JPH0823548B2 - 血清タンパク質分離用高分解能電気泳動ゲル緩衝剤、そのゲル及び電気泳動法 - Google Patents
血清タンパク質分離用高分解能電気泳動ゲル緩衝剤、そのゲル及び電気泳動法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血清タンパク質の分離
に使用するための高分解能電気泳動ゲル及びその電気泳
動方法に関する。
に使用するための高分解能電気泳動ゲル及びその電気泳
動方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】電気泳
動法は血清タンパク質を分離する重要な臨床的手段とし
て受け入れられてきた。血清タンパク質は患者の血液又
は血清中に存在するタンパク質である。ある患者からの
試料中の血清タンパク質の量と種類は疾病の状態又は肉
体上の健康状態の指標となる。全ての血清タンパク質の
臨床的重要性については知られていない。電気泳動には
加えられた電場の影響による溶解物質又は浮遊物質の運
動が含まれる。一般的に言えば、電気泳動には電気二重
層の固定部分と可動部分の間の相対的な運動が含まれ
る。大部分の物質は極性媒質、例えば水性媒質との接触
下に置かれると表面電荷を得る。考えられる荷電機構に
はイオン化、イオン吸着及びイオン解離がある。得られ
た表面電荷は極性媒質中におけるイオンの分布に影響を
及ぼし、例えば、反対電荷のイオン（対イオン）は表面
方向に引き付けられ、同じ電荷のイオン（コイオン）は
表面からはじかれる。このことは、熱運動による混合傾
向と共に、（１）電荷を有する表面（荷電表面）層及び
（２）極性媒質中に拡散状態で分布するコイオン上の対
イオン中和過剰層からなる電気二重層の形成をもたら
す。もし電場を荷電表面の接線方向にそって加えると電
気二重層の両方の部分に力が作用することになる。荷電
表面はその表面に付着した物質すべてをともなって適当
な方向に移動しょうとし、一方電気二重層の可動部分中
のイオンは溶媒をともなって反対方向へそのままの泳動
を示し、イオン流を生じる。電気泳動において測定され
るのは電場の適用に応じる荷電表面、例えば、溶解物質
又は浮遊物質の静止液体に対する運動である。電気浸透
として知られる現象は電気泳動に対し対のもう一方とな
るもので、ここでは静止荷電表面に対する液体の運動が
測定される。
動法は血清タンパク質を分離する重要な臨床的手段とし
て受け入れられてきた。血清タンパク質は患者の血液又
は血清中に存在するタンパク質である。ある患者からの
試料中の血清タンパク質の量と種類は疾病の状態又は肉
体上の健康状態の指標となる。全ての血清タンパク質の
臨床的重要性については知られていない。電気泳動には
加えられた電場の影響による溶解物質又は浮遊物質の運
動が含まれる。一般的に言えば、電気泳動には電気二重
層の固定部分と可動部分の間の相対的な運動が含まれ
る。大部分の物質は極性媒質、例えば水性媒質との接触
下に置かれると表面電荷を得る。考えられる荷電機構に
はイオン化、イオン吸着及びイオン解離がある。得られ
た表面電荷は極性媒質中におけるイオンの分布に影響を
及ぼし、例えば、反対電荷のイオン（対イオン）は表面
方向に引き付けられ、同じ電荷のイオン（コイオン）は
表面からはじかれる。このことは、熱運動による混合傾
向と共に、（１）電荷を有する表面（荷電表面）層及び
（２）極性媒質中に拡散状態で分布するコイオン上の対
イオン中和過剰層からなる電気二重層の形成をもたら
す。もし電場を荷電表面の接線方向にそって加えると電
気二重層の両方の部分に力が作用することになる。荷電
表面はその表面に付着した物質すべてをともなって適当
な方向に移動しょうとし、一方電気二重層の可動部分中
のイオンは溶媒をともなって反対方向へそのままの泳動
を示し、イオン流を生じる。電気泳動において測定され
るのは電場の適用に応じる荷電表面、例えば、溶解物質
又は浮遊物質の静止液体に対する運動である。電気浸透
として知られる現象は電気泳動に対し対のもう一方とな
るもので、ここでは静止荷電表面に対する液体の運動が
測定される。
【０００３】電気泳動の支持媒質として種々の物質を使
用することができる。これらの物質はタンパク質を分離
する目的に応じて二つの範ちゅうに分けることができよ
う。第一の範ちゅうには紙、寒天又はアガロースゲル及
び酢酸セルロースが含まれるが、これらはすべてタンパ
ク質分子が自由に動くのに十分広い細孔を有している。
この種の支持媒質を用いる電気泳動法では一般に５種の
『古典的』電気泳動帯域とみなされるもの、つまり、ア
ルブミン、α1 −、α2 −、β−及びγ−グロブリンに
含まれる４〜７種のタンパク質の画分が得られる。支持
媒質の第二の範ちゅうにはポリアクリルアミドゲル類が
含まれる。これらの物質はそれが分子ふるいとして作用
するほどの非常に直径の小さい細孔を有している。した
がって、これらの媒質を用いる電気泳動法ではその電荷
とともに分子体積に応じてタンパク質を分別することが
でき、２０種以上の画分が得られる。これら媒質の高分
解能性能は生物医学研究において血清タンパク質の遺伝
変形の分離及び同定を可能ならしめる非常な有利なもの
であることが証明された。しかしながら、ポリアクリル
アミド電気泳動に応じて得られる多くのバンド(band)は
日常臨床作業には不適当であることが見出された。それ
はこれらのゲルパターン(gel pattern) が特にそれらが
典型的に未知の臨床意義を有するタンパク質を含有する
場合に解読し難いからである。臨床的な電気泳動におい
て用いられる最も一般的な物質としては寒天又はアガロ
ースゲル、酢酸セルロース及び紙がある。これら媒質は
血清タンパク質を伝統的な４ないし７種のタンパク質画
分に相当良好な分解能で迅速に分離できるものである。
寒天ゲルはタンパク質をろ紙や酢酸セルロースと同程度
に区別することができるが、これら繊維物質とは異な
り、均質性であり、過度の細網構造ないし網目構造でな
いこと、高保水性、半透明性及びタンパク質に対する低
吸着性という利点を有している。しかしながら、不都合
にも寒天ゲルは荷電した硫酸基及びカルボキシル基が存
在するために電気浸透が非常に強く生じる。したがっ
て、寒天ゲルの泳動に対する影響はサンプルの正当な配
置によって調整せねばならない。
用することができる。これらの物質はタンパク質を分離
する目的に応じて二つの範ちゅうに分けることができよ
う。第一の範ちゅうには紙、寒天又はアガロースゲル及
び酢酸セルロースが含まれるが、これらはすべてタンパ
ク質分子が自由に動くのに十分広い細孔を有している。
この種の支持媒質を用いる電気泳動法では一般に５種の
『古典的』電気泳動帯域とみなされるもの、つまり、ア
ルブミン、α1 −、α2 −、β−及びγ−グロブリンに
含まれる４〜７種のタンパク質の画分が得られる。支持
媒質の第二の範ちゅうにはポリアクリルアミドゲル類が
含まれる。これらの物質はそれが分子ふるいとして作用
するほどの非常に直径の小さい細孔を有している。した
がって、これらの媒質を用いる電気泳動法ではその電荷
とともに分子体積に応じてタンパク質を分別することが
でき、２０種以上の画分が得られる。これら媒質の高分
解能性能は生物医学研究において血清タンパク質の遺伝
変形の分離及び同定を可能ならしめる非常な有利なもの
であることが証明された。しかしながら、ポリアクリル
アミド電気泳動に応じて得られる多くのバンド(band)は
日常臨床作業には不適当であることが見出された。それ
はこれらのゲルパターン(gel pattern) が特にそれらが
典型的に未知の臨床意義を有するタンパク質を含有する
場合に解読し難いからである。臨床的な電気泳動におい
て用いられる最も一般的な物質としては寒天又はアガロ
ースゲル、酢酸セルロース及び紙がある。これら媒質は
血清タンパク質を伝統的な４ないし７種のタンパク質画
分に相当良好な分解能で迅速に分離できるものである。
寒天ゲルはタンパク質をろ紙や酢酸セルロースと同程度
に区別することができるが、これら繊維物質とは異な
り、均質性であり、過度の細網構造ないし網目構造でな
いこと、高保水性、半透明性及びタンパク質に対する低
吸着性という利点を有している。しかしながら、不都合
にも寒天ゲルは荷電した硫酸基及びカルボキシル基が存
在するために電気浸透が非常に強く生じる。したがっ
て、寒天ゲルの泳動に対する影響はサンプルの正当な配
置によって調整せねばならない。
【０００４】寒天は赤藻類の紅色植物網に含まれるある
種の赤色海藻の細胞膜から抽出された多糖の混合物であ
る。寒天の主要な成分はアガロースとして知られる精製
線状ガラクタンのハイドロコロイドである。アガロース
は寒天から単離することができ、寒天を含有する海藻か
ら直接回収することもできる。寒天の好ましくない性質
の多くは寒天中に自然に存在する高濃度の硫酸イオンに
由来する。寒天は一般に１〜５％の硫酸塩を含有し、他
方アガロースは０．７％以下の含有量である。実際的な
言い方をすれば、アガロースは最低の荷電量を有し、そ
れ故最大のゲル化能力を有する不均一寒天分子の画分で
ある。単離されたアガロースは、低濃度で高度のゲル強
度を有するために、ほとんど透明の非対流（低電気浸
透）ゲルマトリックスを作る点が独自のものである。こ
の異常な性質はアガロースの比較的不活性な点及びイオ
ン性を調整できる点と相まって電気泳動の臨床的応用に
おけるアガロースゲルの使用の増大をもたらした。それ
にもかかわらず、アガロースゲルは今なお比較的新しい
電気泳動媒質である。前述したように、アガロースは比
較的中性電荷性であるから電気浸透は最小である。アガ
ロースは１９６１年にはじめてゲル電気泳動に使用さ
れ、その使用及び応用は近年になって急速に増大した。
１％の濃度においてアガロースゲルの網目は分子量１０
０万以上の大きさのタンパク質の迅速かつ比較的自由な
電気泳動移動を許容し、したがって血清タンパク質の分
離用として非常に適している。アガロース媒質はバック
グラウンドの着色を避けることができ、尾引き(tailin
g) はほとんど存在しない。アガロースの含水量及び化
学的純度は酢酸セルロースのそれよりも高く、電場の均
一性を保証し、その結果グロブリン画分、特にβ−グロ
ブリンとγ−グロブリンのより鮮明な分離及び限定が得
られる。
種の赤色海藻の細胞膜から抽出された多糖の混合物であ
る。寒天の主要な成分はアガロースとして知られる精製
線状ガラクタンのハイドロコロイドである。アガロース
は寒天から単離することができ、寒天を含有する海藻か
ら直接回収することもできる。寒天の好ましくない性質
の多くは寒天中に自然に存在する高濃度の硫酸イオンに
由来する。寒天は一般に１〜５％の硫酸塩を含有し、他
方アガロースは０．７％以下の含有量である。実際的な
言い方をすれば、アガロースは最低の荷電量を有し、そ
れ故最大のゲル化能力を有する不均一寒天分子の画分で
ある。単離されたアガロースは、低濃度で高度のゲル強
度を有するために、ほとんど透明の非対流（低電気浸
透）ゲルマトリックスを作る点が独自のものである。こ
の異常な性質はアガロースの比較的不活性な点及びイオ
ン性を調整できる点と相まって電気泳動の臨床的応用に
おけるアガロースゲルの使用の増大をもたらした。それ
にもかかわらず、アガロースゲルは今なお比較的新しい
電気泳動媒質である。前述したように、アガロースは比
較的中性電荷性であるから電気浸透は最小である。アガ
ロースは１９６１年にはじめてゲル電気泳動に使用さ
れ、その使用及び応用は近年になって急速に増大した。
１％の濃度においてアガロースゲルの網目は分子量１０
０万以上の大きさのタンパク質の迅速かつ比較的自由な
電気泳動移動を許容し、したがって血清タンパク質の分
離用として非常に適している。アガロース媒質はバック
グラウンドの着色を避けることができ、尾引き(tailin
g) はほとんど存在しない。アガロースの含水量及び化
学的純度は酢酸セルロースのそれよりも高く、電場の均
一性を保証し、その結果グロブリン画分、特にβ−グロ
ブリンとγ−グロブリンのより鮮明な分離及び限定が得
られる。
【０００５】アガロースゲル操作のスケールは紙の場合
よりも酢酸セルロースの場合に似ており、わずか０．６
μｌの血清を要するのみである。８−サンプルゲルの分
析は泳動時間４０分、乾燥、染色及び走査を含めて約２
時間で完了することができる。アガロースゲルは通常ア
ガロースの懸濁液、一般にバルビタールのような緩衝剤
溶液中１％（ｗ／ｖ）程度の液を加熱することによって
調製される。アガロースゲルはまたアガロースの脱イオ
ン水中懸濁液からも調製することができる。しかしなが
ら、このようなゲルは電気泳動分析の始動前に紙や酢酸
セルロースの平衡化と同様に緩衝剤で平衡化する必要が
ある。緩衝剤溶液中で調製された寒天又はアガロースゲ
ルは平衡化が必要でなく、時には『前緩衝処理』(prebu
ffered)と称される。アガロース懸濁液の加熱はマグネ
チックスターラーを装備した電熱器で好ましく行われ、
透明な溶液が得られるまで続けられる。次いで溶液は冷
却され、ガラス板又はプラスチックシート上に拡げられ
る。この調製は手動又は自動のどちらでも行うことがで
きる。透明なたわみ性のプラスチック裏打ちに固定さ
れ、ゲル中に８個のサンプル槽を成形された事前注型ア
ガロースゲル薄層フィルムは商品としてカリフォルニ
ア、パロアルトのコーニング・メディカルから入手でき
る。サンプルを塗布した後、アガロースゲルは『運転用
緩衝液』中に置かれ、 電場がかけられて分析運転が行わ
れる。運転用緩衝液はゲル注型において使用された緩衝
剤溶液と同じであっても同じでなくてもよい。
よりも酢酸セルロースの場合に似ており、わずか０．６
μｌの血清を要するのみである。８−サンプルゲルの分
析は泳動時間４０分、乾燥、染色及び走査を含めて約２
時間で完了することができる。アガロースゲルは通常ア
ガロースの懸濁液、一般にバルビタールのような緩衝剤
溶液中１％（ｗ／ｖ）程度の液を加熱することによって
調製される。アガロースゲルはまたアガロースの脱イオ
ン水中懸濁液からも調製することができる。しかしなが
ら、このようなゲルは電気泳動分析の始動前に紙や酢酸
セルロースの平衡化と同様に緩衝剤で平衡化する必要が
ある。緩衝剤溶液中で調製された寒天又はアガロースゲ
ルは平衡化が必要でなく、時には『前緩衝処理』(prebu
ffered)と称される。アガロース懸濁液の加熱はマグネ
チックスターラーを装備した電熱器で好ましく行われ、
透明な溶液が得られるまで続けられる。次いで溶液は冷
却され、ガラス板又はプラスチックシート上に拡げられ
る。この調製は手動又は自動のどちらでも行うことがで
きる。透明なたわみ性のプラスチック裏打ちに固定さ
れ、ゲル中に８個のサンプル槽を成形された事前注型ア
ガロースゲル薄層フィルムは商品としてカリフォルニ
ア、パロアルトのコーニング・メディカルから入手でき
る。サンプルを塗布した後、アガロースゲルは『運転用
緩衝液』中に置かれ、 電場がかけられて分析運転が行わ
れる。運転用緩衝液はゲル注型において使用された緩衝
剤溶液と同じであっても同じでなくてもよい。
【０００６】精製アガロースを用いる改良された電気泳
動技術が従来の４〜７種の画分よりも多い臨床的に重要
な成分を分離し同定するのに最近開発されてきたが、ア
クリルアミドを用いるタンパク質電気泳動によって得ら
れる非臨床的に有意義なバンドのような多能性は得られ
ていない。ヨハンソン、ビー、ジー、アガロースゲル電
気泳動、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・クリニ
カル・ラボラトリー・インベスティゲーション(Scand.
J. Clin. Lab. Invest.)、２９、（補遺１２４）、７−
１９（１９７２）。改良技術は水冷ガラス板上のアガロ
ースゲル中で比較的高い電圧を印加して血清タンパク質
を分離する方法を用い、その結果１時間以内で約１５の
タンパク質サンプルを同時に分離できた。これに加え
て、標準バルビタール運転用緩衝液にｐＨ８．６でカル
シウムイオンを添加すればβ−グロブリン域成分の良好
な分解が得られグロブリンの着色が強められる。約２６
０Ｖ、もしくは２０Ｖ／ｃｍの高電圧の使用は従来のア
ガロース電気泳動に使用されるそれの２倍以上に相当す
る。この高電圧の結果、おのおの『古典的』電気泳動帯
域の２以上の成分が５０ｍｇ／ｄｌよりも高い濃度で得
られた。Ｉｄ．高電圧によって発生する増加熱量はタン
パク質を変性しアガロースゲルを損なうのでその系から
例えば１０℃の冷水の循環により除去される。運転用緩
衝剤としてのバルビタールの使用は少なくとも血しょう
タンパク質の分離においてトリス−グリシン緩衝剤又は
ホウ酸塩緩衝剤よりも優れていると報告されている。Ｉ
ｄ．
動技術が従来の４〜７種の画分よりも多い臨床的に重要
な成分を分離し同定するのに最近開発されてきたが、ア
クリルアミドを用いるタンパク質電気泳動によって得ら
れる非臨床的に有意義なバンドのような多能性は得られ
ていない。ヨハンソン、ビー、ジー、アガロースゲル電
気泳動、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・クリニ
カル・ラボラトリー・インベスティゲーション(Scand.
J. Clin. Lab. Invest.)、２９、（補遺１２４）、７−
１９（１９７２）。改良技術は水冷ガラス板上のアガロ
ースゲル中で比較的高い電圧を印加して血清タンパク質
を分離する方法を用い、その結果１時間以内で約１５の
タンパク質サンプルを同時に分離できた。これに加え
て、標準バルビタール運転用緩衝液にｐＨ８．６でカル
シウムイオンを添加すればβ−グロブリン域成分の良好
な分解が得られグロブリンの着色が強められる。約２６
０Ｖ、もしくは２０Ｖ／ｃｍの高電圧の使用は従来のア
ガロース電気泳動に使用されるそれの２倍以上に相当す
る。この高電圧の結果、おのおの『古典的』電気泳動帯
域の２以上の成分が５０ｍｇ／ｄｌよりも高い濃度で得
られた。Ｉｄ．高電圧によって発生する増加熱量はタン
パク質を変性しアガロースゲルを損なうのでその系から
例えば１０℃の冷水の循環により除去される。運転用緩
衝剤としてのバルビタールの使用は少なくとも血しょう
タンパク質の分離においてトリス−グリシン緩衝剤又は
ホウ酸塩緩衝剤よりも優れていると報告されている。Ｉ
ｄ．
【０００７】アガロース媒質、冷却系及びカルシウムイ
オンを含有する変性緩衝剤の使用を組み合わせたこの方
法は高分解能電気泳動（ＨＲＥ）として知られてきた。
ＨＲＥは正常な血しょう及び病理学的血しょうに適用さ
れ、血清タンパク質類の９５％以上が含まれる１４成分
もの多くの成分の同定に用いられ、電気泳動パターンの
外観に決定的な影響を有している。ローレル、シー、ビ
ー、血しょう、脳脊髄液及び尿のゲル電気泳動画分の組
成及び変動、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・ク
リニカル・ラボラトリー・インベスティゲーション) 、
２９、（補遺１２４）、７１−８２、１９７２。ＨＲＥ
法を用いて正常なヒトの血清中のプレアルブミン及びフ
ィブリノゲンを除く少なくとも１１のタンパク質画分が
正常に同定できる。サン、ティー、電気泳動の現状、ラ
ボラトリー・マネージメント、１７（６）、４３−４９
（１９７９）。これらの１１画分は『古典的』５電気泳
動帯域と次のような相互関係にある。 ５電気泳動帯域 ＨＲＥ アルブミン アルブミン α1 −グロブリン α1 −リポタンパク質 α1 −アンチトリプシン α2 −グロブリン トリプシンインヒビターアンチ キモトリプシン α2 −マクログロブリン ハプトグロブリン β−グロブリン ヘモペキシン トランスフェリン β−リポタンパク質 Ｃ3 補体 γ−グロブリン γ−グロブリン ＨＲＥパターンは種々の着色強度及び帯域幅を有する多
数のバンド、遺伝変形及びある病理状態における異常な
バンドなどがあるため明らかに複雑である。これらのパ
ターンの主因解釈には依然相当の経験が必要である。血
清の方が血しょうよりも好ましいが、それは血しょう中
のフィブリノゲンのバンドがかなり不明瞭であり、また
β−グロブリン域に存在する何らかの電気泳動的免疫グ
ロブリンの異常性のため混乱が生じるからである。パタ
ーンの主要な価値は個々の画分の着色強度の正常なもの
との変化、選定された正常なものと比較して増大したか
減少したかを目視的に認定することである。その後これ
らのタンパク質は免疫化学的に定量される。
オンを含有する変性緩衝剤の使用を組み合わせたこの方
法は高分解能電気泳動（ＨＲＥ）として知られてきた。
ＨＲＥは正常な血しょう及び病理学的血しょうに適用さ
れ、血清タンパク質類の９５％以上が含まれる１４成分
もの多くの成分の同定に用いられ、電気泳動パターンの
外観に決定的な影響を有している。ローレル、シー、ビ
ー、血しょう、脳脊髄液及び尿のゲル電気泳動画分の組
成及び変動、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・ク
リニカル・ラボラトリー・インベスティゲーション) 、
２９、（補遺１２４）、７１−８２、１９７２。ＨＲＥ
法を用いて正常なヒトの血清中のプレアルブミン及びフ
ィブリノゲンを除く少なくとも１１のタンパク質画分が
正常に同定できる。サン、ティー、電気泳動の現状、ラ
ボラトリー・マネージメント、１７（６）、４３−４９
（１９７９）。これらの１１画分は『古典的』５電気泳
動帯域と次のような相互関係にある。 ５電気泳動帯域 ＨＲＥ アルブミン アルブミン α1 −グロブリン α1 −リポタンパク質 α1 −アンチトリプシン α2 −グロブリン トリプシンインヒビターアンチ キモトリプシン α2 −マクログロブリン ハプトグロブリン β−グロブリン ヘモペキシン トランスフェリン β−リポタンパク質 Ｃ3 補体 γ−グロブリン γ−グロブリン ＨＲＥパターンは種々の着色強度及び帯域幅を有する多
数のバンド、遺伝変形及びある病理状態における異常な
バンドなどがあるため明らかに複雑である。これらのパ
ターンの主因解釈には依然相当の経験が必要である。血
清の方が血しょうよりも好ましいが、それは血しょう中
のフィブリノゲンのバンドがかなり不明瞭であり、また
β−グロブリン域に存在する何らかの電気泳動的免疫グ
ロブリンの異常性のため混乱が生じるからである。パタ
ーンの主要な価値は個々の画分の着色強度の正常なもの
との変化、選定された正常なものと比較して増大したか
減少したかを目視的に認定することである。その後これ
らのタンパク質は免疫化学的に定量される。
【０００８】ＨＲＥ法は血清タンパク質の日常臨床分析
に重要な進歩を提供したけれども、ＨＲＥゲル上に現わ
れるバンドをさらに明瞭化し、それによって分解能を改
善し、ゲルの読み取りを容易に行うことができるゲル及
び／又は方法を提供することは有利であろう。この分野
における一つの方法として高濃度アガロースゲルの使用
が提案された。ホッホ、エイチ及びレワレン、シー、ジ
ー、高濃度アガロースゲル：高分解能電気泳動用新媒
質、アナリティカル・バイオケミストリー、７、３１２
−３１７（１９７７）。アガロース３．５〜１５％（ｗ
／ｖ）の範囲でリン酸ナトリウム緩衝液で仕上げられた
ゲルはアガロース２％（ｗ／ｖ）未満の多少とも標準的
なアガロースゲルの場合よりも優れた分解能を持ってい
ると報告された。しかしながら、高濃度アガロースゲル
は調製が困難で、未だ市販されていない。可撓性のプラ
スチック支持体の上に事前注型された前緩衝処理１％
（ｗ／ｖ）アガロースゲルを使用する高分解能システム
は１９７５年から商品として入手できるようになった
が、最初の市場化はニュージャージー、フリーホールド
のウォーシングトン・ダイアグノスティクスにより商標
パナゲル(Panagel) の名のもとに行われた。このユニッ
トの主要成分は２００Ｖの電圧印加によって発生する過
剰の熱を吸収し媒質又は試料が損なわれるのを防止する
『固体状態』の冷却用ブロックである。パナゲルシステ
ムは１．５２％バルビタール中で仕上げられたアガロー
スゲルを使用する。同じ緩衝液、すなわち、１．５２％
バルビタールが運転用緩衝液として使用される。パナゲ
ルＨＲＥシステムは長さ６インチの比較的長いゲルを使
用することによって分解能を改善する。
に重要な進歩を提供したけれども、ＨＲＥゲル上に現わ
れるバンドをさらに明瞭化し、それによって分解能を改
善し、ゲルの読み取りを容易に行うことができるゲル及
び／又は方法を提供することは有利であろう。この分野
における一つの方法として高濃度アガロースゲルの使用
が提案された。ホッホ、エイチ及びレワレン、シー、ジ
ー、高濃度アガロースゲル：高分解能電気泳動用新媒
質、アナリティカル・バイオケミストリー、７、３１２
−３１７（１９７７）。アガロース３．５〜１５％（ｗ
／ｖ）の範囲でリン酸ナトリウム緩衝液で仕上げられた
ゲルはアガロース２％（ｗ／ｖ）未満の多少とも標準的
なアガロースゲルの場合よりも優れた分解能を持ってい
ると報告された。しかしながら、高濃度アガロースゲル
は調製が困難で、未だ市販されていない。可撓性のプラ
スチック支持体の上に事前注型された前緩衝処理１％
（ｗ／ｖ）アガロースゲルを使用する高分解能システム
は１９７５年から商品として入手できるようになった
が、最初の市場化はニュージャージー、フリーホールド
のウォーシングトン・ダイアグノスティクスにより商標
パナゲル(Panagel) の名のもとに行われた。このユニッ
トの主要成分は２００Ｖの電圧印加によって発生する過
剰の熱を吸収し媒質又は試料が損なわれるのを防止する
『固体状態』の冷却用ブロックである。パナゲルシステ
ムは１．５２％バルビタール中で仕上げられたアガロー
スゲルを使用する。同じ緩衝液、すなわち、１．５２％
バルビタールが運転用緩衝液として使用される。パナゲ
ルＨＲＥシステムは長さ６インチの比較的長いゲルを使
用することによって分解能を改善する。
【０００９】最近、その他の商品化ＨＲＥシステムもま
た入手できるようになった。それらの中にカリフォルニ
ア、パロアルトのコーニング・メディカルによって市場
化されたｐＨ８．６で０．０７５Ｍのバルビタール緩衝
液中の１％（ｗ／ｖ）アガロースと５％（ｗ／ｖ）のス
クロースで作られたシステムがある。コーニングの運転
用緩衝液は１リットルの蒸留水又脱イオン水中でｐＨ
７．３、０．０７５Ｍの組成にされたトリシン（Ｎ−ト
リス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＭＯＰＳ
Ｏ（３−（Ｎ−モルフォリノ）−２−ヒドロキシプロパ
ンスルフォン酸）ナトリウム及び乳酸カルシウムの混合
物１６．３ｇを含有している。ｐＨ８．６のバルビター
ル緩衝液は日常的な血清タンパク質電気泳動用の標準緩
衝液として受け入れられてきた。ベロナールとしても知
られているバルビタールは、コーニング・メディカルか
ら入手できるＨＲＥキットを除く前述の従来技術のＨＲ
Ｅ法の場合と同様、商標タイタン(TITANTM) の名のもと
にテキサス、ビューモントのヘレナ・ラボラトリーズに
より市販され商品として入手できるＨＲＥキットの運転
用緩衝液として用いられる緩衝液である。その例えばト
リス−グリシン及びホウ酸塩緩衝液に対する優秀性は最
初のＨＲＥ法研究に示唆されている。
た入手できるようになった。それらの中にカリフォルニ
ア、パロアルトのコーニング・メディカルによって市場
化されたｐＨ８．６で０．０７５Ｍのバルビタール緩衝
液中の１％（ｗ／ｖ）アガロースと５％（ｗ／ｖ）のス
クロースで作られたシステムがある。コーニングの運転
用緩衝液は１リットルの蒸留水又脱イオン水中でｐＨ
７．３、０．０７５Ｍの組成にされたトリシン（Ｎ−ト
リス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＭＯＰＳ
Ｏ（３−（Ｎ−モルフォリノ）−２−ヒドロキシプロパ
ンスルフォン酸）ナトリウム及び乳酸カルシウムの混合
物１６．３ｇを含有している。ｐＨ８．６のバルビター
ル緩衝液は日常的な血清タンパク質電気泳動用の標準緩
衝液として受け入れられてきた。ベロナールとしても知
られているバルビタールは、コーニング・メディカルか
ら入手できるＨＲＥキットを除く前述の従来技術のＨＲ
Ｅ法の場合と同様、商標タイタン(TITANTM) の名のもと
にテキサス、ビューモントのヘレナ・ラボラトリーズに
より市販され商品として入手できるＨＲＥキットの運転
用緩衝液として用いられる緩衝液である。その例えばト
リス−グリシン及びホウ酸塩緩衝液に対する優秀性は最
初のＨＲＥ法研究に示唆されている。
【００１０】最近、馬尿酸及び／又はそのナトリウム塩
が電気泳動法での使用を目的とする緩衝溶液中のバルビ
タールの代替品として一般に提案されている。バルビタ
ールの代替品の探索はバルビタールがバルビツル酸塩と
して米国の薬品管理法及び規則のもとに、又他の国々に
おいても同様な法律及び規則のもとに『管理物質』とさ
れている事実に由来する。米国特許第４，２９２，１５
４号は電気泳動法に使用される運転用緩衝液中のバルビ
タールの代替品として馬尿酸塩及び他の関連化合物の使
用を開示し、請求の範囲としている。そこに馬尿酸塩緩
衝液がバルビタール緩衝液より優れていることは示唆さ
れておらず、また馬尿酸塩緩衝液のＨＲＥ法におけるタ
ンパク質の電気泳動分離に通常使用される標準バルビタ
ール緩衝液の代替え品として以外の使用も示唆されてい
ない。
が電気泳動法での使用を目的とする緩衝溶液中のバルビ
タールの代替品として一般に提案されている。バルビタ
ールの代替品の探索はバルビタールがバルビツル酸塩と
して米国の薬品管理法及び規則のもとに、又他の国々に
おいても同様な法律及び規則のもとに『管理物質』とさ
れている事実に由来する。米国特許第４，２９２，１５
４号は電気泳動法に使用される運転用緩衝液中のバルビ
タールの代替品として馬尿酸塩及び他の関連化合物の使
用を開示し、請求の範囲としている。そこに馬尿酸塩緩
衝液がバルビタール緩衝液より優れていることは示唆さ
れておらず、また馬尿酸塩緩衝液のＨＲＥ法におけるタ
ンパク質の電気泳動分離に通常使用される標準バルビタ
ール緩衝液の代替え品として以外の使用も示唆されてい
ない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明はＨＲＥ法で使用
される新規なアガロースゲルを提供するものである。ゲ
ルの新規性はアガロースゲルを調製するのに用いるゲル
緩衝液に馬尿酸ナトリウム又はグリシンのいずれか又は
その組み合わせをさらにバルビツル酸ナトリウム、及び
トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−
プロパンジオール）と組み合わせて使用することにあ
る。脱イオン水又は蒸留水で調製される緩衝液中へアス
パラギン酸、塩化カリウム、アジ化ナトリウム及びエチ
レングリコールもまた添加することができる。本発明の
新規なＨＲＥゲルは血清試料タンパク質画分の改善され
た分離及び分解能を提供する。改善された分解能は標準
バルビタール緩衝液が運転用緩衝液として使用される場
合又はゲル緩衝液が運転用緩衝液として使用される場合
に存在する。
される新規なアガロースゲルを提供するものである。ゲ
ルの新規性はアガロースゲルを調製するのに用いるゲル
緩衝液に馬尿酸ナトリウム又はグリシンのいずれか又は
その組み合わせをさらにバルビツル酸ナトリウム、及び
トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−
プロパンジオール）と組み合わせて使用することにあ
る。脱イオン水又は蒸留水で調製される緩衝液中へアス
パラギン酸、塩化カリウム、アジ化ナトリウム及びエチ
レングリコールもまた添加することができる。本発明の
新規なＨＲＥゲルは血清試料タンパク質画分の改善され
た分離及び分解能を提供する。改善された分解能は標準
バルビタール緩衝液が運転用緩衝液として使用される場
合又はゲル緩衝液が運転用緩衝液として使用される場合
に存在する。
【００１２】以下に本発明を詳細に説明する。通常ナト
リウム塩となった馬尿酸（ベンゾイルグリシン）又はグ
リシンのいずれか又はそれらの組み合わせをアガロース
ゲル緩衝液中へ添加することが驚くべきことにＨＲＥ法
に従って得られる清澄性及び分解能を大きく改善するこ
とが発見された。従来の技術（例えば、スカンジナビア
ン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・イ
ンベスティゲーション、２９、（補遺１２４）、７−１
９、（１９７２）参照）はそのようなグリシン基調緩衝
液は劣った結果をもたらすか、標準のバルビタール緩衝
液の分解能に最もよく対比しても反対の結果が得られた
であろうことを示唆している。このゲル緩衝液を同時に
運転用緩衝液として用いた場合も、標準のバルビツル酸
ナトリウム緩衝液を運転用緩衝液として用いた場合もと
もに分解能の改善が観測された。このことは低濃度及び
／又はイオン強度を調節した同じバルビタール緩衝液を
ＨＲＥを含む数種の異なった形式の電気泳動操作に用い
ることができるから特に有利である。さらに、このよう
な分離性の改善はわずか長さ４インチという比較的短い
ゲルの場合にも観察された。
リウム塩となった馬尿酸（ベンゾイルグリシン）又はグ
リシンのいずれか又はそれらの組み合わせをアガロース
ゲル緩衝液中へ添加することが驚くべきことにＨＲＥ法
に従って得られる清澄性及び分解能を大きく改善するこ
とが発見された。従来の技術（例えば、スカンジナビア
ン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・イ
ンベスティゲーション、２９、（補遺１２４）、７−１
９、（１９７２）参照）はそのようなグリシン基調緩衝
液は劣った結果をもたらすか、標準のバルビタール緩衝
液の分解能に最もよく対比しても反対の結果が得られた
であろうことを示唆している。このゲル緩衝液を同時に
運転用緩衝液として用いた場合も、標準のバルビツル酸
ナトリウム緩衝液を運転用緩衝液として用いた場合もと
もに分解能の改善が観測された。このことは低濃度及び
／又はイオン強度を調節した同じバルビタール緩衝液を
ＨＲＥを含む数種の異なった形式の電気泳動操作に用い
ることができるから特に有利である。さらに、このよう
な分離性の改善はわずか長さ４インチという比較的短い
ゲルの場合にも観察された。
【００１３】ゲル緩衝液中において、馬尿酸塩、グリシ
ン、又は馬尿酸塩とグリシンの混合物は通常バルビター
ル及びトリスと同じ濃度で存在し、例えば、各成分の濃
度は全濃度の０．５％以下で変動する範囲内にある。好
ましくは、馬尿酸塩又はグリシンは約０．３％から約
２．０％（ｗ／ｖ）の濃度で同濃度のトリス及び約０．
３〜１．２％（ｗ／ｖ）のバルビツル酸ナトリウムと組
み合わせて緩衝液中へ添加される。しかしながら、余分
の冷却を行う場合にはこの範囲の上限が必要になること
に注意せねばならない。この緩衝液システムは典型的な
ＨＲＥ条件下でアガロースゲル上の血清タンパク質の電
気泳動分離に従って得られるバンドの鮮鋭度を改善す
る。ゲル緩衝液はｐＨを調整するため、さらには分離性
を改善するためアスパラギン酸又はバルビツル酸のよう
な酸、及び伝導度を上昇させるため塩化カリウム又は塩
化ナトリウムのような塩類を含有することができる。最
適の結果を得るための酸及び塩の選択及び相対的濃度は
当業者にとって容易に調整できよう。好ましくは、酸は
馬尿酸塩又はグリシン及びトリスのそれに対比する濃度
であり、約０．３％〜約２．０％（ｗ／ｖ）の程度が好
ましい。塩は通常約０．０１％〜約０．１０％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在する。ゲル緩衝液はさらにアジ化ナト
リウムのような防腐剤を含んでいてもよく、チメロソー
ル(thimerosol)のような他の防腐剤も使用できる。防腐
剤の有効量の決定もまた当業者技術の範囲内にある。一
般に、防腐剤は約０．０５％〜約０．１５％（ｗ／ｖ）
の濃度で添加される。湿潤剤もまたゲル緩衝液に最適に
添加することができる。エチレングリコール及びスクロ
ースはゲルの時間経過による乾燥を防止する一般的な湿
潤剤である。これらの物質はそのうえ粘度を増大させ、
タンパク質バンドの拡散を減少させる。エチレングリコ
ールは通常アガロースゲル中に約２％〜約１５％（ｖ／
ｖ）の濃度で含有され、一方スクロースの濃度は約２％
〜約１０％（ｗ／ｖ）程度である。
ン、又は馬尿酸塩とグリシンの混合物は通常バルビター
ル及びトリスと同じ濃度で存在し、例えば、各成分の濃
度は全濃度の０．５％以下で変動する範囲内にある。好
ましくは、馬尿酸塩又はグリシンは約０．３％から約
２．０％（ｗ／ｖ）の濃度で同濃度のトリス及び約０．
３〜１．２％（ｗ／ｖ）のバルビツル酸ナトリウムと組
み合わせて緩衝液中へ添加される。しかしながら、余分
の冷却を行う場合にはこの範囲の上限が必要になること
に注意せねばならない。この緩衝液システムは典型的な
ＨＲＥ条件下でアガロースゲル上の血清タンパク質の電
気泳動分離に従って得られるバンドの鮮鋭度を改善す
る。ゲル緩衝液はｐＨを調整するため、さらには分離性
を改善するためアスパラギン酸又はバルビツル酸のよう
な酸、及び伝導度を上昇させるため塩化カリウム又は塩
化ナトリウムのような塩類を含有することができる。最
適の結果を得るための酸及び塩の選択及び相対的濃度は
当業者にとって容易に調整できよう。好ましくは、酸は
馬尿酸塩又はグリシン及びトリスのそれに対比する濃度
であり、約０．３％〜約２．０％（ｗ／ｖ）の程度が好
ましい。塩は通常約０．０１％〜約０．１０％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在する。ゲル緩衝液はさらにアジ化ナト
リウムのような防腐剤を含んでいてもよく、チメロソー
ル(thimerosol)のような他の防腐剤も使用できる。防腐
剤の有効量の決定もまた当業者技術の範囲内にある。一
般に、防腐剤は約０．０５％〜約０．１５％（ｗ／ｖ）
の濃度で添加される。湿潤剤もまたゲル緩衝液に最適に
添加することができる。エチレングリコール及びスクロ
ースはゲルの時間経過による乾燥を防止する一般的な湿
潤剤である。これらの物質はそのうえ粘度を増大させ、
タンパク質バンドの拡散を減少させる。エチレングリコ
ールは通常アガロースゲル中に約２％〜約１５％（ｖ／
ｖ）の濃度で含有され、一方スクロースの濃度は約２％
〜約１０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００１４】すべてのＨＲＥゲル緩衝液においてカルシ
ウムイオンがβ−グロブリン域での分離を改善するため
に含有されるべきである。これらカルシウムイオンは、
酢酸カルシウムのようなカルシウムイオン源も使用でき
るけれども、好ましくは乳酸カルシウムの形で添加され
る。カルシウムイオン源として乳酸カルシウムが用いら
れた場合、乳酸カルシウムは好ましくは約０．０５％〜
約０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で含有される。ゲルはいく
つかの標準アガロースゲルの場合と殆ど同じ方法で調製
される。ゲル緩衝液は標準アガロースゲル、例えば、ア
ガロース２％（ｗ／ｖ）未満の場合でも高濃度アガロー
スゲルに対しても同等に有効である。本発明にしたがっ
て標準低濃度アガロースゲルを調製する場合、約１％
（ｗ／ｖ）のアガロースをゲル緩衝液に溶解し、攪拌し
ながら約９５℃に加熱した後約５５℃に冷却し、ガラス
板又はプラスチックシート上で好ましく注型される。代
りに、脱イオン水又は蒸留水に、緩衝液成分を添加する
前に、アガロースを先ず添加し、溶解する。緩衝液成分
は加熱の前後どちらで添加してもよい。加熱後添加する
場合には緩衝液成分が例えば加水分解などによって損な
われる機会が少なくなる。高濃度アガロースゲルは一般
的に従来技術の教示に従って調製されるが、従来技術の
緩衝液又は脱イオン水の代わりに本発明のゲル緩衝液が
用いられる。
ウムイオンがβ−グロブリン域での分離を改善するため
に含有されるべきである。これらカルシウムイオンは、
酢酸カルシウムのようなカルシウムイオン源も使用でき
るけれども、好ましくは乳酸カルシウムの形で添加され
る。カルシウムイオン源として乳酸カルシウムが用いら
れた場合、乳酸カルシウムは好ましくは約０．０５％〜
約０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で含有される。ゲルはいく
つかの標準アガロースゲルの場合と殆ど同じ方法で調製
される。ゲル緩衝液は標準アガロースゲル、例えば、ア
ガロース２％（ｗ／ｖ）未満の場合でも高濃度アガロー
スゲルに対しても同等に有効である。本発明にしたがっ
て標準低濃度アガロースゲルを調製する場合、約１％
（ｗ／ｖ）のアガロースをゲル緩衝液に溶解し、攪拌し
ながら約９５℃に加熱した後約５５℃に冷却し、ガラス
板又はプラスチックシート上で好ましく注型される。代
りに、脱イオン水又は蒸留水に、緩衝液成分を添加する
前に、アガロースを先ず添加し、溶解する。緩衝液成分
は加熱の前後どちらで添加してもよい。加熱後添加する
場合には緩衝液成分が例えば加水分解などによって損な
われる機会が少なくなる。高濃度アガロースゲルは一般
的に従来技術の教示に従って調製されるが、従来技術の
緩衝液又は脱イオン水の代わりに本発明のゲル緩衝液が
用いられる。
【００１５】
【実施例】以下に述べる実施例は本発明を説明すること
を目的とするものであり、本発明のゲル緩衝液の使用に
従って得られる分解能の改善を証明するものである。 実施例１ （馬尿酸塩ゲル緩衝液を用いる電気泳動分離）アガロー
スを濃度１％（ｗ／ｖ）になるように脱イオン水に添加
し、約９５℃に加熱して溶解した。約５５℃に冷却後、
この溶液に次に示す緩衝液成分を添加した： ０．１５％（ｗ／ｖ）乳酸カルシウム ０．６％（ｗ／ｖ）馬尿酸ナトリウム ０．６２％（ｗ／ｖ）バルビツル酸ナトリウム ０．６％（ｗ／ｖ）アスパラギン酸 ０．７％（ｗ／ｖ）トリス ０．０５％（ｗ／ｖ）塩化カリウム ０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム １０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール 得られた溶液を３ｘ４インチのプラスチックのシート上
で注型した。注型ゲルは約８．１よりやや高いｐＨを有
していた。６種の標本試料を標準テンプレート塗布法を
用いてゲルの３インチ方向を横切るように塗布した。次
いでこのゲルをアガロース面を上にして水冷した支持体
中に置き、その全体を逆転させて電極単位を含有する緩
衝液中にゲルの端部が標準バルビタール運転用緩衝液中
に約０．１５μイオン強度で浸漬するようにした。２０
０Ｖの電位をゲルの４インチ方向を横切るように加え、
約４５分間そのままにして電気泳動分離を続行させた。
その後電流を切り、ゲルを取り出し、標準固定液をゲル
上に約１０分間作用させた。次に、ゲルを約２０分間乾
燥させた後標準タンパク質着色液を用い約３分間着色し
た。その後ゲルを５〜１０％酢酸により約３分間脱色
し、通常通り約５分間乾燥させ、読み取りを行った。解
釈は目視でもデンシトメトリーのような自動的方法によ
ってでも可能である。結果を図１に示す。
を目的とするものであり、本発明のゲル緩衝液の使用に
従って得られる分解能の改善を証明するものである。 実施例１ （馬尿酸塩ゲル緩衝液を用いる電気泳動分離）アガロー
スを濃度１％（ｗ／ｖ）になるように脱イオン水に添加
し、約９５℃に加熱して溶解した。約５５℃に冷却後、
この溶液に次に示す緩衝液成分を添加した： ０．１５％（ｗ／ｖ）乳酸カルシウム ０．６％（ｗ／ｖ）馬尿酸ナトリウム ０．６２％（ｗ／ｖ）バルビツル酸ナトリウム ０．６％（ｗ／ｖ）アスパラギン酸 ０．７％（ｗ／ｖ）トリス ０．０５％（ｗ／ｖ）塩化カリウム ０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム １０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール 得られた溶液を３ｘ４インチのプラスチックのシート上
で注型した。注型ゲルは約８．１よりやや高いｐＨを有
していた。６種の標本試料を標準テンプレート塗布法を
用いてゲルの３インチ方向を横切るように塗布した。次
いでこのゲルをアガロース面を上にして水冷した支持体
中に置き、その全体を逆転させて電極単位を含有する緩
衝液中にゲルの端部が標準バルビタール運転用緩衝液中
に約０．１５μイオン強度で浸漬するようにした。２０
０Ｖの電位をゲルの４インチ方向を横切るように加え、
約４５分間そのままにして電気泳動分離を続行させた。
その後電流を切り、ゲルを取り出し、標準固定液をゲル
上に約１０分間作用させた。次に、ゲルを約２０分間乾
燥させた後標準タンパク質着色液を用い約３分間着色し
た。その後ゲルを５〜１０％酢酸により約３分間脱色
し、通常通り約５分間乾燥させ、読み取りを行った。解
釈は目視でもデンシトメトリーのような自動的方法によ
ってでも可能である。結果を図１に示す。
【００１６】実施例２ （グリシンゲル緩衝液を用いる電気泳動分離） 次のゲル緩衝液処方を用いた以外は実施例１に示したの
と同じ操作を行った。 ０．１５％（ｗ／ｖ）乳酸カルシウム １．０％（ｗ／ｖ）グリシン ０．６２％（ｗ／ｖ）バルビツル酸ナトリウム ０．６％（ｗ／ｖ）アスパラギン酸 ０．７％（ｗ／ｖ）トリス ０．０５％（ｗ／ｖ）塩化カリウム ０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム １０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール ９０％（ｖ／ｖ）脱イオン水 電気泳動分離の結果を図２に示す。
と同じ操作を行った。 ０．１５％（ｗ／ｖ）乳酸カルシウム １．０％（ｗ／ｖ）グリシン ０．６２％（ｗ／ｖ）バルビツル酸ナトリウム ０．６％（ｗ／ｖ）アスパラギン酸 ０．７％（ｗ／ｖ）トリス ０．０５％（ｗ／ｖ）塩化カリウム ０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム １０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール ９０％（ｖ／ｖ）脱イオン水 電気泳動分離の結果を図２に示す。
【００１７】実施例３ （馬尿酸塩／グリシンゲル緩衝液を用いる電気泳動分
離） 次のゲル緩衝液処方を用いた以外は実施例１に示したの
と同じ操作を行った。 ０．１５％（ｗ／ｖ）乳酸カルシウム ０．１％（ｗ／ｖ）馬尿酸ナトリウム ０．５％（ｗ／ｖ）グリシン ０．６２％（ｗ／ｖ）バルビツル酸ナトリウム ０．６％（ｗ／ｖ）アスパラギン酸 ０．７％（ｗ／ｖ）トリス ０．５％（ｗ／ｖ）塩化カリウム ０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム １０％（ｗ／ｖ）エチレングリコール ９０％（ｖ／ｖ）脱イオン水 電気泳動分離の結果を図３に示す。他のゲル緩衝液処方
は当業者にとっては明らかであろう。本発明の本質的な
精神から外れることなく本発明は数種の異なったゲル緩
衝液処方及びアガロースゲルにおいて具体化できるの
で、本発明は前記の説明に対応するものとして別記の特
許請求の範囲によって特定されるものである。
離） 次のゲル緩衝液処方を用いた以外は実施例１に示したの
と同じ操作を行った。 ０．１５％（ｗ／ｖ）乳酸カルシウム ０．１％（ｗ／ｖ）馬尿酸ナトリウム ０．５％（ｗ／ｖ）グリシン ０．６２％（ｗ／ｖ）バルビツル酸ナトリウム ０．６％（ｗ／ｖ）アスパラギン酸 ０．７％（ｗ／ｖ）トリス ０．５％（ｗ／ｖ）塩化カリウム ０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム １０％（ｗ／ｖ）エチレングリコール ９０％（ｖ／ｖ）脱イオン水 電気泳動分離の結果を図３に示す。他のゲル緩衝液処方
は当業者にとっては明らかであろう。本発明の本質的な
精神から外れることなく本発明は数種の異なったゲル緩
衝液処方及びアガロースゲルにおいて具体化できるの
で、本発明は前記の説明に対応するものとして別記の特
許請求の範囲によって特定されるものである。
【００１８】
【発明の効果】本発明の高分解能電気泳動（ＨＲＥ）ゲ
ルは、ゲル緩衝剤の調製に馬尿酸塩及び／又はグリシン
を用いることにより従来よりも少量のバルビタール（バ
ルビツル酸塩）を用い、ＨＲＥ法において従来のＨＲＥ
法に用いられたアガロースゲルによるよりも血清タンパ
ク質の分離に好適である。また本発明のＨＲＥ法は、血
清試料タンパク質画分の分離及び分解能に優れる。
ルは、ゲル緩衝剤の調製に馬尿酸塩及び／又はグリシン
を用いることにより従来よりも少量のバルビタール（バ
ルビツル酸塩）を用い、ＨＲＥ法において従来のＨＲＥ
法に用いられたアガロースゲルによるよりも血清タンパ
ク質の分離に好適である。また本発明のＨＲＥ法は、血
清試料タンパク質画分の分離及び分解能に優れる。
【図１】馬尿酸塩ゲル緩衝液を用いる電気泳動分離であ
る。
る。
【図２】グリシンゲル緩衝液を用いる電気泳動分離であ
る。
る。
【図３】馬尿酸塩／グリシンゲル緩衝液を用いる電気泳
動分離である。
動分離である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シンシア アール ブレッサム アメリカ合衆国 92509 カリフォルニア 州ペドリー ウェスト リム サークル 5657 (72)発明者 ミン−リー チェン アメリカ合衆国 92670 カリフォルニア 州プラセンティア ヘイマー ドライブ 1931 (72)発明者 マーク エス アンドレイド アメリカ合衆国 92108 カリフォルニア 州サン ディエゴ ランチョ ミッション ロード 6131 ナンバー 108 (56)参考文献 特開 昭58−105053（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−105052（ＪＰ，Ａ)
Claims (38)
- 【請求項１】 （ｉ）バルビタール、（ｉｉ）トリス、
並びに（ｉｉｉ）馬尿酸塩、グリシン及びそれらの混合
物よりなる群から選ばれる１種、を含んでなるアガロー
スゲル用ＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項２】 前記バルビタール（ｉ）、前記トリス
（ｉｉ）、並びに前記馬尿酸塩、グリシン及びそれらの
混合物よりなる群から選ばれる１種（ｉｉｉ）、がほぼ
同じ濃度で存在する請求項１記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項３】 前記バルビタール（ｉ）が約０．３％か
ら約１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記トリス
（ｉｉ）並びに前記馬尿酸塩、グリシン及びそれらの混
合物よりなる群から選ばれる１種（ｉｉｉ）、が約０．
３％から約２．０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する請求項
１記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項４】さらに酸を含んでなる請求項１記載のＨＲ
Ｅゲル緩衝剤。 - 【請求項５】前記酸がアスパラギン酸である請求項４記
載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項６】さらに塩を含んでなる請求項４記載のＨＲ
Ｅゲル緩衝剤。 - 【請求項７】前記塩が塩化カリウムである請求項６記載
のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項８】さらに乳酸カルシウムを含んでなる請求項
７記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項９】さらに酸を含んでなる請求項２記載のＨＲ
Ｅゲル緩衝剤。 - 【請求項１０】前記酸がアスパラギン酸である請求項９
記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項１１】さらに塩を含んでなる請求項１０記載の
ＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項１２】前記塩が塩化カリウムである請求項１１
記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項１３】さらに乳酸カルシウムを含んでなる請求
項１２記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項１４】さらに酸を含んでなる請求項３記載のＨ
ＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項１５】前記酸がアスパラギン酸である請求項１
４記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項１６】さらに塩を含んでなる請求項１５記載の
ＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項１７】前記塩が塩化カリウムである請求項１６
記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項１８】さらに乳酸カルシウムを含んでなる請求
項１７記載のＨＲＥ緩衝剤。 - 【請求項１９】バルビタール、トリス及び馬尿酸塩を含
んでなる請求項１記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項２０】前記バルビタールが約０．３％から約
１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記トリス及び前
記馬尿酸塩が約０．３％から約２．０％（ｗ／ｖ）の濃
度で存在する請求項１９記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項２１】前記バルビタールが約０．６％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在し、前記トリスが約０．７％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在し、前記馬尿酸塩が約０．６％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在する請求項２０記載のＨＲＥゲル緩衝
剤。 - 【請求項２２】さらに約０．６％（ｗ／ｖ）のアスパラ
ギン酸を含んでなる請求項２１記載のＨＲＥゲル緩衝
剤。 - 【請求項２３】さらに約０．０５％（ｗ／ｖ）の塩化カ
リウムを含んでなる請求項２２記載のＨＲＥゲル緩衝
剤。 - 【請求項２４】バルビタール、トリス及びグリシンを含
んでなる請求項１記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項２５】前記バルビタールが約０．３％から約
１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記トリス及び前
記グリシンが約０．３から約２．０％（ｗ／ｖ）の濃度
で存在する請求項２４記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項２６】 前記バルビタールが約０．６％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在し、前記トリスが約０．７％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在し、前記グリシンが約１．０％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在する請求項２５記載のＨＲＥゲル緩衝
剤。 - 【請求項２７】さらに約０．６％（ｗ／ｖ）のアスパラ
ギン酸を含んでなる請求項２６記載のＨＲＥゲル緩衝
剤。 - 【請求項２８】さらに約０．０５％（ｗ／ｖ）の塩化カ
リウムを含んでなる請求項２７記載のＨＲＥゲル緩衝
剤。 - 【請求項２９】 バルビタール、トリス、及び馬尿酸塩
とグリシンとの混合物を、馬尿酸塩とグリシンの比率が
約１：５から約１：１であるように含んでなる請求項１
記載のＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項３０】 前記バルビタールが約０．３％から約
１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記トリス及び前
記馬尿酸塩とグリシンとの混合物が約０．３％から約
２．０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する請求項２９記載の
ＨＲＥゲル緩衝剤。 - 【請求項３１】前記バルビタールが約０．６％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在し、前記トリスが約０．７％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在し、前記馬尿酸塩が約０．１％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在し、前記グリシンが約０．５％（ｗ／
ｖ）の濃度で存在する請求項３０記載のＨＲＥゲル緩衝
剤。 - 【請求項３２】さらに約０．６％（ｗ／ｖ）のアスパラ
ギン酸を含んでなる請求項３１記載のＨＲＥゲル緩衝
剤。 - 【請求項３３】さらに約０．０５％（ｗ／ｖ）の塩化カ
リウムを含んでなる請求項３２記載のＨＲＥゲル緩衝
剤。 - 【請求項３４】 アガロース、バルビタール、トリス、
並びに馬尿酸塩、グリシン及びそれらの混合物よりなる
群から選ばれる１種、を含んでなるＨＲＥアガロースゲ
ル。 - 【請求項３５】 前記アガロースが約２．０％（ｗ／
ｖ）未満の濃度で存在し、前記バルビタールが約０．３
％から約１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記トリ
ス並びに前記馬尿酸塩、グリシン及びそれらの混合物よ
りなる群から選ばれる１種、が約０．３％から約２．０
％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する請求項３４記載のＨＲＥ
アガロースゲル。 - 【請求項３６】試料を請求項３４記載のＨＲＥアガロー
スゲル上に置き、前記ゲルを運転用緩衝剤中に置き、前
記ゲルの長さ方向を横切って電位を与えて前記試料中の
タンパク質を分離せしめることを含んでなる血清タンパ
ク質を分離するための電気泳動法。 - 【請求項３７】運転用緩衝剤がバルビタールを含んでな
る請求項３６記載の電気泳動法。 - 【請求項３８】 前記運転用緩衝剤が（ｉ）バルビター
ル、（ｉｉ）トリス、並びに（ｉｉｉ）馬尿酸塩、グリ
シン及びそれらの混合物よりなる群から選ばれる１種、
を含んでなる請求項３６記載の電気泳動法。
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