JPH0824595B2 - Ｉｌ―１生物活性の抑制剤 - Google Patents
Ｉｌ―１生物活性の抑制剤Info
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- JPH0824595B2 JPH0824595B2 JP2504068A JP50406890A JPH0824595B2 JP H0824595 B2 JPH0824595 B2 JP H0824595B2 JP 2504068 A JP2504068 A JP 2504068A JP 50406890 A JP50406890 A JP 50406890A JP H0824595 B2 JPH0824595 B2 JP H0824595B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 アルファ‐及びベータ‐インターロイキン‐１の分子
が限定的なアミノ酸相同性を示す事実にもかかわらず
［オーロン・ピー・イー（Auron,P.E.）ら、［1985
年］、J.Mol.Cell lmmunol.2巻169-177頁；ウェッブ・
エイ・シー（Webb,A.C.）、エル・ジェイ・ローゼンワ
ッサー（L.J.Rosenwasser）、ピー・イー・アーロン
（P.E.Auron）［1987年］［組換えリンホカイン類とそ
の受容体］エス・ギリス（S.Gillis）編、マルセル・デ
ッカー社、ニューヨーク州、139-159頁］、タンパクは
同じ膜受容体タンパクに結合し［ダワー・エス・ケイ
（Dower,S.K.）ら、［1986年］Nature324巻266-268頁；
キリアン・ピー・エル（Kilian,P.L.）ら、［1986年］
J.lmmunol.136巻4509-4514頁］、これが最近クローン化
された［シムズ・ジェイ・イー（Sims,J.E.）ら、［198
8年］Science 241巻585-588頁］。ヒトIL-1βタンパク
は、31,000ダルトンの前駆体タンパク（プロIL-1β;269
アミノ酸）として合成され、これが受容体と特異的に結
合し、比較的低いが明確な生物活性をもっている［ジョ
ブリング・エス・エイ（Jobling,S.A.）ら、［1988年］
J.Biol.Chem.263巻16732-16738頁］。プロIL-1βが未定
義の機構によって処理されると、最大の生物活性をもっ
た成熟タンパク（IL-1（117-269））を生ずる。ここで
使用される付番方式は、269アミノ酸の未処理プロIL-1
β前駆体分子に基づいている［ジョブリングら、1988
年；オーロン・ピー・イーら、［1984年］Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 81巻7907-7911頁］。処理ずみ「成熟」型IL
-1βは位置117-269に対応している。ヒトIL-1βの結晶
構造［プリーストル・ジェイ・ピー（Priestle,J.
P.）、エッチ・ピー・スカー（H.P.Scar）、エム・ジー
・グルッター（M.G.Grutter）［1988年構造EMBO J.7巻3
39-343頁］は、逆平行βストランドによって形成される
稜をもった四面体として記述されたが、受容体と相互に
作用するアミノ酸は定義されなかった。IL-1βの生物活
性がタンパク分子の構造的一体性と深く関係している可
能性は非常に大きい。というのは、成熟（即ち完全な）
タンパクからアミノ酸を削除すると、生物活性の重大な
減少が伴うからである。幾つかのグループが、受容体の
配位子相互作用を調べる試みに点突然変異を導入した
［ジョブリングら、1988年；デチアラ・ティー・エム
（Dechiara,T.M.）ら、［1986年］Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 83巻8303-8307頁；モスレー・ビー（Mosley,B.）、
エス・ケー・ダワー、エス・ギリス・ディー・コスマン
（D.Cosman）［1987年］Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84巻4
572-4576頁］。フアンら［フアン・ジェイ・ジェイ（Hu
ang,J.J.）ら［1987年］FEBSレターズ223巻294-298頁］
は、本来のNH2末端配列をalapro-val-arg-serからthr-m
et‐val-arg-serへ変えることによって、IL-1βの生物
活性が４倍から７倍高まることを報告した。しかし、ア
ルギニン120を更に変えて、the-met-val-glu‐serをつ
くると、生物活性が効果的に消えた。円偏光二色性デー
タは、タンパク間の主要な構造の差を示さなかった。グ
ローネンボーンら［グローネンボーン・エイ・エム（Gr
onenborn,A.M.）、ピー・ティー・ウィングフィールド
（P.T.Wingfield）、エッチ・エフ・マクドナルド（H.
F.McDonald）、ユー・シュメイスナー（U.Schmeissne
r）、ジー・エム・クロア（G.M.Clore）［1988年］FEBS
レターズ231巻135-138頁］は、受容体の結合親和性へ影
響を及ぼさずにIL-1アルファヒスチジン及びトリプトフ
ァン残基を突然変異化し、一方マクドナルドら［マクド
ナルド・エッチ・アール（McDonald,H.R.ら［1986年］F
EBSレターズ209巻295-298頁］は、野性型タンパクより2
-100倍少ない競合的結合活性のIL-1ヒスチジンムテイン
類を報告した。受容体結合親和性と生物活性は一般に相
互に関係しているが、この関係は明らかに常に直接的で
はない。
が限定的なアミノ酸相同性を示す事実にもかかわらず
［オーロン・ピー・イー（Auron,P.E.）ら、［1985
年］、J.Mol.Cell lmmunol.2巻169-177頁；ウェッブ・
エイ・シー（Webb,A.C.）、エル・ジェイ・ローゼンワ
ッサー（L.J.Rosenwasser）、ピー・イー・アーロン
（P.E.Auron）［1987年］［組換えリンホカイン類とそ
の受容体］エス・ギリス（S.Gillis）編、マルセル・デ
ッカー社、ニューヨーク州、139-159頁］、タンパクは
同じ膜受容体タンパクに結合し［ダワー・エス・ケイ
（Dower,S.K.）ら、［1986年］Nature324巻266-268頁；
キリアン・ピー・エル（Kilian,P.L.）ら、［1986年］
J.lmmunol.136巻4509-4514頁］、これが最近クローン化
された［シムズ・ジェイ・イー（Sims,J.E.）ら、［198
8年］Science 241巻585-588頁］。ヒトIL-1βタンパク
は、31,000ダルトンの前駆体タンパク（プロIL-1β;269
アミノ酸）として合成され、これが受容体と特異的に結
合し、比較的低いが明確な生物活性をもっている［ジョ
ブリング・エス・エイ（Jobling,S.A.）ら、［1988年］
J.Biol.Chem.263巻16732-16738頁］。プロIL-1βが未定
義の機構によって処理されると、最大の生物活性をもっ
た成熟タンパク（IL-1（117-269））を生ずる。ここで
使用される付番方式は、269アミノ酸の未処理プロIL-1
β前駆体分子に基づいている［ジョブリングら、1988
年；オーロン・ピー・イーら、［1984年］Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 81巻7907-7911頁］。処理ずみ「成熟」型IL
-1βは位置117-269に対応している。ヒトIL-1βの結晶
構造［プリーストル・ジェイ・ピー（Priestle,J.
P.）、エッチ・ピー・スカー（H.P.Scar）、エム・ジー
・グルッター（M.G.Grutter）［1988年構造EMBO J.7巻3
39-343頁］は、逆平行βストランドによって形成される
稜をもった四面体として記述されたが、受容体と相互に
作用するアミノ酸は定義されなかった。IL-1βの生物活
性がタンパク分子の構造的一体性と深く関係している可
能性は非常に大きい。というのは、成熟（即ち完全な）
タンパクからアミノ酸を削除すると、生物活性の重大な
減少が伴うからである。幾つかのグループが、受容体の
配位子相互作用を調べる試みに点突然変異を導入した
［ジョブリングら、1988年；デチアラ・ティー・エム
（Dechiara,T.M.）ら、［1986年］Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 83巻8303-8307頁；モスレー・ビー（Mosley,B.）、
エス・ケー・ダワー、エス・ギリス・ディー・コスマン
（D.Cosman）［1987年］Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84巻4
572-4576頁］。フアンら［フアン・ジェイ・ジェイ（Hu
ang,J.J.）ら［1987年］FEBSレターズ223巻294-298頁］
は、本来のNH2末端配列をalapro-val-arg-serからthr-m
et‐val-arg-serへ変えることによって、IL-1βの生物
活性が４倍から７倍高まることを報告した。しかし、ア
ルギニン120を更に変えて、the-met-val-glu‐serをつ
くると、生物活性が効果的に消えた。円偏光二色性デー
タは、タンパク間の主要な構造の差を示さなかった。グ
ローネンボーンら［グローネンボーン・エイ・エム（Gr
onenborn,A.M.）、ピー・ティー・ウィングフィールド
（P.T.Wingfield）、エッチ・エフ・マクドナルド（H.
F.McDonald）、ユー・シュメイスナー（U.Schmeissne
r）、ジー・エム・クロア（G.M.Clore）［1988年］FEBS
レターズ231巻135-138頁］は、受容体の結合親和性へ影
響を及ぼさずにIL-1アルファヒスチジン及びトリプトフ
ァン残基を突然変異化し、一方マクドナルドら［マクド
ナルド・エッチ・アール（McDonald,H.R.ら［1986年］F
EBSレターズ209巻295-298頁］は、野性型タンパクより2
-100倍少ない競合的結合活性のIL-1ヒスチジンムテイン
類を報告した。受容体結合親和性と生物活性は一般に相
互に関係しているが、この関係は明らかに常に直接的で
はない。
本発明はIL-1の新規で、有用なムテイン類に関する。
これらのムテイン類は、受容体結合親和性を損失せず
に、親分子に比べて低下した生物活性をもっている。更
に詳しくは、本発明は正の荷電をもつ残基（アルギニン
又はリジン）が他の17の天然アミノ酸類の任意のものと
置換された場合の、IL-1ムテイン類に関する。結合活性
に影響せずに生物活性のこの予想外の劇的な変化が起こ
るIL-1分子の特定的な位置は、以下のとおりである。
これらのムテイン類は、受容体結合親和性を損失せず
に、親分子に比べて低下した生物活性をもっている。更
に詳しくは、本発明は正の荷電をもつ残基（アルギニン
又はリジン）が他の17の天然アミノ酸類の任意のものと
置換された場合の、IL-1ムテイン類に関する。結合活性
に影響せずに生物活性のこの予想外の劇的な変化が起こ
るIL-1分子の特定的な位置は、以下のとおりである。
（１）成熟したヒトIL-1β 11位置 （２）ヒトIL-1β前駆体（プロIL-1β） 127位置 （３）ヒトIL-1-アルファ前駆体の131位置、及びびIL-1
-アルファ前駆体の一部に対応し、131位置に対応するア
ミノ酸を含有するその任意の下位ぺプチド類。例えば、
前駆体のセリン残基113から始まる成熟型のヒトIL-1-ア
ルファ中の19位置、又は前駆体のリジン残基119から始
まる成熟型のヒトIL-1-アルファ中の13位置。ヒトIL-1-
アルファ前駆体が少なくとも二つの異なる方法で処理さ
れて、微妙に異なる生物活性の成熟ぺプチド類を生ずる
ことは注目されるべきである［キャメロン・ピー・エム
（Cameron,P.M.）、ジー・リムジュコ（G.Limjuco）、
ジェイ・チン（J.Chin）、エル・シルバーステイン（L.
Silberstein）、及びジェイ・エイ・シュミット［1986
年］J.Exp.Med.164巻237-250頁］。
-アルファ前駆体の一部に対応し、131位置に対応するア
ミノ酸を含有するその任意の下位ぺプチド類。例えば、
前駆体のセリン残基113から始まる成熟型のヒトIL-1-ア
ルファ中の19位置、又は前駆体のリジン残基119から始
まる成熟型のヒトIL-1-アルファ中の13位置。ヒトIL-1-
アルファ前駆体が少なくとも二つの異なる方法で処理さ
れて、微妙に異なる生物活性の成熟ぺプチド類を生ずる
ことは注目されるべきである［キャメロン・ピー・エム
（Cameron,P.M.）、ジー・リムジュコ（G.Limjuco）、
ジェイ・チン（J.Chin）、エル・シルバーステイン（L.
Silberstein）、及びジェイ・エイ・シュミット［1986
年］J.Exp.Med.164巻237-250頁］。
本明細書に特定的に例示されているのは、ヒトプロIL-1
β変異体の調製と試験であり、ここで変異体はArg127は
Gly127へ変換するためのIL-1β cDNAの部位指向性変異
誘発（site-directed mutagenesis）によって調製され
る。Arg127‐Gly127ムテインの生物活性は、野性型IL-1
βより少なくとも100倍少ない。しかし、平衡結合分析
及び競合的結合研究は、Arg127‐Gly127変異体タンパク
の受容体親和性が野性型IL-1βタンパクのそれと区別で
きないことを立証している。Arg127‐Gly127変異体タン
パクは、IL-1β受容体‐配位子相互作用の後に続く、タ
ンパクの複数の作用をもたらす結果の特性化に有用であ
りうる。
β変異体の調製と試験であり、ここで変異体はArg127は
Gly127へ変換するためのIL-1β cDNAの部位指向性変異
誘発（site-directed mutagenesis）によって調製され
る。Arg127‐Gly127ムテインの生物活性は、野性型IL-1
βより少なくとも100倍少ない。しかし、平衡結合分析
及び競合的結合研究は、Arg127‐Gly127変異体タンパク
の受容体親和性が野性型IL-1βタンパクのそれと区別で
きないことを立証している。Arg127‐Gly127変異体タン
パクは、IL-1β受容体‐配位子相互作用の後に続く、タ
ンパクの複数の作用をもたらす結果の特性化に有用であ
りうる。
図１。IL-1βタンパクの生物活性。網状赤血球の翻訳
混合物を培養し、すでに述べたとおりに、胸腺細胞共同
刺激検定において検定した（ジョブリングら、1988
年）。結果は、翻訳混合物の種々の最終希釈度での[3H]
チミジン取入れ（毎分計数）として提示されている。
混合物を培養し、すでに述べたとおりに、胸腺細胞共同
刺激検定において検定した（ジョブリングら、1988
年）。結果は、翻訳混合物の種々の最終希釈度での[3H]
チミジン取入れ（毎分計数）として提示されている。
図２。受容体結合分析。[35S]標識つきIL-1β蛋白質
を、非放射性の競争相手の組換えIL-1βタンパクの非存
在下（−）又は存在下（＋）に、４℃でネズミEL.4細胞
と一緒に培養した。培養後、既述（ジョブリングら、19
88年）のとおりに、シリコーン油を通して細胞を沈殿さ
せた。IL-1βタンパクは、アミノ酸位置に対応する数字
によって、図面の上部に確認される。IL-1（1-269）は
プロIL-1βであるが、IL-1（117-269）は成熟IL-1βタ
ンパクに対応している。図面下部の「天然」及び「Gly
127」の指定は、それぞれ野性型成熟タンパク（Ar
g127）とArg-Gly127ムテインをさす。
を、非放射性の競争相手の組換えIL-1βタンパクの非存
在下（−）又は存在下（＋）に、４℃でネズミEL.4細胞
と一緒に培養した。培養後、既述（ジョブリングら、19
88年）のとおりに、シリコーン油を通して細胞を沈殿さ
せた。IL-1βタンパクは、アミノ酸位置に対応する数字
によって、図面の上部に確認される。IL-1（1-269）は
プロIL-1βであるが、IL-1（117-269）は成熟IL-1βタ
ンパクに対応している。図面下部の「天然」及び「Gly
127」の指定は、それぞれ野性型成熟タンパク（Ar
g127）とArg-Gly127ムテインをさす。
図３。競争的受容体結合。放射性成熟IL-1βタンパク
の一定量を結合培地中の1.9×107個のEL.4細胞に添加し
た。結果は、競争物質の非存在下に特異的に結合した放
射性IL-1βの百分率として提示されている。100％の値
は約30,000cpmを表わす。
の一定量を結合培地中の1.9×107個のEL.4細胞に添加し
た。結果は、競争物質の非存在下に特異的に結合した放
射性IL-1βの百分率として提示されている。100％の値
は約30,000cpmを表わす。
特異的残基の突然変異によるIL-1分子の変換は、IL-1
の生物活性の抑制剤としての有用性をもったムテインを
与える。特定的に開示されているのは、ヒトIL-1βの調
製と試験である。表１は、この変異体が天然の成熟IL-1
βタンパク（すなわち前駆体の残基117-269に由来する
タンパク）と同じく効果的に結合することを示す。IL-1
βペプチドは、[35S]メチオニンの存在に生体外翻訳に
よって合成され、４℃でEL.4細胞と一緒に培養された。
平衡解離定数は、スカチャード・ブロット分析（ジョブ
リングら、1988年）によって決定された。比較のため、
プロIL-1βと二つのIL-1β削除変異体の解離定数も示し
てある。右欄は、成熟野性型IL-1β（100％）に対して
表わされた受容体結合親和性を例示している。
の生物活性の抑制剤としての有用性をもったムテインを
与える。特定的に開示されているのは、ヒトIL-1βの調
製と試験である。表１は、この変異体が天然の成熟IL-1
βタンパク（すなわち前駆体の残基117-269に由来する
タンパク）と同じく効果的に結合することを示す。IL-1
βペプチドは、[35S]メチオニンの存在に生体外翻訳に
よって合成され、４℃でEL.4細胞と一緒に培養された。
平衡解離定数は、スカチャード・ブロット分析（ジョブ
リングら、1988年）によって決定された。比較のため、
プロIL-1βと二つのIL-1β削除変異体の解離定数も示し
てある。右欄は、成熟野性型IL-1β（100％）に対して
表わされた受容体結合親和性を例示している。
図１は、この同じ変異体が成熟IL-1βによって誘発され
る生物活性のわずか１％しか誘発しないことを示す。高
い受容体結合と低い生物活性をもったタンパクが、IL-1
生物活性の抑制剤として作用するという推定は、図３の
データによって支持される。従って、ヒトIL-1βの127
位置でアルギニンをグリシンと置換すると、強い活性を
誘発せずにIL-1受容体に結合し、このため活性型IL-1の
結合に干渉するような新規な分子を生ずる。
る生物活性のわずか１％しか誘発しないことを示す。高
い受容体結合と低い生物活性をもったタンパクが、IL-1
生物活性の抑制剤として作用するという推定は、図３の
データによって支持される。従って、ヒトIL-1βの127
位置でアルギニンをグリシンと置換すると、強い活性を
誘発せずにIL-1受容体に結合し、このため活性型IL-1の
結合に干渉するような新規な分子を生ずる。
過剰な、又は調節されないIL-1は、種々の病気に深く
関連していた。これらは慢性関節リューマチ［例えばフ
ォンタナ（Fontana）ら、［1982年］Arthritis Rheum.2
2巻49-53頁を参照］；骨関節炎［例えばウッド（Wood）
ら、［1983年］Arthritis Rheum.26巻975頁を参照］；
毒物ショック症候群［例えばイケジマ（Ikejima）及び
ジナレロ（Dinarello）［1985年］J.Leukocyte Biology
37巻714頁を参照］；その他の急性又は慢性の炎症性病
状、例えば内毒素によって誘発される炎症性反応［例え
ばハビット（Habcht）及びベック（Beck）［1985年］J.
Leukocyte Biology37巻709頁を参照］；及びその他慢性
の炎症性病状、例えば結核［例えばチェスク（Chesqu
e）ら、［1985年］J.Leukocyte Biology37巻690頁を参
照］を包含している。ベンジャミン（Benjamin）ら
［（1985年）「医化学年報−20」18章173-183頁、アカ
デミックプレス社］は、過剰なIL-1生産が乾せん性関節
炎、ライター症候群、慢性関節リューマチ、骨関節炎、
痛風、外傷性関節炎、ルベラ関節炎、及び急性滑膜炎と
深く関連していることを明らかにしている。
関連していた。これらは慢性関節リューマチ［例えばフ
ォンタナ（Fontana）ら、［1982年］Arthritis Rheum.2
2巻49-53頁を参照］；骨関節炎［例えばウッド（Wood）
ら、［1983年］Arthritis Rheum.26巻975頁を参照］；
毒物ショック症候群［例えばイケジマ（Ikejima）及び
ジナレロ（Dinarello）［1985年］J.Leukocyte Biology
37巻714頁を参照］；その他の急性又は慢性の炎症性病
状、例えば内毒素によって誘発される炎症性反応［例え
ばハビット（Habcht）及びベック（Beck）［1985年］J.
Leukocyte Biology37巻709頁を参照］；及びその他慢性
の炎症性病状、例えば結核［例えばチェスク（Chesqu
e）ら、［1985年］J.Leukocyte Biology37巻690頁を参
照］を包含している。ベンジャミン（Benjamin）ら
［（1985年）「医化学年報−20」18章173-183頁、アカ
デミックプレス社］は、過剰なIL-1生産が乾せん性関節
炎、ライター症候群、慢性関節リューマチ、骨関節炎、
痛風、外傷性関節炎、ルベラ関節炎、及び急性滑膜炎と
深く関連していることを明らかにしている。
ジナレロ（［1985年］J.Clinical Immunol.5巻（５
号）287-297頁）は、IL-1に起因する生物活性を検討し
ている。このように、本発明のIL-1ムテイン類は、過剰
な、又は未調節のIL-1によって起こるヒト又は動物の任
意の病状を予防的又は治療的に処置するのに使用でき
る。
号）287-297頁）は、IL-1に起因する生物活性を検討し
ている。このように、本発明のIL-1ムテイン類は、過剰
な、又は未調節のIL-1によって起こるヒト又は動物の任
意の病状を予防的又は治療的に処置するのに使用でき
る。
更に本発明は、比肩しうる残基が突然変異化されて、
低下した生物活性をもつが、影響されない受容体結合活
性をもったIL-1ムテイン類をつくる場合に、ヒト以外の
種からのIL-1ムテイン類を包含する。このようなIL-1ム
テイン類は、上記のように有用である。
低下した生物活性をもつが、影響されない受容体結合活
性をもったIL-1ムテイン類をつくる場合に、ヒト以外の
種からのIL-1ムテイン類を包含する。このようなIL-1ム
テイン類は、上記のように有用である。
上に開示されたように、IL-1βのArg-Gly変異体型
は、完全に活性のあるIL-1β（117-269）と同等な親和
性をもっている一般的なIL-1高親和性受容体に結合する
が、しかも著しく低下した量の生物活性をもっている。
このため、この変異体はIL-1βの影響について競争的な
抑制剤でありうる。IL-1βは免疫反応と炎症反応双方の
有力な刺激剤であるため、抗炎症剤、抗免疫剤としての
新規な発明の用途がこれから明らかである。
は、完全に活性のあるIL-1β（117-269）と同等な親和
性をもっている一般的なIL-1高親和性受容体に結合する
が、しかも著しく低下した量の生物活性をもっている。
このため、この変異体はIL-1βの影響について競争的な
抑制剤でありうる。IL-1βは免疫反応と炎症反応双方の
有力な刺激剤であるため、抗炎症剤、抗免疫剤としての
新規な発明の用途がこれから明らかである。
例えば、Arg-Gly IL-1β変異体は非経口的に投与され
る抗炎症剤及び下熱剤として一般的な有用性をもちう
る。感染や発熱、及びショックがあるような状況で、循
環水準のIL-1が立証されているため、Arg-Gly変異体の
下熱剤及び抗炎症剤としての用途が明らかである。
る抗炎症剤及び下熱剤として一般的な有用性をもちう
る。感染や発熱、及びショックがあるような状況で、循
環水準のIL-1が立証されているため、Arg-Gly変異体の
下熱剤及び抗炎症剤としての用途が明らかである。
また、IL-1βのArg-Gly変異体は、滑液中にIL-1を含
有することが確認された種々の形の炎症性関節炎におい
て、IL-1抑制剤として使用できる。IL-1が関節液中に立
証された炎症性関節炎には、リウマチ様関節炎、骨関節
炎、及び痛風関節炎がある。リウマチ様関節炎及びその
他の関節炎型での滑液が、IL-1β活性を確かに含み、ま
たこの活性水準が50pg/mlのIL-1βほど低水準で確実に
検出できることが示された［マクドナルド・ビー・エル
（McDonald,B.L.）及びエル・ジェイ・ローゼンワッサ
ー（L.J.Rosenwasser）［1988年］Arthritis and Rheum
atism 31巻（Supp.）52頁；サクスン・ティー（Sax-ne,
T.），ジー・ダブリュー・ダフ（G.W.Duff）、ジー・デ
ィジョヴァイン（G.DiGiovine）、ディー・ヘインガー
ド（D.Heinegard）及びエフ・エイ・ウォールヘイム
（F.A.Wollheim）［1988年］Arthritis and Rheumatism
31巻（Supp.）69頁］。このように、5ng/ml濃度のArg-G
ly変異体の関節内注射は、炎症性関節炎を止めるのに有
効であろう。
有することが確認された種々の形の炎症性関節炎におい
て、IL-1抑制剤として使用できる。IL-1が関節液中に立
証された炎症性関節炎には、リウマチ様関節炎、骨関節
炎、及び痛風関節炎がある。リウマチ様関節炎及びその
他の関節炎型での滑液が、IL-1β活性を確かに含み、ま
たこの活性水準が50pg/mlのIL-1βほど低水準で確実に
検出できることが示された［マクドナルド・ビー・エル
（McDonald,B.L.）及びエル・ジェイ・ローゼンワッサ
ー（L.J.Rosenwasser）［1988年］Arthritis and Rheum
atism 31巻（Supp.）52頁；サクスン・ティー（Sax-ne,
T.），ジー・ダブリュー・ダフ（G.W.Duff）、ジー・デ
ィジョヴァイン（G.DiGiovine）、ディー・ヘインガー
ド（D.Heinegard）及びエフ・エイ・ウォールヘイム
（F.A.Wollheim）［1988年］Arthritis and Rheumatism
31巻（Supp.）69頁］。このように、5ng/ml濃度のArg-G
ly変異体の関節内注射は、炎症性関節炎を止めるのに有
効であろう。
更に、IL-1βは真性糖尿病（DM）で島細胞の破壊に関
与していることが示されたため［マンドラップ＝ポール
セン・ティー（mandrup-Paulsen,T.）、ケイ・ベンドツ
ェン（K.Bendtzen）、ジェイ・ネラップ（J.Nerup）、
シー・エイ・ジナレロ（C.A.Dinarello）、エム・スヴ
ェンソン（M.Svenson）、及びジェイ・エッチ・ニール
ソン（J.H.Nielson）［1986年］Diabetologia 29巻63-6
7頁］、遺伝的背景と家族暦を通して病気にかかりやす
いことが確認された糖尿病の初期の症例において、島細
胞へのリンパ球及び大食細胞を媒介とする損傷を制限す
るために、Arg-Gly変異体を使用できるはずである。す
い臓において抗IL-1効果をもったArg-Gly変異体の局所
濃度をつくりだすために、非経口投与されるArg-Gly変
異体の使用により、初期の糖尿病にかかった人におい
て、すい臓β細胞の炎症性破壊を停止させることができ
るであろう。
与していることが示されたため［マンドラップ＝ポール
セン・ティー（mandrup-Paulsen,T.）、ケイ・ベンドツ
ェン（K.Bendtzen）、ジェイ・ネラップ（J.Nerup）、
シー・エイ・ジナレロ（C.A.Dinarello）、エム・スヴ
ェンソン（M.Svenson）、及びジェイ・エッチ・ニール
ソン（J.H.Nielson）［1986年］Diabetologia 29巻63-6
7頁］、遺伝的背景と家族暦を通して病気にかかりやす
いことが確認された糖尿病の初期の症例において、島細
胞へのリンパ球及び大食細胞を媒介とする損傷を制限す
るために、Arg-Gly変異体を使用できるはずである。す
い臓において抗IL-1効果をもったArg-Gly変異体の局所
濃度をつくりだすために、非経口投与されるArg-Gly変
異体の使用により、初期の糖尿病にかかった人におい
て、すい臓β細胞の炎症性破壊を停止させることができ
るであろう。
最後に、上部下部気道の種々の炎症性気道病におい
て、気道吸入を経由してIL-1ムテイン類を投与すること
も可能である。この範疇に入る病気は鼻炎、喘息、気管
支炎、肺炎、間質性肺線維症、及びIL-1活性の抑制に応
答する幾つかのその他の炎症性肺疾患である。肺の細胞
と気道は、炎症反応中に相当量のIL-1βが発生する領域
を代表していることが立証された。
て、気道吸入を経由してIL-1ムテイン類を投与すること
も可能である。この範疇に入る病気は鼻炎、喘息、気管
支炎、肺炎、間質性肺線維症、及びIL-1活性の抑制に応
答する幾つかのその他の炎症性肺疾患である。肺の細胞
と気道は、炎症反応中に相当量のIL-1βが発生する領域
を代表していることが立証された。
以下は、本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示
した実施例である。これらの実施例は、限定的に考えら
れてはならない。他に注意がなければ、すべての百分率
は重量、すべての溶媒混合物の割合は容量による。
した実施例である。これらの実施例は、限定的に考えら
れてはならない。他に注意がなければ、すべての百分率
は重量、すべての溶媒混合物の割合は容量による。
実施例１ IL-1βタンパクの合成 IL-1βタンパク類は、SP6かT7のメッセンジャーRNAの
生体外翻訳によって合成された。生体外タンパク合成
は、既述のとおりに実施された［ジョブリングら、1988
年；ジョブリング・エス・エイ（Jobling,S.A.）及びエ
ル・ゲールケ（L.Gehrke）［1987年］Nature 325巻622-
625頁］。全構造体mRNAの翻訳効率は、IL-1β mRNAの未
翻訳リーダー配列をアルファルファ・モザイク・ウイル
スRNAのそれと置換することによって高められた［ジョ
ブリングら、1988年；ジョブリングら、1987年］。全IL
-1βタンパク翻訳生成物は、タンパク合成の開始中に付
加されたアミノ末端メチオニン残基を含有する。翻訳生
成物の生物活性は、希釈された翻訳反応混合物の存在下
に培養されたヘルパーＴ細胞（DIO.G4.1）による[3H]チ
ミジン取入れを定量化することによって試験された［ケ
イ・ワイ（Kaye,Y.）、エス・ポルセリ（S.Porcell
i）、ジェイ・タイト（J.Tite）、ビー・ジョーンズ
（B.Jones）、シー・エイ・ジョインウェイ（C.A.Janew
ay）［1983年］J.Exp.Med.158巻836-856頁］（図１）。
結果は、Arg127-Gly127変異体タンパクの半最大生物活
性がプロIL-1βのそれより大きいが、野性型成熟IL-1β
のそれより少なくとも100倍少ないことを立証してい
る。
生体外翻訳によって合成された。生体外タンパク合成
は、既述のとおりに実施された［ジョブリングら、1988
年；ジョブリング・エス・エイ（Jobling,S.A.）及びエ
ル・ゲールケ（L.Gehrke）［1987年］Nature 325巻622-
625頁］。全構造体mRNAの翻訳効率は、IL-1β mRNAの未
翻訳リーダー配列をアルファルファ・モザイク・ウイル
スRNAのそれと置換することによって高められた［ジョ
ブリングら、1988年；ジョブリングら、1987年］。全IL
-1βタンパク翻訳生成物は、タンパク合成の開始中に付
加されたアミノ末端メチオニン残基を含有する。翻訳生
成物の生物活性は、希釈された翻訳反応混合物の存在下
に培養されたヘルパーＴ細胞（DIO.G4.1）による[3H]チ
ミジン取入れを定量化することによって試験された［ケ
イ・ワイ（Kaye,Y.）、エス・ポルセリ（S.Porcell
i）、ジェイ・タイト（J.Tite）、ビー・ジョーンズ
（B.Jones）、シー・エイ・ジョインウェイ（C.A.Janew
ay）［1983年］J.Exp.Med.158巻836-856頁］（図１）。
結果は、Arg127-Gly127変異体タンパクの半最大生物活
性がプロIL-1βのそれより大きいが、野性型成熟IL-1β
のそれより少なくとも100倍少ないことを立証してい
る。
実施例２ 受容体結合特性 Arg127-Gly127変異体タンパクの受容体結合特性は、
特異的に結合されたタンパクのスカチャード分析及びナ
トリウムドデシルスルフェート（SDS）ポリアクリルア
ミドゲル分析によって決定された［ダワーら、1986年；
ジョブリングら、1988年；モスレーら、J.Biol.Chem.19
87年］。ポリアクリルアミドゲル分析には、EL46.1C10
ネズミ胸腺腫細胞を使用する細胞表面受容体結合検定の
前の生体外翻訳中に、IL-1βタンパクに[35S]メチオニ
ンで標識をつけた［ジョブリングら、1988年；モスレー
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987年；マクドナルド・
エッチ・アール・アール・ケイ・リース（R.K.Lees）、
シー・ブロン（C.Bron）［1985年］J.Immunol.135巻394
4頁］（図２）。結合された天然の成熟IL-1β及び結合
されたArg127-Gly127変異体IL-1βを表わすバンドの強
度（図２）は、タンパクの生物活性が同じでない（図
１）という観察にもかかわらず、受容体結合性状が類似
していることを示唆している。平衡結合実験とスカチャ
ード・プロット・データ（表１）は、結合定数の同等で
あることを確認した。
特異的に結合されたタンパクのスカチャード分析及びナ
トリウムドデシルスルフェート（SDS）ポリアクリルア
ミドゲル分析によって決定された［ダワーら、1986年；
ジョブリングら、1988年；モスレーら、J.Biol.Chem.19
87年］。ポリアクリルアミドゲル分析には、EL46.1C10
ネズミ胸腺腫細胞を使用する細胞表面受容体結合検定の
前の生体外翻訳中に、IL-1βタンパクに[35S]メチオニ
ンで標識をつけた［ジョブリングら、1988年；モスレー
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987年；マクドナルド・
エッチ・アール・アール・ケイ・リース（R.K.Lees）、
シー・ブロン（C.Bron）［1985年］J.Immunol.135巻394
4頁］（図２）。結合された天然の成熟IL-1β及び結合
されたArg127-Gly127変異体IL-1βを表わすバンドの強
度（図２）は、タンパクの生物活性が同じでない（図
１）という観察にもかかわらず、受容体結合性状が類似
していることを示唆している。平衡結合実験とスカチャ
ード・プロット・データ（表１）は、結合定数の同等で
あることを確認した。
受容体結合性状のそれ以上の分析として、EL4細胞受
容体への結合について[35S]標識つき野性型成熟IL-1β
と競合させるため、非放射性タンパクを使用した（図
３）。競合的受容体結合は、一定水準の[35S]標識つき
成熟IL-1βと増加濃度の非放射性IL-1β競合翻訳生成物
の存在下に、37℃でEL.4胸腺腫細胞を培養することによ
って実施された。網状赤血球溶解翻訳反応混合物をセフ
ァデックスG-50スパンカラムに通して、取り入れられて
いない[35S]メチオニンを除いてから、細胞と一緒に培
養した［モスレーら、J.Biol.Chem.,1987年］。1.9×10
7個のEL.4細胞を、結合培地（１％牛血清アルブミン、2
0mM HEPES（pH7.4）、及び0.1％ナトリウムアジドを含
有するRPMI 1640培地）250μｌ中で、IL-1β翻訳生成物
の増加量を加えて培養した。生体外翻訳によって合成さ
れたIL-1βタンパクの量は、放射性免疫検定によって定
量化された放射性IL-1βタンパク標準を用いて特異的放
射能によって決定された。非標識つき競合物質の存在
下、又は不在下に、37℃で培養後、遊離及び結合タンパ
クはシリコーン液を通して細胞をペレット化することに
よって分離された（ジョブリングら、1988年）。溶菌緩
衝液（50mM燐酸ナトリウム、pH7;10mMエチレンジアミン
四酢酸（EDTA）;0.1％TRITONTMX‐100;0.1％サルコシ
ル;10mMβ‐メルカプトエタノール）中で細胞を溶解化
してから、液体シンチレーション計数によって結合放射
能を定量化した。平衡結合データは、野性型IL-1β及び
Arg127-Gly127変異体タンパクに対して同じ結合定数を
示唆した（表１）。従って、これらのタンパクが類似の
動力学で[35S]IL-1β結合を阻止することが予想され
た。受容体に対するプロIL-1βの親和性は、成熟型のそ
れより30倍少なく（ジョブリングら、1988年）、このタ
ンパクが細胞受容体に対して野性型成熟IL-1βと効果的
に競合することは予想されなかった。データ（図３）
は、５倍モル過剰までの濃度で、未標識野性型IL-1β及
びArg127-Gly127変異体IL-1βタンパクが野性型成熟IL-
1βより効果的に再現可能に競合したことを立証してい
る。予想のとおり、プロIL-1βタンパクはこれらの濃度
で最小限度に競合した。結合タンパクのSDS-ゲル分析
（図２）、平衡結合データ（表１）、及び競合結合実験
（図３）は、Arg127-Gly127変異体IL-1βタンパクの受
容体結合親和性が影響を受けないが、生物活性は大幅に
低下するとの結論を支持している（図１）。
容体への結合について[35S]標識つき野性型成熟IL-1β
と競合させるため、非放射性タンパクを使用した（図
３）。競合的受容体結合は、一定水準の[35S]標識つき
成熟IL-1βと増加濃度の非放射性IL-1β競合翻訳生成物
の存在下に、37℃でEL.4胸腺腫細胞を培養することによ
って実施された。網状赤血球溶解翻訳反応混合物をセフ
ァデックスG-50スパンカラムに通して、取り入れられて
いない[35S]メチオニンを除いてから、細胞と一緒に培
養した［モスレーら、J.Biol.Chem.,1987年］。1.9×10
7個のEL.4細胞を、結合培地（１％牛血清アルブミン、2
0mM HEPES（pH7.4）、及び0.1％ナトリウムアジドを含
有するRPMI 1640培地）250μｌ中で、IL-1β翻訳生成物
の増加量を加えて培養した。生体外翻訳によって合成さ
れたIL-1βタンパクの量は、放射性免疫検定によって定
量化された放射性IL-1βタンパク標準を用いて特異的放
射能によって決定された。非標識つき競合物質の存在
下、又は不在下に、37℃で培養後、遊離及び結合タンパ
クはシリコーン液を通して細胞をペレット化することに
よって分離された（ジョブリングら、1988年）。溶菌緩
衝液（50mM燐酸ナトリウム、pH7;10mMエチレンジアミン
四酢酸（EDTA）;0.1％TRITONTMX‐100;0.1％サルコシ
ル;10mMβ‐メルカプトエタノール）中で細胞を溶解化
してから、液体シンチレーション計数によって結合放射
能を定量化した。平衡結合データは、野性型IL-1β及び
Arg127-Gly127変異体タンパクに対して同じ結合定数を
示唆した（表１）。従って、これらのタンパクが類似の
動力学で[35S]IL-1β結合を阻止することが予想され
た。受容体に対するプロIL-1βの親和性は、成熟型のそ
れより30倍少なく（ジョブリングら、1988年）、このタ
ンパクが細胞受容体に対して野性型成熟IL-1βと効果的
に競合することは予想されなかった。データ（図３）
は、５倍モル過剰までの濃度で、未標識野性型IL-1β及
びArg127-Gly127変異体IL-1βタンパクが野性型成熟IL-
1βより効果的に再現可能に競合したことを立証してい
る。予想のとおり、プロIL-1βタンパクはこれらの濃度
で最小限度に競合した。結合タンパクのSDS-ゲル分析
（図２）、平衡結合データ（表１）、及び競合結合実験
（図３）は、Arg127-Gly127変異体IL-1βタンパクの受
容体結合親和性が影響を受けないが、生物活性は大幅に
低下するとの結論を支持している（図１）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/545 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＧ (72)発明者 ジーク，リー アメリカ合衆国 01701 マサチューセッ ツ州 フレミング ハム ブルーベリー サークル 11 (72)発明者 アーロン，フィリップ イー. アメリカ合衆国 01721 マサチューセッ ツ州 アシュランド マウンテンゲート ロード 120 (72)発明者 ローゼンワッシャー，レニー アメリカ合衆国 02193 マサチューセッ ツ州 ウエストン シャーバーン サーク ル 58 (56)参考文献 特開 昭63−152398（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，81（1984）Ｐ．7907−7911 Ｎａｔｕｒｅ，315（1985），Ｐ．641− 647
Claims (6)
- 【請求項１】成熟形のIL-1βの11位置に対応する、又は
前駆体形のIL-1βの127位置に対応するアルギニン残基
がグリシン残基に置き換えられているアミノ酸置換を含
んでおり、 実質的に減少したIL-1β活性を有するがIL-1β受容体に
対し結合する、 IL-1βのムテイン。 - 【請求項２】該ムテインがヒトの前駆体IL-1β、又はそ
の機能を有する断片である、請求項１に記載のムテイ
ン。 - 【請求項３】該ムテインがヒトの成熟形IL-1β、又はそ
の機能を有する断片である、請求項１に記載のムテイ
ン。 - 【請求項４】親IL-1分子を部位指向性変異誘発（site-d
irected mutagenesis）にかけることを含めてなる、請
求項１の化合物の製法。 - 【請求項５】成熟形のIL-1βの11位置に対応する、又は
前駆体形のIL-1βの127位置に対応するアルギニン残基
がグリシン残基に置き換えられているアミノ酸置換を含
んでおり、実質的に減少したIL-1β活性を有するがIL-1
β受容体に対し結合するIL-1βのムテインの調節有効量
を含む、過剰なIL-1が調節される必要のあるヒト又は動
物を処置するための、ヒトや動物の病的状態において生
ずる過剰なIL-1を調節する薬剤。 - 【請求項６】成熟形のIL-1βの11位置に対応する、又は
前駆体形のIL-1βの127位置に対応するアルギニン残基
をグリシン残基に置き換えることからなる、実質的にIL
-1β活性を減少させながら、IL-1β受容体に対する結合
を保持する方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US31627889A | 1989-02-27 | 1989-02-27 | |
| US316,278 | 1989-02-27 | ||
| PCT/US1990/000993 WO1990010068A1 (en) | 1989-02-27 | 1990-02-23 | Il-1 biological activity inhibitors |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04503602A JPH04503602A (ja) | 1992-07-02 |
| JPH0824595B2 true JPH0824595B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
ID=23228347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2504068A Expired - Fee Related JPH0824595B2 (ja) | 1989-02-27 | 1990-02-23 | Ｉｌ―１生物活性の抑制剤 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5286847A (ja) |
| EP (1) | EP0460052B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0824595B2 (ja) |
| AT (1) | ATE165114T1 (ja) |
| AU (1) | AU5171890A (ja) |
| CA (1) | CA2046303C (ja) |
| DE (1) | DE69032251T2 (ja) |
| DK (1) | DK0460052T3 (ja) |
| ES (1) | ES2113856T3 (ja) |
| WO (1) | WO1990010068A1 (ja) |
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