JPH08256777A - 翻訳エンハンサー配列およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記の配列１または２で表される塩基配列。 配列１：ACTTCTCTCA ATCCAACTTT TCT 配列２：ACTTCTCTCA ATCCAACTTT TCTATGGCCA TGGCA 【効果】 上記配列が構造遺伝子の５’側に挿入された
場合、この構造遺伝子の発現を活性化する。従って、上
記配列は翻訳エンハンサーとして利用できる。また、前
記配列を含んでなるＤＮＡ鎖で形質転換された形質転換
体は構造遺伝子を高発現させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】技術分野 本発明は、タバコ（Nicotiana sylvestris）が有するよ
うなフェレドキシン結合性サブユニットの５’リーダー
配列中に存在する翻訳を活性化する塩基配列、すなわち
翻訳のエンハンサー（Translational enhancer）として
機能するＤＮＡ鎖およびその使用に関する。

【０００２】背景技術 遺伝子の発現過程において、翻訳の段階は潜在的には重
要と考えられているにもかかわらず、転写制御に比べて
その理解が十分になされているとは言いがたい。真核生
物において翻訳の制御に関して最も良く研究されている
のは、動物のフェリチン(Ferritin)および５’アミノレ
ブリン酸合成酵素 (5'-aminolevulinatesynthase)であ
る。それらの役割は、夫々、鉄の貯蔵と利用に関係して
いる。それらの遺伝子のｍＲＮＡは非翻訳領域に鉄へ反
応する配列 (iron responsible element; IRE)を持って
いる(EMBO J. 10 (1991) 1903-1909) 。鉄飢餓の状態で
は、この配列(IRE) にIRE 結合性タンパク質が結合し
(J. Biol. Chem. 267 (1992)24466-24470) 、その翻訳
を阻害する(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987)847
8-8482)。

【０００３】植物では、ある種の植物ウイルスのｍＲＮ
Ａが宿主植物のｍＲＮＡより効率良く翻訳されることが
知られており、このような現象はそれらのｍＲＮＡの
５’リーダー配列の構造によると考えられている。例え
ば、このような現象は、タバコモザイクウイルス、アル
ファルファモザイクウイルスＲＮＡ４、ブロモモザイク
ウイルスＲＮＡ３、ポテトウイルスＸ、およびタバコエ
ッチウイルスで知られている(Annu. Rev. Plant Physio
l. Plant Mol. Biol. 44 (1993) 985-994)。これらの例
では、リーダー配列には翻訳のエンハンサー配列が存在
しているが、どのようなメカニズムによって制御されて
いるかは明らかにされていない。一方、宿主植物の細胞
では、ｍＲＮＡに翻訳のエンハンサー配列があるかどう
か、ほとんどわかっていない。

【０００４】一方、ｐｓａＤｂ遺伝子は、Nicotiana sy
lvestrisで見いだされた光合成の光化学系Ｉ複合体（Ｐ
ＳＩ）のサブユニットをコードしている核支配の遺伝子
であり(Plant Mol. Biol. 22 (1993) 985-994)、その産
物であるＰＳＩーＤサブユニットはＰＳＩによって還元
される可溶性のフェレドキシンに結合している。近年、
Arabidopsis のフェレドキシン遺伝子ｆｅｄＡのリーダ
ー配列をレポーター遺伝子に連結し一過性検定を行なっ
たところ、遺伝子発現を増幅する効果があったと報告さ
れているが、しかしその増幅が翻訳過程に影響を与えて
いるのかどうかはわかっていない (Plant J. 3 (1993)
161-174)。

【０００５】

【発明の概要】本発明者らは、今般、ｐｓａＤｂ遺伝子
のリーダー配列中に、ｆｅｄＡのリーダー配列と共通の
構造を持つエンハンサー配列が存在することを形質転換
タバコでレポーター遺伝子の発現の様式を解析すること
により見いだした。

【０００６】従って、本発明は、構造遺伝子の５’側に
挿入された場合、この構造遺伝子の発現を活性化する、
翻訳エンハンサー配列の提供をその目的としている。ま
た本発明は、前記エンハンサー配列を含んでなるＤＮＡ
鎖の提供をその目的としている。さらに本発明は、上記
ＤＮＡ鎖で形質転換された宿主、およびこの宿主を利用
した構造遺伝子を高発現させる方法の提供をその目的と
している。

【０００７】具体的には、本発明による翻訳エンハンサ
ー配列は、配列番号１または２に示される配列およびそ
の等価配列である。また、本発明によるＤＮＡ鎖は、上
記翻訳エンハンサーを含んでなるものであり、より具体
的には、構造遺伝子と、該構造遺伝子の発現効率を高め
るよう該構造遺伝子の５’リーダー部位に組み込まれた
上記翻訳エンハンサー配列とを含んでなるもの、であ
る。さらに本発明による形質転換宿主は、上記ＤＮＡ鎖
で形質転換されたもの、である。またさらに本発明によ
る構造遺伝子を高発現させる方法は、上記形質転換宿主
を構造遺伝子が発現可能なように培養または栽培するこ
とからなるもの、である。

【０００８】

【発明の具体的説明】翻訳エンハンサー配列 本発明による翻訳エンハンサー配列は、配列番号１また
は配列番号２に示されているものである。この配列は、
構造遺伝子の翻訳開始点の５’側に挿入されることによ
り、該構造遺伝子を高レベルで発現をさせる。すなわ
ち、翻訳のエンハンサー配列としての性質を有する。従
って、構造遺伝子、とりわけ外来遺伝子の発現効率を高
めるために利用することができる。

【０００９】配列番号１の配列を用いた場合には、その
リーダー配列は翻訳されず、その直後の開始コドンから
翻訳される。一方、配列番号２の配列を用いた場合に
は、その３’側の１２塩基がアミノ酸に翻訳されるので
（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ）、その更に３’側
に付く目的遺伝子とのフュージョン蛋白質となる。

【００１０】また、本発明による配列には、配列番号１
または配列番号２に示されている塩基配列の等価配列も
含まれる。ここで、「その等価配列」とは、配列番号１
または２に示される塩基配列において、いくつかの塩基
の挿入、置換、または欠失、若しくは両末端への付加が
なされたものであって、かつその翻訳活性化の活性を依
然として保持するものをいうものとする。その等価配列
における翻訳活性化の活性の保持とは、その活性を利用
した実際の使用態様において、配列番号１または２に示
される配列を全て有する塩基配列と、同一の条件でほぼ
同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることを
いうものとする。このような「等価配列」は、配列番号
１または２に示される配列を参照すれば、当業者であれ
ば格別の困難性なしに選択し、製造可能であることは明
らかである。本発明による翻訳エンハンサー配列が好ま
しく利用される宿主細胞は植物細胞である。その好まし
い具体例としては、本発明によるエンハンサー配列が単
離されたタバコが属するナス科の植物、例えばトマト、
ジャガイモ、ナス、ピーマン、さらには形質転換が報告
されている他の科の有用植物、例えばキク、ワタ、ダイ
ズ、ナタネ、イネ、ムギ、トウモロコシなどの植物細胞
が挙げられる。

【００１１】本発明によれば、さらに、配列番号１もし
くは２またはそれらの等価配列を含んでなるＤＮＡ鎖が
提供される。

【００１２】本発明によるＤＮＡ鎖の具体的形態は、例
えばプラスミドまたはファージＤＮＡの中に構成員の一
部としてこの配列番号１または２の配列が挿入された形
態であってよい。さらに、プラスミドまたはファージあ
るいはゲノムＤＮＡの中に挿入された形で微生物（特に
細菌）またはファージ粒子あるいは植物の中に存在する
形態であってもよい。なお、ここで、細菌が大腸菌やア
グロバクテリウムを含むことはいうまでもない。

【００１３】本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい存在形態
は、タンパク質を発現させようとしている構造遺伝子
が、植物体中で安定に発現しうるように、プロモータ
ー、本発明による配列番号１もしくは２またはその等価
配列、構造遺伝子ＤＮＡ鎖、翻訳終止コドン、およびタ
ーミネーターとが一体に結合して、これがゲノムに挿入
された形態で植物中に存在するものである。プロモータ
ー、翻訳終止コドン、ターミネーターとしては、公知の
ものを適宜組み合わせて用いる事ができる。利用可能と
考えられるそれらの具体例としては、プロモーターとし
て、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロ
モーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、リブロー
ス２リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユ
ニットのプロモーターなどが挙げられ、またターミネー
ターとしては、ノパリン合成酵素のターミネーター、オ
クトピン合成酵素のターミネーターなどが挙げられる。

【００１４】ＤＮＡ鎖の取得 本発明による配列番号１または２の配列は、核酸合成の
方法に従ってそのＤＮＡ鎖を化学合成することで得るこ
とができる。このＤＮＡ鎖の長さは配列番号１の配列が
２３ｂｐ、ｐｓａＤｂのＮ末端の４アミノ酸に対応する
塩基配列を加えてた配列番号２の配列が３５ｂｐ（配列
番号：２）であるので、市販のＤＮＡ合成機を用いて格
別の困難性なしに合成できる。さらに、これらの配列を
含んでなる上記ＤＮＡ鎖は、遺伝子工学の分野で慣用さ
れている手法を用いて製造することができる。

【００１５】塩基配列の利用／形質転換 上記配列番号１および２で表される配列は、翻訳のエン
ハンサー配列としての用途を有する。これらの配列は、
上記した本発明によるＤＮＡ鎖の形態とされて利用され
るのが好ましい。

【００１６】このようなＤＮＡ鎖によって宿主細胞を形
質転換し、宿主細胞を培養することにより、外来遺伝子
を含む構造遺伝子を高発現させることができる。

【００１７】宿主の好ましい例としては上記した種類の
植物の細胞が挙げられ、さらに具体的な植物材料として
は、葉片、茎片、塊茎片、プロトプラスト、カルス、花
粉、花粉管などが挙げられる。

【００１８】宿主に外来遺伝子を導入する方法として
は、既に報告され確立されている種々の方法を利用する
ことができる。その好ましい例としては、例えばアグロ
バクテリウムのＴｉプラスミドをベクターとして用いる
方法や、植物プロトプラストにエレクトロポレーション
で遺伝子を導入する方法などが挙げられる（’Plant ge
netic transformation and gene expression; a labora
tory manual ’、Draper, J. et. al. eds., Blackwell
Scientific Publication, 1988 参照）。

【００１９】高発現された遺伝子の発現産物は、それ自
体を単離して利用したい場合には、培養物からその発現
産物に適した方法によって単離精製されてよい。さら
に、発現産物の存在により宿主細胞の成長または生育、
さらにはその細胞の性質が改質される場合には、そのよ
うな宿主を培養し、もしくは宿主が脱分化した植物体で
ある場合にはその植物体を栽培することで、目的遺伝子
の発現産物を高発現させる。

【００２０】

【実施例】以下の実施例によって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。実施例１ ：ｐｓａＤｂ遺伝子のリーダー配列の取得 山本らの方法(Plant Mol.Biol. 17(1991) 1251-1254)に
従い、ｐｓａＤａ遺伝子のｃＤＮＡを単離した。このｃ
ＤＮＡ断片を［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識したものをプ
ローブとし、Nicotiana sylvestrisのゲノムＤＮＡのラ
イブラリーをスクリーニングした。その結果、ｐｓａＤ
ａに構造が類似したゲノムクローンを得た。この遺伝子
の構造をダイデオキシ法により解析し(Molecular Cloni
ng; A laboratory manual, 2nd ed. Sambrook et al. e
ds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 参
照) 、また転写開始点をプライマーエクステンション法
により決定した(Plant Mol. Biol. 22(1993)985-994)。
得られたｐｓａＤａ類似の遺伝子はｐｓａＤｂ遺伝子と
であることが確認された。そのリーダー配列は図１Ａに
示されるとおりであった。

【００２１】実施例２ ：キメラＧＵＳ遺伝子の構築 レポーター遺伝子であるベータグルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）と、ｐｓａＤｂ遺伝子のｍＲＮＡのリーダー配列と
のキメラ遺伝子、具体的には図１Ｂに示されるキメラ遺
伝子ＣａＭＶ：：ＧＵＳ、ＣａＭＶ：：ｐｓａＤｂーＧ
ＵＳ’、およびＣａＭＶ：：ＧＵＳ’を構築した。Ｃａ
ＭＶ：：ＧＵＳは、ｐＢＩ１２１として、EMBO J. 6 (1
987) 3901-3907の記載に従い得た。ＣａＭＶ：：ｐｓａ
ＤｂーＧＵＳ’の作成は次のように行った。まず、以下
の２種のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた後、
前記ｐＢＩ２２１のＸｂａＩとＢａｍＨＩ両制限酵素切
断部位の間に挿入し、その塩基配列はシーケンシングに
より確認した。 5'-CTAGACTTCTCTCAATCCAACTTTTCTATGGCCATGGCAC-3' 5'-GATCGTGCCATGGCCATAGAAAAGTTGGATTGAGAGAAGT-3' このようにして作成したキメラ遺伝子を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＨｉｎｄIII により切り出して、プロモーターを
欠くプラスミドであるｐＢＩ１０１を同一酵素の組み合
わせで処理してキメラＧＵＳ入りのｐＢＩ１０１からの
誘導プラスミドとしてＣａＭＶ：：ｐｓａＤｂーＧＵ
Ｓ’を作成した。ＣａＭＶ：：ＧＵＳ’は、以下に示す
２種のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた後、
２）と同様にｐＢＩ１０１へ挿入し作成した。 5'-CTAGATGGCTATGGCTC-3' 5'-GATCGAGCCATAGCCAT-3'

【００２２】なおここで、ｐｓａＤｂのｍＲＮＡのリー
ダー配列は２３塩基の非翻訳配列からなるＤＮＡ鎖であ
り、そのなかの翻訳開始点近くに２箇所のパリンドロミ
ックシーケンスを取りうる配列がある。キメラ遺伝子Ｃ
ａＭＶ：：ｐｓａＤｂーＧＵＳ’は、その２３塩基の配
列に加えて、Ｎ末端の４アミノ酸に対応する塩基配列を
同時にＣａＭＶ：：ＧＵＳ入れたものである。しかしな
がら、その余分なアミノ酸配列が酵素の比活性や安定性
に影響することも考えられたので、ｐｓａＤｂの２３ｂ
ｐのリーダー配列を欠くＣａＭＶ：：ＧＵＳ’を作成し
た。このコントロールプラスミドＣａＭＶ：：ＧＵＳ’
と、ＣａＭＶ：：ｐｓａＤｂーＧＵＳ’とを比較する
と、そのアミノ酸配列は同一であるが、翻訳開始のＡＴ
Ｇから数えて６番目と１２番目の塩基が変わっている。
その結果、２つのキメラ遺伝子がコードするタンパク質
は同一であるが、翻訳開始点近傍に予想されるパリンド
ロミックシーケンスがＣａＭＶ：：ＧＵＳ’では破壊さ
れている（図１Ｃ中の鏑で示した位置）。

【００２３】実施例３：タバコの形質転換とＧＵＳ活性
の測定 実施例２で得られたキメラＧＵＳ遺伝子を有するバイナ
リーベクターを、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４へ
導入した。次に、常法に従ってタバコ（Nicotiana taba
cum cv Petit Havana SR1 ）のリーフディスクへ形質転
換した(Plant molecular biology manual (Gelvin, S.
B. et. al.(1988) pp. A5/1-A5/9, Kluwer Academic P
ublishers, Dordrecht) 。植物は、２５℃、２４時間日
長で栽培した。再分化してきた形質転換体を（Ｍ０世
代）、培養容器（シグマ社；Magenta GA-7）で育成し
た。その後収穫し、液体窒素で凍結したものを粉砕し、
−８０℃に保ったフリーザーで保存した。その一部をＧ
ＵＳ活性測定に(EMBO J.6 (1987) 3901-3907) 、また、
一部をＲＮＡ抽出に使用した。タンパク量を、ブラッド
フォードの方法に従って測定し、ＧＵＳ活性をタンパク
量当たりに換算した(Anal. Biochem. 72 (1976) 248-25
4)。その結果は図２に示されるとおりであった。

【００２４】図２から明らかなように、定常状態でのＧ
ＵＳ活性を、夫々のキメラ遺伝子を導入したタバコ個体
毎に測定したところコントロール植物（ＣａＭＶ：：Ｇ
ＵＳおよびＣａＭＶ：：ＧＵＳ’）に比べてｐｓａＤｂ
の配列を持つもの（ＣａＭＶ：：ｐｓａＤｂーＧＵ
Ｓ’）では、はるかに高いＧＵＳ活性が検出された。

【００２５】実施例４：ＲＮＡ分析 上述のようにして得た粉末試料から、ＡＧＰＣ法により
ＲＮＡを抽出し(Anal.Biochem. 162(1987) 156-159)、
フェノール／クロロホルム抽出を３回行ない、ＬｉＣｌ
により高分子ＲＮＡを選択的に沈殿させる事により全Ｒ
ＮＡ画分を得た。ＧＵＳ遺伝子特異的なプライマー（5'
-GTCGAGTTTTTTGATTTCACGGGTTGGGGTTTCTA-3' ）の５’末
端を³²Ｐでラベルし、プライマー エクステンション分
析を行なった(Plant Mol. Biol. 22 (1993) 985-994)。
産物は８Ｍの尿素を含む６％のポリアクリルアミドゲル
で電気泳動し、そのオートラジオグラフィーをFujix BA
S2000 イメージ アナライザー（Fuji Photo Inc、 Japa
n ）で分析した。

【００２６】実施例３で判明したＧＵＳ活性の上昇は、
翻訳活性の増加以外に、転写活性を増加させるｃｉｓ因
子がそのリーダー配列内にあることや、転写産物の安定
化が機構として考えられた。そこで、まず、定常状態で
の夫々のキメラ遺伝子のｍＲＮＡの量を、上記のプライ
マー エクステンションにより求めた。その結果は図３
に示されるとおりであった。

【００２７】この図３から明らかなように、エクステン
ション産物の大きさは、キメラ遺伝子の構造によって異
なるが、非形質転換体（ＳＲ１）以外からは、夫々特異
的なバンドが検出された。

【００２８】次に、形質転換体毎に、ＧＵＳの活性とｍ
ＲＮＡの量比を調べることにより、ｍＲＮＡあたりのＧ
ＵＳの翻訳効率を求めた。その結果は図４に示されると
おりであった。

【００２９】図４に示されるように、驚くべきことにＣ
ａＭＶ：：ｐｓａＤｂーＧＵＳ’ではＣａＭＶ：：ＧＵ
Ｓ’より平均して１４倍も高い効率であることが判明し
た。このように、ｐｓａＤｂの２３塩基のリーダー配列
または翻訳開始点近傍に予想されるパリンドロミックシ
ーケンスが、ＧＵＳ’のｍＲＮＡの翻訳効率を著しく高
めることが判明した。また、ＣａＭＶ：：ＧＵＳとＣａ
ＭＶ：：ＧＵＳ’を比較すると、後者が平均で５倍以上
のＧＵＳ活性を示していた。このことは、タンパク質に
翻訳されない２５塩基に続く、翻訳される１２塩基（４
アミノ酸に対応）が、その３’側に続くタンパク質、例
えばＧＵＳの安定性や酵素活性を上げること、あるい
は、その４アミノ酸中の２つのメチオニンが翻訳効率を
上げていることを示唆している(Biochemistry 29 (199
0) 10562-10566 、およびMol. Gen.Genet. 238 (1993)
59-64)。

【００３０】実施例５：最近、カスパーとクエイルがAr
abidopsis のフェレドキシン遺伝子（ｆｅｄＡ）の５’
非翻訳領域が遺伝子発現を増大させる事を、アラビドプ
シスの実生を用いた一過性の検定から報告している(Pla
nt J. 3 (1993) 161-174) 。この増加が転写段階に効い
ていることによるのか、あるいは転写後の過程に効いて
いることによるのかは明らかではない。しかし、この遺
伝子とｐｓａＤｂのリーダー配列が、類似の機構によっ
てレポーター遺伝子の翻訳効率を高めているのではない
かと想像されたので、両者のリーダー配列を比較した
（図５）。その結果、２箇所に共通のモチーフが検出さ
れ、２つを合わせるとｐｓａＤｂのリーダー配列の半分
以上を占めることがわかった。それら２つのモチーフを
夫々ＬＭ１（ＴＣＴＣＡＡ）、ＬＭ２（ＣＡＡＣＴＴ
Ｔ）と名付けた。

【００３１】これら２箇所の配列が、実際翻訳のエンハ
ンサー配列として機能しているかどうかを調べるため
に、それらの配列を他の配列に置き換えたキメラ遺伝子
（ＣａＭＶ：：ｐｓａＤｂＬＭーＧＵＳ’）を作成し
た。具体的には、以下に示す２種のオリゴヌクレオチド
をアニーリングさせた後、２）と同様にｐＢＩ１０１へ
挿入し作成した。 5'-CTAGACTTCGAGACCTCACCAGGGTCTATGGCCATGGCAC-3' 5'-GATCGTGCCATGGCCATAGACCCTGGTGAGGTCTCGAAGT-3'

【００３２】そして、実施例３の場合と同様に、形質転
換体を得て、この形質転換体におけるＧＵＳ活性を調べ
た。その結果は、図７に示されるとおりであった。

【００３３】図７より明らかなように、２つのモチーフ
を他の塩基配列に置き換えると翻訳効率（ｍＲＮＡ当た
りのＧＵＳ活性）が２０分の１に減少した。このこと
は、これら２つのモチーフＬＭ１とＬＭ２の両者又は一
方が翻訳のエンハンサーとして必須の構成要素であるこ
とを明確に示すものである。

【００３４】実施例６：発現様式 いずれのキメラ遺伝子を分析した場合においても、子
葉、本葉、および根を用いてプライマーエクステンショ
ン法により発現の器官特異性を調べた。その結果、どの
器官でも同様の発現様式を示した。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類；Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源： 生物名：タバコ 株名：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ 配列： ACTTCTCTCA ATCCAACTTT TCT 23

【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類；Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源： 生物名：タバコ 株名：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ 配列： ACTTCTCTCA ATCCAACTTT TCTATGGCCA TGGCA 35

【図面の簡単な説明】

【図１】レポーター遺伝子であるベータグルクロニダー
ゼ（ＧＵＳ）とｐｓａＤｂのｍＲＮＡのリーダー配列と
のキメラ遺伝子の構築法を概説した図である。（Ａ）
は、ｐｓａＤｂのｍＲＮＡのリーダー配列を示し、＋１
は転写開始点を示す。矢印はパリンドロミックシーケン
スを示す。塩基配列の下には、予想されるアミノ酸配列
を記した。（Ｂ）はキメラＧＵＳ遺伝子の概略図を示
し、矢印が転写開始点を表す。ＣａＭＶ：：ＧＵＳはプ
ラスミドｐＢＩ１２１自体で、基になる遺伝子構成であ
る。ＣａＭＶ：：ｐｓａＤｂーＧＵＳ’は、ＣａＭ
Ｖ：：ＧＵＳの非翻訳部のリーダー配列に(A) で示した
ｐｓａＤｂのリーダー配列を挿入して作成したものであ
る。ＣａＭＶ：：ＧＵＳ’はｐｓａＤｂの２３ｂｐのリ
ーダー配列を欠くことと、（Ｃ）で示すように２塩基の
置換があることを除いてはＣａＭＶ：：ｐｓａＤｂーＧ
ＵＳ’と同じである。（Ｃ）は、制限酵素ＸｂａＩの認
識配列（ＴＣＴＡＧＡ）の下流の塩基配列を示し、ＧＵ
Ｓタンパク質のＮ末端で位置を揃えて表示した。下線部
は挿入したｐｓａＤｂの配列を、鏑は予想されるパリン
ドロミックシーケンスを破壊すると思われる塩基置換の
位置を示す。

【図２】ｐｓａＤｂ由来のリーダー配列を挿入する事に
より、形質転換タバコでＧＵＳの活性が増加したことを
表す図である。活性は、タバコの成熟した葉を用いて測
定し、図では活性を対数表示している。

【図３】キメラＧＵＳ遺伝子を導入したタバコでのｍＲ
ＮＡレベルを示した図である。非形質転換タバコ（ＳＲ
１）と形質転換タバコから調製した全ＲＮＡをプラーマ
ー エクステンション解析に供した。数字は図２と同じ
形質転換系統番号を示し、鏑はキメラＧＵＳ遺伝子のｍ
ＲＮＡに対応するバンドの位置を表す。非形質転換体
（ＳＲ１）からは、特異的なシグナルは検出され無かっ
た。

【図４】ＧＵＳ活性とＧＵＳのｍＲＮＡの比率を示す図
である。（Ａ）はＣａＭＶ：：ＧＵＳを導入した形質転
換タバコのＧＵＳ活性を１とし、ＧＵＳの活性とｍＲＮ
Ａの比を形質転換体ごとに求めた。数字は第２図と同一
の形質転換タバコの番号を示す。（Ｂ）はキメラ遺伝子
毎の平均値と標準誤差を示す。

【図５】Ｎ. ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓのｐｓａＤｂとＡ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｆｅｄＡ遺伝子の５’リーダー
配列の比較を示す図である。２つの保存されているモチ
ーフＬＭー１、およびＬＭー２には下線を記した。

【図６】２つのリーダー配列ＬＭ１およびＬＭ２の塩基
配列の他の配列への置き換えを説明する図である。キメ
ラ遺伝子ＣａＭＶ：：ｐｓａＤｂーＧＵＳ’において、
２つのリーダー配列ＬＭ１およびＬＭ２の塩基配列を他
の配列に置き換えることによって（影を付けた配列）、
新たなキメラ遺伝子ＣａＭＶ：：ｐｓａＤｂＬＭーＧＵ
Ｓ’を作成した。

【図７】ＧＵＳの活性とｍＲＮＡの比率を、ＣａＭ
Ｖ：：ｐｓａＤｂーＧＵＳ’またはＣａＭＶ：：ｐｓａ
ＤｂＬＭーＧＵＳ’を導入した形質転換タバコごと、お
よびキメラごとの平均値を示す図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１に示される配列およびその等価
   配列。
2. 【請求項２】配列番号２に示される配列およびその等価
   配列。
3. 【請求項３】請求項１または２記載の配列を含んでな
   る、ＤＮＡ鎖。
4. 【請求項４】構造遺伝子と、該構造遺伝子の発現効率を
   高めるよう該構造遺伝子の５’リーダー部位に組み込ま
   れた請求項１または２記載の配列とを含んでなる、請求
   項３記載のＤＮＡ鎖。
5. 【請求項５】請求項４記載のＤＮＡ鎖で形質転換され
   た、宿主。
6. 【請求項６】宿主が植物細胞である、請求項５記載の宿
   主。
7. 【請求項７】請求項６記載の宿主を前記構造遺伝子が発
   現可能なように培養または栽培することからなる、植物
   で外来遺伝子を高発現させる方法。