JPH08238100A - 所定の配列を有する核酸を特異的に検出する方法、並びに該方法に使用されるプローブ及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】所定の核酸の配列を高い感度で特異的に検出す
る方法、特にシグナル増幅反応を利用して検出感度を高
める方法、並びにこれに使用されるプローブ及びキット
の提供。 【構成】 試料中の特定の核酸とハイブリダイズするこ
とが可能であり、５´側および３´側にＤＮＡを結合し
たＡＰ部位を有し、該部位は該プローブが該核酸とハイ
ブリダイズしたときのみＡＰエンドヌクレアーゼによっ
て切断可能であり、切断を受けたプローブのみが該核酸
から解離可能であるプローブを用い、該プローブとＡＰ
エンドヌクレアーゼを標的核酸に作用させると、試料中
の該核酸と該プローブとがハイブリダイズする反応と、
２本鎖ＤＮＡ特異的ＡＰエンドヌクレアーゼによってハ
イブリダイズした該プローブのＡＰ部位が切断される反
応と、切断された該プローブが該核酸から解離する反応
とが、この順に繰り返し起こる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、所定の核酸の配列を高
い感度で特異的に検出する方法、特にシグナル増幅反応
を利用して検出感度を高める方法、並びにこれに使用さ
れるプローブ及びキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸配列の相補性に基づくプローブ法
は、遺伝的な特徴を直接的に分析することができるた
め、遺伝的疾患、癌、微生物の識別等には有力な手段で
ある。しかし、相補性を単純に利用する従来の分析技術
では、検体中のＤＮＡとプローブとが一対一で結合する
ため、検出感度に限界があり、検体中に目的の遺伝子量
が少ない場合には検出は容易ではなく、標的遺伝子その
ものあるいは検出シグナル等を増幅することが必要とな
る場合が多かった。

【０００３】標的遺伝子を増幅する方法としては、ＰＣ
Ｒ（Polymerase Chain Reaction)法が一般に行われてい
る。ＰＣＲ法は、in vitroにおける核酸の増幅技術とし
て最も一般的な方法であるが、問題点がいくつか存在す
る。例えば、特別な温度調節装置が必要なこと、用いる
プライマーにより増幅効率が異なりその増幅が対数的に
進むことから定量性に問題が生ずること、増幅した産物
によるコンタミネーションが起こりやすいこと等であ
る。特に多数の検体を同時に扱う場合には、コンタミネ
ーションは重大な問題となる。

【０００４】特殊な装置を必要とせず、単純な反応系で
コンタミネーションの影響を受けにくいシグナル増幅法
が開発されている。例えば、ＤＮＡ‐ＲＮＡ‐ＤＮＡ配
列を持つキメラプローブを標的核酸とハイブリダイズさ
せて、ＲＮａｓｅＨによりプローブ中のＲＮＡ配列を分
解し、結果として標的核酸から分解プローブが解離する
一連の反応を繰り返すことを利用した「サイクリングプ
ローブ反応法」が挙げられる（特表平2-504110号公報参
照）。この方法の検出感度も良く、またＰＣＲ法の種々
の欠点も解決できるので、最近注目されている。また、
ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡのようなキメラプローブをハイ
ブリダイズさせることを利用して標的核酸を検出する方
法としては特開昭62-190086 号公報に記載されているよ
うな方法もある。

【０００５】しかし、これらの方法には、ＤＮＡ−ＲＮ
Ａ−ＤＮＡキメラプローブの合成法が難しく、高価であ
るという難点がある。ＤＮＡ−ＲＮＡを合成するには、
最初にＤＮＡ合成した後、一度反応を停止させて新たに
ＲＮＡ合成する必要があるからである。また、ＲＮＡは
化学的に不安定な構造であると同時に、種々のＲＮＡ分
解酵素の混入による非特異的分解が起きやすく、ＲＮＡ
を一部に含むことに起因するプローブの取扱上の困難が
予想される。ＲＮＡ分解酵素は、実験器具や技術者の体
表面にも日常的に存在しており、その影響を完全に取り
除くのは難しい。

【０００６】加えて、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ構造を持
つキメラプローブのＲＮａｓｅＨによる分解産物末端に
はＲＮＡ（リボヌクレオシド）が１分子残っているた
め、通常のオリゴＤＮＡの様にＤＮＡリガーゼによる基
質とはなり難い。またＲＮａｓｅＨの分解反応は、ＤＮ
Ａ−ＲＮＡキメラ構造におけるＲＮＡ部分の塩基配列に
依存し、ＲＮＡ配列によって分解のされ易さが異なると
いう問題もある。例えばシトシンに比ベアデニンは分解
されにくい。このような問題により、ＤＮＡ−ＲＮＡ−
ＤＮＡキメラプローブを使用する方法は、原理的には優
れていながら実用化が進んでいないのが現状である。更
に、特開昭62-190086 号公報の方法は、従来の増幅を伴
わないプローブ法が抱える問題を内包してしまってい
る。この方法では、キメラプローブと標的核酸とのハイ
ブリダイズを利用しているだけで、プローブの特異的切
断がサイクル反応につながらず、シグナル増幅は期待で
きない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】このように、遺伝子の
配列の相補性を利用した従来の分析技術では、感度を得
にくいという問題があり、また、ＰＣＲ、ＬＣＲ等の公
知のシグナル増幅技術においては、定量性が無く、ノイ
ズに弱く、更には温度制御が煩雑であるという問題を有
している。

【０００８】このような背景の下、本発明者らは、大腸
菌エクソヌレアーゼIII （以下「Exo III 」と略称す
る）の３´→５´エクソヌレアーゼ活性を利用したシグ
ナル増幅法について研究を行い、既に特許出願を行った
（特開平6-327499号公報）。特開平6-327499号公報に
は、ハイブリダイズしたプローブが Exo IIIによって端
部から分解され、２本鎖を維持できない長さになったと
きに外れ、外れた後に別のプローブがハイブリダイズし
再びこれがExo III によって端部から分解され、２本鎖
を維持できない長さになったときに外れ、これを繰り返
すというサイクル反応を行い、このサイクル反応により
生じ増幅されたオリゴヌクレオチド（２本鎖を維持でき
ない長さになって標的核酸から外れたプローブ）を検出
することにより、標的核酸の検出を行う方法が記載され
ている。

【０００９】この方法では、一定温度のもとで単純な反
応系により繰り返し反応を定量的に実現することができ
る有用な核酸検出法であるが、生成するプローブの分解
産物の長さが必ずしも一定でないことから、分解産物を
電気泳動のような物理的な手法で検出する場合には、複
数のバンドの総量を測定しなければならない場合もあ
り、操作性の面ではなお改善すべき点があった。

【００１０】本発明は、以上のような課題に鑑みてなさ
れたものであり、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡという構造の
プローブで問題となる安定性を改善し、この方法（プロ
ーブ切断〜１本鎖分離サイクル）を利用した核酸の検出
方法の実用性を高め、プローブ切断〜１本鎖分離サイク
ルを利用した核酸の検出方法において、様々な検出系の
構築を可能とする新しいプローブを提供することを目的
とする。また、プローブのみならず、新しいプローブを
利用した検出方法や試薬組成物をも提供することを目的
とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】以上のような課題を解決
するために、本発明者らは、Exo III などのＡＰエンド
ヌクレアーゼを利用したシグナル増幅法を考案した。

【００１２】本発明者らは、様々なＡＰエンドヌクレア
ーゼが２本鎖ＤＮＡの種々のタイプのホスホジエステル
結合を加水分解する酵素活性を有すること、具体的に
は、アプリン酸もしくはアピリミジン酸部位（以下「Ａ
Ｐ部位」と略称）において、ホスホジエステル結合を加
水分解する５´−ＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有して
いることに着目して、本発明を完成するに至った。

【００１３】本発明に係るプローブは、要するにＡＰ部
位の５´側および３´側にＤＮＡを結合した構造（DNA-
AP-DNA）を持つプローブであり、詳しくは試料中の特定
の核酸とハイブリダイズすることが可能であり、５´側
および３´側にＤＮＡを結合したＡＰ部位を少なくとも
一つ有し、該ＡＰ部位は該プローブが該特定の核酸とハ
イブリダイズしたときのみＡＰエンドヌクレアーゼによ
って切断可能であり、切断を受けたプローブのみが該特
定の核酸から解離可能となるプローブであることを特徴
とする。

【００１４】このような本発明に係るプローブは、試料
中の特定の核酸の分析に用いられるプローブであり、以
下の反応が順に繰り返し起こることを特徴とする。

【００１５】(1) 試料中の該特定の核酸と該プローブと
がハイブリダイズする反応、(2) ２本鎖ＤＮＡ特異的Ａ
Ｐエンドヌクレアーゼによってハイブリダイズした該プ
ローブのＡＰ部位が切断される反応、(3) 切断された該
プローブが該特定の核酸から解離する反応。

【００１６】本発明に係るプローブを用いて試料中の特
定の核酸を分析するための方法は、上記の反応が順に繰
り返し起こることにより生じた切断されたプローブ（以
下、断片化プローブという）を検出することにより特定
の核酸を検出することを特徴とする。なお、上記反応
は、条件を適当に設定することにより、１サイクルでス
トップさせることも可能である。

【００１７】本発明の範囲には、本発明に係るプローブ
を含むキットも含まれる。このキットは、核酸を分析す
るためのキットであり、上述した反応が繰り返し起こる
こと（即ち、サイクル反応）により生ずる断片化プロー
ブを検出することによって、核酸の分析をすることがで
きる。

【００１８】［反応原埋］次に、本発明の反応原埋を図
１を参照しながら具体的に示す。

【００１９】標的核酸（１本鎖）、ＡＰ部位を導入した
プローブＤＮＡであって標的核酸に対して過剰量のプロ
ーブＤＮＡ、及びＡＰエンドヌクレアーゼからなる反応
液を調製する。標的核酸は１本鎖でなければならないの
で、２本鎖の場合には必要に応じて加熱やアルカリ処理
などを施しておく。この反応液中で、まずプローブＤＮ
Ａが標的配列にハイブリダイズし、２本鎖を形成する。
次いで、２本鎖となった部分のプローブのＡＰ部位に隣
接するホスホジエステル結合がＡＰエンドヌクレアーゼ
により分解される（ class II ＡＰエンドヌクレアーゼ
であれば「ＤＮＡ−」と「−ＡＰ−ＤＮＡ」とに分
離）。ＡＰエンドヌクレアーゼはＤＮＡの２本鎖部分の
ＡＰ部位のみ切断するので、標的核酸や、ハイブリダイ
ズしていない１本鎖状態にある遊離のプローブＤＮＡは
分解されない。

【００２０】ＡＰエンドヌクレアーゼによりプローブが
切断されると、標的核酸とプローブＤＮＡ間の結合力が
低下し、２本鎖構造を維持できなくなってプローブＤＮ
Ａが外れる。その結果、標的核酸はもとの１本鎖にもど
る。１本鎖にもどった標的核酸は新たなプローブＤＮＡ
とハイブリダイズするため、切断を受けていないプロー
ブＤＮＡが存在する限り、上記反応が継続する。

【００２１】このような標的核酸がプローブＤＮＡと繰
り返し反応するサイクル反応が継続する一方で、断片化
プローブが反応液中に蓄積されるため、この蓄積された
断片化プローブを分析すれば標的核酸の存在を検知する
ことができる。このとき標的核酸のサイクル反応により
断片化プローブが反応液中に蓄積されるので情報が増幅
されることになり高い検出感度をもたらす。

【００２２】本発明において、「プローブのハイブリダ
イズ・切断・解離・新しいプローブのハイブリダイズ」
という反応サイクルを短時間にできるだけ多く起こさせ
るためには、プローブをできるだけ高濃度で用いるのが
有利である。多量のプローブを存在させることにより、
新しいプローブのハイブリダイズをより迅速に起こすこ
とができ、結果としてサイクル数の向上を期待できるの
である。従って予想される標的配列に対して許される範
囲で過剰量のプローブを利用するのが好ましい使い方で
ある。具体的には、反応液１μl あたり０．０１〜５０
pmol、好ましくは０．１pmol以上で用いると高いサイク
ル数を期待できる。

【００２３】反応液の条件については、温度はプローブ
のＴｍに依存する。一般的に、反応温度はＴｍからその
１０℃程度下が望ましい。しかし、それは単にＴｍのみ
で決定できる要因ではないので、プローブに合わせて設
定するのが良い。なお、Ｔｍに影響する塩濃度は、一般
的にはＮａＣｌで調整する。反応温度の影響を受ける
が、０〜０．２Ｍ、好ましくは０〜０．１Ｍ程度であ
る。但し、高濃度では酵素に対して阻害的に働く場合が
あるということに注意する必要がある。

【００２４】また、酵素反応のサイクル数を上げるため
には、２本鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ値、Melting Temp
rature）を低下させるDMSOなどの試薬を反応液中に添加
しても良い。

【００２５】反応液中に蓄積された断片化プローブを直
接的に分析する方法としては、例えば、断片化プローブ
ＤＮＡを電気泳動やクロマトグラフィーによって直接的
に検出する方法、プローブＤＮＡの切断によって信号が
変調を受けるような標識を利用し断片化プローブの指標
とする方法（標識については別に説明する）などがあ
る。

【００２６】断片化プローブを１本鎖のまま検出する態
様としては、例えば、切断されたプローブの切断部位に
ターミナルトランスフェラーゼ等を用いて検出可能な分
子を含むヌクレオチドまたはその誘導体を付加させた
り、あるいは切断されたプローブの切断部位にＴ４ＲＮ
Ａリガーゼ等を用いて検出可能な分子を含む１本鎖ＤＮ
Ａを結合させることができる。これらの付加分子にはあ
らかじめ標識や、捕捉のための結合性分子（ビオチン
等）を導入しておけば断片化プローブの検出や分離を容
易に行うことができる。これらの検出技術は、後に3'−
OHを利用した方法として詳細に説明する。

【００２７】断片化プローブを１本鎖のまま検出する態
様に加え、断片化プローブを２本鎖としてから検出する
態様も採用できる。断片化プローブを２本鎖として検出
する態様には、断片化プローブあるいはその修飾物を捕
捉する工程が含まれる。

【００２８】ここで、“捕捉”とし、“ハイブリダイ
ズ”としなかったのは、「断片化プローブ」は単独では
２本鎖構造を維持できなくなって外れたものであり、同
一反応条件下では再ハイブリダイズさせることはできな
いものであるため、特殊な技術を用いて「捕捉」を行う
必要があるからである。即ち、反応液中に蓄積された断
片化プローブは、その長さが通常のハイブリダイゼーシ
ョンを起こすためには不足しているが、特別な促進技術
によって相補配列とハイブリダイズさせることができる
ようになる。例えば、特願平6-136189号によれば、単独
ではハイブリダイゼーションできない短いヌクレオチド
鎖が、相補鎖の隣接する領域が２本鎖となっているとき
に限って安定なハイブリッドを形成することができる
（以下、「スタッキングハイブリダイゼーション（或い
は、単にＣＳＨ）」と称する）。つまり、サイクル反応
により生じた断片化プローブは、該断片化プローブと相
補的な塩基配列を有する１本鎖領域を有し、更に該１本
鎖領域の近傍に２本鎖領域を有するＤＮＡにハイブリダ
イズさせることによって捕捉することができるのであ
る。

【００２９】このような捕捉技術を利用することによ
り、切断を受けた後に解離した断片化プローブまたはそ
の修飾物を捕捉することによって、当該断片化プローブ
の存在を検出することができるようになる。

【００３０】断片化プローブまたはその修飾物を捕捉す
ることによって検出する方法の態様としては、例えば、
切断を受けた後に解離した断片化プローブまたはその修
飾物を、該解離した断片化プローブと相補的な塩基配列
を有する１本鎖領域を有し、更に該１本鎖領域の近傍に
２本鎖領域を有するＤＮＡよって捕捉することにより、
当該捕捉されたプローブ切断断片またはその修飾物を検
出する態様を示すことができる。なお、切断を受けた後
に解離した断片化プローブまたはその修飾物を捕捉する
方法や、当該捕捉された断片化プローブを検出する方法
の詳細については後述する。

【００３１】ここで、このような捕捉技術により検出可
能なプローブとしては、例えば、(1) 末端に、分析対象
である特定の核酸とはハイブリダイズできないが、該プ
ローブを捕捉する捕捉用ＤＮＡとはハイブリダイズ可能
な捕捉配列が付加しており、かつ、(2) 捕捉配列からＡ
Ｐ部位に至る部分は、分析対象である特定の核酸と相補
的な配列を有し、更に、(3) 該ＡＰ部位から捕捉配列と
反対側の末端に至る部分は、分析対象である特定の核酸
とハイブリダイズするが該捕捉用ＤＮＡとハイブリダイ
ズしない配列からなる、ことを特徴とする１本鎖ＤＮＡ
を挙げることができる。

【００３２】更に、本発明は、特定核酸の特定部位の特
定塩基の分析方法を提供する。

【００３３】即ち、ＡＰ部位に隣接して、検出の対象と
なる特定の塩基に相補的な塩基を有するプローブを用い
ることによって、試料中の特定の核酸の特定の部位の特
定の塩基を分析することも可能である。

【００３４】本発明に用いるＡＰエンドヌクレアーゼの
代表的なものはExo III であるが、これに限られること
なく、他の酵素をも用いることができる（他の酵素の例
は後述する）。

【００３５】ところで、Exo III は、５´‐ＡＰエンド
ヌクレアーゼ活性と共に、３´→５´エクソヌクレアー
ゼ活性を持っている。Ｍｇ²⁺存在下では、この３´→５
´エクソヌクレアーゼ活性により標的核酸が存在しない
状況であってもわずかずつではあるがプローブＤＮＡも
分解し、特異性が弱くなる可能性も考えられる。この問
題点は、Ｍｇ²⁺の代わりにＣａ²⁺を用いるか、あるいは
クエン酸を共存させることにより解決できる。もしく
は、プローブＤＮＡの３´末端、及びＡＰ部位の５´側
に位置する１個以上のホスホジエステル結合をホスホロ
チオエート結合に変更しておけば、３´→５´エクソヌ
レアーゼ活性により、プローブＤＮＡが分解されること
はない。

【００３６】［プローブの態様（構造）］本発明に係る
プローブもしくは該プローブを用いて核酸を分析する方
法においては、そのプローブのＡＰ部位が、アプリン酸
部位、アピリミジン酸部位、チミングリコール、ウレア
残基、テトラヒドロフラン、プロパンジオール、エチレ
ングリコール、デオキシリビトール、Ｄ−デオキシリボ
ースのα−アノマーからなる群から選択されるものであ
ることが好適である。この場合には、アプリン酸部位ま
たはアピリミジン酸部位が、プローブ中のウラシル残基
の酵素による除去によって生じるものも、アプリン酸部
位またはアピリミジン酸部位が、プローブへの紫外線照
射によって生じたチミンダイマーの酵素による除去によ
って生じるものも含む。

【００３７】また、上記反応に用いるプローブＤＮＡの
一部の塩基が無くなった状態であるＡＰ部位は、ＡＰ部
位の３´側でβ脱離反応により切断がおきやすいために
不安定である。この解決策として、プローブＤＮＡのＡ
Ｐ部位を化学修飾したものを利用できる（テトラヒドロ
フラン、プロパンジオール、エチレングリコール等の構
造のＡＰ部位：Takeshita,M.et,al.J.Biol.Chem.262.10
l71 10179(l987))。この化学合成ＡＰ部位は化学的に非
常に安定であるので、非特異的分解は起こらないが、Ａ
Ｐエンドヌクレアーゼによってのみ切断可能である。

【００３８】本発明に係るプローブは、ＡＰ部位が１カ
所存在していても、ＡＰ部位が２カ所以上存在していて
も良い。

【００３９】更に本発明に係るプローブは、１個以上の
検出可能な分子を含んでいてもよい。検出可能な分子
は、放射性同位元素、発光分子、蛍光分子、蛍光元素、
酵素、および特定の分子と結合性を有する分子からなる
群から選択することができる。これらの検出可能な分子
をプローブに導入する技術は既に公知である。具体的に
は、ＤＮＡの基本骨格に対して官能性のリンカーを導入
しこれに様々な分子を結合する方法、あるいはＤＮＡの
基本骨格を構成する元素や分子構造を放射性同位元素や
蛍光を持つものに置換する方法等が知られている。

【００４０】検出可能な分子として蛍光や発光を生じる
ものを用いるときには、プローブの切断を分子間の距離
変化による発生した信号の変調から検知することが可能
である。たとえばフルオレセインとローダミンは、両者
が接近しているときには分子間でエネルギー転移が起
き、両者の距離がある範囲を越えるとエネルギー転移が
無くなってフルオレセインの蛍光が強くなる。この現象
を本発明に応用する場合、プローブＤＮＡの切断によっ
て両者の位置関係が変化する部位にこれらの分子を導入
すれば、プローブＤＮＡの切断をフルオレセインやロー
ダミンの蛍光変化として捉えることができる。

【００４１】この他エテノアデノシンを導入したＤＮＡ
では隣接する塩基による塩基−塩基スタッキング作用で
エテノアデノシンの蛍光が消光されるが、ＤＮＡが切断
されるとこの消光作用が失われ蛍光を生じる現象が知ら
れている(Biochemistry 30,1828-1835,1991)。

【００４２】また更に本発明のプローブに導入する特定
の分子と結合性を有する１個以上の分子は、例えばアビ
ジン、ビオチン、抗原、抗体またはその誘導体からなる
群から選択されるものである。

【００４３】これらの結合性分子は、結合性を利用した
間接的な標識の導入か、固相への特異的な結合による物
理的な分離に応用することができる。例えば、ビオチン
を導入したプローブは、アビジン固相で捕捉することが
できる。あるいは、ハプテンを導入したプローブは、こ
のハプテンを認識する標識抗体を結合する。

【００４４】［キット］本発明に係るプローブを使用す
る核酸分析用のキットも提供される。このキットは、試
料中の特定の核酸とハイブリダイズ可能であり、５´側
および３´側にＤＮＡを結合したＡＰ部位を有し、該Ａ
Ｐ部位は該プローブが該特定の核酸とハイブリダイズし
たときのみＡＰエンドヌクレアーゼによって切断可能で
あることを特徴とするプローブを含む、核酸を分析する
ためのキットであり、本発明に係る核酸分析方法に従っ
て所定の分析を行う。

【００４５】［本明細書で使用される用語等］ ＜ＡＰ部位＞ＡＰ部位のＡＰはApyrimidine/Apurine の
頭文字で、「Ａは・・・がない」という意味の接頭語で
あり、ＡＰ部位とは「Pyrimidine/Purine を欠いた部
位」という意味である。本明細書では、ＡＰをプリン／
ピリミジン塩基を持たない（＝Abasic）核酸の意味で使
用している。

【００４６】ＡＰ部位は、放射線照射により直接的に生
じたり、あるいは変異剤によるアルキル化や脱アミノ
化、あるいはｄＵＴＰが誤ってＤＮＡに重合された時
に、これら異常塩基をＤＮＡグリコシラーゼが切除した
後に発生する。このＡＰ部位は、試験管内でも作製する
ことができる。生じたＡＰ部位は、塩基を持たない2-デ
オキシリボースの構造であるので、アルカリや熱により
β脱離が起こりやすく、不安定なものである。これらの
ＡＰ部位の主鎖は、ヌクレオチドどうしが３´−５´ホ
スホジエステル結合して糖とリン酸が一つおきにつなが
っており、塩基部分が欠失したものであるが、塩基部位
が非天然型のものもあり、そのうちチミングリコール、
ウレア残基となったものは、Exo III により分解する
（Biochemistry,28,3894-3901(1989))。

【００４７】一方、自然界には無い非ヌクレオシド（an
ucleoside site）が主鎖であるＡＰ部位も存在する。こ
れらの非天然部位を持つプローブであって、容易に合成
可能でかつExo III やエンドヌクレアーゼIVで分解を受
けるものには、テトラヒドロフラン、プロパンジオー
ル、エチレングリコール、デオキシリビトール、あるい
はＤ−デオキシリボースのαアノマー等がある。これら
は2-デオキシリボースの構造ではないため、非常に安定
である（Takeshita,M.et.al.J.Biol.Chem.262.10171 10
179 (1987)）。従って、これらの化学合成ＡＰ部位は化
学的に非常に安定であるので非特異的分解は起こらない
が、ＡＰエンドヌクレアーゼによってのみ切断可能とな
る。このため、これらの化学合成ＡＰ部位は本発明にと
って非常に好適なものである。

【００４８】＜ＡＰ部位の具体的な構造＞以下に、ＡＰ
部位の具体的な構造を示す。

【００４９】

【化１】

【化２】

【化３】 ＜ＡＰプローブ＞本発明に係るプローブ（ＡＰプロー
ブ）としては、次のような構造のものがある。

【００５０】

【表１】１）通常のＡＰ部位 ２）チミングリコール型ＡＰ部位 ３）ウレア型ＡＰ部位 ４）テトラヒドロフラン型ＡＰ部位 ５）プロパンジオール型ＡＰ部位 ６）エチレングリコール型ＡＰ部位 ７）デオキシリビトール型ＡＰ部位 ８）メトキシアミン型ＡＰ部位 ９）Ｄ−デオキシリボースのαアノマー ここで、１）が通常のＤＮＡの塩基部分のみが欠如した
構造、２）〜９）は天然の核酸には見出されないがＡＰ
エンドヌクレアーゼにより認識され切断が可能な構造で
ある。

【００５１】前述したように、本明細書においてＡＰ部
位（非塩基部位）は、ＤＮＡ内のプリン／ピリミジン塩
基を持たない（＝Abasic）核酸部位の意味で使用してい
る。塩基を持たない2-デオキシリボースの構造のように
塩基部分のみが欠失したＡＰ部位以外に、例えばチミン
グリコール、ウレア残基のように塩基部位が非天然型と
なったものも本明細書ではＡＰの範囲に入れるものとす
る。なお、これらは実施例で示すようにExo III により
分解されるものである（Biochemistry,28,3894-3901(19
89))。

【００５２】[1] 配列 標的配列の連続した配列に特異的であること。但し、Ａ
Ｐ部位の両側以外は無理に完全に相補的な配列としなく
とも、ある程度のホモロジーを保っていれば条件次第で
ハイブリダイズは可能である。一般的なハイブリダイズ
の条件下では７０〜８０％以上の相同性を持っているプ
ローブは利用可能である。

【００５３】プローブの配列を構成する塩基数は、特異
性を左右する重要な条件である。確率論的に、構成塩基
数が多いほど偶然の一致による非特異反応の可能性が小
さくなる。従って、高い特異性を期待するためには、プ
ローブの構成塩基数を増やすのが効果的である。一方、
あまりにも長いプローブでは合成が困難になるので、一
般的な分析対象であればプローブ全体の塩基数を５〜１
００、好ましくは５０以下となるようにすると、十分な
特異性と必要な反応性とを両立することができると同時
に、容易に合成することもできるようになる。

【００５４】[2] ＡＰ部位に隣接する塩基は完全一致 利用するＡＰエンドヌクレアーゼにより、class I では
AP部位の３´側が、class IIでは同じく５´側が完全に
一致していなければ切断活性を得ることができない。

【００５５】なお、ＡＰエンドヌクレアーゼの特性にも
よるが、十分な切断活性を得るには、できればＡＰ部位
の５´および３´の両端がハイブリダイズするように一
致させるのが好ましい。また、酵素によっては、ＡＰ部
位に隣接する塩基を完全にハイブリダイズさせないと、
切断できない場合もある。

【００５６】[3] 配列と反応条件 本発明の「開裂→解離」という反応を進行させるために
はプローブＤＮＡ全体の配列（塩基数と構成塩基種）と
反応条件の関係が重要なファクターである。即ち、本発
明に係るプローブは標的配列に速やかにハイブリダイズ
すると同時に、ＡＰ部位で切断されたときにＡＰ部位の
両側のＤＮＡは速やかに標的配列から離れていく必要が
ある。従って[1] に基づいて設定した配列を構成する塩
基数や塩基種によって、「ハイブリダイズ→開裂→解
離」という本発明による一連の反応サイクルが迅速に回
転するように反応条件を設定する必要が有る。

【００５７】一般に、塩基数が多くなるほどハイブリダ
イズしやすくなると共に１本鎖に解離し難くなることが
知られている。従って、例えば高い特異性を期待してプ
ローブの構成塩基数を多くしたときには、解離しやすい
条件を選択するようにすると良い。２本鎖のＤＮＡが１
本鎖に解離しやすい条件とは、温度を高めに設定する、
ハイブリダイズ促進成分を使わないようにする等を示す
ことができる。一方、少ない塩基数でも特異性を期待で
きるようなとき、或いは故意に特異性を下げて幅広い配
列を検出したいために少ない塩基数のプローブを利用す
るときには、ハイブリダイズを促進するために反応温度
を低めに設定するというような工夫が求められる。

【００５８】塩基種については、２本鎖に含まれるＧＣ
ペアの比率が構造の維持に影響することが知られてい
る。即ち、同じ長さの２本鎖ＤＮＡであれば、ＧＣ含量
が大きいほど１本鎖に解離し難いのである。従って、反
応条件を考えるときにはプローブの塩基数と共にＧＣ含
量も考慮する必要が有る。

【００５９】この他ハイブリダイズと解離に影響を与え
る要因として、塩濃度やｐＨ等を挙げることができる。
本発明においては反応系にヌクレアーゼをはじめとする
酵素も含まれているため十分な酵素活性を期待できる条
件を与える必要も有る。これらの条件を総合的に考慮
し、必要な条件を設定する。

【００６０】＜ＡＰエンドヌクレアーゼ＞本発明におい
てＡＰエンドヌクレアーゼ（AP-endonuclease,apurinic
/apyrimidinic endonuclease）とは、ＤＮＡ中の塩基が
欠落した部位を認識して、その５´側または３´側のホ
スホジエステル結合を分解する酵素をいう。例えば、大
腸菌には３種の酵素があり、Exo III 、エンドヌクレア
ーゼIVが非塩基部位の５´側で切れ目を入れるのに対し
て、エンドヌクレアーゼIII は３´側を切断する。Exo
III のもつＡＰ一エンドヌクレアーゼ活性は菌体内のア
ルキル化損傷修復の８５％以上を担っている。枯草菌、
子ウシの胸腺や肝、植物、ヒトの胎盤や培養細胞にも大
腸菌と同様の酵素が見出されている。色素乾皮症の一部
にはこの酵素の活性が低下しているものがある（生化学
事典 第二版 東京化学同人 p195）。

【００６１】ＡＰエンドヌクレアーゼとしてExo III を
用いた場合、反応液１μl 当たり０．０１〜１０Ｕの濃
度で用いるとよい。ＡＰ部位が天然型ではなくプロパン
ジオール型ＡＰのような合成したものである場合には、
天然型ＡＰより反応性が悪くなるので高濃度のExo III
を用いた方が良い結果を得られる。目安としては天然型
ＡＰ部位の約１０倍程度を用いるのが好ましく、具体的
には反応液１μl 当たり１Ｕ以上の濃度が好適である。

【００６２】大腸菌Exo III は２本鎖ＤＮＡの種々のタ
イプのホスホジエステル結合を加水分解する酵素活性を
持つ。即ち、ＤＮＡ鎖の３´末端から順次５´−モノヌ
クレオチドを遊離する３´→５´エクソヌレアーゼ活
性、３´末端のホスホモノエステルを加水分解する３´
- ホスホターゼ活性、及びアプリン酸またはアピリミジ
ン酸部位の５´側のホスホジエステル結合を加水分解す
る５´→ＡＰエンドヌクレアーゼ活性である。また、Ｄ
ＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを分解するＲＮ
ａｓｅＨ活性をも有している。Ｍｇ²⁺存在下では各種の
ヌクレアーゼ活性が活性化されるが、Ｍｇ²⁺の代わりに
Ｃａ²⁺を用いるか、あるいはクエン酸を共存させること
により３´→５´エクソヌレアーゼ活性を抑制し、ほぼ
５´→ＡＰエンドヌクレアーゼ活性だけとすることが可
能である。

【００６３】また３´→５´エクソヌクレアーゼ活性は
ホスホロチオエート結合等の修飾された結合を分解でき
ないので、プローブＤＮＡの３´末端あるいはＡＰ部位
の５´側のホスホジエステル結合をホスホロチオエート
結合に変更しておけば、３´→５´エクソヌレアーゼ活
性によりプローブＤＮＡが分解されなくなり、５´ＡＰ
エンドヌクレアーゼ活性だけを働かせることが可能であ
る。この場合、ホスホロチオエート結合は１つよりも数
個、好ましくは末端から３つくらいの連続する結合を修
飾しておくとほぼ完全な酵素耐性を与えることができ
る。

【００６４】上記のExo III 以外に、大腸菌や枯草菌な
どの細菌のエンドヌクレアーゼIV、エンドヌクレアーゼ
III 、２本鎖特異的なＡＰエンドヌクレアーゼ活性を持
つ酵素、例えば植物、子ウシの胸腺や肝（B.J.S.Sander
son et al., Biochemistry,28,3894-3901(1989) ）、ヒ
トの胎盤由来の酵素（APEX nuclease:L.Harrison eta
l., Human Molecular Genetics,1,67７一680(l992))等
がこの反応に利用可能である。なお、Exo III とBovine
Apurinic Endonucleaseは２本鎖構造を認識しかつＡＰ
部位のみを特異的に分解する。更に、分裂酵母などで見
出されているシクロブタン型ピリミジンダイマーや６−
４ホトプロダクトを分解する酵素を利用も可能である
が、プローブＤＮＡにおけるＡＰ部位は紫外線照射など
で生ずるシクロブタン型ビリミジンダイマーや６−４ホ
トプロダクトとすることが必要である（K.K.Bowman et
al., Nucleic Acid Res.22,3026-3032(l994)）。

【００６５】なお、先行技術として紹介した特開昭 62-
190086号公報でもExo III が利用されているが、異なる
活性（もしくは基質特異性）を利用している点で本願発
明とは明らかに相違する。即ち、特開昭 62-190086号公
報記載の発明ではExo III のＲＮａｓｅＨ活性が利用さ
れているが、本発明ではこのような活性は利用していな
い（本発明におけるＡＰ部位はＲＮａｓｅＨでは切断す
ることはできない）ので両者は明確に区別される。

【００６６】＜本発明に使用できるＡＰエンドヌクレア
ーゼ＞ＡＰエンドヌクレアーゼ（AP-endonuclease ）活
性を有する酵素は、切断活性により２つに分類されてい
る。ひとつはＡＰ部位の５´側を切断するclass II、他
の一つはＡＰ部位の３´側を切断するclass I である。

【００６７】

【化４】 ［class I 酵素の利用］class I 酵素（ＡＰ部位の３´
側切断）による切断の結果として、３´−ＡＰ部位‐Ｏ
Ｈと５´‐Ｐが生成する。ここで生じた３´−ＡＰ部位
‐ＯＨは、鋳型鎖と水素結合していないので、class II
の場合と異なり、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとし
ては機能できない。しかし、分解にて生じた５´リン酸
化ＤＮＡはＴ４ＤＮＡリガーゼや大腸菌ＤＮＡリガーゼ
の基質となるので、別に用意した３´ＯＨ末端を有する
ＤＮＡと結合させることが可能となり、これを利用して
分解物のみを検出できようになる。

【００６８】class I 酵素には、例えばバクテリオファ
ージＴ４（bacteriophageT4 ）由来のエンドヌクレアー
ゼ（endonuclease）のように、グリコシラーゼ活性を合
わせ持つ酵素も存在する。これは２つの酵素活性を同時
に持っているが、予めＡＰ部位をもつプローブを使用す
る場合ではＡＰ−エンドヌクレアーゼ活性のみを利用し
た系が可能である。あるいは、それぞれの酵素の合わせ
持つ活性を積極的に利用して、予めプローブがＡＰ部位
をもっていなくともプローブ中に酵素の認識する構造を
持たせておけば次のような系が構成できる。即ち、バク
テリオファージＴ４ エンドヌクレアーゼは、チミンフ
ォトダイマー（thymine photodimer）を認識するので、
プローブ中にＵＶ照射等でチミンフォトダイマーを導入
しておき、グリコシラーゼ活性によりＡＰ部位を形成さ
せ、同一酵素のＡＰ−エンドヌクレアーゼ活性によりプ
ローブを切断させることが可能となる。

【００６９】［class II酵素の利用］class II（AP部位
の5'側切断）による切断の結果として、３´−ＯＨと５
´‐Ｐ‐ＡＰ部位が生成される。

【００７０】本発明においては、class II酵素によって
生じた３´−ＯＨを利用する検出法、例えばＤＮＡター
ミナルトランスフェラーゼによる鎖の伸長反応が可能で
ある。先行技術として紹介したＤＮＡ−ＲＮＡキメラプ
ローブでは、末端にＲＮＡ分子を持つためこの種の反応
を採用することはできない。

【００７１】一方、class II酵素で生じた５´‐Ｐ末端
はλエクソヌクレアーゼ等の基質とすることができる。
したがって例えば反応後の分解物をＣＳＨを応用してハ
イブリダイズさせて２本鎖とし、５´−末端からの酵素
的な分解を指標として検出が可能である。

【００７２】本発明においては、ＡＰエンドヌクレアー
ゼが、class I にしろclass IIにしろ、ターゲットとハ
イブリダイズしたプローブのみを分解すること（言い換
えれば１本鎖プローブは分解しないこと）が重要であ
る。２本鎖に対して完全に特異的かどうかを明確にする
ことは難しいが、これは程度の問題であるので、下記に
示す２本鎖特異性が高いとされている酵素は、本発明に
使用できる。なお、特にExo III の場合は、Ｃａ²⁺ある
いはクエン酸存在下で３´末端からの１本鎖切断活性を
検出限界以下まで下げることができる。

【００７３】以下に本発明に利用可能な酵素の例を示
す。

【００７４】

【表２】 class II ＡＰエンドヌクレアーゼ：ＡＰ部位の５´個のリン酸ジエステル結合 を切断する酵素 起源 名称 参考文献 E.coli Exonuclease III Endonuclease IV J.Biol.Chem.263,8066-9071 1988 S.serevisiae Apn1 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A87, 4193-4197 1990 Hemophilus DNase Adv. Enzymol. 60,1-34 1987 influenzae （固有の名前なし） Streptococcus ExoA J.Bacteriology 171,2278-2286 pneumoniae 1989 mouse APEX nuclease J.Biol.Chem.266, 20797-20802 1991 bovine BAP1(bovine AP endonuclease I) Biochemistry 28, ＝ APE(apurinic endodeoxy 3894-3901 1989 ribonuclease) human APEX = HAP1 = APE Biochem.Biophys.Acta 1131, 287-299 1992 class I ＡＰエンドヌクレアーゼ：ＡＰ部位の３´個のリン酸ジエステル結合を 切断する酵素 E.coli Endonuclease III Biochemistry 28,4444-4449 1989 bacteriophageT4 T4 endonuclease V J.Biol.Chem. 264,2609-2614 1989 S.serevisiae Redoxyendonuclease Biochemistry 27,2629-2634 1988 M.luteus UV endonuclease Method in Enzymology 65, 185-191 1980 ＡＰ部位に対する適切な酵素の選択は、例えばテトラヒ
ドロフラン、プロパンジオール、エチレングリコールに
対してはExo III というように当業者が適宜行い得る。

【００７５】＜標的配列の選択と応用＞本発明におい
て、標的配列はＤＮＡに限られず、ＲＮＡであっても逆
転写によりＤＮＡとすれば標的配列とすることができ
る。また、核酸の起源は限定されない。更に、２本鎖の
ものであっても、１本鎖に変性することにより標的配列
とすることができる。

【００７６】本発明のプローブは、非塩基部位の隣接配
列が標的と相補的でない場合に特殊な性状を持つ。即
ち、酵素としてExo III を使いＣａ²⁺存在下で反応を行
うと、プローブのＡＰ部位５´側に隣接する塩基が相補
でないときに切断されにくくなるのである。この特徴を
利用すれば、遺伝子配列の突然変異を検出することがで
きる。即ち、プローブにおけるＡＰ部位の５´側に隣接
する配列をコントロールすれば、標的配列に変異が起こ
ったときにだけ、あるいは正常なときにだけ開裂される
系を構成することができるのである。例えば、実施例
（ＡｐｏＥ３とＡｐｏＥ４）では、ＡＰ部位の５´側の
１塩基を変えたプローブを利用したとき、この部分が検
出対象の配列に完全に相補的である場合に限り反応が進
行することを確認している。このように、本発明のプロ
ーブを用いた場合には、そのＡＰ部位の３´側、および
／または５´側の塩基が、検出の対象となる特定の塩基
に相補的な塩基を有しているということを検出すること
（請求項１２）ができる。

【００７７】遺伝子配列の変異には、予め変異後の配列
が知られているものがあり、この種の変異では変異後の
配列に対して相補的なプローブを用意することができ
る。

【００７８】＜断片化プローブの検出方法＞本発明を実
施することにより生じる断片化プローブ（切断断片化プ
ローブ）は、基本的には、常法に従い、電気泳動や液体
クロマトグラフィーのような技術で検出することができ
る。

【００７９】｛断片化プローブの検出法Ａ｝ ＜ＣＳＨ現象（特願平6-136189号）を利用する方法＞本
発明では開裂したプローブのＴｍが低下して２本鎖を維
持できなくなり、１本鎖に戻ってしまう現象がサイクル
反応の基礎になっている。従って、通常の条件では、開
裂してしまったプローブ断片を再びハイブリダイズさせ
ることはできない。しかしながら、単独では２本鎖を形
成できない断片化プローブも、隣接する部分が予め２本
鎖を形成していれば、ハイブリダイズが促進される（Ｃ
ＳＨ現象；特願平6-136189号）。具体的には、以下のよ
うな関係を持つ部分的に２本鎖を備えた捕捉プローブ
（これをスタッキングプローブと呼ぶこともある）を用
意しておけば、開裂で生じた断片を次々と捕捉していく
ことが可能である。本発明のプローブは断片化プローブ
の末端がＤＮＡの塩基なので、更にＴ４ファージや大腸
菌由来のＤＮＡリガーゼにより連結することも可能であ
る。下記のような関係を持つ捕捉プローブをＡＰプロー
ブとは別に固相化しておけば、断片化プローブを固相に
捕捉できる。断片化プローブが捕捉されたか否かの検出
は、本発明のプローブを予め蛍光標識（他の標識でも
可）しておき、反応後の固相の蛍光強度の検出（「他の
標識」で行った場合には、その標識に対応した検出）を
することにより、簡便に行うことができる。

【００８０】蛍光以外の標識としては、例えばビオチン
を用いることができる。この系では、ビオチン標識して
おいたプローブをＣＳＨによって捕捉し、これを例えば
アビジン化酵素等で検出することができる。或いは市販
のビオチン化酵素をアビジンを介して結合させても良
い。ビオチン化酵素にはビオチン化酢酸キナーゼ等が市
販されており、酢酸キナーゼによって生成するＡＴＰを
ルシフェラーゼによる生物発光反応で検出すれば極めて
高い感度を期待できる。

【００８１】ＣＳＨによって捕捉した断片化プローブ
は、隣接する配列とライゲーションして連続したＤＮＡ
とすることによって更に安定な２本鎖とすることができ
る。ライゲーションには、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を利用
する。なお、通常の化学合成によって得られるプローブ
の５´末端はリン酸化されていないので、この部分はリ
ガーゼによってライゲーションされることはない。こう
してより安定な２本鎖とした後でアルカリ（たとえば
０．１ＮのＮａＯＨ溶液）で洗浄すれば、非特異的に吸
着した標識成分等を強力に除去できる上、目的とする２
本鎖のみを残すことができるのでバックグランドの低い
検出が可能となる。

【００８２】同じような２本鎖を安定させる効果は、例
えば特表昭 61-500688号（WO85/02628）に記載されたよ
うな技術を応用しても実現できる。この先行技術ではハ
イブリダイズによって形成された２本鎖を共有結合によ
って架橋し安定な２本鎖構造としている。共有結合によ
って形成された架橋構造は、洗浄等によっては外れるこ
とはない。

【００８３】

【化５】｛式５｝ 上に示したのは、ＣＳＨを応用した断片化プローブ捕捉
方法の基本的な態様である。このような態様の他に、た
とえば次のような捕捉形態を利用することができる。な
お、いずれの例においても、捕捉用ＤＮＡは、ＤＮＡ末
端、あるいは適当なリンカーを導入した任意の部位で固
相との結合が可能である。

【００８４】１）式５における２本鎖構造を一方だけに
する。

【００８５】２）２本鎖構造を、２本のＤＮＡのハイブ
リッドで構成するのではなく１本のＤＮＡの末端を折り
返して構成したヘアピン構造とする。この場合、両端を
折り返して式５に示すような構造を形成することも可能
である。

【００８６】なお、この例は断片化プローブの塩基数が
不揃いな従来法では利用することはできないという点
で、本発明に特徴的な例である。

【００８７】プローブとして、次の条件(1) −(3) を満
足する構造のプローブを採用すればＣＳＨを利用するこ
と無く、単なる１本鎖ＤＮＡで断片化プローブの捕捉が
可能である。

【００８８】(1) 末端に分析対象である特定の核酸とは
ハイブリダイズできないが、該プローブを捕捉する捕捉
用ＤＮＡとはハイブリダイズ可能な捕捉配列が付加して
おり、(2) かつ、捕捉配列末端から非塩基部位に至る部
分は、分析対象である特定の核酸と相補的な配列を有
し、(3) 更に、該非塩基部位から捕捉配列と反対側の末
端に至る部分は、分析対象である特定の核酸とハイブリ
ダイズするが該捕捉用ＤＮＡとはハイブリダイズしない
配列からなる。

【００８９】但し、このような捕捉システムでは断片化
していないプローブも捕捉用ＤＮＡとハイブリダイズで
きるため、非塩基部位の切断によって生じる３´−ＯＨ
を利用した検出系との組み合わせが要求されよう。

【００９０】｛断片化プローブの検出法Ｂ｝ ＜AP部位切断により生じる断片化プローブの３´−ＯＨ
末端を利用する方法＞本発明では、生じる断片化プロー
ブの長さが一定で、しかもclass II酵素との組み合わせ
では常に３´−ＯＨ末端を持つＤＮＡを生じるので、こ
れを利用した特殊な技術を採用することができる。以
下、断片化プローブの検出方法を列挙する。

【００９１】＜３´−ＯＨ末端を利用する方法１；ター
ミナルトランスフェラーゼを利用する方法＞class II酵
素により生じる断片化プローブが３´−ＯＨ末端を持つ
ことを利用した検出方法の代表的なものは、ターミナル
トランスフェラーゼを利用した検出方法である。この酵
素は、３´−ＯＨを特異的に認識して他のヌクレオチド
鎖を結合するので、切断によって生じる３´−ＯＨのみ
を特異的に検出することが可能となるのである。ターミ
ナルトランスフェラーゼの場合は、３´−ＯＨが鋳型と
ハイブリダイズしていることを要求しないため１本鎖の
ままで反応させることができる。

【００９２】ターミナルトランスフェラーゼ（Terminal
deoxyribonucleotidyl transferase(TdT)）を利用した
方法は、具体的には次のように施行する。ＡＰ部位の５
´側をビオチン標識すると共に３´末端をジデオキシ化
したプローブを用意し、反応後、分解されて初めて生じ
た３´−ＯＨ末端に、ＴｄＴにより蛍光体（もちろん他
の標識物質でも可）を含む核酸類似体のポリマーを伸長
させる。そして、５´側のビオチンを利用してストレプ
トアビジン固相担体にトラップさせ、固相の蛍光強度を
検出する。この系では断片化プローブの３´側に標識物
質が連なるので非常に高い感度が期待できる。

【００９３】＜３´−ＯＨ末端を利用する方法２；Ｔ４
ＲＮＡリガーゼを利用する方法（参考；Analytical Bio
chemistry 158,171-178 1986）＞上記したＴｄＴを利用
する方法と同様の検出は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを利用し
ても行うことができる。この方法を施行するにあたって
は、本発明に係るプローブ（ＡＰ部位をもつプローブ）
の５´末端を脱リン酸化する（通常のＤＮＡ合成では、
リン酸はついていない）と共にその３´末端をジデオキ
シ化しておき、同時にＡＰ部位の５´側にはビオチン標
識を施しておく。

【００９４】Ｔ４ＲＮＡリガーゼは、ヘキサミンコバル
ト塩化物（hexamine cobalt chloride）及びポリエチレ
ングリコールの存在下で、効率よく１本鎖ＤＮＡ鎖どう
しの結合を行う。反応系に、Ｔ４ＲＮＡリガーゼと共
に、蛍光体（他の標識物質でも可）を含むオリゴヌクレ
オチド（５´末端はリン酸化、３´末端はジデオキシ化
したもの）を添加しておけば、反応後に生じた断片化プ
ローブの３´−ＯＨ末端に、当該蛍光体を含むオリゴヌ
クレオチドが結合する。後は、ＴｄＴを利用する方法と
同様に、５´側のビオチンを利用してアビジン固相担体
にトラップされた蛍光強度を検出することにより、標的
核酸の存否が検出できる。

【００９５】＜３´−ＯＨ末端を利用する方法３＞出願
人が過去に出願したＤＮＡポリメラーゼとExo III を組
み合わせたサイクリング反応（特願平5-337863号）を応
用する。このサイクリング反応は、 "ポリメラーゼによ
って付加した塩基をヌクレアーゼで分解する" という反
応サイクルを繰り返すものである。予めヌクレアーゼ耐
性としたプライマーを用い、このヌクレアーゼ耐性プラ
イマーに対してポリメラーゼで鋳型と相補的な塩基（１
塩基でよい）を付加する。付加した塩基をヌクレアーゼ
で分解すれば、再びポリメラーゼにより塩基が付加され
る。このサイクル反応は、塩基の付加にともなって生成
するピロリン酸や、塩基の分解産物を指標として高い感
度で追跡できる。本発明の断片化プローブは塩基配列が
きちんとそろっているので、このような反応系を断片化
プローブの検出に応用することができる。なお、この場
合にも断片化プローブの単独でのハイブリダイズは不可
能なので、ＣＳＨを応用する必要がある。また、この方
法を応用するときには、断片化プローブとスタッキング
プローブの３´未端をExo III 耐性となるように修飾し
ておく必要もある。

【００９６】具体的には、３´未端がExo III 耐性とな
るようにされた本発明に係るプローブを使用し、反応を
行わせる。反応後、デオキシヌクレオシドトリリン酸、
ＤＮＡポリメラーゼ及びExo III を加え、生じるピロリ
ン酸もしくはヌクレオシドモノリン酸を検出することに
より、標的核酸の存在が確認できる。

【００９７】＜３´−ＯＨ末端を利用する方法４；ＤＮ
Ａポリメラーゼを利用する方法＞断片化プローブの３´
−ＯＨは、ターミナルトランスフェラーゼの他に、ＤＮ
Ａポリメラーゼの作用で検出することができる。この酵
素も、ターミナルトランスフェラーゼと同様に、３´−
ＯＨを特異的に認識して他のヌクレオチド鎖を結合する
ので、切断によって生じる３´−ＯＨのみを特異的に検
出することが可能なのである。但し、ターミナルトラン
スフェラーゼの場合は１本鎖のままで反応させることが
できるが、ＤＮＡポリメラーゼの場合には３´−ＯＨが
鋳型とハイブリダイズしていることが要求されるため、
切断によって生じる断片化プローブを２本鎖にする必要
がある点で、上記方法１〜３とは異なる。

【００９８】ここで、断片化プローブは、塩基数が足り
ないので２本鎖を維持できないためプライマーとなるこ
とはできない。しかしながら、ここで先に述べたＣＳＨ
を利用すれば、単独では２本鎖を形成できないような短
い配列でもハイブリダイズさせ、プライマーとして機能
させることができるため、ＤＮＡポリメラーゼを利用す
ることができるようになる。

【００９９】ＤＮＡポリメラーゼを利用して検出を行う
場合には、３´側をポリメラーゼの基質にならないよう
にジデオキシ化もしくは３´−ＯＨ基のリン酸化等で予
め修飾しておくか、あるいは３´末端をハイブリダイズ
できない配列としたプローブを用い、本発明によってＡ
Ｐ部位を切断する。すると、もとのプローブはプライマ
ーとならないが、切断によって、修飾されていない３´
−ＯＨ未端を持つ断片化プローブが生じ、前述したＣＳ
Ｈを利用すればそれをプライマーとして機能させること
ができる。この特徴を利用して、切断が生じたときにだ
けＤＮＡポリメラーゼによる反応を開始する系を構成
し、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応を指標と
し、断片化プローブを検出することができる。

【０１００】具体的には、ＤＮＡポリメラーゼを添加し
た系にＣＳＨのスタッキングプローブを固相に担持して
おき、ここに断片化プローブがハイブリダイズするよう
にする。この場合に、蛍光標識をしたヌクレオチドを基
質にし、断片化プローブをプライマーとしてＤＮＡ鎖を
伸長させる。本発明に係るプローブのＡＰ部位が切断さ
れた場合には、固相に担持されたスタッキングプローブ
に断片化プローブがハイブリダイズしてプライマーとな
り、ＤＮＡポリメラーゼの作用によりＤＮＡ鎖が伸長す
る。ＤＮＡ鎖の伸長は、蛍光標識されたヌクレオチドの
取り込みを伴うため、固相の蛍光を検出することによ
り、標的核酸が存在するか否か判断できる。なお、本発
明に係るプローブのＡＰ部位の５´側を予め蛍光標識し
ておけば、ＤＮＡ鎖の伸長を行わずに、固相の蛍光を検
出するだけで標的核酸の存否が判断できる。

【０１０１】｛断片化プローブの検出法Ｃ｝ＡＰ部位の
５´側をフルオレセイン標識（他の標識でも可）すると
共に３´側をビオチン標識したプローブを用意して反応
を行う。反応後、ストレプトアビジン固相担体に、未反
応及び分解されたＡＰ部位の３´側断片の両方をトラッ
プさせる。この場合に、ＡＰ部位が分解されていない場
合には、ビオチン標識された３´側に伴って、フルオレ
セイン標識された５´側もトラップされることとなる。
一方、ＡＰ部位が分解されている場合には、ビオチン標
識された３´側がトラップされるだけで、フルオレセイ
ン標識された５´側は溶液中に残存する。このように、
この系ではプローブＤＮＡが切断されたときにだけ液相
中に蛍光成分が検出されるので、溶液中に残った分解さ
れたＡＰ部位の５´側の断片の蛍光を測定することによ
り、標的核酸の存否が検出できる。

【０１０２】｛断片化プローブの検出法Ｄ｝ＡＰ部位の
５´側をフルオレセイン標識、３´側をローダミン標識
（逆でも良い）したプローブを用意し、各標識物間の距
離はエネルギー転移の起こる範囲とする。反応後、分解
されたプローブではエネルギー転移が起こらなくなるの
で、エネルギー転移によるローダミンの蛍光強度は低下
（フルオレセインの蛍光強度は増加）するので、分解プ
ローブの量を定量できる（参考：Nucleic acids Reseac
h 22, 920-928, 1994 ）。

【０１０３】

【作用】本発明に係るプローブは、公知のプローブのＲ
ＮＡ部分をＡＰ部位に置き換えただけで、保存安定性の
向上を実現している。更に、合成が容易であるという利
点も備えている。

【０１０４】即ち、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラプローブで
は、ＲＮＡが末端に位置するもののみしか分解できず、
中間部分のＲＮＡは分解できないが、ＡＰ部位を有する
プローブを用いることにより、特定の部位で確実に切断
を行うことができる。

【０１０５】本発明に係るプローブはＡＰ部位を有して
いるので、ＡＰエンドヌクレアーゼとの組み合わせによ
りＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプローブとＲＮａｓｅ
の組み合わせでは実現することのできない多くの効果
（具体的には、例えば次ような効果）を実現することが
できる。

【０１０６】本発明に係るプローブは、化学的に安定な
結合からなっており非特異的な分解が起こりにくい。ま
た、使用するＡＰエンドヌクレアーゼは２本鎖ＤＮＡに
特異的に認識して分解するが１本鎖状態のプローブを殆
ど分解しない。このため、標的ＤＮＡの存在を特異的に
検出できることになる。これに対し、ＤＮＡ−ＲＮＡ−
ＤＮＡキメラプローブを用いた場合には、構造的に不安
定なＲＮＡ部分が存在すること、及び容易に混入する非
特異的なＲＮＡ分解酵素により分解されやすく、これら
のためバックグランドの上昇が起こりやすい。

【０１０７】本発明においては１型あるいは２型のＡＰ
エンドヌクレアーゼを適宜使い分けることにより、切断
後の断片の検出する応用範囲が広くなることも利点であ
る。またいずれのＡＰエンドヌクレアーゼを用いた場合
も切断点が厳密に規定され、かつ切断後の断片は安定な
ＤＮＡであるので明確な結果を得ることができる。しか
し、ＲＮａｓｅＨによるキメラプローブの分解反応では
末端に１個以上のＲＮＡ分子を有するものを生ずる。こ
の末端のＲＮＡ分子は特に不安定な構造で容易に分解さ
れるので、最終産物がＲＮＡ部分を持つものと持たない
ものとの混合物となる。このため、最終産物の検出が難
しくなると予想される。

【０１０８】更に重要な点として、ＡＰ部位に隣接する
塩基をＡＰエンドヌクレアーゼが認識するという点があ
る。したがって、隣接する塩基がミスマッチである場合
には分解反応が起こらなくなり、これを利用することに
より変異点を検出することが可能となる。

【０１０９】

【実施例】以下、本発明の好適な実施例を示すが、本発
明はこれに限られるものではない 。 ［実施例１］ＡＰプローブ（構造１）／５´末端を
³²Ｐ標識 ＜標的ＤＮＡ配列＞モデル実験の材料として、ＨＢＶウ
イルス核酸のｅ抗原遺伝子の一部をＭ１３ｍｐ１８ＤＮ
Ａ上にクローニングしたものを用いた。標的ＤＮＡと相
補的なプローブ配列を下記に示す。

【０１１０】

【化６】5'-AATGCCCCTATCTTATCAACACTTC-OH ＜プローブ核酸の調製＞プローブ核酸として、以下に示
す塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成して用
いた。

【０１１１】

【化７】5'-AATGCCCCTATCUTATCAACACTTC-OH ＜ＡＰ部位を持つプローブ（ＡＰプローブ）の調製＞プ
ローブ内のＴ残基をＵ残基としたオリゴヌクレオチドを
化学合成した後、５´末端を³²Ｐで標識した。次に、ウ
ラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理によりＵ残基の脱ウラ
シル化を行った。この操作により、塩基であるウラシル
を失い、ＡＰ部位が形成される。

【０１１２】＜シグナル増幅反応＞脱ウラシル化プロー
ブＤＮＡ及びこれと相補的なＤＮＡを混合し、Exo III
を添加して反応させた（反応液組成；５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，５０ｍＭ ＮａＣｌ， １０
ｍＭ ２‐メルカプトエタノール，５ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂ ，０．１μｇ／μｌ ＢＳＡ，１ｐｍｏｌ／μｌ
５´末端が³²Ｐで標識されたプローブ（２０ｐｍｏｌ／
ｔｕｂｅ），０−１ｐｍｏｌ標的ＤＮＡ，１Ｕ／μｌ
Exo III （２０Ｕ／ｔｕｂｅ），最終濃度２０％ＤＭＳ
Ｏ，反応液全量２０μｌ）。

【０１１３】まず、前処理として、酵素（Exo III ）を
除く上記反応液を５分間煮沸し、氷上に１分間放置し、
遠心した。そして、そこに酵素（Exo III ）を添加し、
３７℃で６０分保温した。反応後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ
５μｌ，ホルムアミド染料５μｌを添加して５分間煮
沸し、それを７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル
（２０％）で電気泳動し、オートラジオグラフィーによ
り断片化プローブを検出した。

【０１１４】＜結果＞標的ＤＮＡが存在する場合にはポ
リアクリルアミドゲル上で断片化プローブが検出され、
ＡＰプローブの分解が起こったことが確認できた。一
方、標的ＤＮＡが存在しないとき或いは相補性を有しな
いＤＮＡを対象としたときは、いずれもＡＰプローブの
断片化は起らなかった。従って、この反応が標的ＤＮＡ
に特異的であることがわかった。

【０１１５】標的ＤＮＡ濃度が０．１ｐｍｏｌ／μｌで
もプローブＤＮＡの分解は観察された。更に、標的ＤＮ
Ａ濃度が０．１ｐｍｏｌ／μｌ以上の場合では、全ての
プローブＤＮＡが分解されたことから約５００倍程度の
サイクル反応が起こっていることが確認できた。

【０１１６】［実施例２］ＡＰプローブ（構造５）／５
´末端を³²Ｐ標識 ＜標的ＤＮＡ配列＞モデル実験の材料として、ＨＢＶウ
イルス核酸のｅ抗原遺伝子の一部をＭ１３ｍｐ１８ＤＮ
Ａ上にクローニングしたものを用いた。標的ＤＮＡと相
補的なプローブ配列を下記に示す。

【０１１７】

【化８】5'-AATGCCCCTATCTTATCAACACTTC-OH ＜ＡＰ部位を持つプローブ（ＡＰプローブ）の調製＞プ
ローブ核酸として、以下に示す塩基配列を持つオリゴヌ
クレオチドを化学合成して用いた。

【０１１８】

【化９】5'-AATGCCCCTATCXTATCAACACTTC-OH （X:ＡＰ部位）プローブ内のＴ残基をプロパンジオール
の構造を持つＡＰ部位としたオリゴヌクレオチドを化学
合成した後、５´末端を³²Ｐで標識した。プロパンジオ
ールの構造としては、プライムシンセシス社のSpacer P
hosphoramidite C3 を用いた。

【０１１９】＜シグナル増幅反応＞プローブＤＮＡ及び
これと相補的なＤＮＡを混合し、Exo III を添加して、
反応させた（反応液組成；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．０，５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭ ２‐メル
カプトエタノール，５ｍＭ ＣａＣｌ₂ ，０．１μｇ／
μｌ ＢＳＡ，１ｐｍｏｌ／μｌ ５´末端が³²Ｐで標
識されたプローブ（２０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅ），０−１
ｐｍｏｌ標的ＤＮＡ，１Ｕ／μｌ Exo III （２０Ｕ／
ｔｕｂｅ），最終濃度２０％ＤＭＳＯ，反応液全量２０
μｌ）。

【０１２０】まず、前処理として、酵素（Exo III ）を
除く上記反応液を５分間煮沸し、氷上に１分間放置し、
遠心した。そして、そこに酵素（Exo III ）を添加し、
３７℃で６０分保温した。反応後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ
５μｌ，ホルムアミド染料５μｌを添加して５分間煮
沸し、それを７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル
（２０％）で電気泳動し、オートラジオグラフィーによ
り断片化プローブを検出した。

【０１２１】＜結果＞標的ＤＮＡが存在する場合にはポ
リアクリルアミドゲル上で断片化プローブが検出され、
ＡＰプローブの分解が起こっていることが確認できた。
一方、標的ＤＮＡが存在しないときや相補性を有しない
ＤＮＡを対象としたときは、プローブＤＮＡの断片化は
起らなかった。従って、この反応が標的ＤＮＡに待異的
であることがわかった。

【０１２２】標的ＤＮＡ濃度が０．１ｐｍｏｌ／μｌで
もプローブＤＮＡの分解は観察された。更に、標的ＤＮ
Ａ濃度が０．１ｐｍｏｌ／μｌ以上の場合では、全ての
プローブＤＮＡが分解されたことから約５００倍程度の
サイクル反応が起こっていることが確認できた。

【０１２３】［実施例３］ＡＰプローブ（構造５）／５
´末端を³²Ｐ標識 ＜標的ＤＮＡ配列＞モデル実験の材料として、ヒトＡｐ
ｏＥ３、及びＡｐｏＥ４遺伝子の一部をＭｌ３ｍｐ１８
ＤＮＡ上にクローニングしたものを用いた。標的ＤＮＡ
と相補的なプローブ配列を下記に示す。標識としたヒト
ＡｐｏＥ３とＥ４遺伝子の配列は、２４塩基中１塩基だ
けが相違する非常に相同性の高い配列を備えている。

【０１２４】

【化１０】ＡｐｏＥ３：5'-CGGCCGCACACGTCCTCCA-3' ＡｐｏＥ４：5'-CGGCCGCGCACGTCCTCCA-3' ＜ＡＰ部位を持つプローブ（ＡＰプローブ）の調製＞Ａ
Ｐプローブとして、以下に示す塩基配列を持つオリゴヌ
クレオチドを化学合成して用いた。

【０１２５】

【化１１】ＡｐｏＥ３：5'-CGGCCGCAXACGTCCTCCA-3' ＡｐｏＥ４：5'-CGGCCGCGXACGTCCTCCA-3' （X:ＡＰ部位）プローブ内にプロパンジオールの構造を
持つＡＰ部位（Ｘで示した）を有するオリゴヌクレオチ
ドを化学合成した後、５´末端を³²Ｐで標識した。プロ
パンジオールの構造としては、プライムシンセシス社の
Spacer Phosphoamidite C3を用いた。

【０１２６】＜シグナル増幅反応＞プローブＤＮＡ及び
標的ＤＮＡを混合し、Exo III を添加して、反応させた
（反応液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，
５ｍＭ ＣａＣｌ₂ ，１０ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１ｍｇ／ｍｌＢＳ
Ａ，２０％ ＤＭＳ０）。反応後、ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動し、オートラジオグラフィーにより断片
化したプローブＤＮＡを検出した。

【０１２７】＜結果＞ＡｐｏＥ３或いはＡｐｏＥ４用の
ＡＰプローブでは、各々が対応する標的遺伝子が存在す
るときにのみ断片化プローブを生成することが確認され
た。標的遺伝子を対応していないものに置き換えたとき
の断片化プローブの生成はわずかであり、本発明によっ
て塩基の違いを認識できることが明らかとなった。

【０１２８】なお、実施例１〜３の検出系は、いずれも
単に５´末端の³²Ｐ標識により切断断片を検出したもの
であるが、実施例３のみ本発明が１塩基の違いを認識で
きることを確認した。

【０１２９】また、標的ＤＮＡよりも多量のＡＰプロー
ブが分解されたことから、予想したサイクル反応が起こ
っていることが確認できた。

【０１３０】言うまでもなく、いずれのプローブでも、
標的ＤＮＡが存在しないとき、或いは相補性を有しない
ＤＮＡを対象としたときは、プローブＤＮＡの断片化は
起こらなかった。従って、この反応が標的ＤＮＡに特異
的であることがわかった。

【０１３１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明では、以下
のような有用な効果を有する。

【０１３２】特別な温度制御操作をすることなくシグナ
ルの増幅を行えるので、操作が簡単であり自動化が容易
である。

【０１３３】生成物の増加が直線的に進むので、標的Ｄ
ＮＡの定量が容易である。

【０１３４】コンタミネーションの影響を受けにくい。
即ち、ＡＰエンドヌクレアーゼによって分解したプロー
ブ産物を検出するので、たとえ反応後の産物が汚染され
ていたとしてもその汚染が増幅されない。

【０１３５】プローブの合成が容易であり、安価であ
る。

【０１３６】プローブは安定であり、また非特異的分解
を受けにくい。

【０１３７】分解産物の長さが一定であること、或いは
３´−ＯＨを持つこと等、検出に有利な条件を持ってい
る。

【０１３８】＜関連文献＞ １）P.Duck et al.:Probe Amplifier System Based on
Chimeric Cycling Oligonucleotides,BioTechniques 9,
142-147(1990) ２）ID Biomedical:Will CPR beat PCR?:The Genesis R
eport/Dx,2-8(1994) ３）特開昭 61-290326号公報、“核酸配列の検出に有効
な分子” 発明者：ピーター．ダック、ロバート・ベン
ダー 出願人：ミーオジェニックス・インコーポレイテ
ッド ４）特表平2-504110号公報 “核酸配列の検出方法”
発明者：ピーター・ダック、ロバート・ベンダー 出願
人：ミーオジェニックス・インコーポレイテッド ５）M.Takeshita et al.:Oligodeoxynucleotides Conta
inig Synthetic Abasic Sites,Model Substrates for D
NA polymerases and apurinic/apyrimidinic endonucle
ases,J.Biol.Chem.262,10171-10179(l987) ６）C.C.Richardson and A.Kornberg:A Deoxyribonucle
ic acid PhosphataseExonuclease from Escherichia co
li,I.Purification of the enzyme and characterizati
on of the phoshatase activity,J.Biol.Chem.239,242-
250(1964) ７）C,C.Richardson,I.R.Lehman and A.Kornberg:A Deo
xyribonucleic acid Phosphatase Exonuclease from Es
cherichia coli, II． Characterzation of the exonu
clease activity,J.Biol.Chem.239,251-258(1964) ８）S.G.Rogers and B.Weiss:Exonuclease III of E.co
li K 12,and AP Endonuclease,Methods In Enzymology,
65,201-211(1980) ９）S.Liungquist:Endonuclease IV from E.coli,Meth
ods In Enzymology,65,212-216(1980) １０）G.Vesnaver et al.:Influence of abasic and an
ucleosidic sites onthe stability,conformation,and
melting behavior of a DNA duplex,Correlations of t
hermodynamic and structural data,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,86,3614-3618(1989) １１）B.Sanderson et al.:Mechanism of DNA cleavage
and Substrate Recognition by a Bovine Apurinic En
donuclease ,Biochemisty 28 ,3894-3901 (1989) １２）L.Harrison et al.:Human apuricic Endonucleas
e gee,structure andgenomicmapping,Human Mol.Geneti
cs,1 ,677-680 (1992) １３）核酸検出法 特開平6-169800号公報 発明者：神
原秀記他、出願人：日立製作所

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明に係るプローブによるサイクル反応の
様子を説明するための図である。

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の特定の核酸とハイブリダイズす
   ることが可能であり、５´側および３´側にＤＮＡを結
   合した非塩基部位を少なくとも一つ有し、該非塩基部位
   は該プローブが該特定の核酸とハイブリダイズしたとき
   のみＡＰエンドヌクレアーゼによって切断可能であり、
   切断を受けたプローブのみが該特定の核酸から解離可能
   であることを特徴とするプローブ。
2. 【請求項２】 以下の反応が順に繰り返し起こることを
   特徴とする、試料中の特定の核酸の分析に用いられるプ
   ローブであって、該特定の核酸とハイブリダイズ可能で
   あり、非塩基部位の５´側および３´側にＤＮＡを結合
   した構造を持ち、該非塩基部位は該プローブが該特定の
   核酸とハイブリダイズしたときのみＡＰエンドヌクレア
   ーゼによって切断可能であることを特徴とするプロー
   ブ。 (1) 試料中の該特定の核酸と該プローブとがハイブリダ
   イズする反応、(2) ２本鎖ＤＮＡ特異的ＡＰエンドヌク
   レアーゼによってハイブリダイズした該プローブの非塩
   基部位が切断される反応、(3) 切断された該プローブが
   該特定の核酸から解離する反応。
3. 【請求項３】 プローブの非塩基部位が、アプリン酸部
   位、アピリミジン酸部位、チミングリコール、ウレア残
   基、テトラヒドロフラン、プロパンジオール、エチレン
   グリコール、デオキシリビトール、Ｄ−デオキシリボー
   スのα−アノマーからなる群から選択される請求項１ま
   たは２いずれかに記載のプローブ。
4. 【請求項４】 非塩基部位を有するプローブが検出可能
   な分子を含むことを特徴とする請求項１または２いずれ
   かに記載のプローブ。
5. 【請求項５】 検出可能な分子が、放射性同位元素、発
   光分子、蛍光分子、蛍光元素、酵素、特定の分子と結合
   性を有する分子からなる群から選択されることを特徴と
   する請求項４に記載のプローブ。
6. 【請求項６】 検出可能な分子が、発光分子、蛍光分
   子、および蛍光元素からなる群から選択され、かつこれ
   らの検出可能な分子から発生する光信号が前記プローブ
   の切断によって変調を受ける請求項４に記載のプロー
   ブ。
7. 【請求項７】 非塩基部位が２カ所以上存在することを
   特徴とする請求項６に記載のプローブ。
8. 【請求項８】 特定の分子と結合性を有する分子が、ア
   ビジン、ビオチン、抗原、抗体またはその誘導体からな
   る群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の
   プローブ。
9. 【請求項９】 プローブの３´末端の水酸基に所定の修
   飾が施されていることを特徴とする請求項１または２い
   ずれかに記載のプローブ。
10. 【請求項１０】 プローブの３´末端の水酸基が、ター
    ミナルトランスフェラーゼ、リガーゼ、所定のポリメラ
    ーゼにより伸長あるいは付加されないよう修飾されてい
    ることを特徴とする請求項９記載のプローブ。
11. 【請求項１１】 以下の(1) から(3) の反応が順に繰り
    返し起こることを特徴とし、系内に蓄積された切断後の
    プローブを検出することにより、試料中の特定の核酸を
    分析するための方法。 (1) 試料中の特定の核酸と、該特定の核酸に対してハイ
    ブリダイズ可能であり、非塩基部位の５´側および３´
    側にＤＮＡを結合した構造を持ち、該非塩基部位は該プ
    ローブが該特定の核酸とハイブリダイズしたときのみＡ
    Ｐエンドヌクレアーゼによって切断可能であることを特
    徴とするプローブとがハイブリダイズする反応、(2) ２
    本鎖ＤＮＡ特異的ＡＰエンドヌクレアーゼによってハイ
    ブリダイズした該プローブの非塩基部位が切断される反
    応、(3) 切断された該プローブが該特定の核酸から解離
    する反応。
12. 【請求項１２】 プローブの非塩基部位に存在するＡＰ
    エンドヌクレアーゼによる開裂部位の３´側、および／
    または５´側の塩基が、検出の対象となる特定の塩基に
    相補的な塩基を有していることを特徴とする請求項１１
    に記載の方法。
13. 【請求項１３】 ＡＰエンドヌクレアーゼが大腸菌エク
    ソヌクレアーゼIII（Exo III ）である請求項１１に記
    載の方法。
14. 【請求項１４】 Ｃａ²⁺イオンまたはクエン酸存在下で
    プローブの切断反応を行うことを特徴とする請求項１３
    に記載の方法。
15. 【請求項１５】 非塩基部位が、アプリン酸部位、アピ
    リミジン酸部位、チミングリコール、ウレア残基、テト
    ラヒドロフラン、プロパンジオール、エチレングリコー
    ル、デオキシリビトール、Ｄ−デオキシリボースのα−
    アノマーからなる群から選択されるプローブを用いるこ
    とを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 切断されたプローブを電気泳動、また
    はクロマトグラフィーによって分離し検出することを特
    徴とする、請求項１１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 検出可能な分子を含むプローブを用い
    ることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
18. 【請求項１８】 検出可能な分子が、放射性同位元素、
    発光分子、蛍光分子、蛍光元素、酵素、特定の分子と結
    合性を有する分子からなる群から選択されることを特徴
    とする請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 検出可能な分子が、発光分子、蛍光分
    子、および蛍光元素からなる群から選択され、かつこれ
    らの検出可能な分子から発生する光信号が前記プローブ
    の切断によって変調を受ける請求項４に記載の方法。
20. 【請求項２０】 非塩基部位が２カ所以上存在すること
    を特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 ＡＰエンドヌクレアーゼによる切断を
    受けた後に解離したプローブ断片、またはその修飾物ま
    たは未分解のプローブを捕捉することを含む、請求項１
    １に記載の方法。
22. 【請求項２２】 ＡＰエンドヌクレアーゼによる切断を
    受けた後に解離したプローブ断片、またはその修飾物ま
    たは未分解のプローブを、該解離したプローブと相補的
    な塩基配列を有する１本鎖領域を有し、更に該１本鎖領
    域の近傍に２本鎖領域を有するＤＮＡによって捕捉する
    ことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 捕捉したプローブをプライマーとし、
    ＤＮＡポリメラーゼによってヌクレオチド合成反応を行
    う請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 切断されたプローブを、該切断された
    プローブと相補的な塩基配列を有する１本鎖領域を有
    し、更に該１本鎖領域の近傍に２本鎖領域を有するＤＮ
    Ａに捕捉させた後、ＤＮＡポリメラーゼ、エクソヌクレ
    アーゼ、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド三リン
    酸を作用させ、生成するピロリン酸またはヌクレオチド
    一リン酸を検出することを含む、請求項２２に記載の方
    法。
25. 【請求項２５】 プローブとして、(1) 末端に、分析対
    象である特定の核酸とはハイブリダイズできないが、該
    プローブを捕捉する捕捉用ＤＮＡとはハイブリダイズ可
    能な捕捉配列が付加しており、(2) かつ、捕捉配列末端
    から非塩基部位に至る部分は、分析対象である特定の核
    酸と相補的な配列を有し、(3) 更に、該非塩基部位から
    捕捉配列と反対側の末端に至る部分は、分析対象である
    特定の核酸とハイブリダイズするが該捕捉用ＤＮＡとは
    ハイブリダイズしない配列からなることを特徴とする１
    本鎖ＤＮＡを用い、該捕捉用ＤＮＡとして、該プローブ
    とハイブリダイズする部分の該配列側に隣接して、検出
    可能な分子を含む標識プローブとハイブリダイズする領
    域を有する１本鎖ＤＮＡを用い、捕捉用ＤＮＡに捕捉さ
    れた標識プローブを検出することを含む、請求項２１に
    記載の方法。
26. 【請求項２６】 所定の配列を持つ標識オリゴヌクレオ
    チドに相補的な塩基配列、および切断されたプローブと
    相補的な塩基配列を有する１本鎖領域を隣接して有し、
    更に該１本鎖領域に連続する２本鎖領域を有するＤＮＡ
    によって、切断されたプローブと標識オリゴヌクレオチ
    ドとを捕捉することを特徴とする請求項２２に記載の方
    法。
27. 【請求項２７】 ターミナルトランスフェラーゼで検出
    可能なヌクレオチドを付加させることを特徴とする請求
    項１１に記載の方法。
28. 【請求項２８】 リガーゼにより検出可能な分子を有す
    るヌクレオチドを結合させることを特徴とする請求項１
    １に記載の方法。
29. 【請求項２９】 試料中の特定の核酸とハイブリダイズ
    可能であり、非塩基部位の５´側および３´側にＤＮＡ
    を結合した構造を持ち、該非塩基部位は該プローブが該
    特定の核酸とハイブリダイズしたときのみＡＰエンドヌ
    クレアーゼによって切断可能であることを特徴とするプ
    ローブを含む、核酸を分析するためのキット。