JPH0824580B2 - 新規コスミドベクタ− - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子操作技術に関し、さらに詳しくは遺伝
子操作技術を使つて作成した新規コスミドベクターに関
する。

ヒトをはじめとする哺乳動物の遺伝子の大きさは20キ
ロ塩基対（以下キロ塩基対をKbpと略す）を越えるもの
が少なくない。現在、広く使われているラムダベクター
にクローン化できるDNAの大きさは20Kbpなので、これよ
り大きい遺伝子全体を機能のある形でクローン化するこ
とはできない。

ラムダフアージのcohesive end site（以下cosと略
す）を有するベクター、すなわちコスミドベクターを使
えば35〜45Kbpの大きさのDNAをクローン化できる。種々
のベクターの中で、コスミドベクターが最つとも大きい
長さのDNAをクローン化できるが、長いゲノムDNAの調製
がむづかしいことや、インサートのないベクターだけの
バツクグランドが高いこと、また効率が良くないことな
どが障害になつて、コスミドベクターの利用は進まなか
つた。ところが、Ish−Horowicz ＆ Burkeはホスフアタ
ーゼを利用してベクターに方向性を持たせる工夫をし、
ベクターだけのバツクグランドの値を下げるとともにク
ローン化の効率を上げることに成功した〔D.Ish−Horow
icz ＆ J.F.Burke,Nucleic Acids Res.,9,2889,（198
1）〕。

Ish−Horowicz ＆ Burke法によるゲノムDNAの遺伝子
バンクの製造法は以下のようである（たとえば、現在、
広く使われているコスミドベクターの１つであるpJB−
８を例にとる）。pJB−８は5.44Kbpの大きさで、制限酵
素BamHI,HindIII,SalIでそれぞれ１カ所切断され、ラム
ダフアージのcosを１個有するコスミドベクターであ
る。、pJB−８をHindIIIで切断することによつて直線
状DNAとし、次にホスフアターゼ処理によつてHindIIIの
切断片を不活化する。そして、BamHIで切断することに
よつて２個のDNA断片が得られ、cosを含む大きなDNA断
片（5.4Kbp）をアガロースゲル電気泳動法によつて単離
する。得られたcosを含むDNA断片（5.4Kbp）が、ラムダ
フアージの左腕に相当する。、pJB−８をSalIで切断
することによつて直線状DNAとし、次にホスフアターゼ
で処理することによつてSalIの切断片を不活化する。そ
して、BamHIで切断することによつて２個のDNA断片が得
られ、cosを含む小さなDNA断片（2.34Kbp）をアガロー
スゲル電気泳動法によつて単離する。得られたcosを含
むDNA断片（2.34Kbp）が、ラムダフアージの右腕で相当
する。、たとえば、ヒトのゲノムDNAを制限酵素Sau3A
もしくはMboIで部分的に切断し、35〜45Kbpの大きさのD
NA断片を分画する。この35〜45Kbpの大きさのDNA断片
を、とで別々に調製した左腕と右腕との間に、連結
酵素（Ｔ−４−DNAリガーゼ）で挿入させて、組み換え
体DNAを調製する。、組み換え体DNAをin vitroパツケ
ージングで形質導入フアージ粒子に変え、次いで大腸菌
に感染させることによりヒトのゲノムDNAの遺伝子バン
クが製造できる。

以上がIsh−Horowicz ＆ Burke法によるゲノムDNAの
遺伝子バンクの製造法であるが、次の３つの問題点があ
る。第１に、pJB−８はcosが１つしかなく、左腕と右腕
とを別々に調製しなければならない。第２に、左腕と右
腕について、それぞれcosを含むDNA断片をアガロースゲ
ル電気泳動で分離しなければならない。第３に、pJB−
８の左腕の長さは5.4Kbp、右腕の長さは2.34Kbpであ
り、左腕と右腕との長さが異なるので、35〜45Kbpのゲ
ノムDNAに連結する確率も異なり、左腕と右腕の混合す
る比率を検討しなければならない。

本発明者らは、これらの問題点を解決するために、同
一の方向性を持つたラムダフアージのcosを２個有し、
２種類の制限酵素で切ることによつて、それぞれcosを
１個づつ持つた長さのほぼ等しい右腕と左腕が等モルで
きることを特徴とする新規コスミドベクターを作成した
〔第36回日本細胞生物学会大会、講演要旨集、93,94ペ
ージ（1983）〕。

本発明のコスミドベクターは、同一分子内に同一の方
向性を持つた２個のcosが存在し、２種類の制限酵素で
切ることによつて、それぞれcosを１個づつ持つた長さ
のほぼ等しい右腕と左腕が等モルできるので、左腕と右
腕とを別々に調製する必要がなく、アガロースゲル電気
泳動で分離する必要もない。さらに、右腕と左腕の長さ
がほぼ等しいので、35〜45KbpのゲノムDNAにT4−DNAリ
ガーゼによつて連結される程度もほぼ等しいと考えてよ
く、２種類の制限酵素で切断してできた右腕と左腕の等
モル混合物を、そのまま35〜45KbpのゲノムDNAと連結す
れば、組み換え体DNAの半分が形質導入フアージ粒子に
変り得ることが期待できる。このように、本発明のベク
ターを用いれば、35〜45KbpのDNA断片として、ゲノムDN
Aの遺伝子バンクをより簡単、かつより効率よく製造で
きる。

本発明の新規コスミドベクターの１つであるpDcos Ap
^r/oriを第１図に示す〔第36回日本細胞生物学会大会、
講演要旨集93ページ（1983）〕。pDcos Ap^r/oriは、フ
アージベクターであるCharon4A由来の同一方向性のある
cos2個と、Tn903由来のネオマイシン耐性遺伝子（ne
o^r）〔Oka,Sugisaki ＆ Takanami,J.Mol.Biol.,147,217
（1981）〕、pBR−327由来のアンピシリン耐性遺伝子
（Ap^r）及び複製開始点（ori）〔Soberon,Cavarrubias
＆ Bolivar,Gene,9,287（1980）〕とからなる。大きさ
は4.7Kbpであり、制限酵素PvuII、Bam HI、PstIによつ
てそれぞれ１カ所、制限酵素Bst EIIによつて２カ所、
制限酵素Eco RIによつて３ケ所切断される。このベクタ
ーは次のような特徴を有する。、同一の方向性を持つ
た２つのcosがある。、Bam HIサイトにSau3Aもしくは
MboIなどで限定消化した35〜45KbpのゲノムDNAをクロー
ン化できる。、インサートはBam HIサイトの両側にあ
るEco RIサイトを切ることによつてベクターから切り出
すことができる。、PvuIIでベクターを切断し、ホス
フアターゼ処理することによつて、ベクターに方向性を
持たせ、さらにBam HIサイトを切ることによつて、等モ
ルの右腕と左腕ができる。T4−DNAリガーゼを使つ
て、Sau3AもしくはMboIなどで限定消化した35〜45Kbpの
ゲノムDNAの両側に、ベクターの右腕と左腕をBam HIサ
イトで連結し、組み換え体DNAを、in vitroパツケージ
ングによつて形質導入フアージ粒子に変換し、次いで大
腸菌に感染させることができる。この形質導入体DNA
は、ベクター由来のAp^rとoriを含むので、アンピシリン
で選択することによつて、組み換え体DNAをプラスミド
として持つ大腸菌のみを選択的に生かすことができる。
また、本ベクターを用いるゲノムDNA（外来DNA）の遺伝
子バンクの製造法を示せば以下のようになる（第２図参
照）。、pDcos Ap^r/oriをPvuIIで切断することによつ
て直線状DNAとし、次にホスフアターゼ処理によつてPvu
IIの切断片を不活化する。そしてBam HIで切断すること
によつて、それぞれcosを１個づつ持つた長さがほぼ等
しい右腕と左腕とを調製する。、外来DNAをSau3Aもし
くはMboIなどで限定消化し、35〜45Kbpの大きさのDNA断
片を調製する。、35〜45KbpのゲノムDNA断片をで調
製した左腕と右腕との間にT4−DNAリガーゼで挿入させ
て、組み換え体DNAを調製する。、組み換え体DNAをin
vitroパツケージングで形質導入フアージ粒子に変え、
大腸菌に感染させる。、形質導入したアンピシリン耐
性大腸菌をアンピシリンで選択することによつて、組み
換え体DNAをプラスミドとして持つ大腸菌のみを生かす
ことができる。このようにしてゲノムDNAの遺伝子バン
クを製造することができる。

また、本発明者らはトランスホーマント細胞から遺伝
子回収を目的とするコスミドベクター、pDcos Tc^r（第
３図）、pDcos Tc^r/ori（第４図）の作成に成功した
（第36回日本細胞生物学会大会、講演要旨集、94ページ
（1983）〕。哺乳動物の培養細胞への遺伝子移入を利用
して哺乳動物のマーカー遺伝子を単離することができ
る。その際、培養細胞に遺伝子移入したDNA配列をトラ
ンスホーマント細胞から大腸菌に回収する作業がある
が、本発明に包含される新規コスミドベクターpDcos Tc
^r及びpDcos Tc^r/oriは、この遺伝子回収のために有用な
ベクターである。pDcos Tc^rはCharon4A由来の同一の方
向性のあるcos2個と、pBR−327由来のテトラサイクリン
耐性遺伝子（Tc^r）及び複製開始点（ori）とからなる。
pDcos Tc^r/oriは、同様にcos2個と、pBR−327由来のTc^r
及びoriと、スペーサーとしてのSV−ジヒドロ葉酸リダ
クターゼ遺伝子（SV−dhfr）〔Subramani,Mulligan ＆
Berg,Mol.Cell.Biol.,1,854（1981）〕とからなる。こ
れらのベクターは、先に述べたpDcosAp^r/ori（第１図）
と同様な特徴を有しており、同様にこれらを用いてゲノ
ムDNAの遺伝子バンクを製造することができるが、Bam H
Iサイトの代りにBglIIサイトにSau3AもしくはMboIなど
で限定消化した35〜45KbpのゲノムDNAをクローン化でき
る点が異なつている。pDcos Tc^rで作成した形質導入フ
アージ粒子はプラスミドのoriを持たないので、大腸菌
に感染しても増殖できない。目的の遺伝子の近傍にori
がある場合にのみテトラサイクリン耐性（Tc^r）のクロ
ーンとして目的の遺伝子を大腸菌に回収することができ
る。一方、pDcosTc^r/oriで作成した形質導入フアージ粒
子は、oriとTc^rマーカーを持つており、Tc^rクローンと
してゲノムDNAの遺伝子バンクを作成することができ
る。もし、目的の遺伝子の近傍にAp^rなどの薬剤耐性マ
ーカーがあれば、アンピシリン耐性（Ap^r）などの薬剤
耐性クローンとして目的のものだけを選択的に大腸菌に
回収できる。

さらに、本発明者らは哺乳動物細胞に対する選択マー
カーを持つていて、哺乳動物細胞への遺伝子移入を目的
とするコスミドベクター、pDcosAp^r/ori/gpt/TK（第５
図）を作成した。pDcosAp^r/ori/gpt/TKは、Charon4A由
来の同一方向性のあるcos2個と、pBR−327由来のAp^r及
びori、スペーサーとしてのpSV2−dhfr由来のSV−dhfr
遺伝子、pSV2−gpt由来のgpt遺伝子〔Richard,Mulligan
＆ Berg,Mol.Cell.Biol.,1,449（1981）〕、及びpTK−
４由来のTK遺伝子〔Ishiura,M.,etal.,Mol.Cell.Biol.,
2,607（1982）〕とからなる。このコスミドベクター
は、前記したpDcosAp^r/oriと同様に、ゲノムDNAの遺伝
子バンクを製造できる。すなわち、同一の方向性を持つ
た２個のcosがあり、PvuIIとBamHIで切断することによ
り、cosを１個づつ持つた長さがほぼ等しい右腕と左腕
とが等モルでき、BamHIサイトに35〜45KbpのゲノムDNA
を挿入させた組み換え体DNAを作成できる。そして、こ
の組み換え体DNAは、in vitroパツケージングによつて
形質導入フアージ粒子に変換し、大腸菌に移すことがで
き、組み換え体DNAはベクター由来のAp^rとoriを含むの
で、組み換え体DNAを含む大腸菌は、アンピシリンで選
択することによつて、アンピシリン耐性クローンとして
得ることができる。さらに、この組み換え体プラスミド
は、gpt遺伝子とTK遺伝子を持つので、哺乳動物の培養
細胞への遺伝子移入した際に、キサンチングアニンホス
ホリボシルトランスフエラーゼ（gpt）活性もしくはチ
ミジンキナーゼ（TK）活性をマーカーとすることによつ
て、ベクター由来の組み換え体DNAの挿入の判定が培養
細胞のレベルで可能であるという利点がある。

本発明に用いられるcosとしては、ラムダフアージま
たはラムドイドフアージ由来のものが挙げられる。特
に、ラムダフアージ由来のcosが好ましいものとして挙
げられる。

本発明のベクターは、２種類の制限酵素で切ることに
よつて、それぞれcosを１個づつ持つた右腕と左腕がで
きるのであるが、この２種類の制限酵素の組み合せとし
ては、PvuIIとBamHI,PvuIIとBglII,ClaIとBamHI,ClaIと
BglIIなどを挙げることができる。勿論この他にも組合
せは考えることができるので、これらに限定されるもの
ではない。

本発明のベクター中には、ベクター由来のDNA断片が
挿入されたことを、判定するためには一般的に薬剤耐性
による選択が行われる。従つて、本発明のベクター中に
も薬剤耐性を発現するDNA断片が組み込まれていること
が好ましい。薬剤耐性としては、アンピシリン耐性、テ
トラサイクリン耐性、ネオマイシン（カナマイシン）耐
性、もしくはクロラムフエニコール耐性など通常の抗生
物質耐性が挙げられる。pDcos Ap^r/oriはアンピシリン
耐性遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を持ち、pDcosT
c^rとpDcosTc^r/oriはテトラサイクリン耐性遺伝子を有し
ている。pDcosAp^r/ori/gpt/TKはアンピシリン耐性遺伝
子を持つている。

本発明のベクターを用いてゲノムDNA（外来DNA）の遺
伝子バンクを製造し、哺乳動物の培養細胞へ遺伝子（遺
伝子バンク）移入する際には、ベクター由来のDNA断片
が挿入されたことを判定するために特定の生理機能を発
現するDNA断片が本発明のベクター中に組み込まれてい
るのが好ましい。特定の生理機能を発現せしめる遺伝子
としては、アミノグリコシド３′−ホスホトランスフェ
ラーゼ（neo）遺伝子〔Oka,Sugisaki＆Takanami,J.Mol.
Biol.,147,217（1981）〕、チミジンキナーゼ（TK）遺
伝子〔Wigler,M.etal.,Cell,14,725（1978）、アデニン
ホスホリボシルトランスフエラーゼ（APRT）遺伝子〔Wi
gler,M.,etal.,Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76,1373（19
79）〕、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトラン
スフエラーゼ（HGPRT）遺伝子〔Graf,L.H.Jr.,etal,Som
at.Cell.Genet.,5,1031（1979）〕、キサンチングアニ
ンホスホリボシルトランスフエラーゼ（XGPRT又はgpt）
遺伝子〔Berg,P.,etal.Mol.Cell.Biol.,1,449（198
1）〕などが挙げられる。本発明の新規コスミドベクタ
ーpDcosAp^r/ori/gpt/TKはgpt遺伝子とTK遺伝子を有して
いる。

さらに、本発明のベクター中には、ColEI由来の複製
機能を有する遺伝子画分を有することが好ましい。

本発明において用いられる外来DNAの例としては、細
菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物もしくは各
種フアージ等に由来するDNAが挙げられる。

また、本発明において用いられる制限酵素（DNA断片
の特定の塩基配列部位を選択的に切断する機能を有する
酵素）や制限酵素により切断されて生じるDNA接着末端
と、これを相補的な関係のある他のDNA断片接着末端を
結合させる為に用いる酵素（リガーゼ）、あるいは互い
に相補的でないDNA末端同志を結合させるためにDNA末端
同志を互いに相補的な接着末端にする酵素、あるいはこ
れらを結合させるリガーゼについてはすでに良く知ら
れ、数多くの酵素が市販され、それらを用いる手法等に
ついても広く開示されている〔Molecular Cloning,Cold
Spring Harbor Laboratory,Maniatis,T.,etal.,（198
2）〕ので、それらを利用すればよい。

本発明のベクターを用いることによつて、ヒトをはじ
めとする哺乳動物のガンや遺伝病などを分子レベルで解
析することがより容易となるであろう。たとえば、ヒト
の正常細胞由来のゲノムDNAの遺伝子バンクをpDcos Ap^r
/oriで作成し、この遺伝子バンクで遺伝病細胞をトラン
スホーム（正常化）し、トランスホーマント細胞を得
る。トランスホーマント細胞からゲノムDNAを抽出し、p
DcosTc^rもしくはpDcosTc^r/oriでゲノムDNAの遺伝子バン
クを作成し、目的の遺伝子を回収する。目的の遺伝子を
種々の面から検討することによつて、ヒトの遺伝病を分
子レベルで解析することができる。

また、本発明のベクターを用い、ゲノムDNA（外来DN
A）の遺伝子バンクを作成することによつて、有用物質
を発現せしめる特定の遺伝子を効率よく見い出すことが
可能である。この特定の遺伝子とは、細菌、糸状菌、酵
母などの微生物、高等動植物あるいは各種フアージ等に
由来するDNAがあり、具体的な有用物質としては、例え
ば各種ホルモン、酵素、さらには抗生物質やアミノ酸な
どの合成系酵素等が挙げられる。

以下、実施例を示して本発明をいつそう詳細に説明す
る。

実施例１ pDcosTc^rの作成及び調製（第６図） （ａ）pAPcosの作成及び調製 ｉ）作成 フアージベクターであるCharon4A由来のcosを１個有
するコスミドベクターであるpHC79〔Hohn ＆ Collins,G
ene,11,291（1980）〕20μｇを、反応混液200μｌ（10m
MTris−HCl（pH7.6）、12mM MgCl₂、10m MDTT、100μg/
ml BSA（ウシ血清アルブミン）で、29.9ユニツトの制限
酵素BalI（New England Biolabs社製）と37℃で２時間
反応させて完全に消化したのち、さらに反応混液500μ
ｌ（150mM NaCl,6mM Tris−HCl（pH7.9）、6mM MgCl₂、
6mMDTT、100μg/μl BSA〕で、41.1ユニツトの制限酵素
Bst EII（New England Biolabs社製）と60℃で２時間反
応させて完全に消化した。反応終了後、等量の水飽和フ
エノールで抽出を行ない、水層をセカンダリブタノール
で濃縮後、0.1倍容量の3M酢酸ナトリウムと２倍容量の
エタノールを加えて、DNAを沈澱として得、95％エタノ
ールで洗つたのち、水流ポンプで乾燥を行ない、沈澱を
10mM Tris−HCl（pH8.0）、0.1mMEDTAからなる水溶液
（以下10t/0.1Eと略す）14μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解
させた。

次に、このBalI及びBstEIIで消化したDNA溶液１μｌ
（〜１μｇ）を反応混液25μｌ〔50mM Tris−HCl（pH7.
2）、10mMMgSO₄、0.1mM DTT、50μg/mlBSA、80μM dCT
R、80μMdGDP、80μM dATP、80μMdTTp〕で、２ユニツ
トのKlenow酵素（Boehringer Mannheim社製）と22℃で3
0分間反応させて、互いに相補鎖が存在する２本鎖DNA断
片（cohesive end）を両端がそろつた２本鎖DNA断片（b
lunt end）に変えた。反応終了後、反応液を65℃で10分
間熱処理してKlenow酵素を失活させた。

そして、この液10μｌ（DNA〜0.4μｇ）を反応混液50
μｌ（50mM Tris−HCl（pH7.4）、10mM MgCl₂、10mMDT
T、1mMスペルミジン、1mM ATP、100μg/mlBSA）で、15
ユニツトのT4−DNAリガーゼ（New England Biolabs社製
と12℃で17.5時間反応させて、cos及びori,Ap^r ₁Tc^rを含
むDNA断片（4.75Kbp）を閉環化させた。反応終了後、フ
エノール抽出を行なつたのち、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに
溶解させた。

ii）トランスホーメーシヨン このDNA溶液10μｌを大腸菌HB101のcompetent cell 1
00μｌ（対数増殖期の大腸菌HB101を０〜４℃で0.1M Ca
Cl₂溶液で15分間処理後、もとの培養液の1/10溶量の0.1
M CaCl₂/14％glycerol溶液に再懸濁し、−70℃に保存）
とよく混合し、０℃で10分間、続いて37℃で５分間保温
して、DNAを大腸菌内に取りこませたのち、これにＬ−
ブロス（１％Bactotryptone,0.5％酵母エキス0.5％NaC
l,0.1％グルコース）2mlを加えて、37℃で１時間振盪培
養した。この菌体懸濁液を20μg/mlのアンピシリン及び
20μg/mlのテトラサイクリンを含むＬ−プレート（Ｌ−
ブロースに寒天を１％添加したプレート）上にまき、37
℃で24〜48時間培養し、アンピシリン及びテトラサイク
リン耐性のクローンを得た。

iii）少量培養、及び少量DNA調製 Ap^r ₁Tc^rであるクローンをＬ−ブロス2ml中（Ap20μg/
ml含有）で37℃、１晩振盪して、増殖させた。培養液1.
5mlをエツペンドルフチユーブにとり、机上遠心分離機
にかけて集菌後、この菌体を抽出液（８％シヨ糖、0.5
％TritonX−100,50mMEDTA（pH8.0）、10mM Tris−HCl
（pH8.0））0.35mlに再懸濁させた。次に、リゾチーム
溶液25μｌ〔10mg/ml、10mM Tris−HCl（pH8.0）〕を加
え混合したのち、チユーブを沸騰水中に40秒間おいた。
そして、直ちにチユーブを４℃にて遠心分離機（21,000
rpm、15分間）にかけて上澄液を得、これにRNaseA溶液
（20mg/ml、10t/0.1E）0.5μｌを加えて37℃で１時間保
温してRNAを分解させた。その後、フエノール抽出で除
蛋白後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1
E20μｌに溶解させて、プラスミドDNA溶液を得た。

iv）プラスミドDNAの特性化 そして、このプラスミドDNA溶液１μｌ又は２μｌを
制限酵素EcoRI,BstEII,BglII,PvuIIなどで消化したの
ち、0.4〜1.5％アガロースゲル電気泳動〔40mM Tris,20
mM酢酸ナトリウム、2mM EDTA（pH8.15）;10mA,12〜24時
間〕にかけた。分解されたDNA断片は臭化エチジウム染
色と長波長紫外線照明によつて検出できる。このように
して、プラスミドDNAの制限地図を作成することによつ
て、各クローンが持つているプラスミドDNAを特性化し
た。そして、PHC79のBalIサイトとBstEIIサイトの間のD
NA断片（1.68Kbp）を欠いたプラスミド:pAPcos（第６
図）を持つ大腸菌を得た。

Ｖ）大量培養、及びプラスミドDNAの調製 この大腸菌を、TYG−Ｐ培地（１％Bactotryptone,0.1
％酵母エキス、0.2％グルコース、0.1％ NH₄Cl,0.3％
NaCl,0.01％ Na₂SO₄,0.08％MgCl₂・６H₂O,1.52％ Na₂
HPO₄・12H₂O,0.3％ KH₂PO₄）１中で（Ap20μg/ml含
有）、37℃で振盪培養し、600nmでの吸光度（A600）が
1.0になつた時点で、クロラムフエニコールを100μg/ml
の濃度になるように添加し、さらに15時間37℃で振盪培
養した。培養終了後、遠心分離機（6,000rpm,10分間）
にかけて集菌を行ない、次に菌体を25％シヨ糖、50mM T
ris−HCl（pH8.0）からなる等張緩衝液18mlに再懸濁し
た。これに、リゾチーム溶液〔5mg/ml、0.25M Tris−HC
l（pH8.0）〕3.6mlを加え、おだやかに混合し、０℃で
５分間おいたのち、0.25MEDTA（pH8.0）溶液7.2mlを加
え、おだやかに混合し、０℃で５分間おいた。その後、
10％SDS溶液2.7mlと5M NaCl溶液8.1mlとを加えおだやか
に混合し、０℃で１晩おいたのち、遠心分離機（20,000
rpm,45分間）にかけて粗溶菌液（cleared lysate）〜39
mlを得た。この粗溶菌液に、RNaseA溶液（20mg/ml,10t/
0.1E）20μｌを加えて37℃にて１時間保温してRNAを分
解させたのち、フエノール抽出で除蛋白を行ない、さら
にセフアロース2Bのゲルロ過にかけた。プラスミドDNA
を含むボイドフラクシヨンから、DNAをエタノール沈澱
として得、次にDNAを塩化セシウム−臭化エチジウム溶
液〔1M Tris−HCl（pH8.0）0.375ml、0.25MEDTA（pH8.
0）0.30ml、H₂O6.45ml、CsCl7.5g、EtBr溶液（4mg/ml）
0.375ml〕で平衡密度勾配遠心（60,000rpm12時間）にか
けた。そうすると、共有結合で閉鎖された環状のプラス
ミドDNA（ccc−DNA）は、遠沈管中で長波長紫外線照射
下において、線状のプラスミドDNA及び染色体のけい光
帯の下にバンド状に見えてくる。このccc−DNAのバンド
を分画し、CsCl水溶液で飽和したイソプロパノールで抽
出を行なつて、臭化エンジウムを取り除いた後、10t/0.
1E 1に対して透析を行なつた。そして、透析内液か
ら、ccc−DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.
1E2mlに溶解させてpAPcosのプラスミドDNA溶液（0.418m
g/ml）を調製した。

（ｂ）pAPcosΔ（EcoRI）の作成及び調製 pAPcos10μｇを反応混液100μｌ（100mM Tris−HCl
（pH7.5）、50mM NaCl、5mM MgCl₂、100μg/ml BSA）
で、60.6ユニツトの制限酵素EcoRI（New England Biola
bs社製）と37℃で２時間反応させて完全に消化した。そ
して、フエノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μｌ）に
溶解させた。

次に、このEcoRIで消化したDNA溶液１μｌ（〜１μ
ｇ）を反応混液25μｌ（50mM Tris−HCl（pH7.2）、10m
M MgSO₄、0.1mM DTT、50μg/mlBSA、80μM dATP,80μM
dCTP,80μM dGTP,80μM dTTP）で、２ユニツトのKlenow
酵素と22℃で30分間反応させて、cohesive endをblunt
endに変えた。そして、反応液を65℃で10分間熱処理し
てKlenow酵素を失活させた。

次に、このDNA溶液10μｌ（〜0.4μｇ）を反応混液50
μｌ（50mM Tris−HCl（pH7.4）、10mM MgCl₂、10mM DT
T,1mMスペルミジン、1mMATP,100μg/mlBSA）で、15ユニ
ツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉
環化したのちフエノール抽出を行ない、DNAをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を0.1MT ris−HCl（pH7.5）溶液2
0μｌに溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）とトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rかつTc^rクローンを得
た。次に、これらのクローンについて少量培養及び少量
DNA調製を行なつたのち、各クローンのもつプラスミドD
NAの特性を調べて、pAPcosのEcoRIサイトを欠いたプラ
スミド:pAPcosΔ（EcoRI）（第６図）を持つ大腸菌を得
た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpAPcosΔ（EcoR
I）のプラスミドDNAを調製した。

（ｃ）pHPcosの作成及び調製 pAPcosΔ（EcoRI）20μｇを、反応混液200μｌ〔60mM
NaCl,6mM Tris HCl（pH8.0）、10mM MgCl₂ 6mM DTT,10
0μg/mlBSA〕で75.8ユニツトの制限酵素AvaI（New Engl
and Biolabs社製）と37℃で２時間反応させて完全に消
化したのち、さらに反応混液500μｌ〔60mM NaCl,7mM T
ris−HCl（pH7.4）、7mM MgCl₂,100μg/mlBSA〕で、101
ユニツトの制限酵素HindIII（New England Biolabs社
製）と37℃で２時間反応させて完全に消化した。そし
て、フエノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱
として得、沈澱を10t/0.1E 14μｌ（〜１μg/μｌ）に
溶解させた。

次に、このAvaIとHindIIIで消化したDNA溶液１μｌ
（〜１μｇ）を、反応混液25μｌで、２ユニツトのKlen
ow酵素と22℃で30分間反応させて、cohesive endをblun
t endに変えた。そして、反応液を65℃で10分間熱処理
してKlenow酵素を失活させた。

次に、このDNA溶液10μｌ（〜0.4μｇ）を反応混液50
μｌで、15ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時
間反応させて、cos及びori,Ap^rを含むDNA断片（3.75Kb
p）を閉環化させた（HindIIIサイトは再構成される）。
その後、フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μ
ｌに溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rかつTc^s（テトラサイ
クリン感受性）クローンを得た。次でこれらのクローン
のもつプラスミドDNAの特性を調べて、pAPcosΔ（EcoR
I）のAvaIサイトとHindIIIサイトの間のDNA断片（1Kb
p）を欠いたプラスミド:pHPcos（第６図）を持つ大腸菌
を得た。

この大腸菌をTYG−Ｐ培地１中で増殖させたのち、
菌体よりccc−DNAを分離精製してpHPcosのプラスミドDN
Aを調製した。

（ｄ）pHBglIIcosの作成及び調製 pHPcos10μｇを、反応混液100μｌ〔60mM NaCl,6mM T
ris−HCl（pH7.5）、6mM MgCl₂ 6mM DTT,100μg/mlBS
A〕で、51.2ユニツトの制限酵素PvuII（Takara社製）と
37℃で２時間反応させて完全に消化した。（blunt en
d）。そして、フエノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μ
ｌ）に溶解させた。

次に、このPvuIIで消化したDNA溶液0.4μｌ（〜0.4μ
ｇ）とBglIIリンカー〔ｄ（pC−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−
Ｔ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液20μｌ〔50mM Tris−H
Cl（pH7.4）、10mM MgCl₂,10mM DTT,1mMスペルミジン、
1mM ATP,100μg/mlBSA〕で、６ユニツトのT4−DNAリガ
ーゼと22℃で６時間反応させて連結した。その後フエノ
ール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を、反応混液250μｌ〔60mM NaCl,10mM T
ris−HCl（pH7.4）、10mM MgCl₂,10mMDTT,100μg/mlBS
A〕で、200ユニツトの制限酵素BglII（Takara社製）と3
7℃で４時間反応させて消化したのち、0.8％調製用アガ
ロースゲルにかけて、10mAで12時間電気泳動した。分解
されたDNA断片は臭化エチジウム染色と長波長紫外線照
明によつて見えてくる。cos及びori,Ap^rからなるDNA断
片（2.55Kbp）を含有するゲルを切り出したのち、５倍
容量の抽出液（0.5M NH₄OAc,1mM EDTA（pH7.5）：水飽
和フエノール＝1:1）の存在下で、ゲルをすりつぶしてD
NAを溶出させた。そして、溶出液をセカンダリーブタノ
ールで濃縮後、0.1倍容量の3M酢酸ナトリウムと２倍容
量のエタノールを加えてDNAを沈澱として得た。

このDNA沈澱を反応混液20μｌで、６ユニツトのT4−D
NAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて、cos及びori,A
p^rからなるDNA断片（2.55Kbp）を閉環化させた。その
後、フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに
溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次
で、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調
べて、pHPcosのPvuIIサイトにBglIIリンカーを挿入させ
たプラスミド:pHBglIIcos（第６図）を持つ大腸菌を得
た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１で増殖させたのち、
菌体よりccc−DNAを分離精製してpHBglIIcosのプラスミ
ドDNAを調製した。

（ｅ）pAPcos（BglII）の作成及び調製 pAPcos10μｇを、反応混液100μｌで60.6ユニツトのE
coRIと37℃で２時間反応させて消化した。そして、フエ
ノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させ
た。

次に、このEcoRIで消化したDNA溶液１μｌ（〜１μ
ｇ）を、反応混液25μｌで、２ユニツトのKlenow酵素と
22℃で30分間反応させて、cohesive endをblunt endに
変えた。そして反応液を65℃で10分間熱処理してKlenow
酵素を失活させた。

次に、このDNA溶液10μｌ（0.4μｇ）とBglIIリンカ
ー〔ｄ（pC−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ）〕２μｇと
を、反応混液20μｌで、６ユニツトのT4−DNAリガーゼ
と22℃で６時間反応させて連結した。

そして、この反応液10μｌを、反応混液50μｌで、15
ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させ
て、cos及びori,Ap^r．Tc^rからなるDNA断片（4.75Kbp）
を閉環化させた。その後、フエノール抽出を行ないDNA
をエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH
7.5）溶液20μｌに溶解させた。

このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトランスホー
メーシヨンしたのち、Ap^rかつTc^rクローンを得た。次い
で、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調
べて、pAPcosのEcoRIサイトにBglIIリンカーを挿入させ
たプラスミド:pAPcos（BglII）（第６図）を持つ大腸菌
を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpAPcos（BglII）
のプラスミドDNAを調製した。

（ｆ）pDcos Ap^r／Tc^r（2BglII）の作成及び調製 pAPcos（BglII）20μｇを、反応混液200μｌで202ユ
ニツトのBglIIと37℃で２時間反応させて消化したの
ち、0.8％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、cos
及びTc^rを含むDNA断片（1.86Kbp）を分離精製して、DNA
をエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 5.5μｌ
（〜１μg/μｌ）に溶解させた。

一方、pHBglIIcos10μｇを、反応混液100μｌで94ユ
ニツトのBglIIと37℃で２時間反応させて消化した。そ
してフエノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱
として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μｌ）に溶
解させた。

そして、pAPcos（BglII）のcos及びTc^rを含むBglII断
片のDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）と、pHBglIIcosをBglII
で消化したDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）とを、反応混液2
0μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間
反応させて連結した。その後、フエノール抽出を行な
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−
HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させた。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラン
スホーメーシヨンしたのち、Ap^rかつTc^rクローンを得
た。次いでこれらのクローンのもつプラスミドDNAの特
性を調べて、同一の方向性を持つたcosを２個有するプ
ラスミド:pDcos Ap^r／Tc^r（2BglII）（第６図）を持つ
大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpDcos Ap^r／Tc
^r（2BglII）のプラスミドDNAを調製した。

（ｇ）pDcos Ap^r／Tc^rの作成及び調製 pDcos Ap^r／Tc^r（2BglII）10μｇを反応混液100μｌ
で、11.0ユニツトのBglIIと37℃で30分間反応させて限
定消化した。次で、フエノール抽出で除蛋白後、DNAを
エタノール沈澱として得た。このDNA沈澱を反応混液100
μｌで21.8ユニツトのPvuIIと37℃で２時間反応させて
完全に消化したのち、0.8％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、２個のcos及びori,Ap^r，Tc^rを含むDNA断
片（4.2Kbp）を分離精製して、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を10t/0.1E 6.5μｌ（〜１μg/μｌ）に溶
解させた。

次に、このDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）を、反応混液2
5μｌで、２ユニツトのKlenow酵素と22℃で30分間反応
させて、cohesive endをblunt endに変えた。そして、
反応液を65℃で10分間熱処理してKlenow酵素を失活させ
た。

次に、このDNA溶液10μｌ（0.4μｇ）とPvuIIリンカ
ー〔ｄ（pC−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ）〕２μｇと
を、反応混液20μｌで、６ユニツトのT4−DNAリガーゼ
と22℃で６時間反応させて連結した。

そして、この反応液10μｌを、反応混液50μｌで、15
ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させ
て、２個のcos及びori,Ap^r，Tc^rからなるDNA断片（4.2K
bp）を閉環化させた。その後、フエノール抽出を行な
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−
HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させた。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラン
スホーメーシヨンしたのち、Ap^rかつTc^rクローンを得
た。そして、これらのクローンのもつプラスミドDNAの
特性を調べて、pDcos Ap^r／Tc^r（2BglII）のPvuIIサイ
トとBglIIサイトの間のDNA断片（0.2Kbp）を欠いたプラ
スミド:pDcos Ap^r／Tc^r（第６図）を持つ大腸菌を得
た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpDcos Ap^r／Tc^rの
プラスミドDNAを調製した。

（ｈ）pDcos Ap^r／Tc^r・XhoI^aの作成及び調製 pDcos Ap^r／Tc^r 10μｇを反応混液100μｌで、42.9ユ
ニツトのAvaIと37℃で２時間反応させて消化した。そし
て、フエノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱
として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μｌ）に溶
解させた。

次に、このAvaIで消化したDNA溶液１μｌ（〜１μ
ｇ）を、反応混液25μｌで、２ユニツトのKlenow酵素と
22℃で30分間反応させて、cohesive endをblunt endに
変えた。そして反応液を65℃で10分間熱処理してKlenow
酵素を失活させた。

このDNA溶液10μｌ（0.4μｇ）と、XhoIリンカー〔ｄ
（pC−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ）〕２μｇとを、反
応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼと22℃で
６時間反応させて連結した。その後、フエノール抽出を
行ない、DNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を、反応混液600μｌ（150mM NaCl,6mM T
ris−HCl（pH7.9）、6mM MgCl₂,6mM DTT,100μg/m lBS
A）で、1000ユニツトのXhoI（New England Biolabs社
製）と37℃で４時間反応させて消化したのち、0.8％調
製用アガロースゲル電気泳動にかけて、２個のcos及びo
ri,Ap^r，Tc^rを含むDNA断片（4.2Kbp）を分離精製して、
DNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を反応混液20μｌで、６ユニツトのT4−D
NAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉環化したの
ち、フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに
溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rかつTc^rクローンを得
た。次で、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特
性を調べて、pDcos Ap^r／Tc^rのAvaIサイトにXhoIリンカ
ーを挿入させたプラスミド:pDcos Ap^r／Tc^r・XhoI^a（第
６図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpDcos Ap^r／Tc^r・
XhoI^aのプラスミドDNAを調製した。

（ｉ）pDcos Tc^rの作成及び調製 pDcos Ap^r／Tc^r・XhoI^a10μｇを反応混液100μｌで6.
2ユニツトのBstEIIと60℃で30分間反応させて限定消化
した。そしてフエノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を10t/0.1 E7μｌ（〜１μg/μ
ｌ）に溶解させた。

次に、このBstEIIで限定消化したDNA溶液１μｌ（〜
１μｇ）を、反応混液25μｌで、２ユニツトのKlenow酵
素と22℃で30分間反応させて、cohesive endをblunt en
dに変えた。そして反応液を65℃で10分間熱処理してKle
now酵素を失活させた。

このDNA溶液10μｌ（0.4μｇ）と、PstIリンカー〔ｄ
（pG−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−−Ａ−Ｇ−Ｃ）〕２μｇとを、
反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼと22℃
で６時間反応させて連結した。その後、フエノール抽出
を行ない、DNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を、反応混液400μｌ（50mM(NH₄)₂SO₄、2
0mM Tris−HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、100μg/mlBSA）
で、600ユニツトのPstI（New England Biolabs社製）と
37℃で４時間反応させて消化したのち、0.8％調製用ア
ガロースゲル電気泳動にかけて、２個のcos及びori,Tc^r
を含むDNA断片（〜4Kbp）を分離精製して、DNAをエタノ
ール沈澱として得た。

次に、このDNA沈澱を反応混液20μｌで、６ユニツト
のT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉環化
したのち、フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール
沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20
μｌに溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Tc^rクローンを得た。次
いでこれらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調
べて、pDcos Ap^r／Tc^r・XhoI^aのBstEIIサイトとPstIサ
イトの間のDNA断片（〜0.2Kbp）を欠いたプラスミド:pD
cos Tc^r（第3,6図）を持つ大腸菌を得た。なお、本菌株
は、工業技術院微生物工業技術研究所に「微工研菌第75
51号（FERMP−7551）」として寄託されている。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpDcos Tc^rのプラ
スミドDNAを調製した。

実施例２ pDcos Tc^r/oriの作成及び調製（第７図） （ａ）pBR−327・XhoI^pの作成及び調製 pBR−327 10μｇを反応混液100μｌで、24.8ユニツト
のPstIと37℃で２時間反応させて消化した。そして、フ
エノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させ
た。次に、このPstIで消化したDNA溶液1.5μｌ（〜1.5
μｇ）を、反応混液30μｌ（33mM Tris−aceta−te（pH
7.9）、66mM酢酸カリ、10mM MgCl₂、0.5mM DTT,100μg/
me BSA、0.1mM dATP、0.1mM dCTP、0.1mM dGTP、0.1mM
dTTP）で、５ユニツトのT4−DNAポリメラーゼ（P.L社
製）と、37℃で15分間反応させて、cohesive endをblun
t endに変えた。そして、反応液を65℃で10分間熱処理
してT4−DNAポリメラーゼを失活させた。

このDNA溶液８μｌ（0.4μｇ）と、XhoIリンカー〔ｄ
（pC−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ）〕２μｇとを、反
応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼと22℃で
６時間反応させて連結した。その後、フエノール抽出を
行ない、DNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を、反応混液600μｌで1000ユニツトのXh
oIと37℃で４時間反応させて消化したのち、0.8％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、3.27KbpのDNA断片
を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNA
リガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉環化したのち、
フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解
させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Tc^rクローンを得た。次
いでこれらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調
べてpBR−327のPstIサイトにXhoIリンカーを挿入させた
プラスミド:pBR−327・XhoI^p（第７図）を持つ大腸菌を
得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpBR−327・XhoI^p
のプラスミドDNAを調製した。

（ｂ）pDcos Tc^r（2ori）の作成及び調製 pDcos Tc^r20μｇを、反応混液500μｌ（150mM NaCl、
6mM Tris−HCl（pH7.9）、6mM MgCl₂,6mM DTT,100μg/m
l BSA）で、167ユニツトの制限酵素BamHI（New England
Biolabs社製）及び500ユニツトのXhoIと37℃で２時間
反応させて完全に消化したのち、0.8％調製用アガロー
スゲル電気泳動にかけて、２個のcos及びoriを含むDNA
断片（2.4Kbp）を分離精製して、DNAをエタノール沈澱
として得、沈澱を10t/0.1E 9.5μｌ（〜１μg/μｌ）に
溶解させた。

一方、pBR−327 XhoI^p 20μｇを反応混液500μｌで、
167ユニツトのBamHI及び500ユニツトのXhoIと37℃で２
時間反応させて完全に消化したのち、0.8％調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、oriを含むDNA断片（2.14
Kbp）を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、
沈澱を10t/0.1E 9.0μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させ
た。

そして、pDcos Tc^rのcos及びoriを含むBamHI/XhoI断
片のDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）と、pBR−327・XhoI^pの
oriを含むBamHI/XhoI断片のDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）
とを、反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼ
と12℃で17.5時間反応させて連結した。その後、フエノ
ール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として得、沈
澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させ
た。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラン
スホーメーシヨンしたのち、Tc^rクローンを得た。次い
でこれらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調べ
て、２個のcos及び２個のori,Tc^rを有するプラスミド:p
Dcos Tc^r（2ori）（第７図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpDcos Tc^r（2or
i）のプラスミドDNAを調製した。

（ｃ）pSV2−dhfrΔ（BglII）の作成及び調製 pSV2−dhfr〔Subramani,Mulligan ＆ Berg,Mol.Cell.
Biol.,1,854（1981）〕10μｇを反応混液100μｌで、4
8.5ユニツトのBglIIと37℃で２時間反応させて消化し
た。そして、フエノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μ
ｌ）に溶解させた。

次に、このBglIIで消化したDNA溶液１μｌ（〜１μ
ｇ）を、反応混液25μｌで、２ユニツトのKlenow酵素と
22℃で30分間反応させて、cohesive endをblunt endに
変えた。そして反応液を65℃で10分間熱処理してKlenow
酵素を失活させた。

次に、このDNA溶液10μｌ（〜0.4μｇ）を反応混液50
μｌで、15ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時
間反応させて閉環化したのち、フエノール抽出を行な
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−
HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次
いで、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を
調べて、pSV2−dhfrのBglIIサイトを欠いたプラスミド:
pSV2−dhfrΔ（BglII）（第７図）を持つ大腸菌を得
た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpSV2−dhfrΔ（Bg
lII）のプラスミドDNAを調製した。

（ｄ）pDcos Tc^r/oriの作成及び調製 pDcos Tc^r（2ori）20μｇを反応混液500μｌ〔60mM N
aCl,6mM Tris−HCl（pH7.5）、6mM MgCl₂、6mM DTT,100
μg/ml BSA〕で、42.5ユニツトのPvuII及び35.8ユニツ
トのPstIと37℃で２時間反応させて完全に消化したの
ち、0.8％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、２
個のcos及びori,Tc^rを含むDNA断片（3.1Kbp）を分離精
製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1
E 9.5μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させた。

一方、pSV2−dhfrΔ（BglII）20μｇを反応混液500μ
ｌで、38.8ユニツトのPvuII及び32.7ユニツトのPstIと3
7℃で２時間反応させて完全に消化したのち、0.8％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、SV−dhfrを含むDN
A断片（2.45Kbp）を分離精製して、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μｌ）に
溶解させた。

そして、pDcos Tc^r（2ori）のcos及びori,Tc^rを含むP
vuII/PstI断片のDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）と、pSV2−
dhfrΔ（BglII）のSV−dhfrを含むPvuII/PstI断片のDNA
溶液１μｌ（〜１μｇ）とを、反応混液20μｌで６ユニ
ツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて連
結した。その後、フエノール抽出を行ない、DNAをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）
溶液20μｌに溶解させた。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラン
スホーメーシヨンしたのち、Tc^rクローンを得た。次い
で、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調
べて、２個のcos及びori,Tc^r,SV−dhfrを有するプラス
ミド:pDcos Tc^r/ori（第４、７図）を持つ大腸菌を得
た。なお、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所
に「微工研菌第7554号（FERMD−7554）」として寄託さ
れている。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pDcos Tc^r/ori
のプラスミドDNAを調製した。

実施例３ pDcos Ap^r/oriの作成及び調製（第８図） （ａ）pBR−327 XhoI^aの作成及び調製 pBR−32710μｇを反応混液100μｌで、110ユニツトの
AvaIと37℃で２時間反応させて消化した。そして、フエ
ノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させ
た。

次に、このAvaIで消化したDNA溶液１μｌ（〜１μ
ｇ）を、反応混液25μｌで、２ユニツトのKlenow酵素と
22℃で30分間反応させて、cohesive endをblunt endに
変えた。そして、反応液を65℃で10分間熱処理してKlen
ow酵素を失活させた このDNA溶液10μｌ（0.4μｇ）と、XhoIリンカー〔ｄ
（pC−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ）〕２μｇとを、反
応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼと22℃で
６時間反応させて連結した。その後、フエノール抽出を
行ない、DNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を、反応混液600μｌで、1000ユニツトの
XhoIと37℃で４時間反応させて消化したのち、0.8％調
製用アガロースゲル電気泳動にかけて、3.27KbpのDNA断
片を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNA
リガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉環化したのち、
フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解
させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rかつTc^rクローンを得
た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドDNAの
特性を調べて、pBR−327のAvaIサイトにXhoIリンカーを
挿入させたプラスミド:pBR−327・XhoI^a（第８図）を持
つ大腸菌を得た。

この大腸菌をTYG−Ｐ培地１中で増殖させたのち、
菌体よりccc−DNAを分離精製して、pBR−327・XhoI^aの
プラスミドDNAを調製した。

（ｂ）pDcos Ap^r/ori/dhfrΔ（BglII）の作成及び調製 pDcos Tc^r/ori 20μｇを反応混液200μｌで106ユニツ
トのEcoRIと37℃で２時間反応させて消化したのちさら
に反応混液500μｌで530ユニツトのXhoIと37℃で２時間
反応させて消化した。その後、0.8％調製用アガロース
ゲル電気泳動にかけて２個のcos及びSV−dhfrを含むDNA
断片（〜2.9Kbp）を分離精製して、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μｌ）に
溶解させた。

一方、pBR−327・XhoI^a 20μｇを反応混液200μｌで1
67ユニツトのEcoRIと37℃で２時間反応させて消化した
のち、さらに反応混液500μｌで880ユニツトのXhoIと37
℃で２時間消化した。その後、0.8％調製用アガロース
ゲル電気泳動にかけて、ori及びAp^rを含むDNA断片（1.8
4Kbp）を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を10t/0.1E 8μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させ
た。

そして、pDcos Tc^r/oriのcos及びSV−dhfrを含むEcoR
I/XhoI断片のDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）と、pBR−327
・XhoI^aのori及びAp^rを含むEcoRI/XhoI断片のDNA溶液１
μｌ（〜１μｇ）とを、反応混液20μｌで６ユニツトの
T4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて連結し
た。その後、フエノール抽出を行ない、DNAをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液2
0μｌに溶解させた。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）とトラン
スホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次い
で、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調
べて、２個のcos及びori,Ap^r,SV−dhfrΔ（BglII）を有
するプラスミド:pDcos Ap^r/ori/dhfrΔ（BglII）（第８
図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pDcos Ap^r/ori/
dhfrΔ（BglII）のプラスミドDNAを調製した。

（ｃ）pSV2−dhfrΔ（BamHI/BglII）の作成及び調製 pSV2−dhfr 10μｇを反応混液100μｌで48.5ユニツト
のBglIIと37℃で２時間反応させて消化したのち、さら
に反応混液250μｌで58.2ユニツトのBamHIと２時間反応
させて消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、
DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ
（〜１μg/μｌ）に溶解させた。

次に、このBglIIとBamHIで消化したDNA溶液１μｌ
（〜１μｇ）を、反応混液25μｌで、２ユニツトのKlen
ow酵素と22℃で30分間反応させてcohesive endをblunt
endに変えた。そして、反応液を65℃で10分間熱処理し
て、Klenow酵素を失活させた。

次に、このDNA溶液10μｌ（〜0.4μｇ）を反応混液50
μｌで、15ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時
間反応させて閉環化したのち、フエノール抽出を行な
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−
HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次
でこれらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調べ
て、pSV2−dhfrのBglIIサイトとBamHIサイトとの間のDN
A断片（0.85Kbp）を欠いたプラスミド:pSV2−dhfrΔ（B
amHI/BglII）（第８図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌をTYG−Ｐ培地１中で増殖させたのち、
菌体よりccc−DNAを分離精製して、pSV2−dhfrΔ（BamH
I/BglII）のプラスミドDNAを調製した。

（ｄ）pDcos Ap^r/ori/dhfrΔ（BamHI/BglII）の作成及
び調製 pDcos Ap^r/ori/dhfrΔ（BglII）20μｇを反応混液200
μｌで、2.9ユニツトのPstIと37℃で30分間反応させて
限定消化した。次いでフエノール抽出で除蛋白後、DNA
をエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を反応混液200μｌで34.0ユニツトのPvuI
Iと37℃で２時間反応させて消化した。その後、0.8％調
製用アガロースゲル電気泳動にかけて、２個のcos及びo
ri,Ap^rを含むDNA断片（2.3Kbp）を分離精製して、DNAを
エタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１
μg/μｌ）に溶解させた。

一方、pSV2−dhfrΔ（BamHI/BglII）20μｇを反応混
液500μｌで、46.8ユニツトのPvuII及び39.5ユニツトの
PstIと37℃で２時間反応させて完全に消化したのち、0.
8％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、SV−dhfr
を含むDNA断片（1.61Kb）を分離精製して、DNAをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 5.5μｌ（〜１μg/
μｌ）に溶解させた。

そして、pDcos Ap^r/ori/dhfrΔ（BglII）のcos及びor
i,Ap^rを含むPvuII/PstI断片のDNA溶液１μｌ（〜１μ
ｇ）と、pSV2−dhfrΔ（BamHI/BglII）のSV−dhfrを含
むPvuII/PstI断片のDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）とを反
応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で1
7.5時間反応させて連結した。その後、フエノール抽出
を行ない、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させた。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラン
スホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次い
で、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調
べて、２個のcos及びori,Ap^r,SV−dhfrΔ（BamHI/BglI
I）を有するプラスミド:pDcos Ap^r/ori/dhfrΔ（BamHI/
BglII）（第８図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で、増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pDcos Ap^r/ori/
dhfrΔ（BamHI/BglII）のプラスミドDNAを調製した。

（ｅ）pDcos Ap^r/ori/dhfrΔ（BamHI）の作成及び調製 pDcos Ap^r/ori/dhfrΔ（BamHI/BglII）10μｇを、反
応混液100μｌで、73.7ユニツトのEcoRIと37℃で２時間
反応させて消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白
後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 7
μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させた。

次に、このEcoRIで消化したDNA溶液１μｌ（〜１μ
ｇ）を、反応混液25μｌで、２ユニツトのKlenow酵素と
22℃で30分間反応させて、cohesive endをblunt endに
変えた。そして、反応液を65℃で10分間熱処理してKlen
ow酵素を失活させた。

このDNA溶液10μｌ（0.4μｇ）と、BamHIリンカー
〔ｄ（pC−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕２μｇとを
反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼと22℃
で６時間反応させて連結した。その後、フエノール抽出
を行ないDNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を、反応混液600μｌで1000ユニツトのBa
mHIと37℃で４時間反応させて消化したのち、0.8％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、3.91KbpのDNA断片
を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNA
リガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉環化したのち、
フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解
させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次
いで、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を
調べて、pDcos Ap^r/ori/dhfrΔ（BamHI/BglII）のEcoRI
サイトにBamHIリンカーを挿入させたプラスミド（この
場合、BamHIサイトの両側にEcoRIサイトが再構成され
る）:pDcos Ap^r/ori/dhfr（BamHI）（第８図）を持つ大
腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で、増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pDcos Ap^r/ori/
dhfr（BamHI）のプラスミドDNAを調製した。

（ｆ）pSVO10/neo^rの作成及び調製 pAO43（Oka,Sugisaki ＆ Takanami,J.Mol,Biol,147,2
14（1981））20μｇを反応混液200μｌ（60mM NaCl,6mM
Tris−HCl（pH8.0）,10mM MgCl₂,6mM DTT,100μg/ml B
SA）で、150ユニツトの制限酵素AvaII（New England Bi
olabs社製）と37℃で２時間反応させて消化したのち、
0.8％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、neo^rを
含むDNA断片（1.24Kbp）を分離精製して、DNAをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 5μｌ（〜１μg/μ
ｌ）に溶解させた。

このDNA溶液２μｌ（〜２μｇ）を、反応混液50μｌ
で、４ユニツトのKlenow酵素と22℃で30分間反応させ
て、cohesive endをblunt endに変えた。そして、フエ
ノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を10t/0.1E 1.5μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解さ
せた。

一方、pSVO10〔｛πVX〔Brain seed,Nucleic Acids R
es.,11,2427（1983）〕由来のポリリンカーを持つたpSV
O1〔Tjan,R,et al,Proc,Natl,Acad.Sci.U.S.A.,77,6491
（1980）〕の類縁プラスミド｝〕10μｇを、反応混液10
0μｌで129ユニツトのBamHIと37℃で２時間反応させて
消化したのち、フエノール抽出を行ない、DNAをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μ
ｌ）に溶解させた。

このDNA溶液２μｌ（〜２μｇ）を、反応混液50μｌ
で、４ユニツトのKlenow酵素と22℃で30分間反応させ
て、cohesive endをblunt endに変えた。そして、フエ
ノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を10t/0.1E 1.5μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解さ
せた。

次に、pAO43のneo^rを含むDNA断片をKlenow酵素で処理
したDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）と、pSVO10をBamHIで消
化し、Klenow酵素で処理したDNA溶液１μｌ（〜１μ
ｇ）とを、反応液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガー
ゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。その後、フエ
ノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として得、
沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させ
た。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rかつKm^r（neo^r）クロ
ーンを得た。次いでこれらのクローンをもつプラスミド
DNAの特性を調べてpSVO10のBamHIサイトにneo^rを挿入さ
せたプラスミド:pSVO10/neo^r（第８図）を持つ大腸菌を
得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で、増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pSVO10/neo^rの
プラスミドDNAを調製した。

（ｇ）pBR−322/neo^rの作成及び調製 pSVO10/neo^r 20μｇを反応混液200μｌで46.6ユニツ
トのPstIと37℃で２時間反応させて消化したのち、さら
に反応混液500μｌで166ユニツトのEcoRIと37℃で２時
間反応させて消化した。その後、0.8％調製用アガロー
スゲル電気泳動にかけて、neo^rを含むDNA断片（1.24Kb
p）を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈
澱を10t/0.1E 5μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させた。

一方、pBR−322 20μｇを反応混液200μｌで37.2ユニ
ツトのPstIと37℃で２時間反応させて消化したのち、さ
らに反応混液500μｌで132ユニツトのEcoRIと２時間反
応させて消化した。その後、0.8％調製用アガロースゲ
ル電気泳動にかけて、ori及びTc^rを含むDNA断片（3.6Kb
p）を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈
澱を10t/0.1E 11μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させた。

そして、pSVO10/neo^rのneo^rを含むEcoRI/PstI断片のD
NA溶液１μｌ（〜１μｇ）と、pBR−322のori及びTc^rを
含むEcoRI/PstI断片のDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）と
を、反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼと1
2℃で17.5時間反応させて連結した。その後、フエノー
ル抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱
を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させた。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラン
スホーメーシヨンしたのち、Km^r（neo^r）かつTc^r，Ap^s
クローンを得た。次いでこれらのクローンをもつプラス
ミドDNAの特性を調べて、pBR−322にneo^r断片を挿入さ
せたプラスミド:pBR−322/neo^r（第８図）を持つ大腸菌
を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で、増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpBR−322/neo^rの
プラスミドDNAを調製した。

（ｈ）pBR−322/neo^rΔ（EcoRI/BalI）の作成及び調製 pBR−322/neo^r 10μｇを反応混液100μｌで40ユニツ
トのBalIと37℃で２時間反応させて消化したのち、さら
に反応混液250μｌで120ユニツトのEcoRIと37℃で２時
間反応させて消化した。そして、フエノール抽出で除蛋
白後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E
7μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させた。

次に、このBalIとEcoRIで消化したDNA溶液１μｌ（〜
１μｇ）を、反応混液25μｌで、２ユニツトのKlenow酵
素と22℃で30分間反応させて、cohesive endをblunt en
dに変えた。そして、反応液を65℃で10分間熱処理してK
lenow酵素を失活させた。

次に、このDNA溶液10μｌ（〜0.4μｇ）を反応混液50
μｌで、15ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時
間反応させて閉環化したのち（この場合、EcoRIサイト
が再構成される）、フエノール抽出を抽出を行ない、DN
Aをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−HCl（p
H7.5）溶液20μｌに溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、neo^r（Km^r）かつTc^s，Ap
^sクローンを得た。次いでこれらのクローンのもつプラ
スミドDNAの特性を調べて、pBR−322/neo^rのEcoRIサイ
トとBalIサイトとの間のDNA断片（1.42Kbp）を欠いたプ
ラスミド:pBR−322/neo^rΔ（EcoRI/BalI）（第８図）を
持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で、増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pBR−322/neo^r
Δ（EcoRI/BalI）のプラスミドDNAを調製した。

（ｉ）pDcos Ap^r/oriの作成及び調製 pDcos Ap^r/ori/dhfr（BamHI）20μｇを反応混液200μ
ｌで、4.1ユニツトのPstIと37℃で30分間反応させて限
定消化した。次いでフエノール抽出で除蛋白後、DNAを
エタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を、反応混液200μｌで49ユニツトのPvuI
Iと37℃で２時間反応させて消化した。

その後、0.8％調製用アガロースゲル電気泳動にかけ
て、２個のcos及びori,Ap^rを含むDNA断片（2.3Kbp）を
分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を1
0t/0.1E 8μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させた。

一方、pBR−322/neo^rΔ（EcoRI/BalI）20μｇを反応
混液500μｌで、56ユニツトのPvuII及び47ユニツトのPs
tIと37℃で２時間反応させて完全に消化したのち、0.8
％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、neo^rを含む
DNA断片（1.9Kbp）を分離精製して、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱を10t/0.1E 8μｌ（〜１μg/μｌ）に
溶解させた。

そして、pDcos Ap^r/ori/dhfr（BamHI）のcos及びori,
Ap^rを含むPvuII/PstI断片のDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）
と、pBR−322/neo^rΔ（EcoRI/BalI）のneo^rを含むPvuII
/PstI断片のDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）とを、反応混液
20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時
間反応させて連結した。その後、フエノール抽出を行な
いDNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−HC
l（pH7.5）溶液20μｌに溶解させた。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラン
スホーメーシヨンしたのち、Ap^rかつneo^r（Km^r）クロー
ンを得た。次でこれらのクローンをもつプラスミドDNA
の特性を調べて、２個のcos及びori,Ap^r，neo^rを有する
プラスミド:pDcos Ap^r/ori（第1,8図）を持つ大腸菌を
得た。なお、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に「微工研菌第7553号（FERMP−7553）」として寄託
されている。

この大腸菌をTYG−Ｐ培地１中で、増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pDcos Ap^r/ori
のプラスミドDNAを調製した。

実施例４ pDcos Ap^r/ori/gpt/TKの作成及び調製（第９
図） （ａ）pSV2−gptΔ（HindIII/BglII）の作成及び調製 pSV2−gpt〔Richard,Mulligan ＆ Berg,Mol.Cell.Bio
l.,1,449,（1981）〕10μｇを、反応混液100μｌで、46
ユニツトのHindIII及び46ユニツトのBglIIと37℃で２時
間反応させて消化した。そして、フエノール抽出で除蛋
白後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E
7μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させた。

次に、このHindIII及びBglIIで消化したDNA溶液１μ
ｌ（〜１μｇ）を、反応混液25μｌで２ユニツトのKlen
ow酵素と22℃で30分間反応させて、cohesive endをblun
t endに変えた。そして、反応液を65℃で10分間熱処理
してKlenow酵素を失活させた。

次に、このDNA溶液10μｌ（〜4.9μｇ）を反応混液50
μｌで、15ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時
間反応させて閉環化したのち、フエノール抽出を行な
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−
HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次
いで、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を
調べて、pSV2−gptのHindIIIサイトとBglIIサイトとの
間のDNA断片（0.12Kbp）を欠いたプラスミド:pSV2−gpt
Δ（HindIII/BglII）（第９図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で、増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpSV2−gptΔ（Hin
dIII/BglII）のプラスミドDNAを調製した。

（ｂ）pSV2−gptΔ（HindIII/BglII）/BamHIの作成及び
調製 pSV2−gptΔ（HindIII/BglII）10μｇを反応混液100
μｌで18.8ユニツトのPvuIIと37℃で２時間反応させて
消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、DNAを
エタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１
μg/μｌ）に溶解させた。

次に、このDNA溶液0.4μｌ（〜0.4μｇ）と、BamHIリ
ンカー〔ｄ（pC−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕２μ
ｇとを、反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガー
ゼと22℃で６時間反応させて連結した。その後、フエノ
ール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を、反応混液600μｌで1000ユニツトのBa
mHIと37℃で４時間反応させて消化したのち、0.8％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、5.1Kbpの長さのDN
A断片を分離精製して、DNAをエタノール沈澱とした。

このDNA沈澱を反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNA
リガーゼと12℃17.5時間反応させて閉環化したのち、フ
エノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解
させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次
で、これらのクローンをもつプラスミドDNAの特性を調
べて、pSV2−gptΔ（HindIII/BglII）のPvuIIサイトにB
amHIリンカーを挿入させたプラスミド:pSV2−gptΔ（Hi
ndIII/BglII）/BamHI（第９図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpSV2−gptΔ（Hin
dIII/BglII）/BamHIのプラスミドDNAを調製した。

（ｃ）pDcos Ap^r/ori/gpt（2 BamHI）の作成及び調製 pSV2−gptΔ（HindIII/BglII）BamHI 20μｇを反応混
液200μｌで、226ユニツトのBamHIと37℃で２時間反応
させて消化したのち、0.8％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、gptを含むDNA断片（2.2Kbp）を分離精製
して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E
8.5μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させた。

一方、pDcosAp^r/ori/dhfr（BamHI）10μｇを反応混液
100μｌで74ユニツトのBamHIと37℃で２時間反応させて
消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、DNAを
エタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1 E7μｌ（〜１
μg/μｌ）に溶解させた。

そして、pSV2−gptΔ（HindIII/BglII）/BamHIのgpt
を含むBamHI断片のDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）と、pDco
sAp^r/ori/dhfr（BamHI）をBamHIで消化したDNA溶液１μ
ｌ（〜１μｇ）とを、反応混液20μｌで６ユニツトのT4
−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。
その後、フエノール抽出を抽出を行ない、DNAをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶
液20μｌに溶解させた。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラン
スホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次い
で、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調
べて、pDcos Ap^r/ori/dhfrのBamHIサイトにgptを挿入さ
せたプラスミド:pDcos Ap^r/ori/gpt（2BamHI）（第９
図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpDcos Ap^r/ori/gp
t（2BamHI）のプラスミドDNAを調製した。

（ｄ）pDcos Ap^r/ori/gptの作成及び調製 pDcos Ap^r/ori/gpt（2BamHI）10μｇを、反応混液100
μｌで9.1ユニツトのBamHIと37℃で30分間反応させて限
定消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、DNA
をエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜
１μg/μｌ）に溶解させた。

次に、このBamHIで限定消化したDNA溶液１μｌ（〜１
μｇ）を、反応混液25μｌで２ユニツトのKlenow酵素と
22℃で30分間反応させて、cohesive endをblunt endに
変えたのち、0.8％調製用アガロースゲル電気泳動にか
けて、6.3Kbpの長さのDNA断片を分離精製して、DNAをエ
タノール沈澱として得た。

このDNA沈澱を反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNA
リガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉環化したのち、
フエノール抽出を抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱
として得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌ
に溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次
でこれらのクローンをもつプラスミドDNAの特性を調べ
て、pDcos Ap^r/ori/gpt（2BamHI）のcosとgptとの間のB
amHIサイトを欠いたプラスミド:pDcos Ap^r/ori/gpt（第
９図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pDcos Ap^r/ori/
gptのプラスミドDNAを調製した。

（ｅ）pTK−4/BamHIの作成及び調製 pTK−４〔Ishiura,M.,etal.Mol.Cell Biol,2,607（19
82）〕10μｇを反応混液100μｌで、3.0ユニツトのPvuI
Iと37℃で30分間反応させて限定消化したのち、0.8％調
製用アガロースゲル電気泳動にかけて、6.43Kbpの長さ
のDNA断片を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を10t/0.1E 3μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解させ
た。

次に、このDNA溶液0.4μｌ（〜0.4μｇ）と、BamHIリ
ンカー〔ｄ（pC−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕２μ
ｇとを、反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガー
ゼと22℃で６時間反応させて連結した。

そして、この反応液10μｌを、反応混液50μｌで15ユ
ニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて
閉環化した。その後フエノール抽出を行ない、DNAをエ
タノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.
5）溶液20μｌに溶解させた。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラン
スホーメーシヨンしたのち、Ap^rかつTc^rクローンを得
た。そして、これらのクローンのもつプラスミドDNAの
特性を調べて、pTK−４のoriとTKとの間のPvuIIサイト
にBamHIリンカーを挿入させたプラスミド:pTK−4/BamHI
（第９図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pTK−4/BamHIの
プラスミドDNAを調製した。

（ｆ）pTK−4/BamHI/BamHIの作成及び調製 pTK−4/BamHI 10μｇを反応混液100μｌで９ユニツト
のBamHIと37℃で30分間反応させて限定消化したのち、
フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として
得た。

このエタノール沈澱を反応混液100μｌで15ユニツト
のPvuIIと37℃で２時間反応させて完全に消化したの
ち、フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を10t/0.1E 3μｌ（〜１μg/μｌ）に溶解
させた。

次に、このBamHIで限定消化し、さらにPvuIIで消化し
たDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）を、反応混液25μｌで２
ユニツトのKlenow酵素と22℃で30分間反応させて、cohe
sive endをblunt endに変えたのち、0.8％調製用アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、ori及びAp^r,TKを含むDNA断
片（4.67Kbp）を分離精製して、DNAをエタノール沈澱と
して得た。

このDNA沈澱を反応混液20μｌで６ユニツトのT4−DNA
リガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉環化したのち
（この場合、BamHIサイトが再構成される）、フエノー
ル抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱
を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させた。

そして、このDNA溶液10μｌで、大腸菌（HB101）をト
ランスホーメーシヨンしたのち、Ap^rかつTc^sクローンを
得た。次いでこれらのクローンのもつプラスミドDNAの
特性を調べて、pTK−4/BamHIのPvuIIサイトとBamHIサイ
ト（Tc^r上）の間のDNA断片（1.76Kbp）を欠いたプラス
ミド:pTK−4/BamHI/BamHI（第９図）を持つ大腸菌を得
た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pTK−4/BamHI/B
amHIのプラスミドDNAを調製した。

（ｇ）pDcos Ap^r/ori/gpt/TK（2BamHI）の作成及び調製 pTK−4/BamHI/BamHI 20μｇを反応混液200μｌで247
ユニツトのBamHIと37℃で２時間反応させて消化したの
ち、1.0％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、TK
を含むDNA断片（2Kbp）を分離精製して、DNAをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 6μｌ（〜１μg/μ
ｌ）に溶解させた。

一方、pDcos Ap^r/ori/gpt 10μｇを反応混液100μｌ
で、91ユニツトのBamHIと37℃で２時間反応させて消化
した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、DNAをエタ
ノール沈澱として得沈澱を10t/0.1E 7μｌ（〜１μg/μ
ｌ）に溶解させた。

そして、pTK−4/BamHI/BamHIのTKを含むBamHI断片のD
NA溶液１μｌ（〜１μｇ）と、pDcos Ap^r/ori/gptをBam
HIで消化したDNA溶液１μｌ（〜１μｇ）とを、反応混
液20μｌで６ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて連結した。その後フエノール抽出を行な
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−
HCl（pH7.5）溶液20μｌに溶解させた。

次に、このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトラン
スホーメーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次い
で、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調
べて、pDcos Ap^r/ori/gptのBamHIサイトにTKを挿入させ
たプラスミド:pDcos Ap^r/ori/gpt/TK（2BamHI）（第９
図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pDcos Ap^r/ori/
gpt/TK（2BamHI）のプラスミドDNAを調製した。

（ｈ）pDcos Ap^r/ori/gpt/TKの作成及び調製 pDcos Ap^r/ori/gpt/TK（2BamHI）10μｇを反応混液10
0μｌで、6.9ユニツトのBamHIと37℃で30分間反応させ
て限定消化した。そしてフエノール抽出で除蛋白後、DN
Aをエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E7μｌ（〜
１μg/μｌ）に溶解させた。

次に、このBamHIで限定消化したDNA溶液１μｌ（〜１
μｇ）を、反応混液25μｌで２ユニツトのKlenow酵素と
22℃で30分間反応させて、cohesive endをblunt endに
変えたのち、0.8％調製用アガロースゲル電気泳動にか
けて、8.3Kbpの長さのDNA断片を分離精製して、DNAをエ
タノール沈澱として得た。

そして、このDNA沈澱を反応混液20μｌで６ユニツト
のT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉環化
したのち、フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール
沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−HCl（pH7.5）溶液20
μｌに溶解させた。

このDNA溶液10μｌで大腸菌（HB101）をトランスホー
メーシヨンしたのち、Ap^rクローンを得た。次いで、こ
れらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を調べて、p
Dcos Ap^r/ori/gpt/TK（2BamHI）のTKと Ap^rとの間のBa
mHIサイトを欠いたプラスミド:pDcosAp^r/ori/gpt/TK
（第５、９図）を持つ大腸菌を得た。なお、本菌株は、
工業技術院微生物工業技術研究所に「微工研菌第7552号
（FERMP−7552）」として寄託されている。

この大腸菌を、TYG−Ｐ培地１中で、増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pDcos Ap^r/ori/
gpt/TKのプラスミドDNAを調製した。

実施例５ pDcos Ap^r/oriによるゲノムDNA（外来DNA）
の遺伝子バンクの製造（第２図参照） （ａ）高分子量のゲノムDNAの調製 pBR−322の塩基配列を持つ、ヘルペスシンプレツクウ
イルス１型（HSV−１）のチミジンキナーゼ（TK）遺伝
子の組み換え体を移入したマウスＬ細胞（Ltk^-〔HSV−
１TK⁺〕）は、10％仔牛血清を添加したイーグルMEMで培
養し、confluent monolayers（100mm−プレート９枚、
〜10⁷cells/プレート）とし、PBS（137mM NaCl1,3mMKCl
1,8mM Na₂HPO₄,1mM KH₂PO₄）で２度洗つたのち、可溶化
剤（100μg/mlProteinase K 0.5％SDS,150mM NaCl,10mM
EDTA,10mM Tris−HCl（pH7.5））をプレート当り1.0ml
加え、65℃で15〜30分間保温して可溶化した。この可溶
化物は50ml容量の遠沈管に移し、さらに37℃で一晩保温
し、途中、ProtinaseKをさらに100μg/ml添加した。反
応後、等量のトリス緩衝液で飽和したフエノールでおだ
やかに２度抽出し、水層を50mM Tris−HCl（pH8.0）、1
0mM EDTA,10mM NaClからなる透析緩衝液3lに対して４回
透析を行なつた。透析内液は、50μg/mlのDNase−free
RNase Aを加えて37℃で３時間保温してRNAを分解した。
反応後、等量のフエノール：クロロホルム混液で２度お
だやかに抽出し、水層を10mM Tris−HCl（pH8.0）,1mM
EDTAからなる水溶液（TE）3lに対して９回透析して、精
製DNA溶液50mlを得た。DNA溶液の260nmと280nmでの吸光
度（OD）は、10倍希釈でそれぞれ0.667,0.363（OD₂₈₀／
OD₂₆₀＝0.544）であり、DNAの濃度は0.667×0.050（μg
/1OD）×10＝0.334μg/μｌであつた。

（ｂ）35〜45KbpのゲノムDNAの調製 精製したゲノムDNA溶液5.98ml（2mg）を、反応混液2
9.96ml（50mM NaCl,10mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgC
l₂,100μg/ml BSA）で15.6ユニツトのSau 3A（New Engl
and Biolabs社製）と37℃で１時間反応させて限定消化
したのち、0.5MEDTA（pH8.0）溶液を1.3ml加え、等量の
トリス緩衝液飽和フエノールで２度おだやかに抽出し
た。そして水層をセカンダリーブタノールで10mlまで濃
縮したのち、3.0M酢酸ナトリウム1.1mlとエタノール20m
lを加え、エタノール沈澱としてゲノムDNAを得、70％エ
タノールで洗つたのち水流ポンプにて乾燥を行ない、エ
タノール沈澱をTE2mlに溶解させた。

次に、このDNA溶液300μｌを５〜25％シヨ糖密度勾配
遠心〔20mM Tris−HCl（pH7.6）、5mM EDTA、ベツクマ
ンSW28、20,000rpm、９時間、20℃〕にかけて30滴ごと
に分画した。各分画20μｌを0.4％アガロースゲル電気
泳動にかけて長さを測定し、35〜45Kbpの大きさのDNA分
画を集めたのち、TE3lに対して３回透析を行なつた。そ
して透析内液をフエノール抽出後、水層をセカンダリー
ブタノールで濃縮し、DNAをエタノール沈澱として得、
沈澱をTE1mlに溶解させて、35〜45KbpのゲノムDNA溶液
を得た。DNA溶液のOD₂₆₀及びOD₂₈₀は50倍希釈でそれぞ
れ0.216,0.112（OD₂₈₀／OD₂₆₀＝0.519）であり、DNAの
濃度は0.216×0.050（μg/1OD）×50＝0.54μg/μｌで
あつた。

（ｃ）コスミドベクターDNAの調製 pDcos Ap^r/ori 40μｇを、反応混液800μｌで152ユニ
ツトのPvuIIと37℃で２時間反応させて消化した。その
後、フエノール抽出を行ない、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を10t/0.1E 100μｌに溶解させた。

このPvuIIで消化したDNA溶液95μｌを、反応混液500
μｌ（50mM Tris−HCl（pH9.0）,1mM MgCl₂,0.1mM ZnCl
₂,1mMスペルジミン）で、６ユニツトのホスフアターゼ
（Calf intestinal alkaline phosphatase,Boehringer,
Mannheim社製）と、37℃で15分間、56℃で15分間反応
後、さらに６ユニツトのホスフアターゼを加え、37℃で
15分間、続いて56℃で15分間反応させて、PvuIIの切断
片を不活化した。その後、H₂O400μl,STE（100mM Tris
−HCl（pH8.0）、1M NaCl,10mM EDTA）100μｌ、10％ S
DS 50μｌを加え、68℃で15分間保温してホスフアター
ゼを失活させた。そして、フエノール抽出で除蛋白後、
DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t/0.1E 30μｌ
に溶解した。

次に、このPvuIIで消化し、ホスフアターゼで不活化
したDNA溶液30μｌを、反応混液500μｌで、152ユニツ
トのBamHIと37℃で２時間反応させて消化した。そし
て、フエノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱
として得、沈澱を10t/0.1E 30μｌに溶解させて、コス
ミドベクターDNA溶液を得た。DNA溶液のOD₂₆₀及びOD₂₈₀
は300倍希釈でそれぞれ0.046,0.026（OD₂₈₀／OD₂₆₀＝0.
565）であり、DNAの濃度は0.046×0.050（μg/1OD）×3
00＝0.690μg/μｌであつた。

（ｄ）35〜45KbpのゲノムDNAとコスミドベクターDNAと
の連結 （ｂ）で調製した35〜45Kbpのゲノム溶液2.61μｌ
（1.4μｇ）と、（ｃ）で調製したコスミドベクターDNA
溶液0.86μｌ（0.59μｇ）とを、反応混液10μｌで5.9
ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させ
て連結した。反応終了後、反応液は４℃で保存した。

（ｅ）パツケージング抽出液の調製 ｉ）BHB2690から超音波処理して得られる菌体抽出液の
調製 大腸菌BHB2690をNZY培地（１％NZamine,0.5％酵母エ
キス、0.5％NaCl,0.2％ MgCl₂・６H₂O,pH7.5）100mlで
一晩培養した液のOD₆₀₀を測定後、あらかじめ32℃に保
温しておいたNZY培地500ml（2lフラスコ中）に最初のOD
₆₀₀が0.025になるように菌を接種し、32℃で振盪培養を
開始した。そして、OD₆₀₀が0.3になつた時点で（培養開
始から２時間40分後）、45℃で15分間おきプロフアージ
の誘導を行なつた。その後、培養温度を38〜39℃に変
え、さらに３時間激しく振盪培養した（培養液の少量に
クロロホルムを一滴滴下することによつて誘導の検査を
した）。

培養終了後、6,000rpmで10分間遠心分離機にかけて集
菌を行ない、菌体を20mM Tris−HCl（pH8.0）,1mM EDT
A,5mMβ−メルカプトエタノールからなる緩衝液3.6mlに
懸濁させた。そして、４℃以下で超音波処理（最大出力
で５秒間×20回）を行なつたのち、20,000rpmで10分間
遠心分離機にかけて（４℃）、上澄液〜3mlを得た。

次に、上澄み液3mlに等量の上記緩衝液とパツケージ
ング緩衝液（6mM Tris−HCl（pH8.0）、50mMスペルジミ
ン、50mMプトレシン、20mM MgCl₂,30mM ATP,30mMβ−メ
ルカプトエタノール）0.5mlを加えたのち、15μｌづつ
1.5mlのエツペンドルフチユーブに分注し、直ちに液体
窒素中で冷凍し、−70℃で保存した。

ii）BHB2688から凍結・融解によつて得られる菌体抽出
液の調製 大腸菌2688を、NZY培地100mlで一晩培養した液のOD
₆₀₀を測定したのち、あらかじめ32℃に保温しておいたN
ZY培地500ml（2lフラスコ中）に最初のOD₆₀₀が0.025に
なるように菌を接種し、32℃で振盪培養を開始した。そ
して、OD₆₀₀が0.3になつた時点で（培養開始から２時間
40分後）、45℃で15分間おきプロフアージの誘導を行な
つた。その後、培養温度を38〜39℃に変え、さらに３時
間激しく振盪培養した（培養液の少量にクロロホルムを
一滴、滴下することによつて誘導の検査をした）。

培養終了後、6,000rpmで10分間遠心分離機にかけて集
菌を行ない、菌体をシヨ糖溶液（10％シヨ糖、50mM Tri
s−HCl（pH8.0）3mlに懸濁させたのち、0.5mlづつエツ
ペンドルフチユーブ６本にとり、この各々のチユーブに
リゾチーム溶液（2mg/ml、0.25M Tris−HCl（pH8.0））
25μｌを加え（４℃）、おだやかに混合し、すばやく液
体窒素中にて凍結させた。

次に、チユーブを氷上において抽出物を融解させたの
ち、各チユーブにパツケージング緩衝液25μｌを加えて
混合した。そして、各抽出物を一緒にして、21,000rpm
で１時間（４℃）遠心分離機にかけて上澄液を得、これ
の10μｌづつを1.5mlのエツペンドルフチユーブに分注
し、直ちに液体窒素中で冷凍し、−70℃で保存した。

（ｆ）in vitroパツケージング −70℃に保存しておいたBHB2690とBHB2688の菌体抽出
液を氷上におき、まず先に融解するBHB2688の抽出液をB
HB2690の抽出液に加えておだやかに混合した。ほぼ全部
融解したところで、（ｄ）で調製した組み換え体DNA溶
液2.5μｌ（0.5μｇ）を加えてよく混合したのち、室温
で１時間反応させてin vitroパツケージングを行なつ
た。

反応終了後、SM溶液（0.58％NaCl,0.2％MgSO₄・７H
₂O,50mM Tris−HCl（pH7.5）0.01％ゲラチン）1mlとク
ロロホルム一滴を加えて混合した。そして、エツペンド
ルフチユーブを机上遠心機に30秒間かけて、上澄液を形
質導入フアージ粒子溶液として得た。

（ｇ）形質導入及びプレーテイング 大腸菌HB101のＬ−ブロス（マルトース0.4％添加）で
一晩培養した液200μｌを机上遠心機にかけて集菌を行
ない、その菌体を10mM MgCl₂溶液100μｌに再懸濁し
た。次に、この菌体懸濁液100μｌにSM溶液で10倍希釈
した形質導入フアージ粒子溶液100μｌを加え、37℃で1
5分間保温して形質導入を行なつたのち、さらにＬ−ブ
ロス1.1mlを加え37℃で45分間振盪培養した。そして、
この菌体懸濁液を100μｌづつアンピシリン20μg/ml含
有する100mmのＬ−プレートに塗布し、プレートを37℃
で一晩おいたのち、生ずるコロニーを竹ぐしでついてＬ
−ブロス（アンピシリン20μg/ml含有）で増殖させた。
また、プレート当りのコロニー数は20〜100個であつ
た。

（ｈ）トランスホーマントの培養及び、それの持つプラ
スミドDNAの調製と特性化 アンピシリン耐性コロニー（トランスホーマント）20
個を、Ｌ−ブロス（アンピシリン20μg/ml含有）2mlで
一晩培養したのち、各培養液1.5mlを1.5mlのエツペンド
ルフチユーブにとり、机上遠心機にかけて集菌した。こ
れらの菌体を溶液Ｉ（50mMグルコース、25mM Tris−HCl
（pH8.0）、10mM EDTA、4mg/mlリゾチーム）100μｌに
再懸濁したのち、室温で５分間おいた。次に、溶液II
（0.2N NaoH,1％SDS）200μｌを加えておだやかに混合
し、氷上に５分間おいたのち、溶液III〔5M酢酸カリ（p
H4.8）〕150μｌを加えておだやかに混合し、氷上に５
分間おいた。そして、エツペンドルフチユーブを机上遠
心機にかけて上澄液を得、これに２倍容量のエタノール
を加えて、プラスミドDNAをエタノール沈澱として得
た。

各トランスホーマントのもつプラスミドDNAを少量の1
0t/0.1Eに溶解させたのち、サイズマーカーDNA（ラムダ
DNA:48Kbp,ラムダDNAをHindIIIで消化したもの:22.3Kb
p,9.5Kbp）と一緒に、0.4％アガロースゲル電気泳動に
かけたところ、アンピシリン耐性コロニー20個のうち、
すべてが22.3Kbp〜48Kbpの大きさのところにプラスミド
DNAの存在が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は新規コスミドベクターpDcos Ap^r/oriを示し、 第２図は第１図の新規コスミドベクターを用いるゲノム
DNAの遺伝子バンクの製造法を示し、 第３図は新規コスミドベクターpDcos Tc^rを示し、 第４図は新規コスミドベクターpDcos Tc^r/oriを示し、 第５図は新規コスミドベクターpDcos Ap^r/ori/gpt/TKを
示し、 第６図はpDcos Tc^rの作成方法を示し、 第７図はpDcos Tc^r/oriの作成方法を示し、 第８図はpDcos Ap^r/oriの作成方法を示し、 第９図はpDcos Ap^r/ori/gpt/TKの作成方法を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡田 善雄 大阪府箕面市半町２−22―28 (56)参考文献 Ｇｅｎｅ，26，［1983］Ｐ．137−146

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】同一の方向性を持った下記の cos :ラムダファージのcos ori :複製開始点 Ap^r：アンピシリン耐性を発現する領域 neo^r：ネオマイシン耐性を発現する領域 で示されるコスミドベクターpDcosAp^r/oriおよび下記の cos:ラムダファージのcos ori:複製開始点 Tc^r：テトラサイクリン耐性を発現する領域 で示されるコスミドベクターpDcos Tc^rおよび下記の cos：ラムダファージのcos ori：複製開始点 Tc^r：テトラサイクリン耐性を発現する領域 SV−dhfr:SV−40 ジヒドロ葉酸リダクターゼ活性を発
   現する領域 で示されるコスミドベクターpDcos Tc^r/oriまたは下記
   の cos：ラムダファージのcos ori：複製開始点 Ap^r：アンピシリン耐性を発現する領域 SV−dhfr:SV−40 ジヒドロ葉酸リダクターゼ活性を発
   現する領域 TK：チミジンキナーゼ活性を発現する領域 gpt：キサンチングアニンホスホリボシルトランス
   フェラーゼ活性を発現する領域 で示されるコスミドベクターpDcos Ap^r/ori/gpt/TKであ
   るcosを２個有し、２種類の制限酵素で切ることによっ
   て、それぞれcosを１個づつ持った長さがほぼ等しい右
   腕と左腕とが等モルできるようにしたことを特徴とする
   新規コスミドベクター。
2. 【請求項２】コスミドベクター由来の遺伝子画分の挿入
   を判定するための薬剤耐性、もしくは特定の生理機能を
   発現せしめる遺伝子配列を含有する特許請求の範囲第１
   項記載の新規コスミドベクター。
3. 【請求項３】薬剤耐性としてアンピシリン耐性、テトラ
   サイクリン耐性、ネオマイシン耐性もしくはクロラムフ
   エニコール耐性を発現せしめる遺伝子配列を有する特許
   請求の範囲第２項記載の新規コスミドベクター。
4. 【請求項４】特定の生理機能として、アミノグリコシド
   ３′−ホスホトランスフエラーゼ（neo）活性、チミジ
   ンキナーゼ（TK）活性、アデニンホスホリボシルトラン
   スフエラーゼ（APRT）活性、ヒポキサンチングアニンホ
   スホリボシルトランスフエラーゼ（HGPRT）活性、キサ
   ンチングアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ（XG
   PRT又はgpt）活性、もしくはジヒドロ葉酸リダクターゼ
   （dhfr）活性を発現せしめる遺伝子配列を有する特許請
   求の範囲第２項記載の新規コスミドベクター。
5. 【請求項５】Col EI由来の複製機能を有する遺伝子画分
   を含有する特許請求の範囲第２項記載の新規コスミドベ
   クター。