JPH0823806A - チューリップ属植物の増殖培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 チューリップの大量増殖および遺伝子導入や
細胞融合等の育種への実用的利用を目的とし、不定芽分
化可能なカルスを誘導・増殖し、該カルスからの不定芽
形成法を見いだした。 【構成】 チューリップ属植物の花蕾内組織を培養して
不定芽形成可能なカルスを誘導・増殖した後、該カルス
を培養して不定芽を形成させる培養方法であり、カルス
誘導・増殖の際は２３〜３２℃、不定芽形成の際は１１
〜２２℃で培養を行うチューリップ属植物の増殖培養方
法。 【効果】 本発明方法は、チューリップの不定芽分化可
能なカルスを誘導・増殖し、該カルスから不定芽を形成
することにより、大量の不定芽および小球根を形成させ
ることを可能とした。そして、従来の方法と比較して細
胞育種や実用的な種苗生産に利用度が高い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、チューリップ属植物の
不定芽分化可能なカルスの誘導・増殖方法および該カル
スからの不定芽形成による植物組織培養技術を利用した
チューリップ属植物の大量増殖法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、組織培養技術の発達により多くの
植物で大量増殖による商業化の可能性が高まりつつあ
る。チューリップにおいても大量増殖の可能性を示唆す
る技術が報告されている。チューリップを組織培養によ
って増殖しようとする場合、例えば、チューリップ植物
体組織片より直接に不定芽を誘導分化させて増殖する方
法（Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，Ｖｏｌ．
１０９，２６３〜２７０，１９８０）が報告されている
が、不定芽の形成効率は低く、増殖効率の点から、商業
的な大量増殖技術には至っていない。

【０００３】また、比較的大量に不定芽が得られた例と
しては、花茎組織から培養によって誘導される不定芽を
縦に分割し、培養を行い不定芽を誘導および増殖させる
方法（Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，Ｖｏ
ｌ．３２５，４４１〜４４６，１９９２）や、長径２ｍ
ｍの不定芽を培養することによって不定芽を増殖させる
方法（Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，Ｖｏ
ｌ．２６６，８３〜９０，１９９０、特開平５−１９２
０５３号公報）があるが、商業的な大量増殖技術として
は適切でない。

【０００４】また、リン片組織からのカルス培養の報告
（北海道教育大学紀要，第３３巻，第４９〜６５頁，１
９８２、Ｊ．Ｋｏｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．，Ｖ
ｏｌ．２３（４），３４８〜３５６，１９８２）では、
カルス誘導は可能であるが、不定芽分化可能なカルスを
誘導・増殖させた報告はない。このように現在までチュ
ーリップの植物体組織より不定芽分化可能なカルスを誘
導・増殖し、さらに該カルスから不定芽を形成させた報
告はない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】植物組織培養技術の育
種への応用として動・植物および微生物由来の遺伝子の
導入や変異の誘発・選抜での細胞選抜さらに細胞融合等
が多くの植物で行われている。チューリップもこれらの
技術を利用した育種が望まれており、これらの育種法を
利用するためには脱分化した細胞塊（カルス）やプロト
プラストを得るための細胞が必要となる。さらにこれら
の細胞からの植物体再生法の技術の確立も必要となる。
しかし、現在チューリップでは植物体再分化可能なカル
スの誘導・増殖やカルスからの植物体再生は行われてい
ないため上記の育種法は利用されていない。したがっ
て、上記の育種法を行うために、チューリップ植物体組
織からの植物体再分化可能なカルス誘導・増殖および該
カルスからの植物体再生法の技術の確立が望まれてい
る。同時に、この技術はチューリップの植物体を商業的
規模で大量かつ短期間に得ることもでき、チューリップ
属植物の増殖培養法の技術としてもおおいに望まれてい
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決するため鋭意研究を重ねた結果、チューリップの花蕾
内組織を培養することにより不定芽分化可能なカルスを
誘導・増殖する方法および該カルスから不定芽を形成さ
せる方法を見いだした。さらに該不定芽を用いることに
より、公知の方法で、チューリップの小球根を大量に生
産することができる。

【０００７】即ち、本発明は下記に記載されるとおり、
チューリップ属植物の不定芽分化可能なカルスの誘導・
増殖方法および該カルスからの不定芽形成による植物組
織培養技術を利用したチューリップ属植物の大量増殖法
に関する。

【０００８】（１）チューリップ属植物の花蕾内組織を
培養し、不定芽分化可能なカルスを誘導・増殖すること
を特徴とするチューリップ属植物の培養方法。 （２）カルス誘導・増殖の際、２３〜３２℃の温度条件
下で培養を行うことを特徴とする前記（１）記載のチュ
ーリップ属植物の培養方法。 （３）チューリップ属植物の花蕾内組織を培養し、得ら
れる不定芽分化可能なカルスから不定芽を形成させるこ
とを特徴とするチューリップ属植物の培養方法。 （４）不定芽形成の際、１１〜２２℃の温度条件下で培
養を行うことを特徴とする前記（３）記載のチューリッ
プ属植物の培養方法。 （５）チューリップ属植物の花蕾内組織を培養して不定
芽分化可能なカルスを誘導・増殖した後、該カルスを培
養して不定芽を形成させることを特徴とするチューリッ
プ属植物の増殖培養方法。 （６）チューリップ属植物の球根を不定芽を用いて作出
させることにおいて、チューリップ属植物の花蕾内組織
を培養して得た不定芽分化可能なカルスから形成された
不定芽を用いることを特徴とするチューリップ属植物の
植物体作出方法。

【０００９】以下、本発明について詳細に説明する。 １）不定芽分化可能なカルスの誘導に用いる植物体 本発明方法で用いられるチューリップとはチューリップ
属植物を指し、例えばトライアンフ品種群に属するポー
ル・リヒター、メリーウイドーの各品種やダーウィンハ
イブリッド品種群に属するアペルドーン、オックスフォ
ードエリートの各品種さらにその他の種群（野生種）に
属するチューリッパ・タルダ（Ｔｕｌｉｐａ ｔａｒｄ
ａ）、チューリッパ・ハーゲリー（Ｔ．ｈａｇｅｒ
ｉ）、チューリッパ・トルケスタニカ（Ｔ．ｔｕｒｋｅ
ｓｔａｎｉｃａ）等をあげることができる。

【００１０】２）不定芽分化可能なカルス誘導に用いる
植物体組織 本発明方法で用いられるチューリップの花蕾は、５〜３
０ｍｍの長さの花蕾であり、花蕾が球根内にある生育段
階の未熟なものである。花蕾内組織としては、葯、葯基
部、花柱、子房壁、花糸基部、子房などがあげられる
が、より好ましくは子房である。

【００１１】３）不定芽分化可能なカルスの誘導及び増
殖 植物体組織から不定芽分化可能なカルスを誘導および増
殖するためのカルス誘導・増殖培地は、少なくとも無機
塩、植物ホルモン、糖類を必須成分とし、ビタミン類、
アミノ酸類、カゼイン加水分解物を必要に応じて添加し
たものである。具体的に従来から植物の組織培養に用い
られている基本培地、例えば、ムラシゲ・スクーグ（Ｍ
ｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ）の培地（ＭＳ培地）、
リンスマイヤー・スクーグ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ＆Ｓｋ
ｏｏｇ）の培地（ＬＳ培地）、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏ
ｒｇ）のＢ５培地等を用いることができる。これらの従
来公知の培地の組成などは、例えば、原田及び駒嶺著
「植物組織培養」ｐ３９０〜３９１、理工学社、１９８
４年に記載されている。

【００１２】培地の糖類としては、シュークロス、グル
コース等を例示でき、その濃度は０．１〜６％が好まし
く、１〜３％で用いることが特に好ましい。植物ホルモ
ンは、オーキシンとしては、例えば２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、１−ナフタレン酢酸（Ｎ
ＡＡ）等を用いることができる。また、サイトカイニン
としてはベンジルアデニン（ＢＡ）、６−フルフリルア
ミノプリン（カイネチン）等を用いることができ、オー
キシンとサイトカイニンを併用するか、オーキシンを単
独で用いてもよい。その添加濃度は、オーキシンは０．
１〜２０μｍｏｌ／ｌで用いることが好ましく、１〜１
０μｍｏｌ／ｌが特に好ましい。サイトカイニンは無添
加もしくは１０μｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは無添加も
しくは３μｍｏｌ／ｌ以下の濃度で添加すればよい。

【００１３】アミノ酸類としてはＬ−プロリン、グルタ
ミン等を例示でき０．１〜１０ｍＭの濃度で添加するこ
とが好ましい。カゼイン加水分解物は、１０〜５００ｐ
ｐｍの濃度で添加することが好ましい。

【００１４】また、固形培地を調製するときのゲル化剤
としては、寒天、ゲルライト等を例示でき、これらの濃
度は寒天の場合０．７〜０．９％、ゲルライトの場合
０．１５〜０．２５％が好ましい。次に、植物体組織か
ら不定芽分化可能なカルスを誘導しようとする場合に
は、上述した誘導培地をまず調製し、無菌化した植物体
組織を置床する。植物体組織の無菌化は、常法に従いエ
タノール、次亜塩素酸ナトリウム液等を用い実施でき
る。

【００１５】誘導されたカルスの増殖においては、不定
芽分化可能なカルス（これは黄色で細胞質密度が高い）
と不定芽分化可能でないカルス（これは白色で細胞質密
度が低い）とを分離し、不定芽分化能のないカルスを選
抜し、増殖する。増殖培地での不定芽分化可能なカルス
（以下、カルスと略す）の継代は１週間毎に行う。

【００１６】カルスの誘導および増殖は２３〜３２℃の
温度条件下で行うのが好ましく、約２５℃が特に好まし
い。

【００１７】培養光については白色光照射下（例えば、
１００〜２，０００ルックス）で行ってもカルスを誘導
および増殖することは可能であるが、暗所下で培養をお
こなうほうが良好な結果が得られる。

【００１８】４）カルスからの不定芽の誘導 カルスから不定芽を誘導する不定芽誘導培地は、少なく
とも無機塩、植物ホルモン、糖類を必須成分とし、ビタ
ミン類、アミノ酸類、カゼイン加水分解物を必要に応じ
て添加したものである。具体的には前記のＭＳ培地、Ｌ
Ｓ培地、ガンボルグのＢ５培地さらにはホワイト（Ｗｈ
ｉｔｅ）等を例示することができる。なお通常、無機窒
素源を除く無機塩類は１／８〜２倍の濃度で用いること
が好ましく、１／４〜１倍の濃度で用いることが特に好
ましい。カルシウム塩に関しては無添加もしくは３ｍＭ
以下が好ましい。

【００１９】無機窒素源については硝酸態窒素とアンモ
ニア態窒素で供給することができるが、硝酸態窒素のみ
あるいは硝酸態窒素とアンモニア態窒素を組み合わせて
用いることが好ましく、総窒素濃度は１ｍＭ〜３０ｍＭ
が好ましい。その際、硝酸態窒素濃度は１ｍＭ〜３０ｍ
Ｍが好ましい、アンモニア態窒素濃度は無添加もしくは
２０ｍＭ以下が好ましく、無添加もしくは１０ｍＭ以下
が特に好ましい。この時、アンモニア態／硝酸態の比が
０以上２以下であることが好ましく、０以上１以下で用
いることが特に好ましい。

【００２０】培地の糖類としては、シュークロス、グル
コース等を例示でき、その濃度は０．１〜６％が好まし
く、０．５〜２％で用いることが特に好ましい。植物ホ
ルモンはオーキシンとサイトカイニンを組み合わせて用
いる。オーキシンとしては、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、イン
ドールー３−酢酸（ＩＡＡ）等を例示することができ、
オーキシンは０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、好ましくは１
〜３μｍｏｌ／ｌの濃度で、サイトカイニンとしてはＢ
Ａ、カイネチン、２−イソペンテニルアデニン（２ｉ
Ｐ）等を例示することができ、０．１〜１０μｍｏｌ／
ｌ、好ましくは１〜１０μｍｏｌ／ｌの濃度で添加すれ
ばよい。

【００２１】アミノ酸類としてはＬ−プロリン、グルタ
ミン等を例示でき０．１〜１０ｍＭの濃度で添加するこ
とが好ましい。カゼイン加水分解物は、１０〜５００ｐ
ｐｍの濃度で添加することが好ましい。

【００２２】また、固形培地を調製するときのゲル化剤
としては、寒天、ゲルライト等を例示でき、これらの濃
度は寒天の場合０．７〜１．５％、ゲルライトの場合
０．２〜０．６％が好ましい。

【００２３】不定芽誘導の培養は、１１〜２２℃の温度
条件下で行うのが好ましく、約１８℃が特に好ましい。

【００２４】培養光については白色光照射下（例えば、
１００〜２，０００ルックス）で行っても不定芽を誘導
することは可能であるが、培養開始から不定芽が誘導さ
れるまでの期間は暗所下で培養をおこなうほうが良好な
結果が得られる。

【００２５】次に、低温処理等により球根誘導を行い、
十分に肥大した球根を得るためには該不定芽（長さ１〜
２ｍｍ）をシュート（３０ｍｍ以上）にまで生長させる
必要がある。不定芽誘導培地のままでもシュートは形成
されるが、よりシュート形成効率を高めるために該不定
芽をシュート形成培地にて培養する。シュート形成培地
は前記４）記載のカルスからの不定芽の誘導工程に示さ
れている、植物ホルモン条件以外同様の培地組成を用い
ればよい、シュート形成の植物ホルモン条件はオーキシ
ン及びサイトカイニンを添加し、オーキシンとしては、
ＮＡＡ、ＩＡＡ等を例示することができ、オーキシンは
０．０１〜３μｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１〜１μｍ
ｏｌ／ｌの濃度で、サイトカイニンとしてはＢＡ、カイ
ネチン、２ｉＰ等を例示することができ、サイトカイニ
ンは０．０１〜３μｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１〜１
μｍｏｌ／ｌの濃度で添加する。そして１８℃、照明下
（例えば、１，０００ルックス、１６時間明期）で培養
をおこない、シュートを得る。

【００２６】得られたシュートは、例えば前記（Ａｃｔ
ａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，Ｖｏｌ．２６６，８
３〜９０，１９９０）の公知の方法により４℃で低温処
理またはジベレリン（ＧＡ_３）処理し、培養することに
より小球根を形成させることができる。該小球根は自然
条件または促成条件において開花可能な球根になる。

【００２７】

【実施例】次に、本発明方法をさらに実施例および比較
例をもって具体的に説明するが、これら例に本発明方法
はなんら限定されるものではない。

【００２８】（実施例１）チューリップのオックスフォ
ードエリートを供試種として用いた。花蕾が球根内にあ
る生育段階の未熟な子房組織を２ｍｍ角の大きさに切り
出し、各種濃度のオーキシン及びサイトカイニンを含む
下記のカルス誘導培地に置床し、２５℃、暗所下で、２
週間培養し、前記同一の培地で１週間毎に継代培養する
と、３週間後にはカルス形成が認められ、５週間目まで
培養を行なった。なお、培地に添加するオーキシンとし
て２，４−Ｄを、サイトカイニンとしてはＢＡを各種濃
度で用いた。このカルス誘導時において植物ホルモンが
カルス形成率（全組織片当たりカルスが形成された組織
片の割合）におよぼす結果は表１に示したとおりであ
る。その結果、全ての植物ホルモンの組み合わせにおい
てカルス形成がみられた。その中でも７０％以上の高い
カルス形成率を示したのは、２，４−Ｄが３〜１０μｍ
ｏｌ／ｌの濃度で、かつＢＡが１〜３μｍｏｌ／ｌの濃
度であった。 ［カルス誘導培地］２％シュークロス、１ｍＭ Ｌ−プ
ロリン、１００ｐｐｍカゼイン加水分解物、植物ホルモ
ン、ｐＨ５．８、０．２％ゲルライトを含むＭＳ培地。

【００２９】

【表１】

【００３０】（実施例２）チューリップのポール・リヒ
ターを供試種とし用いた。花蕾が球根内にある生育段階
の未熟な花糸基部組織を１ｍｍ角の大きさに切り出し、
各種濃度のオーキシン及びサイトカイニンを含む下記の
カルス誘導培地に置床し、２５℃、暗所下で、２週間培
養し、前記同一の培地で１週間毎に継代培養すると、４
週間後にはカルス形成が認められ、６週間目まで培養を
行なった。なお、培地に添加するオーキシンとしてＮＡ
Ａを、サイトカイニンとしてはカイネチンを各種濃度で
用いた。このカルス誘導時において植物ホルモンがカル
ス形成率におよぼす結果は表２に示したとおりである。
その結果、全ての植物ホルモンの組み合わせにおいてカ
ルス形成がみられた。その中でもカルス形成率が３６％
と良好だったのＮＡＡが１０μｍｏｌ／ｌの濃度、カイ
ネチンが１μｍｏｌ／ｌの濃度であった。 ［カルス誘導培地］２％シュークロス、１ｍＭ Ｌ−プ
ロリン、１００ｐｐｍカゼイン加水分解物、植物ホルモ
ン、ｐＨ５．８、０．２％ゲルライトを含むＭＳ培地。

【００３１】

【表２】

【００３２】（実施例３）チューリップのメリーウイド
ーを供試種として用いた。花蕾が球根内にある生育段階
の未熟な子房組織を２ｍｍ角の大きさに切り出し、下記
のカルス誘導・増殖培地上に置床し、２５℃、暗所下
で、２週間培養し、前記同一の培地で１週間毎に継代培
養すると、２週間後にはカルスが形成された。次いで誘
導したカルスを植物体組織片から取り除き、下記のカル
ス誘導・増殖培地に生重量５０ｍｇのカルスを置床し、
１週間毎に４回継代培養をおこなつた。その際の培養温
度を１１，１８，２３，２５，３２℃とし、暗所下で培
養をおこない、増殖培養開始４週間後にカルスの生重量
を測定しカルス増殖度（置床カルスに対する４週間後の
カルスの生重量倍数）を計算した。

【００３３】このカルス継代時の培養温度がカルスの増
殖度におよぼす結果は表３に示したとおりである。その
結果、全ての温度条件下でカルス増殖し、好ましくはカ
ルス増殖度が５倍以上と良好だった、２３，２５，３２
℃であった。より好ましくは２５℃で、その時のカルス
増殖度は、置床カルス生重量５０ｍｇに対し、培養４週
間後には３５０ｍｇと７倍に増殖した。 ［カルス誘導・増殖培地］２％シュークロス、１ｍＭ
Ｌ−プロリン、１００ｐｐｍカゼイン加水分解物、２，
４−Ｄ １０μｍｏｌ／ｌ、カイネチン１μｍｏｌ／
ｌ、ｐＨ５．８、０．２％ゲルライトを含むＭＳ培地。

【００３４】

【表３】

【００３５】（実施例４）カルス誘導・増殖における培
養温度を２５℃として、培養温度以外の条件を実施例３
と同様に培養を行ないカルスを得た。該カルスを、各種
濃度のオーキシン及びサイトカイニンを含む下記の不定
芽誘導培地に置床し、１８℃、暗所下で培養を行ない、
培養開始７週間後に不定芽形成率（全カルス塊数当たり
不定芽分化したカルス塊数の割合）と不定芽分化数（１
カルス塊当たり分化した平均不定芽数）を集計した。

【００３６】このカルスからの不定芽形成に及ぼす植物
ホルモンの影響結果は表４に示したとおりである。その
結果、全ての処理で、不定芽形成がみられ、その中でも
不定芽形成率が７５％と特に良好だったのは２，４−Ｄ
が３μｍｏｌ／ｌの濃度、ＢＡが３μｍｏｌ／ｌの濃度
であった。 ［不定芽誘導培地］１％シュークロス、１ｍＭグルタミ
ン、１００ｐｐｍカゼイン加水分解物、植物ホルモン、
ｐＨ５．８、０．７％寒天を含むＭＳ改変（硝酸態窒素
濃度１１．５ｍＭ、アンモニア態窒素無添加、塩化カル
シウム塩無添加）培地。

【００３７】

【表４】

【００３８】（実施例５）カルス増殖温度を実施例３で
最も良好なカルス増殖結果を得た２５℃とし、実施例３
と同様に培養を行い、カルスを誘導・増殖させた。継代
４週間後のカルスを下記の不定芽誘導培地に移植して、
培養温度を１１，１８，２２，２５，３２℃とし暗所下
で培養をおこない、培養開始７週間後に不定芽形成率と
不定芽分化数を集計した。

【００３９】この不定芽誘導時の培養温度が不定芽形成
率におよぼす結果は表５に示したとおりである。その結
果、全ての温度条件下で不定芽形成し、好ましくは不定
芽形成率が５０％以上の１１，１８，２２℃であった。
より好ましくは１８℃で、その時の不定芽形成率は７２
％、不定芽分化数は１３．７本であった。 ［不定芽誘導培地］１％シュークロス、１ｍＭ Ｌ−プ
ロリン、１００ｐｐｍカゼイン加水分解物、ＮＡＡ ３
μｍｏｌ／ｌ、ＢＡ ３μｍｏｌ／ｌ、ｐＨ５．８、
０．７％寒天を含むＭＳ改変（硝酸態窒素濃度１１．５
ｍＭ、アンモニア態窒素濃度２ｍＭ、塩化カルシウム塩
０．１ｍＭ）培地。

【００４０】

【表５】

【００４１】（実施例６）チューリップ野生種チューリ
ッパ・タルダ（Ｔ．ｔａｒｄａ）を供試種として用い
た。５〜１０ｍｍの長さの花蕾を球根内から取り出し、
これを７０％のエタノール溶液に１０秒間、次いで１％
の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１０分間浸漬した後、滅
菌水で洗浄した。この花蕾から無菌的に子房組織を切り
出し、これを供試材料とした。この子房組織を１ｍｍ角
の大きさに切り出し、下記のカルス誘導・増殖培地上に
置床し、２週間培養後、前記同一の培地で１週間毎に継
代培養すると、２週間後にはカルスが形成された。次い
で誘導したカルスを植物体組織から取り除き下記のカル
ス誘導・増殖培地に置床し、１週間毎に継代を行なっ
た。なおカルス誘導・増殖の培養温度は２５℃とし、暗
所下で培養を行なった。 ［カルス誘導・増殖培地］２％シュークロス、１ｍＭグ
ルタミン、１００ｐｐｍカゼイン加水分解物、２，４−
Ｄ １０μｍｏｌ／ｌ、ＢＡ １μｍｏｌ／ｌ、ｐＨ
５．８、０．２％ゲルライトを含むＭＳ培地。

【００４２】１週間毎に継代したカルスを７週間継代し
た後、下記の不定芽誘導培地に移植して、１８℃、暗所
下で培養したところ、７週間後に不定芽が形成された。 ［不定芽誘導培地］１％シュークロス、１ｍＭグルタミ
ン、１００ｐｐｍカゼイン加水分解物、ＩＡＡ ３μｍ
ｏｌ／ｌ、２ｉＰ ３μｍｏｌ／ｌ、ｐＨ５．８、０．
７％寒天を含むＭＳ改変（硝酸態窒素濃度１１．５ｍ
Ｍ、アンモニア態窒素無添加、塩化カルシウム塩無添
加）培地。

【００４３】得られた不定芽（長さが１〜２ｍｍ）を下
記のシュート形成培地に移植して、１８℃、１，０００
ルックスで１６時間照明下で培養したところ、４週間目
には３０ｍｍ程度にまで伸長したシュートが得られた。 ［シュート形成培地］１％シュークロス、１ｍＭプロリ
ン、１００ｐｐｍカゼイン加水分解物、ＩＡＡ ０．３
μｍｏｌ／ｌ、ＢＡ ０．３μｍｏｌ／ｌ、ｐＨ５．
８、０．８％寒天を含むＭＳ改変（硝酸態窒素濃度１
１．５ｍＭ、アンモニア態窒素濃度２ｍＭ）培地。

【００４４】得られたシュートは、４℃、１，０００ル
ックスで１６時間照明下、１０週間の低温処理を行った
後、６％シュークロスを添加した無機塩濃度を１／２と
したＭＳ培地に移植し、２５℃、１，０００ルックスで
１６時間照明下、３０日間培養することによりシュート
基部に小球根が形成された。

【００４５】この結果、培養開始４週間目のカルス形成
率は９６％、７週間の増殖培養におけるカルス増殖度は
４２．９倍、さらに不定芽誘導培地に移植して７週間後
の不定芽形成率は７６％、さらにシュート形成培地に移
植して４週間後、言い換えると培養開始から約１５０日
後のシュート形成数（１球根分の子房組織片当たり形成
された全シュート数）は１２２０本、そして最終的に得
られた球根分化数（１球根分の子房組織片当たり分化し
た球根数）は培養開始から約２５０日後に６２０個の小
球根を得た。

【００４６】（実施例７）カルス誘導・増殖及び不定芽
誘導の各培養温度を、各々常に１８℃とし、この培養温
度条件を除き、実施例６と同様に培養して、カルス、不
定芽、シュート、球根を得た。その結果、カルス形成率
は５４％、カルス増殖度は７．４倍、さらに不定芽形成
率は７８％であり、さらにシュート形成数は２０５本、
そして最終的に得られた球根分化数は１２０個であっ
た。

【００４７】（実施例８）カルス誘導・増殖及び不定芽
誘導の各培養温度を、各々常に２５℃とし、この培養温
度条件を除き、実施例６と同様に培養して、カルス、不
定芽、シュート、球根を得た。その結果、カルス形成率
は９０％、カルス増殖度は６２．６倍、さらに不定芽形
成率は３６％であり、さらにシュート形成数は４３０
本、そして最終的に得られた球根分化数は１３９個であ
った。

【００４８】（実施例９）チューリップ野生種チューリ
ッパ・ハーゲリー（Ｔ．ｈａｇｅｒｉ）を供試種とし、
以下に示すカルス誘導・増殖培地と不定芽誘導培地以外
は実施例６と同様に培養を行なった。 ［カルス誘導・増殖培地］２％シュークロス、１ｍＭグ
ルタミン、１００ｐｐｍカゼイン加水分解物、２，４−
Ｄ １０μｍｏｌ／ｌ、ｐＨ５．８、０．２％ゲルライ
トを含むＭＳ培地。

【００４９】［不定芽誘導培地］１％シュークロス、１
ｍＭグルタミン、１００ｐｐｍカゼイン加水分解物、Ｎ
ＡＡ ３μｍｏｌ／ｌ、ＢＡ ３μｍｏｌ／ｌ、ｐＨ
５．８、０．７％寒天を含むＭＳ改変（硝酸態窒素濃度
１１．５ｍＭ、アンモニア態窒素無添加、塩化カルシウ
ム塩無添加）培地。

【００５０】カルス増殖における継代期間を７週間おこ
なった後、不定芽を誘導した。その結果、５個の外植体
から得られたシュートは１５０日間で１０２０本であっ
た。このようにして、得られたシュートを４℃で、１０
週間低温処理し、培養することにより小球根を形成させ
た。結果、試験開始から２５０日後に５２０個の小球根
を得た。

【００５１】（比較例１）チューリップ野生種チューリ
ッパ・ハーゲリー（Ｔ．ｈａｇｅｒｉ）を供試種とし培
養をおこなった。花蕾が球根内にある生育段階の未熟な
花茎をＮＡＡ、ＢＡを共に１ｍｇ／ｌ添加したＭＳ培地
で６０日間培養し、白っぽい薄緑色の粒状の不定芽を誘
導し、直径１ｍｍ〜２ｍｍの大きさの不定芽を３ｍｍの
塊に切り取った。増殖用培地にて６０日間、継代培養を
行った結果、５個の外植体から８０個の不定芽の小塊を
得た。さらに得られた該不定芽をシュート再生培地に移
植し、３０日間培養を行い、最終的に培養開始から１５
０日間で５６０本のシュートを得た。このようにして、
得られたシュートを４℃で、１０週間低温処理し、培養
することにより小球根を形成させた。結果、試験開始か
ら２５０日後に３１５個の小球根を得るだけであった。
実施例９での本発明方法と比較してカルスを経由してい
ない方法では明らかに不定芽形成数および球根形成数が
低かった。

【００５２】

【発明の効果】本発明方法は、チューリップの花蕾内組
織から誘導された不定芽分化可能なカルスを誘導・増殖
させ、該カルスから不定芽を誘導させることを可能とし
た。カルスからの植物体再分化が可能になったことによ
り商業的に利用可能な大量増殖やプロトプラスト融合、
エレクトロポレーションなどの遺伝子導入や突然変異な
どの育種法を用いることができる。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 チューリップ属植物の花蕾内組織を培養
   し、不定芽分化可能なカルスを誘導・増殖することを特
   徴とするチューリップ属植物の培養方法。
2. 【請求項２】 カルス誘導・増殖の際、２３〜３２℃の
   温度条件下で培養を行うことを特徴とする請求項１記載
   のチューリップ属植物の培養方法。
3. 【請求項３】 チューリップ属植物の花蕾内組織を培養
   し、得られる不定芽分化可能なカルスから不定芽を形成
   させることを特徴とするチューリップ属植物の培養方
   法。
4. 【請求項４】 不定芽形成の際、１１〜２２℃の温度条
   件下で培養を行うことを特徴とする請求項３記載のチュ
   ーリップ属植物の培養方法。
5. 【請求項５】 チューリップ属植物の花蕾内組織を培養
   して不定芽分化可能なカルスを誘導・増殖した後、該カ
   ルスを培養して不定芽を形成させることを特徴とするチ
   ューリップ属植物の増殖培養方法。
6. 【請求項６】 チューリップ属植物の球根を不定芽を用
   いて作出させることにおいて、チューリップ属植物の花
   蕾内組織を培養して得た不定芽分化可能なカルスから形
   成された不定芽を用いることを特徴とするチューリップ
   属植物の植物体作出方法。