を共に有する融合蛋白
質を提供し、さらにこの融合蛋白質の製造方法、並びに
この製造方法において必要な該融合蛋白質をコードする
DNA、該DNAを含有するプラスミド及び該プラスミドによ
り形質転換された大腸菌を提供する。
の抗体結合部位を含むポリペプチドとリンホトキシンの
ポリペプチドとを含んで成り、リンホトキシンが本来有
する生物学的活性、すなわち制癌作用、及びプロテイン
Ａが本来有する抗体との結合能力を共に有する融合蛋白
質を提供し、さらにこの融合蛋白質の製造方法、並びに
この製造方法において必要な該融合蛋白質をコードする
DNA、該DNAを含有するプラスミド及び該プラスミドによ
り形質転換された大腸菌を提供する。
図面の簡単な説明
第１図はプラスミドpLTM1の作製を示す。
第２図はプラスミドpLTM2の作製を示す。
第３−１図及び第３−２図は、本発明のプラスミド作
製のための出発プラスミドpLTM2中の、天然リンホトキ
シンをコードするDNAの塩基配列及び対応するポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。
製のための出発プラスミドpLTM2中の、天然リンホトキ
シンをコードするDNAの塩基配列及び対応するポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。
第４−１図及び第４−２図はプラスミドpRIT2T中のプ
ロテインＡをコードするDNAの塩基配列及びそれに対応
するポリペプチドのアミノ酸配列の内この発明に関連す
る部分を示す。
ロテインＡをコードするDNAの塩基配列及びそれに対応
するポリペプチドのアミノ酸配列の内この発明に関連す
る部分を示す。
第５図はプラスミドpLTM9の作製を示す。
第６図は本発明のプラスミドpPRALT1の作製を示す。
第７図は本発明の融合蛋白質の連結部分をコードする
塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
本発明の融合蛋白質はそのリンホトキシンペプチド部
分において制癌作用を示し、且つそのプロテインＡ部分
においてアフィニティーにより抗体と結合する能力を有
するので、このアフィニティーにより癌に対して特異的
な抗体、例えばモノクローナル抗体と結合して複合体を
形成することができる。そして、この様な複合体を非経
口的に投与した場合、癌に対して特異的な抗体の作用に
よって癌細胞に集中し、そこで癌細胞表面のリンホトキ
シンレセプターとリンホトキシンとの親和性により融合
蛋白質が癌細胞に引き渡されると期待される。
分において制癌作用を示し、且つそのプロテインＡ部分
においてアフィニティーにより抗体と結合する能力を有
するので、このアフィニティーにより癌に対して特異的
な抗体、例えばモノクローナル抗体と結合して複合体を
形成することができる。そして、この様な複合体を非経
口的に投与した場合、癌に対して特異的な抗体の作用に
よって癌細胞に集中し、そこで癌細胞表面のリンホトキ
シンレセプターとリンホトキシンとの親和性により融合
蛋白質が癌細胞に引き渡されると期待される。
A.融合蛋白質及びそれをコードするDNA
本発明の融合ペプチドはプロテインＡの抗体結合部位
を含むポリペプチド及びリンホトキシンのポリペプチド
を含んで成り、場合によってはこの両ポリペプチド間に
オリゴペプチドリンカーが介在する。
を含むポリペプチド及びリンホトキシンのポリペプチド
を含んで成り、場合によってはこの両ポリペプチド間に
オリゴペプチドリンカーが介在する。
（１）プロテインＡの抗体結合部位を含むポリペプチド
及びこれをコードするDNA 抗体結合能力を有する限り、この部分の長さは特に限
定されない。プロテインＡのアミノ酸配列はすでに決定
されており、これをコードするDNAを含有するプラスミ
ドが販売されている。従って本発明においてはこの様な
プラスミドを出発プラスミドとして使用することができ
る。この様なプラスミドとして、例えばファルマシア社
から入手することができるプラスミドpRIT2Tを挙げるこ
とができる（第５図）。このプラスミド中のプロテイン
Ａのアミノ酸配列をコードする塩基配列の内、本発明に
関連する部分を第４−１図及び第４−２図に示す。
及びこれをコードするDNA 抗体結合能力を有する限り、この部分の長さは特に限
定されない。プロテインＡのアミノ酸配列はすでに決定
されており、これをコードするDNAを含有するプラスミ
ドが販売されている。従って本発明においてはこの様な
プラスミドを出発プラスミドとして使用することができ
る。この様なプラスミドとして、例えばファルマシア社
から入手することができるプラスミドpRIT2Tを挙げるこ
とができる（第５図）。このプラスミド中のプロテイン
Ａのアミノ酸配列をコードする塩基配列の内、本発明に
関連する部分を第４−１図及び第４−２図に示す。
（２）リンホトキシンのポリペプチド及びこれをコード
するDNA この部分としては、融合蛋白質の形態でリンホトキシ
ンの生物学的活性を発揮することができる限り、任意の
長さのポリペプチドを使用することができる。本発明に
おいては具体例としてヒトーリンホトキシンの全長ポリ
ペプチドを用いる。
するDNA この部分としては、融合蛋白質の形態でリンホトキシ
ンの生物学的活性を発揮することができる限り、任意の
長さのポリペプチドを使用することができる。本発明に
おいては具体例としてヒトーリンホトキシンの全長ポリ
ペプチドを用いる。
天然リンホトキシンのcDNAを含有する一連のプラスミ
ドpLT1、pLTM1及びpLTM2はすでに得られており、その作
製方法は特願昭61−123700号明細書に詳細に記載されて
いる。プラスミドpLT1を含有する大腸菌エシェリシア・
コリ（Escherichia coli）x1776/pLT1は微工研菌寄第87
84号（FERM P−8784）として、プラスミドpLTMを含有す
る大腸菌エシェリシア・コリ（Escherichia coli）x177
6/pLTM2は微工研菌寄第8785号（FERM P−8785）とし
て、それぞれ工業技術院生物工業技術研究所に寄託され
ている。これらのプラスミドの作製方法は参考例として
後記し、第１図及び第２図に要約する。従って、本発明
のプラスミドはこれらのすでに得られているプラスミド
から出発して作製することができる。なお、本発明の出
発プラスミドpLTM2中のリンホトキシンをコードするDNA
配列及び対応するアミノ酸配列を第３−１図及び第３−
２図に示す。
ドpLT1、pLTM1及びpLTM2はすでに得られており、その作
製方法は特願昭61−123700号明細書に詳細に記載されて
いる。プラスミドpLT1を含有する大腸菌エシェリシア・
コリ（Escherichia coli）x1776/pLT1は微工研菌寄第87
84号（FERM P−8784）として、プラスミドpLTMを含有す
る大腸菌エシェリシア・コリ（Escherichia coli）x177
6/pLTM2は微工研菌寄第8785号（FERM P−8785）とし
て、それぞれ工業技術院生物工業技術研究所に寄託され
ている。これらのプラスミドの作製方法は参考例として
後記し、第１図及び第２図に要約する。従って、本発明
のプラスミドはこれらのすでに得られているプラスミド
から出発して作製することができる。なお、本発明の出
発プラスミドpLTM2中のリンホトキシンをコードするDNA
配列及び対応するアミノ酸配列を第３−１図及び第３−
２図に示す。
（３）リンカーオリゴペプチド及びこれをコードするDN
A配列 本発明において、本発明の融合蛋白質をコードする発
現プラスミドの作製の過程でプロテインＡの抗体結合部
位を含むポリペプチドをコードするDNAとリンホトキシ
ンのポリペプチドをコードするDNAとの間にコンセンサ
スSD配列等のオリゴヌクレオチド配列が介在する場合が
あり、従って本発明の融合蛋白質は、プロテインＡの抗
体結合部位を含むペプチドとリンホトキシンのポリペプ
チドが直接連結されたもののほか、これらが前記オリゴ
ヌクレオチドによりコードされるオリゴペプチドリンカ
ーを介して連結されているものも包含する。
A配列 本発明において、本発明の融合蛋白質をコードする発
現プラスミドの作製の過程でプロテインＡの抗体結合部
位を含むポリペプチドをコードするDNAとリンホトキシ
ンのポリペプチドをコードするDNAとの間にコンセンサ
スSD配列等のオリゴヌクレオチド配列が介在する場合が
あり、従って本発明の融合蛋白質は、プロテインＡの抗
体結合部位を含むペプチドとリンホトキシンのポリペプ
チドが直接連結されたもののほか、これらが前記オリゴ
ヌクレオチドによりコードされるオリゴペプチドリンカ
ーを介して連結されているものも包含する。
B.プラスミド
本発明のプラスミドは適当な制御配列の制御のもとに
前記DNAコード領域を含有し、大腸菌中でこのDNAコード
領域を発現せしめることができるプラスミドである。プ
ロモーターとしては、例えばPLプロモーター、tacプロ
モーター、trtプロモーター、lacUV5プロモーター、等
を使用することができ、またSD配列として、例えばメタ
ピロカテカーゼ遺伝子のSD配列およびコンセンサスなら
SD配列を使用することができる。
前記DNAコード領域を含有し、大腸菌中でこのDNAコード
領域を発現せしめることができるプラスミドである。プ
ロモーターとしては、例えばPLプロモーター、tacプロ
モーター、trtプロモーター、lacUV5プロモーター、等
を使用することができ、またSD配列として、例えばメタ
ピロカテカーゼ遺伝子のSD配列およびコンセンサスなら
SD配列を使用することができる。
大腸菌でのリンホトキシンの発現量を増大させるため
に、発明者らはプラスミドpLTM2より３種のプラスミドp
LTM7、pLTM9、及びpLTM11を作製した。プラスミドpLTM7
はプラスミドpLTM2中のリンホトキシンの３′非翻訳領
域を欠除させたものであり、その領域に存在するmRNAを
不安定化させる領域を欠除する事により発現量が約２倍
増加した。プラスミド2pLTM9は、プラスミドpLTM7に理
想的なコンセンサスSD配列を付与したものであり、SD領
域の改善により発現量がさらに約２倍増加した。プラス
ミドpLTM11は、プラスミドpLTM9のＮ末端のメチオニン
に続くロイシン、プロリンのコドンをmRNAの転写に有利
なように改変したプラスミドであり発現量がさらに約２
倍増加した。
に、発明者らはプラスミドpLTM2より３種のプラスミドp
LTM7、pLTM9、及びpLTM11を作製した。プラスミドpLTM7
はプラスミドpLTM2中のリンホトキシンの３′非翻訳領
域を欠除させたものであり、その領域に存在するmRNAを
不安定化させる領域を欠除する事により発現量が約２倍
増加した。プラスミド2pLTM9は、プラスミドpLTM7に理
想的なコンセンサスSD配列を付与したものであり、SD領
域の改善により発現量がさらに約２倍増加した。プラス
ミドpLTM11は、プラスミドpLTM9のＮ末端のメチオニン
に続くロイシン、プロリンのコドンをmRNAの転写に有利
なように改変したプラスミドであり発現量がさらに約２
倍増加した。
（１）プラスミドpLTM7の作製法
リンホトキシン遺伝子を含有する出発プラスミドpLTM
2からEcoRIによりリンホトキシン遺伝子を含有するDNA
断片を切り出し、これをM13ファージmp10のEcoRI部位に
挿入して、オリゴヌクレオチドプライマーを用いること
により特異的塩基置換変異を行い、リンホトキシン遺伝
子の翻訳終止コドンの下流にEcoRI部位を導入して変異
体ファージLTM 61を得る。
2からEcoRIによりリンホトキシン遺伝子を含有するDNA
断片を切り出し、これをM13ファージmp10のEcoRI部位に
挿入して、オリゴヌクレオチドプライマーを用いること
により特異的塩基置換変異を行い、リンホトキシン遺伝
子の翻訳終止コドンの下流にEcoRI部位を導入して変異
体ファージLTM 61を得る。
この変異体ファージの二本鎖DNAからEcoRIによりリン
ホトキシン遺伝子を切り出し、これをプラスミドpLTM2
のリンホトキシン遺伝子を含まないEcoRIベクター断片
に挿入することによりプラスミドpLTM7を得る。この方
法の詳細を実施例１に記載する。
ホトキシン遺伝子を切り出し、これをプラスミドpLTM2
のリンホトキシン遺伝子を含まないEcoRIベクター断片
に挿入することによりプラスミドpLTM7を得る。この方
法の詳細を実施例１に記載する。
（２）プラスミドpLTM9の作製法
次に、このpLTM7を制限酵素XcyIにより切断してリン
ホトキシン遺伝子を含むDNA断片を生じさせ、これに前
記リンカーを連結し、さらにEcoRIにより切断すること
により、リンホトキシン遺伝子及びインカーヌクレオチ
ドから成る537bpのEcoRI−EcoRI DNA断片を得る。このD
NA断片をプラスミドpLTM2のリンホトキシン遺伝子を含
まないEcoRIベクターに挿入する事によりプラスミドpLT
M9を得る。この方法の詳細とリンカーに用いたオリゴヌ
クレオチドの配列を実施例２に記載する。
ホトキシン遺伝子を含むDNA断片を生じさせ、これに前
記リンカーを連結し、さらにEcoRIにより切断すること
により、リンホトキシン遺伝子及びインカーヌクレオチ
ドから成る537bpのEcoRI−EcoRI DNA断片を得る。このD
NA断片をプラスミドpLTM2のリンホトキシン遺伝子を含
まないEcoRIベクターに挿入する事によりプラスミドpLT
M9を得る。この方法の詳細とリンカーに用いたオリゴヌ
クレオチドの配列を実施例２に記載する。
（３）プラスミドpLTM11の作製法
プラスミドpLTM9より、プラスミドpLTM7の作製法と同
様の方法によりファージLTM81とプラスミドpLTM11を得
る。この方法の詳細を実施例３に記載する。
様の方法によりファージLTM81とプラスミドpLTM11を得
る。この方法の詳細を実施例３に記載する。
（４）プラスミドpPRALT1の作製法
リンホトキシン遺伝子を含有する出発プラスミドpLTM
9からEcoRIによりリンホトキシン遺伝子を含有するDNA
断片を切出し、それを前記プロテインＡをコードするプ
ラスミドpRIT2TのEcoRI部位に挿入する事により、本発
明の融合蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミドpP
RALT1を得る。この方法の詳細は実施例４に記載する。
このプラスミドpPRALT1を含有する大腸菌エシェリシャ
・コリ（Escherichia coli）x1776/pPRALT1は微工研条
寄第1899号（FERM BP−1899） 〔原国内寄託：微工研菌寄第9389号（FERM P−9389）〕
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
9からEcoRIによりリンホトキシン遺伝子を含有するDNA
断片を切出し、それを前記プロテインＡをコードするプ
ラスミドpRIT2TのEcoRI部位に挿入する事により、本発
明の融合蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミドpP
RALT1を得る。この方法の詳細は実施例４に記載する。
このプラスミドpPRALT1を含有する大腸菌エシェリシャ
・コリ（Escherichia coli）x1776/pPRALT1は微工研条
寄第1899号（FERM BP−1899） 〔原国内寄託：微工研菌寄第9389号（FERM P−9389）〕
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
C.形質転換される大腸菌
本発明においては、遺伝子工学的手法によりポリペプ
チドを生産する場合に常用されている任意の大腸菌株を
用いることができ、例えば、N48301、RR1、RB791、SM3
2、HB101、N99、JM103等を挙げることができる。
チドを生産する場合に常用されている任意の大腸菌株を
用いることができ、例えば、N48301、RR1、RB791、SM3
2、HB101、N99、JM103等を挙げることができる。
D.目的ポリペプチドの発現
目的ポリペプチドの発現は、前記のプラスミドにより
形質転換された大腸菌を、例えばLB培地等において常法
に従って培養し、プロモーターに依存して誘導操作を行
うことにより行うことができる。次に大腸菌体から、こ
の産生したポリペプチドを回収することにより目的とす
るポリペプチドを得ることができる。詳細は後の実施例
において記載する。
形質転換された大腸菌を、例えばLB培地等において常法
に従って培養し、プロモーターに依存して誘導操作を行
うことにより行うことができる。次に大腸菌体から、こ
の産生したポリペプチドを回収することにより目的とす
るポリペプチドを得ることができる。詳細は後の実施例
において記載する。
E.殺細胞活性
前記の方法により得られたポリペプチドの殺細胞活性
は、例えばマイクロプレート法により測定することがで
きる。この測定方法及び結果は、後の実施例において詳
細に説明する。
は、例えばマイクロプレート法により測定することがで
きる。この測定方法及び結果は、後の実施例において詳
細に説明する。
本発明の融合蛋白質はリンホトキシンが本来有する殺
細胞活性を維持している。
細胞活性を維持している。
F.融合蛋白質の抗体に対する親和性
実施例において詳細に説明する様に、本発明の融合蛋
白質は抗体に対する親和性を有し、抗体と複合体を形成
することができる。
白質は抗体に対する親和性を有し、抗体と複合体を形成
することができる。
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例1.プラスミドpLTM7の作製
（１）終止コドンの直接下流へのEcoRI部位の導入
プラスミドpLTM2を制限酵素EcoRIで切断し、リンホト
キシン遺伝子を含む断片を0.8％アガロースゲルより回
収した。
キシン遺伝子を含む断片を0.8％アガロースゲルより回
収した。
このDNA断片0.5pmolとM13ファージmp10の２本鎖DNAの
EcoRI切断物0.5pmolとを混合し、66mM Tris−HCl（pH
7.5）、5mM MgCl2、5mM DTT及び1mM ATP含有する溶液20
μｌ中で100ユニットのT4DNAリガーゼを用いて12℃にて
16時間連結反応を行った。反応後、反応液を用いてメッ
シング等の方法〔メッシング等、メソズ・イン・エンチ
モロジー（Methods in Enzymology）101、20−78、198
3〕に従って大腸菌JM 103を形質転換し、0.02％Ｘ−gal
及び1mMIPTGを含有する軟寒天と共にプレートし、37℃
にて一晩培養した。組換体によって形成された白いプラ
ークより一本鎖鋳型DNAを調整した。すなわち、白いプ
ラークをつまようじの先端で釣り、大腸菌JM 103が生育
している。1.5mlの２×YT培養液（1.6％バクトトリプト
ン、１％酵母エキストラクト及び0.5％NaCl）中に懸濁
して37℃にて５時間培養し、そして培養液上清から、ポ
リエチレングリコール沈澱、フェノール処理及びエタノ
ール沈澱によって１本鎖組換体ファージDNAを回収し
た。
EcoRI切断物0.5pmolとを混合し、66mM Tris−HCl（pH
7.5）、5mM MgCl2、5mM DTT及び1mM ATP含有する溶液20
μｌ中で100ユニットのT4DNAリガーゼを用いて12℃にて
16時間連結反応を行った。反応後、反応液を用いてメッ
シング等の方法〔メッシング等、メソズ・イン・エンチ
モロジー（Methods in Enzymology）101、20−78、198
3〕に従って大腸菌JM 103を形質転換し、0.02％Ｘ−gal
及び1mMIPTGを含有する軟寒天と共にプレートし、37℃
にて一晩培養した。組換体によって形成された白いプラ
ークより一本鎖鋳型DNAを調整した。すなわち、白いプ
ラークをつまようじの先端で釣り、大腸菌JM 103が生育
している。1.5mlの２×YT培養液（1.6％バクトトリプト
ン、１％酵母エキストラクト及び0.5％NaCl）中に懸濁
して37℃にて５時間培養し、そして培養液上清から、ポ
リエチレングリコール沈澱、フェノール処理及びエタノ
ール沈澱によって１本鎖組換体ファージDNAを回収し
た。
得られた１本鎖DNAを鋳型としてメッシングらの方法
（前掲）に従ってジデオキシ法により塩基配列を決定
し、クローニングされた１本鎖DNAの配列を確認した。
こうしてリンホトキシン遺伝子のアンチコーディング鎖
を含む１本鎖DNAが得られた。この組換体ファージをLTM
21と命名した。
（前掲）に従ってジデオキシ法により塩基配列を決定
し、クローニングされた１本鎖DNAの配列を確認した。
こうしてリンホトキシン遺伝子のアンチコーディング鎖
を含む１本鎖DNAが得られた。この組換体ファージをLTM
21と命名した。
上記のようにしてえられたLTM21の１本鎖DNAを鋳型と
して用い、合成オリゴヌクレオチド： CGC TCT GTA GAA TTC GGA AAA ATC CAG をプライマーとして、DNAポリメラーゼKlenow断片によ
る修復反応を行った。すなわち、鋳型１本鎖DNA0.5pmol
に５′末端を燐酸化したプライマー2pmolを加え、そし
て7mM Tris−HCl（pH7.5）、0.1mM EDTA、20mM NaCl及
び7mM MgCl2を含有する溶液10μｌ中で60℃にて20分間
保持し、続いて23℃にて20分間保持した。さらに、この
反応混合物に、dATP、dGTP、dTTP、及びdCTPをそれぞれ
0.5mMになるように加え、全体を20μｌとしてDNAポリメ
ラーゼKlenow断片２ユニットを加え、そして23℃にて20
分間インキュベートした。続いて、１−mMATPを１μｌ
及びT4DNAリガーゼ１ユニットを加え、12℃にて一晩イ
ンキュベートした。
して用い、合成オリゴヌクレオチド： CGC TCT GTA GAA TTC GGA AAA ATC CAG をプライマーとして、DNAポリメラーゼKlenow断片によ
る修復反応を行った。すなわち、鋳型１本鎖DNA0.5pmol
に５′末端を燐酸化したプライマー2pmolを加え、そし
て7mM Tris−HCl（pH7.5）、0.1mM EDTA、20mM NaCl及
び7mM MgCl2を含有する溶液10μｌ中で60℃にて20分間
保持し、続いて23℃にて20分間保持した。さらに、この
反応混合物に、dATP、dGTP、dTTP、及びdCTPをそれぞれ
0.5mMになるように加え、全体を20μｌとしてDNAポリメ
ラーゼKlenow断片２ユニットを加え、そして23℃にて20
分間インキュベートした。続いて、１−mMATPを１μｌ
及びT4DNAリガーゼ１ユニットを加え、12℃にて一晩イ
ンキュベートした。
上記２本鎖DNA0.1pmolを用いてメッシングの方法に従
い大腸菌JM 103を形質転換した。
い大腸菌JM 103を形質転換した。
上記のようにして得られたファージプラークについ
て、さきのオリゴヌクレオチド（32Pで標識したもの）
をプローブとして用いて、プラークハイブリダイゼーシ
ョンによる変異体ファージのスクリーニングを行った。
すなわち、ベントン・デイビス等の方法〔W.D.ベントン
及びR.W.デイビス、サイエンス（Sciance）196、180、1
977〕に従って軟寒天培地からニトロセルロースフィル
ターにプラークを移し、真空中80℃にて２時間ベーキン
グした。このニトロセルロースフィルターを６×SSC、1
0×Denhardt溶液中で、32Pで標識したプライマーオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして23℃にて１晩ハイブリダ
イゼーションを行った。次に、このフィルターを６×SS
C中で59℃にて洗浄し、そしてオートラジオグラフィー
を行い陽性シグナルを示す変異体ファージプラークを単
離した。
て、さきのオリゴヌクレオチド（32Pで標識したもの）
をプローブとして用いて、プラークハイブリダイゼーシ
ョンによる変異体ファージのスクリーニングを行った。
すなわち、ベントン・デイビス等の方法〔W.D.ベントン
及びR.W.デイビス、サイエンス（Sciance）196、180、1
977〕に従って軟寒天培地からニトロセルロースフィル
ターにプラークを移し、真空中80℃にて２時間ベーキン
グした。このニトロセルロースフィルターを６×SSC、1
0×Denhardt溶液中で、32Pで標識したプライマーオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして23℃にて１晩ハイブリダ
イゼーションを行った。次に、このフィルターを６×SS
C中で59℃にて洗浄し、そしてオートラジオグラフィー
を行い陽性シグナルを示す変異体ファージプラークを単
離した。
このファージプラークよりラピドアイソレーション法
により２本鎖ファージを調整し、これをEcoRIで切断し
て715bpの断片を得、これを鋳型としてジデオキシ法に
より塩基配列を決定し、塩基置換変異が生じ、リンホト
キシン遺伝子の終止コドンの直接下流にEcoRI部位を有
するファージを得た事を確認した。この変異体ファージ
株をJM 103/LTM 61と命名した。
により２本鎖ファージを調整し、これをEcoRIで切断し
て715bpの断片を得、これを鋳型としてジデオキシ法に
より塩基配列を決定し、塩基置換変異が生じ、リンホト
キシン遺伝子の終止コドンの直接下流にEcoRI部位を有
するファージを得た事を確認した。この変異体ファージ
株をJM 103/LTM 61と命名した。
（２）プラスミドの作製と形質転換
ファージJM 103/LTM 61より常法に従って２本鎖DNAを
調整し、制限酵素EcoRIで切断してリンホトキシン遺伝
子を有するDNA断片を0.8％アガロースゲル電気泳動より
回収してElutip−ｄで精製した。
調整し、制限酵素EcoRIで切断してリンホトキシン遺伝
子を有するDNA断片を0.8％アガロースゲル電気泳動より
回収してElutip−ｄで精製した。
プラスミドpLTM2のリンホトキシン遺伝子を含まないE
coRI断片0.5pmolと上記のDNA断片0.5pmolとを40mM HEPE
S（pH7.8）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM ATP中でT4
リガーゼ100ユニットを用いて12℃にて16時間反応を行
った。
coRI断片0.5pmolと上記のDNA断片0.5pmolとを40mM HEPE
S（pH7.8）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM ATP中でT4
リガーゼ100ユニットを用いて12℃にて16時間反応を行
った。
この反応液を10μｌを用いて大腸菌株RR1を形質転換
し、100μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換を選ん
だ。形質転換体のコロニーからプラスミドDNAを抽出し
ジデオキシ法により塩基配列を確認した。このプラスミ
ドをpLTM7と命名した。
し、100μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換を選ん
だ。形質転換体のコロニーからプラスミドDNAを抽出し
ジデオキシ法により塩基配列を確認した。このプラスミ
ドをpLTM7と命名した。
実施例2.プラスミドpLTM9の作製（第５図）
24μｇのプラスミドpLTM7（156μｌ）を60ユニットの
制限酵素Xcy I（24μｌ）及び20μｌのXcy I緩衝液と共
に37℃にて４時間インキュベートし、次にこの反応混合
物に９μｇ（20μｌ）ずつの次の５′リン酸化オリゴヌ
クレ の溶液を添加し、この混合物をフェノール及びクロロホ
ルムで抽出し、エタノール沈澱によりDNAを回収し、こ
れを乾燥した。このDNAを40mM HEPES（pH7.8）、10mM M
gcl2、10mM DTT、0.4mM ATP中でT4リガーゼ100ユニット
を用いて12℃にて16時間反応を行った。この反応混合物
をフェノール及びクロロホルムにより抽出した後エタノ
ール沈澱によりDNAを沈澱せしめ、この沈澱を乾燥し
た。
制限酵素Xcy I（24μｌ）及び20μｌのXcy I緩衝液と共
に37℃にて４時間インキュベートし、次にこの反応混合
物に９μｇ（20μｌ）ずつの次の５′リン酸化オリゴヌ
クレ の溶液を添加し、この混合物をフェノール及びクロロホ
ルムで抽出し、エタノール沈澱によりDNAを回収し、こ
れを乾燥した。このDNAを40mM HEPES（pH7.8）、10mM M
gcl2、10mM DTT、0.4mM ATP中でT4リガーゼ100ユニット
を用いて12℃にて16時間反応を行った。この反応混合物
をフェノール及びクロロホルムにより抽出した後エタノ
ール沈澱によりDNAを沈澱せしめ、この沈澱を乾燥し
た。
この沈澱を160μｌの蒸留水に溶解し、300ユニットの
EcoRI（20μｌ）及び20μｌのEcoRI緩衝液（20μｌ）と
混合して、37℃にて２時間インキュベートし、この反応
混合物を凍結した。
EcoRI（20μｌ）及び20μｌのEcoRI緩衝液（20μｌ）と
混合して、37℃にて２時間インキュベートし、この反応
混合物を凍結した。
この反応混合物を、２％アガロースゲルを用いる電気
泳動により分離し、537bpのDNA断片を含有するゲル部分
を切り出し、透析膜中で電気透析により溶出した。この
溶出液をelutip−ｄカラムに適用し、DNAを吸着した
後、カラムを洗浄し、溶離液のイオン濃度を上げること
によりDNAを溶出、回収した。エタノール沈澱物を乾燥
し、得られたDNAを20μｌの蒸留水に溶解した。
泳動により分離し、537bpのDNA断片を含有するゲル部分
を切り出し、透析膜中で電気透析により溶出した。この
溶出液をelutip−ｄカラムに適用し、DNAを吸着した
後、カラムを洗浄し、溶離液のイオン濃度を上げること
によりDNAを溶出、回収した。エタノール沈澱物を乾燥
し、得られたDNAを20μｌの蒸留水に溶解した。
プラスミドpLTM2のリンホトキシン遺伝子を含まないE
coRI断片0.5pmolと上記のDNA断片0.5pmolとを40mM HEPE
S（pH7.8）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM MgCl2、10m
M DTT、0.4mM ATP中でT4リガーゼ100ユニットを用いて1
2℃にて16時間反応を行った。
coRI断片0.5pmolと上記のDNA断片0.5pmolとを40mM HEPE
S（pH7.8）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM MgCl2、10m
M DTT、0.4mM ATP中でT4リガーゼ100ユニットを用いて1
2℃にて16時間反応を行った。
この反応液10μｌを用いて大腸菌株RR1を形質転換
し、100μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換体を選
んだ。形質転換体のコロニーからプラスミドDNAを抽出
しジデオキシ法により塩基配列を確認した。このプラス
ミドをpLTM9と命名した。
し、100μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換体を選
んだ。形質転換体のコロニーからプラスミドDNAを抽出
しジデオキシ法により塩基配列を確認した。このプラス
ミドをpLTM9と命名した。
実施例3.プラスミドpLTM11の作製
（１）２番目のロイシン、及び３番目のプロリンのアミ
ノ酸のコドンの変換したプラスミドpLTM9を制限酵素Eco
RIで切断し、リンホトキシン遺伝子を含む断片を0.8％
アガロースゲルより回収した。
ノ酸のコドンの変換したプラスミドpLTM9を制限酵素Eco
RIで切断し、リンホトキシン遺伝子を含む断片を0.8％
アガロースゲルより回収した。
このDNA断片0.5pmolとM13ファージmp10の２本鎖DNAの
EcoRI切断物0.5pmolとを混合し、66mM Tris−HCl（pH
7.5）、5mM MgCl2、5mMDTT及び1mM ATP含有する溶液20
μｌ中で100ユニットのT4DNAリガーゼを用いて12℃にて
16時間連結反応を行った。反応後、反応液を用いてメッ
シング等の方法〔メッシング等、メソズ・イン・エンチ
モロジー（Methods in Enzymology）101、20−78、198
3〕に従って大腸菌JM 103を形質転換し、0.02％Ｘ−gal
及び1mMIPTGを含有する軟寒天と共にプレートし、37℃
にて一晩培養した。組換体によって形成された白いプラ
ークより一本鎖鋳型DNAを調整した。すなわち、白いプ
ラークをつまようじの先端で釣り、大腸菌JM 103が生育
している。1.5mlの２×YT培養液（1.6％バクトトリプト
ン、１％酵母エキストラクト及び0.5％NaCl）中に懸濁
して37℃にて５時間培養し、そして培養液上清から、ポ
リエチレングリコール沈澱、フェノール処理及びエタノ
ール沈澱によって１本鎖組換体ファージDNAを回収し
た。
EcoRI切断物0.5pmolとを混合し、66mM Tris−HCl（pH
7.5）、5mM MgCl2、5mMDTT及び1mM ATP含有する溶液20
μｌ中で100ユニットのT4DNAリガーゼを用いて12℃にて
16時間連結反応を行った。反応後、反応液を用いてメッ
シング等の方法〔メッシング等、メソズ・イン・エンチ
モロジー（Methods in Enzymology）101、20−78、198
3〕に従って大腸菌JM 103を形質転換し、0.02％Ｘ−gal
及び1mMIPTGを含有する軟寒天と共にプレートし、37℃
にて一晩培養した。組換体によって形成された白いプラ
ークより一本鎖鋳型DNAを調整した。すなわち、白いプ
ラークをつまようじの先端で釣り、大腸菌JM 103が生育
している。1.5mlの２×YT培養液（1.6％バクトトリプト
ン、１％酵母エキストラクト及び0.5％NaCl）中に懸濁
して37℃にて５時間培養し、そして培養液上清から、ポ
リエチレングリコール沈澱、フェノール処理及びエタノ
ール沈澱によって１本鎖組換体ファージDNAを回収し
た。
得られた１本鎖DNAを鋳型としてメッシングらの方法
（前掲）に従ってジデオキシ法により塩基配列を決定
し、クローニングされた１本鎖DNAの配列を確認した。
こうしてリンホトキシン遺伝子のアンチコーディング鎖
を含む１本鎖DNAが得られた。この組換体ファージをLTM
71と命名した。
（前掲）に従ってジデオキシ法により塩基配列を決定
し、クローニングされた１本鎖DNAの配列を確認した。
こうしてリンホトキシン遺伝子のアンチコーディング鎖
を含む１本鎖DNAが得られた。この組換体ファージをLTM
71と命名した。
上記のようにして得られたLTM71の１本鎖DNAを鋳型と
して用い、合成オリゴヌクレオチド： T TTA AAT ATG TTA CCT GGT GTT GG をプライマーとして、DNAポリメラーゼKlenow断片によ
る修復反応を行った。すなわち、鋳型１本鎖DNA0.5pmol
に５′末端を燐酸化したプライマー2pmolを加え、そし
て7mM Tris−HCl（pH7.5）、0.1mM EDTA、20mM NaCl及
び7mM MgCl2を含有する溶液10μｌ中で60℃にて20分間
保持し、続いて23℃にて20分間保持した。さらに、この
反応混合物に、dATP、dGTP、dTTP、及びdCTPをそれぞれ
0.5mMになるように加え、全体を20μｌとしてDNAポリメ
ラーゼKlenow断片２ユニットを加え、そして23℃にて20
分間インキュベートした。続いて、10mMATPを１μｌ及
びT4DNAリガーゼ１ユニットを加え、12℃にて一晩イン
キュベートした。
して用い、合成オリゴヌクレオチド： T TTA AAT ATG TTA CCT GGT GTT GG をプライマーとして、DNAポリメラーゼKlenow断片によ
る修復反応を行った。すなわち、鋳型１本鎖DNA0.5pmol
に５′末端を燐酸化したプライマー2pmolを加え、そし
て7mM Tris−HCl（pH7.5）、0.1mM EDTA、20mM NaCl及
び7mM MgCl2を含有する溶液10μｌ中で60℃にて20分間
保持し、続いて23℃にて20分間保持した。さらに、この
反応混合物に、dATP、dGTP、dTTP、及びdCTPをそれぞれ
0.5mMになるように加え、全体を20μｌとしてDNAポリメ
ラーゼKlenow断片２ユニットを加え、そして23℃にて20
分間インキュベートした。続いて、10mMATPを１μｌ及
びT4DNAリガーゼ１ユニットを加え、12℃にて一晩イン
キュベートした。
上記２本鎖DNA0.1pmolを用いてメッシングの方法に従
い大腸菌JM 103を形質転換した。
い大腸菌JM 103を形質転換した。
上記のようにして得られたファージプラークについ
て、さきのオリゴヌクレオチド（32Pで標識したもの）
をプローブとして用いて、プラークハイブリダイゼーシ
ョンによる変異体ファージのスクリーニングを行った。
すなわち、ベントン・デイビス等の方法〔W.D.ベントン
及びR.W.デイビス、サイエンス（Sciance）196、180、1
977〕に従って軟寒天培地からニトロセルロースフィル
ターにプラークを移し、真空中80℃にて２時間ベーキン
グした。このニトロセルロースフィルターを６×SSC、1
0×Denhardt溶液中で、32Pで標識したプライマーオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして23℃にて１晩ハイブリダ
イゼーションを行った。次に、このフィルターを６×SS
C中で59℃にて洗浄し、そしてオートレジオグラフィー
を行い陽性シグナルを示す変異体ファージプラークを単
離した。
て、さきのオリゴヌクレオチド（32Pで標識したもの）
をプローブとして用いて、プラークハイブリダイゼーシ
ョンによる変異体ファージのスクリーニングを行った。
すなわち、ベントン・デイビス等の方法〔W.D.ベントン
及びR.W.デイビス、サイエンス（Sciance）196、180、1
977〕に従って軟寒天培地からニトロセルロースフィル
ターにプラークを移し、真空中80℃にて２時間ベーキン
グした。このニトロセルロースフィルターを６×SSC、1
0×Denhardt溶液中で、32Pで標識したプライマーオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして23℃にて１晩ハイブリダ
イゼーションを行った。次に、このフィルターを６×SS
C中で59℃にて洗浄し、そしてオートレジオグラフィー
を行い陽性シグナルを示す変異体ファージプラークを単
離した。
このファージプラークよりラピドアイソレーション法
により２本鎖ファージを調整し、これをEcoRIで切断し
て537bpの断片を得、これを鋳型としてジデオキシ法に
より塩基配列を決定し、塩基置換変異が生じ、リンホト
キシン遺伝子の２番目のロイシンと３番目のプロリンの
アミノ酸のコドンが変わった事を確認した。この変異体
ファージ株をJM 103/LTM 81と命名した。
により２本鎖ファージを調整し、これをEcoRIで切断し
て537bpの断片を得、これを鋳型としてジデオキシ法に
より塩基配列を決定し、塩基置換変異が生じ、リンホト
キシン遺伝子の２番目のロイシンと３番目のプロリンの
アミノ酸のコドンが変わった事を確認した。この変異体
ファージ株をJM 103/LTM 81と命名した。
ファージJM 103/LTM 81より常法に従って２本鎖DNAを
調整し、制限酵素EcoRIで切断してリンホトキシン遺伝
子を有するDNA断片を0.8％アガロースゲル電気泳動より
回収してElutip−ｄで精製した。
調整し、制限酵素EcoRIで切断してリンホトキシン遺伝
子を有するDNA断片を0.8％アガロースゲル電気泳動より
回収してElutip−ｄで精製した。
プラスミドpLTM2のリンホトキシン遺伝子を含まないE
coRI断片0.5pmolと上記のDNA断片0.5pmolとを40mM HEPE
S（pH7.8）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM ATP中でT4
リガーゼ100ユニットを用いて12℃にて16時間反応を行
った。
coRI断片0.5pmolと上記のDNA断片0.5pmolとを40mM HEPE
S（pH7.8）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM ATP中でT4
リガーゼ100ユニットを用いて12℃にて16時間反応を行
った。
この反応液を10μｌを用いて大腸菌株RR1を形質転換
し、100μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換を選ん
だ。形質転換体のコロニーからプラスミドDNAを抽出し
ジデオキシ法により塩基配列を確認した。このプラスミ
ドをpLTM11と命名した。
し、100μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換を選ん
だ。形質転換体のコロニーからプラスミドDNAを抽出し
ジデオキシ法により塩基配列を確認した。このプラスミ
ドをpLTM11と命名した。
実施例4.プラスミドpPRALT1の作製（第６図）
プラスミドpRIT2T（ファルマイアから入手）５μｇ
（10μｌ）を、15ユニットのEcoRI（１μｌ）と37℃に
て５時間インキュベートして消化を行い、次にこの反応
混合物に40μｌの25mM Tris−Hcl（pH8.0）緩衝液及び1
0μｌのアルカリ性ホスファーターゼ（E.コリ C75）
（1/10希釈物）を添加して65℃にて40分間反応せしめ
た。
（10μｌ）を、15ユニットのEcoRI（１μｌ）と37℃に
て５時間インキュベートして消化を行い、次にこの反応
混合物に40μｌの25mM Tris−Hcl（pH8.0）緩衝液及び1
0μｌのアルカリ性ホスファーターゼ（E.コリ C75）
（1/10希釈物）を添加して65℃にて40分間反応せしめ
た。
反応液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタ
ノール沈澱によりDNAを回収しこれを乾燥した。
ノール沈澱によりDNAを回収しこれを乾燥した。
このDNA沈澱物0.5pmolとプラスミドpLTM9のリンホト
キシン遺伝子を含むEcoRI断片0.5pmolとを、40mM HEPES
（pH7.8）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM ATP中でT4リ
ガーゼ100ユニットを用いて12℃にて16時間反応を行っ
た。
キシン遺伝子を含むEcoRI断片0.5pmolとを、40mM HEPES
（pH7.8）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM ATP中でT4リ
ガーゼ100ユニットを用いて12℃にて16時間反応を行っ
た。
この反応液10μｌを用いて大腸菌株RR1を形質転換
し、100μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換体を選
んだ。形質転換体のコロニーからプラスミドDNAを抽出
しジデオキシ法により塩基配列を確認した。このプラス
ミドをpPRALT1と命名した。
し、100μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換体を選
んだ。形質転換体のコロニーからプラスミドDNAを抽出
しジデオキシ法により塩基配列を確認した。このプラス
ミドをpPRALT1と命名した。
実施例5.インビトロ翻訳による発現産物確認
リンホトキシンとプロテインＡとの融合蛋白質をコー
ドする本発明のプラスミドpPRALT1、及びプロテインＡ
をコードするプラスミドpRIT2Tのインビトロ翻訳による
発現産物を、DNA発現キット（アマーシャム社製）を用
いて試験した。発現生成物を10％−26％のグラジエント
SDS−PAGEにより分離し、発現生成物のバンドの位置を
分子量標準のバンドの位置と比較して見かけ分子量を求
めたところ、pPRALT1の発現生成物は約48Kの分子量を有
し、pPIT2Tの発現生成物は約30Kの分子量を有してい
た。従ってプラスミドpPRALT1により、本発明の融合蛋
白質が発現していることを確認した。
ドする本発明のプラスミドpPRALT1、及びプロテインＡ
をコードするプラスミドpRIT2Tのインビトロ翻訳による
発現産物を、DNA発現キット（アマーシャム社製）を用
いて試験した。発現生成物を10％−26％のグラジエント
SDS−PAGEにより分離し、発現生成物のバンドの位置を
分子量標準のバンドの位置と比較して見かけ分子量を求
めたところ、pPRALT1の発現生成物は約48Kの分子量を有
し、pPIT2Tの発現生成物は約30Kの分子量を有してい
た。従ってプラスミドpPRALT1により、本発明の融合蛋
白質が発現していることを確認した。
実施例6.ポリペプチドの発現と精製
前記のプラスミドpPRALT1を含有する大腸菌
HB101株を30mlのLB培地で37℃にて１夜インキュベート
した後、3lのLB培地に接種し37℃にて７時間培養した。
培養にはジャーファーメンター（いわしや製）を用い
た。培養終了后、培養液を遠心して菌体を集菌した。集
菌した菌体にリン酸緩衝液（10mMリン酸ナトリウム（pH
7.2）。1mM EDTA）を加えてよく懸濁した後にマントン
ゴーリン、ホモジナイザーを8000psiで３回通過させて
菌体を破砕した。これを10,000rpmにて30分間遠心する
ことにより、上清を得た。
した後、3lのLB培地に接種し37℃にて７時間培養した。
培養にはジャーファーメンター（いわしや製）を用い
た。培養終了后、培養液を遠心して菌体を集菌した。集
菌した菌体にリン酸緩衝液（10mMリン酸ナトリウム（pH
7.2）。1mM EDTA）を加えてよく懸濁した後にマントン
ゴーリン、ホモジナイザーを8000psiで３回通過させて
菌体を破砕した。これを10,000rpmにて30分間遠心する
ことにより、上清を得た。
この上清に５％w/vの硫安を加えて硫安沈殿を行い上
清をブチルトヨパール（東ソ−製）カラムで精製した。
清をブチルトヨパール（東ソ−製）カラムで精製した。
５％w/vの硫安を含むリン酸緩衝液（10mMリン酸ナト
リウム（pH7.2）、0.02％ツイン20）で平衡化したブチ
ルトヨパール650M20mlに上清を加え、直ちに平衡化に用
いた液100mlで洗浄し、硫安を含まないリン酸緩衝液で
カラムに吸着している蛋白質を溶出させた。溶出した画
分が目的とするポリペプチドであった。
リウム（pH7.2）、0.02％ツイン20）で平衡化したブチ
ルトヨパール650M20mlに上清を加え、直ちに平衡化に用
いた液100mlで洗浄し、硫安を含まないリン酸緩衝液で
カラムに吸着している蛋白質を溶出させた。溶出した画
分が目的とするポリペプチドであった。
実施例7.目的ポリペプチドの抗体結合能力の確認
目的とするポリペプチドが抗体と結合すること、さら
にこの結合がプロテインＡ部分のアフィニティーによる
ものであることを確認した。すなわち、実施例６で得ら
れた目的ポリペプチドをSDS−PAGEにかけた後エレクト
ロブロッティング装置（バイオメトラ製）を用いてニト
ロセルロースメンブランヘトランスファーした。１％BS
Aを含むリン酸緩衝液でブロッキングをした後、ペルオ
キシダーゼで標識された牛の抗ウサギ1gG抗体（ベッチ
ルラボラトリー製）と結合させ、洗浄後４−クロロ−１
−ナフトール溶液と過酸化水素水で発色させた。その結
果分子量４万４千に暗紫色に発色するバンドが確認され
た。目的とするポリペプチドは、ペルオキシダーゼ標識
された牛の抗体と結合した。
にこの結合がプロテインＡ部分のアフィニティーによる
ものであることを確認した。すなわち、実施例６で得ら
れた目的ポリペプチドをSDS−PAGEにかけた後エレクト
ロブロッティング装置（バイオメトラ製）を用いてニト
ロセルロースメンブランヘトランスファーした。１％BS
Aを含むリン酸緩衝液でブロッキングをした後、ペルオ
キシダーゼで標識された牛の抗ウサギ1gG抗体（ベッチ
ルラボラトリー製）と結合させ、洗浄後４−クロロ−１
−ナフトール溶液と過酸化水素水で発色させた。その結
果分子量４万４千に暗紫色に発色するバンドが確認され
た。目的とするポリペプチドは、ペルオキシダーゼ標識
された牛の抗体と結合した。
プラスミドpPRALT1を含有する大腸菌N48301及びプラ
スミドpLTM7を含有する大腸菌RR1から実施例２の方法に
より得た細胞抽出液（上清）、並びにHUT−102細胞の培
養上清を、リン酸緩衝液によりそれぞれ大腸菌抽出液に
ついては１×104U/mlに、そしてHUT−102上清について
は１×103U/mlに希釈した。これらの液300μｌずつにカ
ラム担体IgGセファロース６ファースト・フロウ（ファ
ルマシア製）10μｌを加え、室温でゆっくり１時間にわ
たり振り混ぜた。これらを6000rpmにて遠心分離し上清
Ａを得た。沈澱した担体を200μｌずつのリン酸緩衝液
により３回洗浄した。6000rpmにて遠心分離して担体を
洗浄から分離した後、この担体に、プロテインＡ（シグ
マ社）1mg/mlを含むリン酸緩衝液300μｌを加えて室温
にて１時間にわたりゆっくり振り混ぜた。この混合物を
6000rpmにて遠心分離し、上清Ｂを得た。
スミドpLTM7を含有する大腸菌RR1から実施例２の方法に
より得た細胞抽出液（上清）、並びにHUT−102細胞の培
養上清を、リン酸緩衝液によりそれぞれ大腸菌抽出液に
ついては１×104U/mlに、そしてHUT−102上清について
は１×103U/mlに希釈した。これらの液300μｌずつにカ
ラム担体IgGセファロース６ファースト・フロウ（ファ
ルマシア製）10μｌを加え、室温でゆっくり１時間にわ
たり振り混ぜた。これらを6000rpmにて遠心分離し上清
Ａを得た。沈澱した担体を200μｌずつのリン酸緩衝液
により３回洗浄した。6000rpmにて遠心分離して担体を
洗浄から分離した後、この担体に、プロテインＡ（シグ
マ社）1mg/mlを含むリン酸緩衝液300μｌを加えて室温
にて１時間にわたりゆっくり振り混ぜた。この混合物を
6000rpmにて遠心分離し、上清Ｂを得た。
こうして調整した上清Ａ及び上清Ｂについてリンホト
キシン活性を前記の方法により測定したところ次の結果
が得られた。
キシン活性を前記の方法により測定したところ次の結果
が得られた。
以上の結果から、本発明のプラスミドpPRALT1を含有
する大腸菌からの生成物、すなわちリンホトキシンとプ
ロテインＡとの融合蛋白質を含有する抽出液について上
清Ｂにリンホトキシン活性が認められた。このことは、
該融合蛋白質が、担体に固定化された抗体（IgG）を介
して担体に吸着された後に、プロテインＡの添加によっ
て置換溶出されたことを意味する。
する大腸菌からの生成物、すなわちリンホトキシンとプ
ロテインＡとの融合蛋白質を含有する抽出液について上
清Ｂにリンホトキシン活性が認められた。このことは、
該融合蛋白質が、担体に固定化された抗体（IgG）を介
して担体に吸着された後に、プロテインＡの添加によっ
て置換溶出されたことを意味する。
従って、この実験によりプロテインＡとリンホトキシ
ンと融合蛋白質である本発明のポリペプチドが抗体と複
合体を形成することが証明された。
ンと融合蛋白質である本発明のポリペプチドが抗体と複
合体を形成することが証明された。
実施例8.殺細胞活性
目的とするポリペプチドの殺細胞活性はB.B.Aggarwal
（J.Biological Chemistry，260,2345−2354）の方法
により測定した。５％ウシ脂児血清、0.5％ペニシリ
ン、0.5％ストレプトマイシン、及び１μg/mlのアクチ
ノマイシンＤを含有するイーグルMEM培地にマウスＬ−
Ｍ細胞を培養し、その３×104細胞/100μｌをウエルに
入れ、前記の希釈されたアンプル100μｌを加えて５％C
O2雰囲気下、37℃にて24時間培養した。プレートを洗浄
した後、0.05％のクリスタルバイオレット・ホルマリン
・エタノール溶液100μｌを加えて30分間細胞を染色し
た。次に、0.05％ＭのNaH2PO4・エタノール液100μｌで
色素を溶出し、光度計（ミニリーダーII、ダイナテック
社製）を用いて、570nmの吸光度を測定した。
（J.Biological Chemistry，260,2345−2354）の方法
により測定した。５％ウシ脂児血清、0.5％ペニシリ
ン、0.5％ストレプトマイシン、及び１μg/mlのアクチ
ノマイシンＤを含有するイーグルMEM培地にマウスＬ−
Ｍ細胞を培養し、その３×104細胞/100μｌをウエルに
入れ、前記の希釈されたアンプル100μｌを加えて５％C
O2雰囲気下、37℃にて24時間培養した。プレートを洗浄
した後、0.05％のクリスタルバイオレット・ホルマリン
・エタノール溶液100μｌを加えて30分間細胞を染色し
た。次に、0.05％ＭのNaH2PO4・エタノール液100μｌで
色素を溶出し、光度計（ミニリーダーII、ダイナテック
社製）を用いて、570nmの吸光度を測定した。
吸光度（通常目盛）と希釈倍率（対数目盛）とを片対
数グラフにプロットし、50％殺細胞に要する活性を１ユ
ニットとしてサンプル中の殺細胞活性のユニット数を計
算した。内部標準として試薬のTNF（ジェンザイム社
製）を用いて殺細胞活性の値を補正した。
数グラフにプロットし、50％殺細胞に要する活性を１ユ
ニットとしてサンプル中の殺細胞活性のユニット数を計
算した。内部標準として試薬のTNF（ジェンザイム社
製）を用いて殺細胞活性の値を補正した。
実施例６で得られた目的とするポリペプチドの殺細胞
活性は8.8×105ユニット（蛋白質1mg当り）であった。
ゆえに、プラスミドpPRALT1により発現される本発明の
融合蛋白質はリンホトキシン活性を有する。
活性は8.8×105ユニット（蛋白質1mg当り）であった。
ゆえに、プラスミドpPRALT1により発現される本発明の
融合蛋白質はリンホトキシン活性を有する。
参考例1.cDNAライブラリーの調整及びスクリーニング
（１）mRNAの調整
ヒトＴリンパ球性白血病細胞株HUT−102を５％ウシ胎
児血清を含むRPMI−1640培地20mlに懸濁し、５％CO2イ
ンキュベーター中37℃で、２〜３日間培養を行なった。
培地を２倍量づづ増加していき、その度２〜３日間培養
し、最終的に１の培養液を得た。得られた培養液を４
℃、3000rpm、10分間遠心し、細胞を集め、リン酸緩衝
液（10mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.15M NaCl）50ml
に懸濁して洗浄した後、遠心し、Ｔ細胞ペレットを得
た。
児血清を含むRPMI−1640培地20mlに懸濁し、５％CO2イ
ンキュベーター中37℃で、２〜３日間培養を行なった。
培地を２倍量づづ増加していき、その度２〜３日間培養
し、最終的に１の培養液を得た。得られた培養液を４
℃、3000rpm、10分間遠心し、細胞を集め、リン酸緩衝
液（10mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.15M NaCl）50ml
に懸濁して洗浄した後、遠心し、Ｔ細胞ペレットを得
た。
mRNAをT.Maniatis等“Molecular Cloning"Cold Sprin
g Harbor Laboratory 1982 p.196に準じグアニジウム/C
sCl法を用いて単離した。Ｔ細胞ペレットを５倍量のグ
アニジウムイソチオシアネート液（6Mグアニジウムイソ
チオシアネート、5mMクエン酸ナトリウム、pH7.0、0.1M
β−メルカプトエタノール、0.5％サルコシル）に溶解
し、ガラスホモジナイザー容器に入れ、テフロン棒で10
回ホモジナイズしたのち、ホモジネート液を、SW55用遠
心チューブ（Ultra Clear、商標）に入れた5.7M CsCl及
び0.1M EDTA含有溶液（pH7.5）1.5ml上に静かにのせ、1
5℃にて35,000rpmで20時間超遠心を行なった。グアニジ
ウム液を除去した後、壁をグアニジウム液で３回洗浄
し、遠心チューブをCsCl液の上部で切断した。CsCl液を
除去した後、沈澱を80％エタノールで２回洗浄し、10mM
Tris−HCl pH7.4、5mM EDTA及び10％SDSを含有する緩
衝液（TES）500μｌに溶解した。これをクロロホルム−
Ｎ−ブタノール混合液（4:1）500μｌで抽出し、有機層
をTES500μｌで再抽出した後、水層を合わせてエタノー
ル沈澱を行ない、mRNAを得た。
g Harbor Laboratory 1982 p.196に準じグアニジウム/C
sCl法を用いて単離した。Ｔ細胞ペレットを５倍量のグ
アニジウムイソチオシアネート液（6Mグアニジウムイソ
チオシアネート、5mMクエン酸ナトリウム、pH7.0、0.1M
β−メルカプトエタノール、0.5％サルコシル）に溶解
し、ガラスホモジナイザー容器に入れ、テフロン棒で10
回ホモジナイズしたのち、ホモジネート液を、SW55用遠
心チューブ（Ultra Clear、商標）に入れた5.7M CsCl及
び0.1M EDTA含有溶液（pH7.5）1.5ml上に静かにのせ、1
5℃にて35,000rpmで20時間超遠心を行なった。グアニジ
ウム液を除去した後、壁をグアニジウム液で３回洗浄
し、遠心チューブをCsCl液の上部で切断した。CsCl液を
除去した後、沈澱を80％エタノールで２回洗浄し、10mM
Tris−HCl pH7.4、5mM EDTA及び10％SDSを含有する緩
衝液（TES）500μｌに溶解した。これをクロロホルム−
Ｎ−ブタノール混合液（4:1）500μｌで抽出し、有機層
をTES500μｌで再抽出した後、水層を合わせてエタノー
ル沈澱を行ない、mRNAを得た。
mRNAを“Molecular Cloning"に記載されている方法に
準じて、オリゴ（dT）セルロースカラムに通すことによ
り、poly（Ａ）＋RNAを精製した。
準じて、オリゴ（dT）セルロースカラムに通すことによ
り、poly（Ａ）＋RNAを精製した。
（２）cDNAの合成
cDNA第一鎖の合成はGubler−Hoffman法に準じて行な
った。水8.4μｌ、1M Tris−HCl（pH8.3）１μｌ（50m
M）、0.6M KCl 1μｌ（30mM）,0.16M MgCl2 1μｌ（8m
M）、20mM DTT 1μｌ（1mM）、25mM dNTP（dATP、dCT
P、dGTP、dTTP 各25mMの混合液）1.6μｌ（各2mM）,RN
asin（バイオテック30Uμｌ）１μｌ、オリゴ（dT）12
−18（PL社製）１μｌ（２μｌ）、及びHUT−102poly
（Ａ）＋RNA（１μg/μｌ）３μｌを混合し、総量19μ
ｌとし、37℃５分間プレインキューベートした後、逆転
写酵素（Life Science、12.5U/μｌ）１μｌを加えて37
℃で１時間反応させた。塩溶液の（ ）内は最終濃度を
示す。反応後に0.5M EDTA 1μｌと10％SDS0.5μｌを加
えて反応を停止させた後、フェノール・クロロホルム抽
出、酢酸アンモニウム・エタノール沈澱を２回、及び80
％エタノール洗浄を行ない、減圧乾燥した後、水 50μ
ｌに溶解した。このうち５μｌを取り、RNase 1μｇを
加えて室温で10分間放置した後フェノール抽出を行な
い、水層を0.7％アガロースゲル電気泳動にかけ第一鎖
伸長の程度を調べた。
った。水8.4μｌ、1M Tris−HCl（pH8.3）１μｌ（50m
M）、0.6M KCl 1μｌ（30mM）,0.16M MgCl2 1μｌ（8m
M）、20mM DTT 1μｌ（1mM）、25mM dNTP（dATP、dCT
P、dGTP、dTTP 各25mMの混合液）1.6μｌ（各2mM）,RN
asin（バイオテック30Uμｌ）１μｌ、オリゴ（dT）12
−18（PL社製）１μｌ（２μｌ）、及びHUT−102poly
（Ａ）＋RNA（１μg/μｌ）３μｌを混合し、総量19μ
ｌとし、37℃５分間プレインキューベートした後、逆転
写酵素（Life Science、12.5U/μｌ）１μｌを加えて37
℃で１時間反応させた。塩溶液の（ ）内は最終濃度を
示す。反応後に0.5M EDTA 1μｌと10％SDS0.5μｌを加
えて反応を停止させた後、フェノール・クロロホルム抽
出、酢酸アンモニウム・エタノール沈澱を２回、及び80
％エタノール洗浄を行ない、減圧乾燥した後、水 50μ
ｌに溶解した。このうち５μｌを取り、RNase 1μｇを
加えて室温で10分間放置した後フェノール抽出を行な
い、水層を0.7％アガロースゲル電気泳動にかけ第一鎖
伸長の程度を調べた。
第二鎖の合成も、前記Gubler−Hoffman法の第二鎖合
成の条件に準じて行なった。cDNA第一鎖水溶液45μｌ、
水33.5μｌ、1M Tris−HCl（pH7.5）２μｌ（20mM）、
0.5M MgCl2 1μｌ（5mM）、1M（NH4）2SO4 1μｌ（10m
M）、1M KCl 10μｌ（100mM）、10mMβ−NAD1μｌ（0.1
mM）、5mg/ml BSA 1μｌ（50μg/ml）、4mMdNTP1μｌ
（40μＭ）、E.コリDNAリガーゼ（PL、0.5μg/μｌ）１
μｌ、E.コリDNAポリメラーゼＩ（PL、15U/μｌ）２μ
ｌ、E.コリRNaseH（宝酒造製1.3U/μｌ）0.5μｌ、1032
P−dCTP1μｌ（10μｌ）を混合し、総量100μｌとした
後、12℃１時間、続いて22℃で１時間反応させた。反応
前後において１μｌのサンプルを採取し、TCA沈澱法に
より、放射能の取り込み量を測定した。反応液に0.5M E
DTA4μｌ、10％SDS5μｌを加えて反応を停止させた後、
フェノール−クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱
を２回行い、沈澱を80％エタノールで洗浄し、減圧乾燥
した後、この沈澱を水10μｌに溶解させた。
成の条件に準じて行なった。cDNA第一鎖水溶液45μｌ、
水33.5μｌ、1M Tris−HCl（pH7.5）２μｌ（20mM）、
0.5M MgCl2 1μｌ（5mM）、1M（NH4）2SO4 1μｌ（10m
M）、1M KCl 10μｌ（100mM）、10mMβ−NAD1μｌ（0.1
mM）、5mg/ml BSA 1μｌ（50μg/ml）、4mMdNTP1μｌ
（40μＭ）、E.コリDNAリガーゼ（PL、0.5μg/μｌ）１
μｌ、E.コリDNAポリメラーゼＩ（PL、15U/μｌ）２μ
ｌ、E.コリRNaseH（宝酒造製1.3U/μｌ）0.5μｌ、1032
P−dCTP1μｌ（10μｌ）を混合し、総量100μｌとした
後、12℃１時間、続いて22℃で１時間反応させた。反応
前後において１μｌのサンプルを採取し、TCA沈澱法に
より、放射能の取り込み量を測定した。反応液に0.5M E
DTA4μｌ、10％SDS5μｌを加えて反応を停止させた後、
フェノール−クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱
を２回行い、沈澱を80％エタノールで洗浄し、減圧乾燥
した後、この沈澱を水10μｌに溶解させた。
（３）cDNAライブラリーの調製
cDNA水溶液10μｌ、水２μｌ、1MTris−アセテート
（pH7.9）0.7μｌ（35mM）、1M酢酸カリウム、1.3μｌ
（65mM）、0.1M酢酸マグネシウム２μｌ（10mM）、10mM
DTT1μｌ（1mM）、5mg/ml BSA 1μｌ（250μg/ml）、2m
MdNTP1μｌ（0.1mM）、T4DNAポリメラーゼ（宝酒造製1.
5U/μｌ）１μｌを混合し、総量20μｌとし、37℃10分
間反応させた。0.5M EDTA 1μｌと10％SDS0.5μｌを加
えて反応を停止させた後、フェノール−クロロホルム抽
出を行い、エタノール沈澱を２回行い、沈澱を80％エタ
ノールで洗浄し減圧乾燥し、そして水10μｌに溶解し
た。
（pH7.9）0.7μｌ（35mM）、1M酢酸カリウム、1.3μｌ
（65mM）、0.1M酢酸マグネシウム２μｌ（10mM）、10mM
DTT1μｌ（1mM）、5mg/ml BSA 1μｌ（250μg/ml）、2m
MdNTP1μｌ（0.1mM）、T4DNAポリメラーゼ（宝酒造製1.
5U/μｌ）１μｌを混合し、総量20μｌとし、37℃10分
間反応させた。0.5M EDTA 1μｌと10％SDS0.5μｌを加
えて反応を停止させた後、フェノール−クロロホルム抽
出を行い、エタノール沈澱を２回行い、沈澱を80％エタ
ノールで洗浄し減圧乾燥し、そして水10μｌに溶解し
た。
EcoRIリンカー（宝酒造製、GGAATTCC、１μg/μｌ）
２μｌに、水５μｌ、５×リンカーキナーゼ緩衝液（0.
33M Tris−HCl pH7.6、5mM ATP、5mMスペルミジン、50m
M MgCl2、75mM DTT、1mg/mlBSA）２μｌ、T4DNAキナー
ゼ（宝酒造製6U/μｌ）１μｌを加え総量10μｌとし、3
7℃１時間反応させた。これに、前記の様に平滑末端化
したcDNA溶液５μｌ、５×リンカーキナーゼ緩衝液２μ
ｌ、水1.5μｌ、T4RNAリガーゼ（宝酒造製、175U/μｌ
（１μｌ、T4RNAリガーゼ（PL、0.8μg/μｌ）0.5μｌ
を加え、総量20μｌとし、12℃一晩または22℃６時間反
応させた。反応液を65℃10分間加熱してリガーゼを不活
性化した後、水65μｌ、10×EcoRI緩衝液10μｌ、EcoRI
（宝酒造製7.5U/μｌ）５μｌを加え総量100μｌとし、
37℃で３時間反応させた。EcoRI消化の前後で1/10容量
づつ試料を採取し、10％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、EcoRIリンカーの連結ならびにEcoRI消化反応
の成否をチェックした。反応液をフェノール抽出し、水
層に、5M NaClを加えて、0.3M NaClとなるようにし、セ
ファロースCL−4Bカラム（2ml）にかけ、EcoRIリンカー
モノマーを除去した。TE（pH7.6）、0.3M NaClで展開
し、４〜５滴づつ採取後、カウントのある分画をエタノ
ール沈澱し、各分画を、水10μｌに溶解した。
２μｌに、水５μｌ、５×リンカーキナーゼ緩衝液（0.
33M Tris−HCl pH7.6、5mM ATP、5mMスペルミジン、50m
M MgCl2、75mM DTT、1mg/mlBSA）２μｌ、T4DNAキナー
ゼ（宝酒造製6U/μｌ）１μｌを加え総量10μｌとし、3
7℃１時間反応させた。これに、前記の様に平滑末端化
したcDNA溶液５μｌ、５×リンカーキナーゼ緩衝液２μ
ｌ、水1.5μｌ、T4RNAリガーゼ（宝酒造製、175U/μｌ
（１μｌ、T4RNAリガーゼ（PL、0.8μg/μｌ）0.5μｌ
を加え、総量20μｌとし、12℃一晩または22℃６時間反
応させた。反応液を65℃10分間加熱してリガーゼを不活
性化した後、水65μｌ、10×EcoRI緩衝液10μｌ、EcoRI
（宝酒造製7.5U/μｌ）５μｌを加え総量100μｌとし、
37℃で３時間反応させた。EcoRI消化の前後で1/10容量
づつ試料を採取し、10％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、EcoRIリンカーの連結ならびにEcoRI消化反応
の成否をチェックした。反応液をフェノール抽出し、水
層に、5M NaClを加えて、0.3M NaClとなるようにし、セ
ファロースCL−4Bカラム（2ml）にかけ、EcoRIリンカー
モノマーを除去した。TE（pH7.6）、0.3M NaClで展開
し、４〜５滴づつ採取後、カウントのある分画をエタノ
ール沈澱し、各分画を、水10μｌに溶解した。
プラスミドpU9を常法に従ってEcoRIで切断し、仔牛腸
アルカリホスファターゼ（CIP）で処理した。この調整
物１μｌ（0.4μｇ）、前記の方法により調整したcDNA1
0μｌ、５×リンカーキナーゼ緩衝液20μｌ及び水64μ
ｌを混合し、68℃10分間加熱処理した後、T4RNAリガー
ゼ５μｌを加え総量100μｌとし、12℃で一晩反応させ
た反応液と65℃10分間加熱した後、10μｌづつを大腸菌
x1776株のコンピテント細胞液210μｌと混合し、形質
転換を行なった。こうして調整した形質転換菌溶液を、
300mlのx1776用培地50μg/mlのアンピシリン含有）に加
え、37℃で一晩培養した。一部を15％グリセリン溶液と
して、−80℃で凍結保存した。
アルカリホスファターゼ（CIP）で処理した。この調整
物１μｌ（0.4μｇ）、前記の方法により調整したcDNA1
0μｌ、５×リンカーキナーゼ緩衝液20μｌ及び水64μ
ｌを混合し、68℃10分間加熱処理した後、T4RNAリガー
ゼ５μｌを加え総量100μｌとし、12℃で一晩反応させ
た反応液と65℃10分間加熱した後、10μｌづつを大腸菌
x1776株のコンピテント細胞液210μｌと混合し、形質
転換を行なった。こうして調整した形質転換菌溶液を、
300mlのx1776用培地50μg/mlのアンピシリン含有）に加
え、37℃で一晩培養した。一部を15％グリセリン溶液と
して、−80℃で凍結保存した。
（４）cDNAライブラリーのスクリーニング
cDNA含有形質転換菌の凍結グリセリン保存液20μｌ
を、x1776用培地で5,000倍希釈し、希釈溶液100μｌ
を、アンピシリン含有x1776用寒天培地プレート上に置
いたニトロセルロースの上に広げ37℃で一晩培養した。
ニトロセルロース上のコロニーを、２枚のニトロセルロ
ースに写した。このレプリカを、x1776用培地上で３時
間培養した後、10μg/mlクロラムフェニコール含有培地
上に移し、さらに一晩培養した。フィルターを順次５分
間づつ10％SDS、変性溶液（0.5N NaOH、1.5M NaCl）、
中和溶液（1.5M NaCl、0.5M Tris−HCl、pH8.0）上に置
いた後、フィルター１枚当り5mlのプロティナーゼＫ溶
液〔プロティナーゼＫ（Merk）1mg/ml、0.5M NaCl、10T
ris−HCl、pH7.4、5mM EDMA 0.1％SDS〕中で37℃１時間
反応させた。フィルターを濾紙にはさんでローラーで強
くこすった後、２×SSCで２回洗浄し、80℃で３時間加
熱処理した。
を、x1776用培地で5,000倍希釈し、希釈溶液100μｌ
を、アンピシリン含有x1776用寒天培地プレート上に置
いたニトロセルロースの上に広げ37℃で一晩培養した。
ニトロセルロース上のコロニーを、２枚のニトロセルロ
ースに写した。このレプリカを、x1776用培地上で３時
間培養した後、10μg/mlクロラムフェニコール含有培地
上に移し、さらに一晩培養した。フィルターを順次５分
間づつ10％SDS、変性溶液（0.5N NaOH、1.5M NaCl）、
中和溶液（1.5M NaCl、0.5M Tris−HCl、pH8.0）上に置
いた後、フィルター１枚当り5mlのプロティナーゼＫ溶
液〔プロティナーゼＫ（Merk）1mg/ml、0.5M NaCl、10T
ris−HCl、pH7.4、5mM EDMA 0.1％SDS〕中で37℃１時間
反応させた。フィルターを濾紙にはさんでローラーで強
くこすった後、２×SSCで２回洗浄し、80℃で３時間加
熱処理した。
上記のニトロセルロースフィルターを、６×SSC、10
×Denhardt溶液中で32Pで標識したオリゴヌクレオチド
プローブ♯71と42℃にて一晩ハイブリダイゼーションを
行った。次にこのフィルターを６×SSC中で55℃にて洗
浄し２日間オートラジオグラフィーを行ったところ３個
のコロニーが陽性のシグナルを示した。
×Denhardt溶液中で32Pで標識したオリゴヌクレオチド
プローブ♯71と42℃にて一晩ハイブリダイゼーションを
行った。次にこのフィルターを６×SSC中で55℃にて洗
浄し２日間オートラジオグラフィーを行ったところ３個
のコロニーが陽性のシグナルを示した。
次にこのフィルターを１×SSC溶液中で65℃30分洗浄
して陽性のシグナルを洗い流した后、乾燥させて再びオ
リゴヌクレオチドプローブ♯72とのハイブリダイゼーシ
ョンに用いた。６×SSC、10×Denhardt溶液中で32Pで標
識したオリゴヌクレオチドプローブ♯72と42℃にて一晩
ハイブリダイゼーションを行った。次にこのフィルター
を６×SSC中で50℃にて洗浄し２日間オートラジオグラ
フィーを行ったところ、♯71プローブを用いた際と同一
の３個のコロニーが陽性シグナルを示した。
して陽性のシグナルを洗い流した后、乾燥させて再びオ
リゴヌクレオチドプローブ♯72とのハイブリダイゼーシ
ョンに用いた。６×SSC、10×Denhardt溶液中で32Pで標
識したオリゴヌクレオチドプローブ♯72と42℃にて一晩
ハイブリダイゼーションを行った。次にこのフィルター
を６×SSC中で50℃にて洗浄し２日間オートラジオグラ
フィーを行ったところ、♯71プローブを用いた際と同一
の３個のコロニーが陽性シグナルを示した。
これら３個のコロニーからプラスミドDNAを抽出し、
ジデオキシ法により、常法に従って塩基配列を決定し
た。その結果、これらのクローンのうちの１つはリンホ
トキシンペプチドのすべてのコード配列を含んでいた。
このプラスミドをpLT1と命名した（第１図）。
ジデオキシ法により、常法に従って塩基配列を決定し
た。その結果、これらのクローンのうちの１つはリンホ
トキシンペプチドのすべてのコード配列を含んでいた。
このプラスミドをpLT1と命名した（第１図）。
参考例2.プラスミドpLMT1の作成（第１図）
前記プラスミドpLT1を大腸菌RR1株に形質転換し、常
法に従ってこの形質転換体を培養し、培養菌体からプラ
スミドDNAを抽出した。
法に従ってこの形質転換体を培養し、培養菌体からプラ
スミドDNAを抽出した。
40μｌ（20μｇ）のpLT1プラスミドDNA、20μｌのEco
RI緩衝液（×10）、140μｌの蒸留水及び４μｌのEcoRI
酵素液（40ユニット）を混合し、37℃にて３時間反応し
た。この反応混合液を100μｌずつのフェノール及びク
ロロホルムで抽出し、200μｌのエーテルで洗浄後、エ
タノール沈澱を行った。乾燥後、沈澱物を100μｌの電
気泳動用染料溶液に溶解し、１×TBE（Tris−Borate−E
DTA緩衝液）中1.2％アガロースゲルにより電気泳動し
（AGE分離）、目的とする約0.9kbのDNAを含むゲルを切
り出した。このゲル片を透析チューブに入れ、１×TBE
中で２時間電気泳動溶出し、透析チューブの内容液を回
収してElutip−ｄカラムに適用し、DNAを吸着した後、
カラムを洗浄し、溶離液のイオン濃度を上げることによ
りDNAを溶出、回収した。エタノール沈澱後、沈澱物を
３分間乾燥し、得られたDNAを20μｌの蒸留水に溶解し
た。
RI緩衝液（×10）、140μｌの蒸留水及び４μｌのEcoRI
酵素液（40ユニット）を混合し、37℃にて３時間反応し
た。この反応混合液を100μｌずつのフェノール及びク
ロロホルムで抽出し、200μｌのエーテルで洗浄後、エ
タノール沈澱を行った。乾燥後、沈澱物を100μｌの電
気泳動用染料溶液に溶解し、１×TBE（Tris−Borate−E
DTA緩衝液）中1.2％アガロースゲルにより電気泳動し
（AGE分離）、目的とする約0.9kbのDNAを含むゲルを切
り出した。このゲル片を透析チューブに入れ、１×TBE
中で２時間電気泳動溶出し、透析チューブの内容液を回
収してElutip−ｄカラムに適用し、DNAを吸着した後、
カラムを洗浄し、溶離液のイオン濃度を上げることによ
りDNAを溶出、回収した。エタノール沈澱後、沈澱物を
３分間乾燥し、得られたDNAを20μｌの蒸留水に溶解し
た。
プラスミドpKK223−３含有液10μｌ（10μｌ）、５μ
ｌのEcoRI緩衝液（×10）、36μｌの蒸留水及び３μｌ
のEcoRI（30ユニット）を混合し、37℃にて３時間反応
した。次に、この反応混合物に、50μｌの50mM Tris−H
Cl（pH8.0）及び10μｌの細菌アルカリホスファターゼ
（BAP）Ｃ−75液（1/10希釈物）を加えて65℃にて１時
間反応した。反応混合物を100μｌずつのフェノール及
びクロロホルムで抽出し、200μｌのエーテルで洗浄
後、エタノール沈澱を行い、この沈澱物を３分間乾燥し
た。この沈澱物を20μｌの蒸留水に溶解した。
ｌのEcoRI緩衝液（×10）、36μｌの蒸留水及び３μｌ
のEcoRI（30ユニット）を混合し、37℃にて３時間反応
した。次に、この反応混合物に、50μｌの50mM Tris−H
Cl（pH8.0）及び10μｌの細菌アルカリホスファターゼ
（BAP）Ｃ−75液（1/10希釈物）を加えて65℃にて１時
間反応した。反応混合物を100μｌずつのフェノール及
びクロロホルムで抽出し、200μｌのエーテルで洗浄
後、エタノール沈澱を行い、この沈澱物を３分間乾燥し
た。この沈澱物を20μｌの蒸留水に溶解した。
前記のpKK223−３消化物５μｌ、前記のpLTI消化物５
μｌ、10μｌの100mM HEPES（pH7.8）、10μｌの30mM M
gCl2、１μｌの300m MDTT、１μｌの10mM ATP、及び２
μｌのT4DNAリガーゼ溶液（20ユニット）を混合し、12
℃で１夜反応した。
μｌ、10μｌの100mM HEPES（pH7.8）、10μｌの30mM M
gCl2、１μｌの300m MDTT、１μｌの10mM ATP、及び２
μｌのT4DNAリガーゼ溶液（20ユニット）を混合し、12
℃で１夜反応した。
この反応混合物10μｌと大腸菌JM 103株のコンピテン
ト細胞200μｌを混合して形質転換を行い、これをＨプ
レート上に拡げ、37℃にて一晩培養した。形成された多
数のコロニーの内12コロニーにつき、ラピッドアイソレ
ーション法により分析し、３コロニーが目的とするプラ
スミドを含むことを確認した。このプラスミドをpLTM1
と命名した。
ト細胞200μｌを混合して形質転換を行い、これをＨプ
レート上に拡げ、37℃にて一晩培養した。形成された多
数のコロニーの内12コロニーにつき、ラピッドアイソレ
ーション法により分析し、３コロニーが目的とするプラ
スミドを含むことを確認した。このプラスミドをpLTM1
と命名した。
参考例3.プラスミドpLTM2の作製（第２図）
100μｌ（10μｇ）のプラスミドpLTM1液、40μｌのPv
uII緩衝液（×10）、260μｌの蒸留水、４μｌのPvuII
酵素溶液（40ユニット）を混合し、37℃にて１日反応し
た。この反応混合物に、360μｌの蒸留水、40μｌのPvu
I緩衝液及び４μｌのPvuI酵素液（40ユニット）を加え
て37℃にて１日反応した。この反応混合物を400μｌず
つのフェノール及びクロロホルムにより抽出し、800μ
ｌのエーテルで洗浄後、エタノール沈澱を行い、得られ
た沈澱物を乾燥した。この沈澱物を100μｌのアガロー
ス電気泳動用染料溶液に溶解し、１×TBE中で1.2％アガ
ロースゲルにより電気泳動した。約1.6kb及び1.7kbの長
さのDNAを含有するゲルを切り出した。このゲル片を透
析チューブに入れ、１×TBE中で２時間電気泳動溶出
し、透析チューブの内容液を回収してElutip−ｄカラム
に適用してDNAを吸着した後、カラムを洗浄し、溶離液
の濃度を上げることによってDNAを溶出、回収した。溶
出液からDNAをエタノール沈澱し、３分間乾燥したの
ち、この沈澱物を20μｌの蒸留水に溶解した。この溶液
に、380μｌの1M Tris−HCl（pH8.0）及び４μｌのBAP
C−75酵素溶液（1/10希釈物）を加え、65℃にて１時間
反応せしめた。この反応混合物を300μｌずつのフェノ
ール及びクロロホルムで抽出後、600μｌのエーテルで
洗浄した。
uII緩衝液（×10）、260μｌの蒸留水、４μｌのPvuII
酵素溶液（40ユニット）を混合し、37℃にて１日反応し
た。この反応混合物に、360μｌの蒸留水、40μｌのPvu
I緩衝液及び４μｌのPvuI酵素液（40ユニット）を加え
て37℃にて１日反応した。この反応混合物を400μｌず
つのフェノール及びクロロホルムにより抽出し、800μ
ｌのエーテルで洗浄後、エタノール沈澱を行い、得られ
た沈澱物を乾燥した。この沈澱物を100μｌのアガロー
ス電気泳動用染料溶液に溶解し、１×TBE中で1.2％アガ
ロースゲルにより電気泳動した。約1.6kb及び1.7kbの長
さのDNAを含有するゲルを切り出した。このゲル片を透
析チューブに入れ、１×TBE中で２時間電気泳動溶出
し、透析チューブの内容液を回収してElutip−ｄカラム
に適用してDNAを吸着した後、カラムを洗浄し、溶離液
の濃度を上げることによってDNAを溶出、回収した。溶
出液からDNAをエタノール沈澱し、３分間乾燥したの
ち、この沈澱物を20μｌの蒸留水に溶解した。この溶液
に、380μｌの1M Tris−HCl（pH8.0）及び４μｌのBAP
C−75酵素溶液（1/10希釈物）を加え、65℃にて１時間
反応せしめた。この反応混合物を300μｌずつのフェノ
ール及びクロロホルムで抽出後、600μｌのエーテルで
洗浄した。
プラスミドpCTM4を含有する大腸菌JM 103株を常法に
従って培養し、常法に従って培養菌体からプラスミドDN
Aを抽出した。このpCTM4プラスミドDNA溶液100μｌ（DN
A10μｇ）、イオン濃度を上げてDNAを溶出回収した。こ
の溶出液からDNAをエタノールで沈澱し、この沈澱を３
分間乾燥後、400μｌの蒸留水に溶解した。この溶液を3
00μｌずつのフェノール及びクロロホルムで抽出し、そ
して600μｌのエーテルで洗浄した。
従って培養し、常法に従って培養菌体からプラスミドDN
Aを抽出した。このpCTM4プラスミドDNA溶液100μｌ（DN
A10μｇ）、イオン濃度を上げてDNAを溶出回収した。こ
の溶出液からDNAをエタノールで沈澱し、この沈澱を３
分間乾燥後、400μｌの蒸留水に溶解した。この溶液を3
00μｌずつのフェノール及びクロロホルムで抽出し、そ
して600μｌのエーテルで洗浄した。
前記の約1.6kb及び1.7kbの長さのDNAを含有している
溶液100μｌ、前記の約1.9kbの長さのDNAを含有してい
る溶液50μｌ、20μｌ（75μｇ）ずつの５′リン酸化オ
リゴヌクレオチド♯73及び♯74: CATGCTCCCGGGTGTTGGTCTTACTCCATCAG ♯73 TGCAGTACGAGGGCCCACAACCAGAATGAGGTAGTC ♯74 10μｇのtRNA及び50μｌの3M酢酸ナトリウムを混合
し、これに1mlのエタノールを加えて−80℃に20分間置
き、４℃にて16000rpmにて10分間遠心分離してDNA類をt
RNAと共に沈澱せしめ、上清を除去して沈澱物を乾燥
し、８μｌの30mM MgCl2、４μｌの蒸留水及び８μｌの
100mM HEPES（pH7.5）の混合液に溶解し、そして65℃に
て20分間、42℃にて30分間、室温にて５分間、続いて氷
上で５分間アニーリングした。これに１μｌの10mM AT
P、１μｌの300m DTT、９μｌの40％PEG、及び２μｌの
T4DNAリガーゼ溶液（20ユニット）を加え、20℃にて一
晩反応を行った。
溶液100μｌ、前記の約1.9kbの長さのDNAを含有してい
る溶液50μｌ、20μｌ（75μｇ）ずつの５′リン酸化オ
リゴヌクレオチド♯73及び♯74: CATGCTCCCGGGTGTTGGTCTTACTCCATCAG ♯73 TGCAGTACGAGGGCCCACAACCAGAATGAGGTAGTC ♯74 10μｇのtRNA及び50μｌの3M酢酸ナトリウムを混合
し、これに1mlのエタノールを加えて−80℃に20分間置
き、４℃にて16000rpmにて10分間遠心分離してDNA類をt
RNAと共に沈澱せしめ、上清を除去して沈澱物を乾燥
し、８μｌの30mM MgCl2、４μｌの蒸留水及び８μｌの
100mM HEPES（pH7.5）の混合液に溶解し、そして65℃に
て20分間、42℃にて30分間、室温にて５分間、続いて氷
上で５分間アニーリングした。これに１μｌの10mM AT
P、１μｌの300m DTT、９μｌの40％PEG、及び２μｌの
T4DNAリガーゼ溶液（20ユニット）を加え、20℃にて一
晩反応を行った。
この連結反応混合物10μｌを用いて、Hanahan法に従
って、大腸菌RR1株を形質転換し、これをLBアンピシリ
ンプレート上に拡げて37℃にて一晩培養した。こうして
55個のコロニーが出現した。この内９コロニーをラピッ
ドアイソレーション法により分析し、２コロニーが目的
とするプラスミドを含有することが確認された。このプ
ラスミドをpLTM2と命名した。
って、大腸菌RR1株を形質転換し、これをLBアンピシリ
ンプレート上に拡げて37℃にて一晩培養した。こうして
55個のコロニーが出現した。この内９コロニーをラピッ
ドアイソレーション法により分析し、２コロニーが目的
とするプラスミドを含有することが確認された。このプ
ラスミドをpLTM2と命名した。
このプラスミドにより、大腸菌JM 103及びx1776株を
形質転換し、それぞれエシェリシャ・コリ（Escherichi
a coli）JM 103/pLTM2、及びエシェリシャ・コリ（Esch
erichia coli）x1776/pLTM2を得た。
形質転換し、それぞれエシェリシャ・コリ（Escherichi
a coli）JM 103/pLTM2、及びエシェリシャ・コリ（Esch
erichia coli）x1776/pLTM2を得た。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
//(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(71)出願人 999999999
日産化学工業株式会社
東京都千代田区神田錦町３丁目７番地１
(71)出願人 999999999
東ソー株式会社
山口県新南陽市大字富田4560番地
(72)発明者 三木 鉄蔵
千葉県我孫子市新々田２―１ Ａ―908
(72)発明者 加藤 誠志
神奈川県相模原市南台１―９―２
(72)発明者 長田 寛
東京都町田市つくし野４―19―12
Claims (9)
- 【請求項１】プロテインＡの抗体結合部位を含むポリペ
プチドとリンホトキシンのポリペプチドとを含んで成
り、リンホトキシンの生物学的活性及び抗体と結合する
能力を有する融合蛋白質。 - 【請求項２】前記プロテインＡの抗体結合部位を含むポ
リペプチドとリンホトキシンのポリペプチドとが直接に
又はリンカーペプチドを介して連結されている請求の範
囲第１項に記載の融合蛋白質。 - 【請求項３】次のアミノ酸配列： を有する請求の範囲第２項に記載の融合蛋白質。
- 【請求項４】プロテインＡの抗体結合部位を含むポリペ
プチドとリンホトキシンのポリペプチドとを含んで成
り、リンホトキシンの生物学的活性及び抗体と結合する
能力を有する融合蛋白質をコードするDNA。 - 【請求項５】次の塩基配列： を有する請求の範囲第４項に記載のDNA。
- 【請求項６】プロテインＡの抗体結合部位を含むポリペ
プチドとリンホトキシンのポリペプチドとを含んで成
り、リンホトキシンの生物学的活性及び抗体と結合する
能力を有する融合蛋白質をコードするDNAを含んで成る
プラスミド。 - 【請求項７】pPRALT1と称する請求の範囲第６項に記載
のプラスミド。 - 【請求項８】プロテインＡの抗体結合部位を含むポリペ
プチドとリンホトキシンのポリペプチドとを含んで成
り、リンホトキシンの生物学的活性及び抗体と結合する
能力を有する融合蛋白質をコードするDNAを含んで成る
プラスミドにより形質転換された大腸菌。 - 【請求項９】プロテインＡの抗体結合部位を含んで成る
ポリペプチドとリンホトキシンのポリペプチドとを含ん
で成り、リンホトキシンの生物学的活性及び抗体と結合
する能力を有する融合蛋白質の製造方法であって、この
蛋白質をコードするDNAを含んで成るプラスミドにより
形質転換された大腸菌を培養し、この培養物から前記融
合蛋白質を採取することを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-504508A JPH082315B2 (ja) | 1987-05-29 | 1988-05-28 | リンホトキシンを含む融合蛋白質 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13172687 | 1987-05-29 | ||
| JP62-131726 | 1987-05-29 | ||
| JP63-504508A JPH082315B2 (ja) | 1987-05-29 | 1988-05-28 | リンホトキシンを含む融合蛋白質 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO1988009343A1 JPWO1988009343A1 (ja) | 1989-07-06 |
| JPH082315B2 true JPH082315B2 (ja) | 1996-01-17 |
| JPH082315B1 JPH082315B1 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=15064759
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63-504508A Expired - Lifetime JPH082315B2 (ja) | 1987-05-29 | 1988-05-28 | リンホトキシンを含む融合蛋白質 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5095096A (ja) |
| EP (1) | EP0317641B1 (ja) |
| JP (1) | JPH082315B2 (ja) |
| AT (1) | ATE87007T1 (ja) |
| DE (1) | DE3879395T2 (ja) |
| WO (1) | WO1988009343A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5004692A (en) * | 1987-12-15 | 1991-04-02 | Protein Design Labs, Inc. | Cloning and expression of phosopholipase C genes |
| IE63847B1 (en) * | 1989-05-05 | 1995-06-14 | Res Dev Foundation | A novel antibody delivery system for biological response modifiers |
| US6267964B1 (en) | 1989-08-01 | 2001-07-31 | Affibody Technology Sweden Ab | Stabilized protein or peptide conjugates able to bond albumin having extended biological half-lives |
| SE509359C2 (sv) * | 1989-08-01 | 1999-01-18 | Cemu Bioteknik Ab | Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel |
| US5314995A (en) * | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
| US5273889A (en) * | 1990-08-22 | 1993-12-28 | University Of Saskatchewan | Gamma-iterferon-leukotoxin gene fusions and uses thereof |
| US5594107A (en) * | 1990-08-22 | 1997-01-14 | University Of Saskatchewan | Chimeric protein comprising an RTX-family cytotoxin and interferon-2 or interferon |
| US5238823A (en) * | 1990-08-22 | 1993-08-24 | Veterinary Infectious Disease Organization | Interleukin-2-leukotoxin gene fusions and uses thereof |
| DK0546124T4 (da) * | 1990-08-29 | 2003-05-19 | Inst Genetics Llc | Hæmatopoiese-stimulatorer med flere domæner |
| JPH05255393A (ja) * | 1990-09-21 | 1993-10-05 | Ishihara Sangyo Kaisha Ltd | ポリペプチド |
| US5525491A (en) * | 1991-02-27 | 1996-06-11 | Creative Biomolecules, Inc. | Serine-rich peptide linkers |
| US7070771B1 (en) | 1996-12-09 | 2006-07-04 | Regents Of The University Of California | Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells |
| EP0965597A4 (en) * | 1996-12-27 | 2003-01-08 | Mochida Pharm Co Ltd | CELL MEMBRANE EFFECTIVE DRUGS |
| ZA200305980B (en) | 2001-02-12 | 2007-01-31 | Res Dev Foundation | Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof |
| US7101977B2 (en) | 2001-07-17 | 2006-09-05 | Research Development Foundation | Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins |
| US7786282B2 (en) | 2001-12-06 | 2010-08-31 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain |
| US7495090B2 (en) | 2002-05-23 | 2009-02-24 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids encoding chimeric CD154 polypeptides |
| CN105153313A (zh) | 2010-02-16 | 2015-12-16 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 因子viii融合蛋白 |
Family Cites Families (7)
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|---|---|---|---|---|
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| SE462046C (sv) * | 1982-08-23 | 1998-04-27 | Pharmacia Biotech Ab | Hybrid-DNA-vektor innehållande DNA-sekvens från Staphylococcus aureus, förfarande för dess framställning och bakterie innehållande densamma |
| SE8300693L (sv) * | 1983-02-09 | 1984-08-10 | Sven Lofdahl | Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta |
| US4617266A (en) * | 1983-04-28 | 1986-10-14 | Genex Corporation | Production of Protein A |
| NZ212312A (en) * | 1984-06-07 | 1988-09-29 | John Richard Murphy | Hybrid protein comprising fragments of diphtheria toxin and part of cell-specific ligand; and fused gene therefor |
| EP0196864A3 (en) * | 1985-03-25 | 1988-03-23 | Cetus Corporation | Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, dna sequences for use therein and cells transformed using such sequences |
| SE8505922D0 (sv) * | 1985-12-13 | 1985-12-13 | Kabigen Ab | Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering |
-
1988
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