JPH0826073B2 - 精製されたＵｓｎＲＮＰ複合体を構成するポリペプチド鎖、その製造法および抗ＵｓｎＲＮＰ抗体の測定法 - Google Patents
精製されたＵｓｎＲＮＰ複合体を構成するポリペプチド鎖、その製造法および抗ＵｓｎＲＮＰ抗体の測定法Info
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- JPH0826073B2 JPH0826073B2 JP2112129A JP11212990A JPH0826073B2 JP H0826073 B2 JPH0826073 B2 JP H0826073B2 JP 2112129 A JP2112129 A JP 2112129A JP 11212990 A JP11212990 A JP 11212990A JP H0826073 B2 JPH0826073 B2 JP H0826073B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、自己免疫病，自己免疫現象の予知，診断等
に有効に利用される精製されたUsnRNP複合体を構成する
ポリペプチド鎖、その製造法および抗UsnRNP抗体の測定
法に関する。
に有効に利用される精製されたUsnRNP複合体を構成する
ポリペプチド鎖、その製造法および抗UsnRNP抗体の測定
法に関する。
低分子リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体は１本のRNA鎖と
６ないし９本のポリペプチド鎖から構成される複合体粒
子であり構成RNA鎖、および構成ポリペプチド鎖の種類
によりU1，U2，U4，U5，U6RNPに分類される。またこれ
らのUsnRNPは動物の細胞核内に普遍的に存在し、その抗
原性は種を越えて共通である。通常、健常人においては
該複合体に対する抗体群を保有しないが、自己免疫病、
特に全身性紅斑性狼瘡（SLE），混合型結合組織病（MCT
D）の患者においては血清中に該複合体に対する抗体群
を保有する。
６ないし９本のポリペプチド鎖から構成される複合体粒
子であり構成RNA鎖、および構成ポリペプチド鎖の種類
によりU1，U2，U4，U5，U6RNPに分類される。またこれ
らのUsnRNPは動物の細胞核内に普遍的に存在し、その抗
原性は種を越えて共通である。通常、健常人においては
該複合体に対する抗体群を保有しないが、自己免疫病、
特に全身性紅斑性狼瘡（SLE），混合型結合組織病（MCT
D）の患者においては血清中に該複合体に対する抗体群
を保有する。
したがつて、患者血清中の該抗体群を検出する臨床上
の本質的意義は、自己免疫病および自己免疫現象の予
知，診断またはフオローアツプにある。
の本質的意義は、自己免疫病および自己免疫現象の予
知，診断またはフオローアツプにある。
従来から、リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に対する抗
体群としては抗RNP抗体群と抗Sm抗体群が広く知られて
いる。ところが、これら両抗体群はいずれも対応するリ
ボ核蛋白質（UsnRNP）複合体上の異なつた抗原決定基に
対する抗体の集合体であり、構成抗体の組み合せおよび
量は患者によつて多様である。しかしながら実際に、リ
ボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に対する抗体は、抗RNP抗
体群および抗Sm抗体群の２群に区別して検出されている
にすぎない。これは因習的に管理された抗RNP抗体群あ
るいは抗Sm抗体群を含有する基準血清と粗抗原液との反
応様式に対比させて例えば２元免疫拡散法による出現沈
降線の融合現象により検出されているからであり、抗原
が精製されたものである必要がなかつた。
体群としては抗RNP抗体群と抗Sm抗体群が広く知られて
いる。ところが、これら両抗体群はいずれも対応するリ
ボ核蛋白質（UsnRNP）複合体上の異なつた抗原決定基に
対する抗体の集合体であり、構成抗体の組み合せおよび
量は患者によつて多様である。しかしながら実際に、リ
ボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に対する抗体は、抗RNP抗
体群および抗Sm抗体群の２群に区別して検出されている
にすぎない。これは因習的に管理された抗RNP抗体群あ
るいは抗Sm抗体群を含有する基準血清と粗抗原液との反
応様式に対比させて例えば２元免疫拡散法による出現沈
降線の融合現象により検出されているからであり、抗原
が精製されたものである必要がなかつた。
リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体の精製および単離につ
いては多くの方法が科学文献に記載されている〔J.Bio
l.Chem.第258巻第2604〜2613頁（1983）等参照〕。大抵
の方法においては、イオン交換クロマトグラフイ，分子
篩クロマトグラフイあるいはこれら両クロマトグラフイ
を組み合わせることにより、また方法によつてはさらに
免疫吸着クロマトグラフイを組み合わせることにより精
製が行われる。しかし、いずれの場合もリボ核蛋白質
（UsnRNP）複合体として精製および単離する方法に関す
るものであつた。
いては多くの方法が科学文献に記載されている〔J.Bio
l.Chem.第258巻第2604〜2613頁（1983）等参照〕。大抵
の方法においては、イオン交換クロマトグラフイ，分子
篩クロマトグラフイあるいはこれら両クロマトグラフイ
を組み合わせることにより、また方法によつてはさらに
免疫吸着クロマトグラフイを組み合わせることにより精
製が行われる。しかし、いずれの場合もリボ核蛋白質
（UsnRNP）複合体として精製および単離する方法に関す
るものであつた。
前述のごとく、低分子リボ核蛋白質は、一本のRNA鎖
に強固に非共有結合した数本のポリペプチド鎖より構成
されるが、この結合は生理的条件下では解離しない。ま
た、構成ポリペプチド鎖のうちあるものは抗RNP抗体
と、またあるものは抗Sm抗体と反応できる。さらにいず
れの抗体とも反応するポリペプチド鎖もある。
に強固に非共有結合した数本のポリペプチド鎖より構成
されるが、この結合は生理的条件下では解離しない。ま
た、構成ポリペプチド鎖のうちあるものは抗RNP抗体
と、またあるものは抗Sm抗体と反応できる。さらにいず
れの抗体とも反応するポリペプチド鎖もある。
したがつて従来の技術では抗RNP抗体とのみ反応する
抗原標品を得ることは困難であるばかりか、このような
抗原標品を使つた自己免疫疾患者の抗体を検出する方法
を開発することも困難であつた。
抗原標品を得ることは困難であるばかりか、このような
抗原標品を使つた自己免疫疾患者の抗体を検出する方法
を開発することも困難であつた。
そこで、本発明者らは低分子リボ核蛋白質を構成する
ポリペプチド鎖を、その抗原性を消失させることなく単
離する方法につき鋭意研究した結果、本発明を完成させ
た。
ポリペプチド鎖を、その抗原性を消失させることなく単
離する方法につき鋭意研究した結果、本発明を完成させ
た。
本発明は、動物の組織抽出物からUsnRNP複合体を抽出
し、次いで非イオン系界面活性剤の存在下に、単離対象
であるポリペプチド鎖を他のUsnRNP複合体構成要素から
解離させた状態でイオン交換クロマトグラフイを行な
い、該ポリペプチド鎖を含有する画分を分取し、その後
に分子篩クロマトグラフイにより単離対象であるポリペ
プチド鎖を分別し、抗RNP抗体と特異的に反応する画分
を取得することを特徴とする、精製されたUsnRNP複合体
を構成するポリペプチド鎖の製造法（以下、第１の発明
という）、その製造法によって得られるポリペプチド鎖
並びに、該ポリペプチド鎖を抗原として使用し、該ポリ
ペプチド鎖に対する抗体を検出又は定量することを特徴
とする抗UsnRNP抗体の測定法（以下、第２の発明とい
う）に関する。
し、次いで非イオン系界面活性剤の存在下に、単離対象
であるポリペプチド鎖を他のUsnRNP複合体構成要素から
解離させた状態でイオン交換クロマトグラフイを行な
い、該ポリペプチド鎖を含有する画分を分取し、その後
に分子篩クロマトグラフイにより単離対象であるポリペ
プチド鎖を分別し、抗RNP抗体と特異的に反応する画分
を取得することを特徴とする、精製されたUsnRNP複合体
を構成するポリペプチド鎖の製造法（以下、第１の発明
という）、その製造法によって得られるポリペプチド鎖
並びに、該ポリペプチド鎖を抗原として使用し、該ポリ
ペプチド鎖に対する抗体を検出又は定量することを特徴
とする抗UsnRNP抗体の測定法（以下、第２の発明とい
う）に関する。
まず第１の発明について詳細に説明する。
動物の細胞抽出液または細胞核抽出液からリボ核蛋白
質（UsnRNP）複合体を抽出する過程において、該複合体
は希薄塩濃度もしくは生理的塩濃度で可溶化されるが、
同時に可溶化される考えられうるすべての蛋白分解酵素
による侵襲から保護するため蛋白分解酵素に対する阻害
剤を添加した抽出用緩衝液で抽出されるのが好ましい。
さらにこの抽出操作に関し、なるべく多くのリボ核蛋白
質（UsnRNP）複合体を得るために被抽出対象物からの抽
出は２回行い、２回の抽出物を合体するのが好ましい。
また、抽出液中のリボ核蛋白質（UsnRNP）複合体の検出
は操作が簡易であることから２元免疫拡散法により行う
のが好ましい。
質（UsnRNP）複合体を抽出する過程において、該複合体
は希薄塩濃度もしくは生理的塩濃度で可溶化されるが、
同時に可溶化される考えられうるすべての蛋白分解酵素
による侵襲から保護するため蛋白分解酵素に対する阻害
剤を添加した抽出用緩衝液で抽出されるのが好ましい。
さらにこの抽出操作に関し、なるべく多くのリボ核蛋白
質（UsnRNP）複合体を得るために被抽出対象物からの抽
出は２回行い、２回の抽出物を合体するのが好ましい。
また、抽出液中のリボ核蛋白質（UsnRNP）複合体の検出
は操作が簡易であることから２元免疫拡散法により行う
のが好ましい。
その後に、該抽出液に粉末の硫酸アンモニウム等の塩
析剤を添加することで蛋白質の塩析沈澱を行う。例えば
硫酸アンモニウムの飽和度30％ないし60％で沈澱する画
分を遠心により集める。次に、得られた沈澱蛋白をなる
べく少量のイオン交換クロマトグラフイ用開始緩衝液に
溶解し、かつイオン交換クロマトグラフイ用開始緩衝液
に対し２昼夜透析する。本発明においてはこのイオン交
換クロマトグラフイ用開始緩衝液は非イオン系界面活性
剤を含有する。このような緩衝液を用いた場合、リボ蛋
白質（UsnRNP）複合体を構成するあるポリペプチド鎖は
その溶液環境下で該複合体から解離するものと思われ
る。なぜならば実際に、その後のイオン交換クロマトグ
ラフイ用担体に解離したポリペプチド鎖としてイオン結
合するからである。従つて、非イオン系界面活性剤は、
解離させうるに必要な濃度で存在させる。
析剤を添加することで蛋白質の塩析沈澱を行う。例えば
硫酸アンモニウムの飽和度30％ないし60％で沈澱する画
分を遠心により集める。次に、得られた沈澱蛋白をなる
べく少量のイオン交換クロマトグラフイ用開始緩衝液に
溶解し、かつイオン交換クロマトグラフイ用開始緩衝液
に対し２昼夜透析する。本発明においてはこのイオン交
換クロマトグラフイ用開始緩衝液は非イオン系界面活性
剤を含有する。このような緩衝液を用いた場合、リボ蛋
白質（UsnRNP）複合体を構成するあるポリペプチド鎖は
その溶液環境下で該複合体から解離するものと思われ
る。なぜならば実際に、その後のイオン交換クロマトグ
ラフイ用担体に解離したポリペプチド鎖としてイオン結
合するからである。従つて、非イオン系界面活性剤は、
解離させうるに必要な濃度で存在させる。
非イオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレン
ノニルフエニルエーテル，ポリオキシエチレンオクチル
フエニルエーテル，ポリオキシエチレンヘプタメチルヘ
キシルエーテル，ポリオキシエチレンメチルドデシルエ
ーテル，ポリオキシエチレン脂肪酸エステル，ポリオキ
シエチレンソルビトールエステルなどが使用できる。ま
たその濃度は、0.03〜0.3％（重量／容積）が好まし
い。
ノニルフエニルエーテル，ポリオキシエチレンオクチル
フエニルエーテル，ポリオキシエチレンヘプタメチルヘ
キシルエーテル，ポリオキシエチレンメチルドデシルエ
ーテル，ポリオキシエチレン脂肪酸エステル，ポリオキ
シエチレンソルビトールエステルなどが使用できる。ま
たその濃度は、0.03〜0.3％（重量／容積）が好まし
い。
つづいてこの透析物を、イオン交換クロマトグラフイ
用担体を充填したカラムに通し、ポリペプチド鎖を該官
能基とイオン結合させる。
用担体を充填したカラムに通し、ポリペプチド鎖を該官
能基とイオン結合させる。
イオン交換クロマトグラフイ用担体としては、ジエチ
ルアミノエチル基，ジエチル−（α−ハイドロキシ−プ
ロピル）アミノエチル基，ポリエチレンイミン基，アミ
ン混合体等の官能基を保有する球状または微顆粒状の架
橋アガロース，架橋デキストラン，架橋セルロース，ポ
リメタクリレート系樹脂，スチレン／ジビニルベンゼン
コポリマー，親水性シリカ等が使用できる。
ルアミノエチル基，ジエチル−（α−ハイドロキシ−プ
ロピル）アミノエチル基，ポリエチレンイミン基，アミ
ン混合体等の官能基を保有する球状または微顆粒状の架
橋アガロース，架橋デキストラン，架橋セルロース，ポ
リメタクリレート系樹脂，スチレン／ジビニルベンゼン
コポリマー，親水性シリカ等が使用できる。
このようなイオン交換クロマトグラフイー用担体とし
て、DEAE−セフアデツクス（Sephadex）,DEAE−セフア
ロース（Sapharose）,DEAE−セルロース（Cellulose）,
DEAE−セフアセル（Sephacel）,DEAE−バイオゲル（Bio
Gel），セルロース（Cellulose）−DEAE,QAE−セフア
デツクス（Sephadex），セルロース（Cellulose）−TEA
E等が市販されている。
て、DEAE−セフアデツクス（Sephadex）,DEAE−セフア
ロース（Sapharose）,DEAE−セルロース（Cellulose）,
DEAE−セフアセル（Sephacel）,DEAE−バイオゲル（Bio
Gel），セルロース（Cellulose）−DEAE,QAE−セフア
デツクス（Sephadex），セルロース（Cellulose）−TEA
E等が市販されている。
イオン交換クロマトグラフイーは、カラムに詰めたイ
オン交換担体の全イオン交換容量の範囲内の量で、流速
150ml/時間以下（Fast flowの場合は0.7l/時間以下）、
特に50〜100ml/時間の条件で行なうのが好ましい。
オン交換担体の全イオン交換容量の範囲内の量で、流速
150ml/時間以下（Fast flowの場合は0.7l/時間以下）、
特に50〜100ml/時間の条件で行なうのが好ましい。
その後、該カラムを過剰量のイオン交換クロマトグラ
フイ用開始緩衝液で官能基とイオン結合しない他の核酸
および蛋白成分あるいはポリペプチド鎖を洗浄除去す
る。カラム洗浄後、緩衝液中のイオン強度を塩類を添加
することにより増加させ、官能基に捕捉されたポリペプ
チド鎖との間でイオン交換反応を行いポリペプチド鎖を
溶離する。溶離液は画分として集め、２元免疫拡散法に
よりリボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に由来するポリペプ
チド鎖の含有を検出し、該ポリペプチド鎖を含有する画
分を合体して排除限界分子量が10,000である例えばポリ
サルフオンを材質とする限外濾過膜で窒素ガス加圧下、
その後につづいて行う分子篩クロマトグラフイカラム体
積の約1/50まで濃縮する。
フイ用開始緩衝液で官能基とイオン結合しない他の核酸
および蛋白成分あるいはポリペプチド鎖を洗浄除去す
る。カラム洗浄後、緩衝液中のイオン強度を塩類を添加
することにより増加させ、官能基に捕捉されたポリペプ
チド鎖との間でイオン交換反応を行いポリペプチド鎖を
溶離する。溶離液は画分として集め、２元免疫拡散法に
よりリボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に由来するポリペプ
チド鎖の含有を検出し、該ポリペプチド鎖を含有する画
分を合体して排除限界分子量が10,000である例えばポリ
サルフオンを材質とする限外濾過膜で窒素ガス加圧下、
その後につづいて行う分子篩クロマトグラフイカラム体
積の約1/50まで濃縮する。
なお、限外濾過膜としては、ポリサルフオン系の他、
ポリ−ｎ−フエニレンイソフタルアミド系（芳香族ポリ
アミド系），ポリスチレンスルホン酸ソーダとポリビニ
ルベンジルトリメチルアンモニウムクロライドの複合
体、セルロース系のものなどを使用することもできる。
ポリ−ｎ−フエニレンイソフタルアミド系（芳香族ポリ
アミド系），ポリスチレンスルホン酸ソーダとポリビニ
ルベンジルトリメチルアンモニウムクロライドの複合
体、セルロース系のものなどを使用することもできる。
その後更に、キレート剤を含有する燐酸緩衝生理食塩
液で平衡化した１×104ないし1.3×103の蛋白分画範囲
を有する球状架橋アガロースを充填したカラムを通すこ
とにより分子篩クロマトグラフイを行いポリペプチド鎖
を分離できる。担体としては前記球状架橋アガロースの
他、前記蛋白分画範囲を有する球状又は微顆粒状の架橋
デキストラン，架橋セルロース,N,N′−メチレンビスア
クリルアミドとアリルデキストランの架橋物，多孔性ポ
リアクリルアミド、などを用いることもできる。
液で平衡化した１×104ないし1.3×103の蛋白分画範囲
を有する球状架橋アガロースを充填したカラムを通すこ
とにより分子篩クロマトグラフイを行いポリペプチド鎖
を分離できる。担体としては前記球状架橋アガロースの
他、前記蛋白分画範囲を有する球状又は微顆粒状の架橋
デキストラン，架橋セルロース,N,N′−メチレンビスア
クリルアミドとアリルデキストランの架橋物，多孔性ポ
リアクリルアミド、などを用いることもできる。
このような担体としては、セフアデツクス（Sephade
x），セフアクリル（Sephacryl），セフアロース（Seph
arose），セフアロースCL,セルロフアイン（Cellulofin
e），バイオーゲル（Bio−Gel）P,バイオ−ゲルＡなど
が市販されている。
x），セフアクリル（Sephacryl），セフアロース（Seph
arose），セフアロースCL,セルロフアイン（Cellulofin
e），バイオーゲル（Bio−Gel）P,バイオ−ゲルＡなど
が市販されている。
分子篩クロマトグラフイーの条件としては、カラム体
積の1/25体積以下、特に約1/100体積の試料，又はカラ
ム体積の水重量の1/200以下、特に1/1000以下の試料を
用いるのが好ましく、流速は、担体毎に定められた許容
物理強度以下の流水圧を得る流速、一般的にはカラム長
10cmにつき１時間以下の流速で行なうのが好ましい。
積の1/25体積以下、特に約1/100体積の試料，又はカラ
ム体積の水重量の1/200以下、特に1/1000以下の試料を
用いるのが好ましく、流速は、担体毎に定められた許容
物理強度以下の流水圧を得る流速、一般的にはカラム長
10cmにつき１時間以下の流速で行なうのが好ましい。
溶出液は画分として集め、２元免疫拡散法によりリボ
核蛋白質（UsnRNP）複合体に由来するポリペプチド鎖の
含有を検出し、該ポリペプチド鎖を含有する画分を合体
する。この場合、分子ふるいされうるポリペプチド鎖は
重合して多量体を形成していても、あるいは夾雑してい
るRNA鎖に結合していても問題にならない。なぜなら
ば、記載した分子篩クロマトグラフイを行う溶液環境中
で、単離対象であるポリペプチド鎖が取りうる形態は常
に一定であり、この推定されるポリペプチド鎖の存在様
式に関する性質によつては、しばしば分離効果を高める
ことになるからである。
核蛋白質（UsnRNP）複合体に由来するポリペプチド鎖の
含有を検出し、該ポリペプチド鎖を含有する画分を合体
する。この場合、分子ふるいされうるポリペプチド鎖は
重合して多量体を形成していても、あるいは夾雑してい
るRNA鎖に結合していても問題にならない。なぜなら
ば、記載した分子篩クロマトグラフイを行う溶液環境中
で、単離対象であるポリペプチド鎖が取りうる形態は常
に一定であり、この推定されるポリペプチド鎖の存在様
式に関する性質によつては、しばしば分離効果を高める
ことになるからである。
したがつて、前掲の非イオン系界面活性剤存在下での
イオン交換クロマトグラフイと生理的緩衝環境に近い条
件での分子篩クロマトグラフイとを組み合わせることに
より、リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に由来するポリペ
プチド鎖を分離精製することがより効果的となる。
イオン交換クロマトグラフイと生理的緩衝環境に近い条
件での分子篩クロマトグラフイとを組み合わせることに
より、リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に由来するポリペ
プチド鎖を分離精製することがより効果的となる。
このようにして得たリボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に
由来するポリペプチド鎖はU1リボ核蛋白質複合体を構成
するＢサブユニツトおよびＢ′サブユニツトであること
が考えられる（Arthritis Rheum.第29巻 第457〜460頁
（1986）参照）が他にU1リボ核蛋白質複合体を構成する
ＡサブユニツトおよびU2リボ核蛋白質複合体を構成する
Ａ′サブユニツト，U1リボ核蛋白質複合体を構成するＢ
サブユニツトおよびU2リボ核蛋白質複合体を構成する
Ｂ″サブユニツト，U1リボ核蛋白質複合体を構成する
Ｂ′サブユニツトおよびU2リボ核蛋白質複合体を構成す
るＢ″サブユニツト、またはU1リボ核蛋白質複合体を構
成するＢサブユニツト,B′サブユニツトおよびU2リボ核
蛋白質複合体を構成するＢ″サブユニツトのいずれかの
組み合わせであることも考えられる。これは、動物種に
より各サブユニツトの大きさが異なるためであり、例え
ばヒトの場合、Ｂサブユニツトが約28000,B′サブユニ
ツトが約29000と報告されているが、牛等では、これよ
りも大きい分子量となつていると考えられるからであ
る。いずれの動物種にせよ、本発明の方法によれば約28
000〜34000の分子量を有するポリペプチド鎖が分離精製
されるものである。そして上述したポリペプチド鎖は免
疫化学的に因習的に使用される抗RNP抗体と特異的に反
応し、したがつて自己成分に対する抗体検出用診断剤に
使用する抗原として用いることができる。
由来するポリペプチド鎖はU1リボ核蛋白質複合体を構成
するＢサブユニツトおよびＢ′サブユニツトであること
が考えられる（Arthritis Rheum.第29巻 第457〜460頁
（1986）参照）が他にU1リボ核蛋白質複合体を構成する
ＡサブユニツトおよびU2リボ核蛋白質複合体を構成する
Ａ′サブユニツト，U1リボ核蛋白質複合体を構成するＢ
サブユニツトおよびU2リボ核蛋白質複合体を構成する
Ｂ″サブユニツト，U1リボ核蛋白質複合体を構成する
Ｂ′サブユニツトおよびU2リボ核蛋白質複合体を構成す
るＢ″サブユニツト、またはU1リボ核蛋白質複合体を構
成するＢサブユニツト,B′サブユニツトおよびU2リボ核
蛋白質複合体を構成するＢ″サブユニツトのいずれかの
組み合わせであることも考えられる。これは、動物種に
より各サブユニツトの大きさが異なるためであり、例え
ばヒトの場合、Ｂサブユニツトが約28000,B′サブユニ
ツトが約29000と報告されているが、牛等では、これよ
りも大きい分子量となつていると考えられるからであ
る。いずれの動物種にせよ、本発明の方法によれば約28
000〜34000の分子量を有するポリペプチド鎖が分離精製
されるものである。そして上述したポリペプチド鎖は免
疫化学的に因習的に使用される抗RNP抗体と特異的に反
応し、したがつて自己成分に対する抗体検出用診断剤に
使用する抗原として用いることができる。
次に、第２の発明について詳述する。第２の発明にお
いては、例えば前記第１の発明のような生化学的手法ま
たは生化学的手段を組み合わせた方法により分離分別し
たリボ核蛋白質複合体由来のポリペプチド鎖を抗原とし
て使用する。本発明の測定法は、前記抗原を使用しさえ
すれば、どのような測定方法であつてもよい。例えば、
酵素免疫測定法，放射免疫測定法，免疫比濁法，免疫比
ろう法，ラテツクス凝集法，血球凝集法，螢光免疫測定
法，免疫化学光法，色素免疫測定法などを行なうことが
できる。好ましい一例として、標識免疫測定法について
説明する。
いては、例えば前記第１の発明のような生化学的手法ま
たは生化学的手段を組み合わせた方法により分離分別し
たリボ核蛋白質複合体由来のポリペプチド鎖を抗原とし
て使用する。本発明の測定法は、前記抗原を使用しさえ
すれば、どのような測定方法であつてもよい。例えば、
酵素免疫測定法，放射免疫測定法，免疫比濁法，免疫比
ろう法，ラテツクス凝集法，血球凝集法，螢光免疫測定
法，免疫化学光法，色素免疫測定法などを行なうことが
できる。好ましい一例として、標識免疫測定法について
説明する。
固体表面、例えばポリスチレン孔を前記ポリペプチド
鎖で覆う。通常、この被覆操作はアルカリ域に緩衝作用
を有する、例えば炭酸ナトリウム緩衝液にポリペプチド
鎖を溶解し0.01ないし100μg/ml溶液として用い、低温
下にて１夜中行う。その後に、固体表面に物理吸着され
なかつたポリペプチド鎖を緩衝液と共に吸引除去し、つ
づいて該ポリペプチド鎖と免疫化学的交叉性のない親水
性球状蛋白質、例えばミルクカゼインなどの0.01ないし
１％（重量／容積）溶液で、室温下約１時間ブロツキン
グを行う。これは、ポリペプチド鎖で被覆されなかつた
固体表面あるいは固体表面に物理吸着したポリペプチド
鎖の分子表面上の疎水性部位を覆うことにより、その後
に添加する被検対象溶液または標識２次抗体溶液中の蛋
白成分が非特異的に吸着するのを防ぐためである。
鎖で覆う。通常、この被覆操作はアルカリ域に緩衝作用
を有する、例えば炭酸ナトリウム緩衝液にポリペプチド
鎖を溶解し0.01ないし100μg/ml溶液として用い、低温
下にて１夜中行う。その後に、固体表面に物理吸着され
なかつたポリペプチド鎖を緩衝液と共に吸引除去し、つ
づいて該ポリペプチド鎖と免疫化学的交叉性のない親水
性球状蛋白質、例えばミルクカゼインなどの0.01ないし
１％（重量／容積）溶液で、室温下約１時間ブロツキン
グを行う。これは、ポリペプチド鎖で被覆されなかつた
固体表面あるいは固体表面に物理吸着したポリペプチド
鎖の分子表面上の疎水性部位を覆うことにより、その後
に添加する被検対象溶液または標識２次抗体溶液中の蛋
白成分が非特異的に吸着するのを防ぐためである。
その後に、被覆あるいはブロツキングに使用されなか
つたポリペプチド鎖または蛋白成分を固体表面から除去
するため、非イオン系界面活性剤を含有する中性の洗浄
液で十分に洗浄する。以上のようにして抗原となるポリ
ペプチド鎖を担体に固定し、次いで抗体の検出又は定量
を行なう。
つたポリペプチド鎖または蛋白成分を固体表面から除去
するため、非イオン系界面活性剤を含有する中性の洗浄
液で十分に洗浄する。以上のようにして抗原となるポリ
ペプチド鎖を担体に固定し、次いで抗体の検出又は定量
を行なう。
非イオン系界面活性剤と該ポリペプチド鎖と免疫化学
的交叉性のない親水性球状蛋白質とを含有する生理的緩
衝液で適宜に希釈した被検対象物、例えば患者血清をポ
リペプチド鎖で被覆した固体表面と抗原抗体結合反応が
完結するのに十分な時間接触させる。
的交叉性のない親水性球状蛋白質とを含有する生理的緩
衝液で適宜に希釈した被検対象物、例えば患者血清をポ
リペプチド鎖で被覆した固体表面と抗原抗体結合反応が
完結するのに十分な時間接触させる。
その後更に、非イオン系界面活性剤を含有する中性の
洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、過剰量の標識２次抗
体を含有する生理的溶液に該固体表面を抗原抗体結合反
応が完結するのに十分な時間接触させる。ここで標識物
質は、酵素，放射性同位元素，螢光物質等、特に制限さ
れないが、酵素標識が特に好ましい。
洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、過剰量の標識２次抗
体を含有する生理的溶液に該固体表面を抗原抗体結合反
応が完結するのに十分な時間接触させる。ここで標識物
質は、酵素，放射性同位元素，螢光物質等、特に制限さ
れないが、酵素標識が特に好ましい。
そしてひきつづき、非イオン系界面活性剤を含有する
中性の洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、該標識２次抗
体の存在または量を検出する。酵素標識の場合、酵素に
対する特異的基質溶液に該固体表面を酵素反応の生成物
が検出されるに十分な時間接触させる。この場合、酵素
反応により生成される産物の量は被検対象中に含有され
る該ポリペプチド鎖上の抗原決定基に対する抗体量に比
例依存的であり、したがつて間接的に被検対象中の該抗
体を定量することができる。
中性の洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、該標識２次抗
体の存在または量を検出する。酵素標識の場合、酵素に
対する特異的基質溶液に該固体表面を酵素反応の生成物
が検出されるに十分な時間接触させる。この場合、酵素
反応により生成される産物の量は被検対象中に含有され
る該ポリペプチド鎖上の抗原決定基に対する抗体量に比
例依存的であり、したがつて間接的に被検対象中の該抗
体を定量することができる。
（実施例） 以下に、リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体を構成する分
子量33000及び34000のポリペプチド鎖の単離精製および
その用法について、実施例により本発明を詳述する。
子量33000及び34000のポリペプチド鎖の単離精製および
その用法について、実施例により本発明を詳述する。
ポリペプチド鎖の単離精製 例１ 緩衝液A:11中に、塩化ナトリウム8g,塩化カリウム0.2g,
燐酸２ナトリウム・12水塩2.7g,燐酸１カリウム0.2gを
含有する燐酸系緩衝液。
燐酸２ナトリウム・12水塩2.7g,燐酸１カリウム0.2gを
含有する燐酸系緩衝液。
緩衝液B:蛋白分解酵素阻害剤として、エチレングリコー
ル４酢酸（EGTA）10-3M，フツ化フエニルメチルスルフ
オニル（PMSF）10-3M，ロイペプチン0.05％（重量／容
積），アンチパイン0.05％（重量／容積），キモスタチ
ン0.05％（重量／容積），ペプスタチンA0.05％（重量
／容積）をさらに含有する緩衝液Ａ。
ル４酢酸（EGTA）10-3M，フツ化フエニルメチルスルフ
オニル（PMSF）10-3M，ロイペプチン0.05％（重量／容
積），アンチパイン0.05％（重量／容積），キモスタチ
ン0.05％（重量／容積），ペプスタチンA0.05％（重量
／容積）をさらに含有する緩衝液Ａ。
緩衝液C:塩化ナトリウム0.14M,ノニデットＰ−40（Poly
oxyethylene（９）p-tert-octylphenol、非イオン系界
面活性剤）0.05％（容積／容積），エチレングリコール
４酢酸（EGTA）５×10-4M，フツ化フエニルメチルスル
フオニル（PMSF）２×10-4M，ジチオスレイトール（DT
T）２×10-4Mを含有するトリス系緩衝液0.02M×HCl pH
7.4。
oxyethylene（９）p-tert-octylphenol、非イオン系界
面活性剤）0.05％（容積／容積），エチレングリコール
４酢酸（EGTA）５×10-4M，フツ化フエニルメチルスル
フオニル（PMSF）２×10-4M，ジチオスレイトール（DT
T）２×10-4Mを含有するトリス系緩衝液0.02M×HCl pH
7.4。
緩衝液D:塩化ナトリウム0.18M,ノニデツトＰ−40 0.05
％（容積／容積），エチレングリコール４酢酸（EGTA）
５×10-4M，フツ化フエニルメチルスルフオニル（PMS
F）２×10-4M，ジチオスレイトール（DTT）２×10-4Mを
含有するトリス系緩衝液0.02M×HCl pH7.4。
％（容積／容積），エチレングリコール４酢酸（EGTA）
５×10-4M，フツ化フエニルメチルスルフオニル（PMS
F）２×10-4M，ジチオスレイトール（DTT）２×10-4Mを
含有するトリス系緩衝液0.02M×HCl pH7.4。
緩衝液E:エチレングリコール４酢酸（EGTA）2.5×10-4M
をさらに含有する緩衝液Ａ。
をさらに含有する緩衝液Ａ。
1.使用されるリボ核蛋白質（UsnRNP）複合体画分の取得 以下に示す操作は、すべて４℃で行つた。
緩衝液B450mlを仔牛胸腺アセトン粉末（ペルーフリー
ズ（Pel−Freeze）社製）30gに添加し、該混合物を一夜
中溶解させた。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30分間
遠心分離し、上澄液を抽出液Ａとした。この沈澱物から
２回目の抽出を行うため、沈殿物に緩衝液B100mlを添加
し４時間攪拌した。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30
分間遠心分離し、上澄液を抽出液Ｂとし、抽出液Ａと合
わせることにより抽出液Ｃとした。得られる核可溶性画
分の総蛋白量は、Lowry法による蛋白定量の結果、7.04g
であった。
ズ（Pel−Freeze）社製）30gに添加し、該混合物を一夜
中溶解させた。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30分間
遠心分離し、上澄液を抽出液Ａとした。この沈澱物から
２回目の抽出を行うため、沈殿物に緩衝液B100mlを添加
し４時間攪拌した。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30
分間遠心分離し、上澄液を抽出液Ｂとし、抽出液Ａと合
わせることにより抽出液Ｃとした。得られる核可溶性画
分の総蛋白量は、Lowry法による蛋白定量の結果、7.04g
であった。
抽出液Ｃに、飽和度30％になるように硫酸アンモニウ
ムを添加し、蛋白の塩析に十分な時間（４時間以上）攪
拌後、10,000×ｇで20分間遠心分離した。その後、さら
に硫酸アンモニウムを60％飽和させうる量を上澄液に添
加し、塩析に十分な時間攪拌後、10,000×ｇで20分間遠
心分離し、リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体画分とした。
ムを添加し、蛋白の塩析に十分な時間（４時間以上）攪
拌後、10,000×ｇで20分間遠心分離した。その後、さら
に硫酸アンモニウムを60％飽和させうる量を上澄液に添
加し、塩析に十分な時間攪拌後、10,000×ｇで20分間遠
心分離し、リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体画分とした。
2.イオン交換クロマトグラフイによる分画 リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体画分として得られた沈
澱物を、なるべく少量の緩衝液Ｃに溶解しかつ緩衝液Ｃ
に対して２夜中透析した。透析物を緩衝液Ｃで平衡化し
たφ3.2×11cmのジエチルアミノエチル（DEAE）セフア
ロース（フアルマシア社製）カラムに流速100ml/時間で
掛けた。その後、該カラムを緩衝液Ｃで、未結合の蛋白
質が除去されるまで（１晩）洗浄した。カラム洗浄後、
リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に由来するポリペプチド
鎖を含有する画分を緩衝液Ｄで溶出した。また、分取体
積は１分画あたり8.0mlとし、各画分の蛋白質はLowry法
により定量した。この分別溶離の状態を第１図に示す。
澱物を、なるべく少量の緩衝液Ｃに溶解しかつ緩衝液Ｃ
に対して２夜中透析した。透析物を緩衝液Ｃで平衡化し
たφ3.2×11cmのジエチルアミノエチル（DEAE）セフア
ロース（フアルマシア社製）カラムに流速100ml/時間で
掛けた。その後、該カラムを緩衝液Ｃで、未結合の蛋白
質が除去されるまで（１晩）洗浄した。カラム洗浄後、
リボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に由来するポリペプチド
鎖を含有する画分を緩衝液Ｄで溶出した。また、分取体
積は１分画あたり8.0mlとし、各画分の蛋白質はLowry法
により定量した。この分別溶離の状態を第１図に示す。
3.分子篩クロマトグラフイによる分画 得られたリボ核蛋白質（UsnRNP）複合体に由来するポ
リペプチド鎖を含有する画分として135番目から155番目
の画分を集め、排除限界分子量10.000の限外濾過膜（ア
ドバンテツクUK−10）で窒素ガス加圧下3mlまで濃縮し
た。濃縮後の総蛋白量は92.2mgであった。これを緩衝液
Ｅで平衡化したφ1.6×68cmのウルトロゲルAcA44（LKB
社製）カラムに掛けた。その後、該カラム中の試料を緩
衝液Ｄにより10ml/時間の流速で展開溶出し、1.75mlず
つ集液し、280nmにおける吸光度を測定した。集液した
分取画分のうち、２元免疫拡散法にてリボ核蛋白質（Us
nRNP）複合体に由来するポリペプチド鎖を含有している
画分（36番目から44番目の分取分画）を合わせ精製ポリ
ペプチド鎖とした。ここで、２元免疫拡散法とは、抗原
溶液及び抗体溶液をそれぞれゲル内の所定の穴に分注
し、拡散させ、抗原抗体反応によって形成された沈降線
の形状によって、これらの抗原抗体の特異性を判別する
方法である。上記実施例においては、抗体溶液として、
抗RNP抗体を含有する血清及び抗Sm抗体を含有する血清
を使用した。分別の状態を第２図に示す。Lowry法によ
る蛋白定量の結果、本精製標品は28mgであった。
リペプチド鎖を含有する画分として135番目から155番目
の画分を集め、排除限界分子量10.000の限外濾過膜（ア
ドバンテツクUK−10）で窒素ガス加圧下3mlまで濃縮し
た。濃縮後の総蛋白量は92.2mgであった。これを緩衝液
Ｅで平衡化したφ1.6×68cmのウルトロゲルAcA44（LKB
社製）カラムに掛けた。その後、該カラム中の試料を緩
衝液Ｄにより10ml/時間の流速で展開溶出し、1.75mlず
つ集液し、280nmにおける吸光度を測定した。集液した
分取画分のうち、２元免疫拡散法にてリボ核蛋白質（Us
nRNP）複合体に由来するポリペプチド鎖を含有している
画分（36番目から44番目の分取分画）を合わせ精製ポリ
ペプチド鎖とした。ここで、２元免疫拡散法とは、抗原
溶液及び抗体溶液をそれぞれゲル内の所定の穴に分注
し、拡散させ、抗原抗体反応によって形成された沈降線
の形状によって、これらの抗原抗体の特異性を判別する
方法である。上記実施例においては、抗体溶液として、
抗RNP抗体を含有する血清及び抗Sm抗体を含有する血清
を使用した。分別の状態を第２図に示す。Lowry法によ
る蛋白定量の結果、本精製標品は28mgであった。
なお、分子量はSDS−PAGE法により測定した。具体的
には、Laemmliらの方法を準じ、12.5％アクリルアミド
ゲル（架橋度0.8）中で標品試料を展開した。泳動条件
は、泳動開始時40mA、濃縮泳動時15mA、分離泳動時20mA
とした。また、泳動試料は予め還元剤を含まない試料用
緩衝液（312.5mNトリス−塩酸,PH6.8、0.1％BPB、10％S
DS、20％グリセリン）を0.25体積加え30分間室温処理し
た。泳動後、0.05％CBBでゲルを１晩染色し、翌日、0.7
％酢酸で脱色した。その結果、分子量33000と34000の蛋
白バンドとして検出された。
には、Laemmliらの方法を準じ、12.5％アクリルアミド
ゲル（架橋度0.8）中で標品試料を展開した。泳動条件
は、泳動開始時40mA、濃縮泳動時15mA、分離泳動時20mA
とした。また、泳動試料は予め還元剤を含まない試料用
緩衝液（312.5mNトリス−塩酸,PH6.8、0.1％BPB、10％S
DS、20％グリセリン）を0.25体積加え30分間室温処理し
た。泳動後、0.05％CBBでゲルを１晩染色し、翌日、0.7
％酢酸で脱色した。その結果、分子量33000と34000の蛋
白バンドとして検出された。
ELISA法による抗リボ核蛋白質抗体の測定 例２ 緩衝液a:炭酸ナトリウム緩衝液50mM pH8.85。
緩衝液b:1中に、塩化ナトリウム8g、塩化カリウム0.2
g、燐酸２ナトリウム・12水塩2.7g、燐酸１カリウム0.2
g、トウイーン203mlを含有する燐酸系緩衝液。
g、燐酸２ナトリウム・12水塩2.7g、燐酸１カリウム0.2
g、トウイーン203mlを含有する燐酸系緩衝液。
緩衝液c:1中に、塩化ナトリウム8g、塩化カリウム0.2
g、燐酸２ナトリウム・12水塩2.7g、燐酸１カリウム0.2
g、トウイーン203ml、２％脱脂粉乳溶液5mlを含有する
燐酸系緩衝液。
g、燐酸２ナトリウム・12水塩2.7g、燐酸１カリウム0.2
g、トウイーン203ml、２％脱脂粉乳溶液5mlを含有する
燐酸系緩衝液。
ポリスチレン製の96穴ELISA用マイクロプレート（住
友ベークライト社製）を孔あたり、緩衝液ａに溶解した
例１記載の方法で分離したポリペプチド鎖の2.5μg/ml
溶液の200μｌで、４℃１夜中被覆した。つづいて翌
日、0.1％脱脂粉乳溶液の400μｌで、室温下１時間ブロ
ツキングを行つた。
友ベークライト社製）を孔あたり、緩衝液ａに溶解した
例１記載の方法で分離したポリペプチド鎖の2.5μg/ml
溶液の200μｌで、４℃１夜中被覆した。つづいて翌
日、0.1％脱脂粉乳溶液の400μｌで、室温下１時間ブロ
ツキングを行つた。
その後に、緩衝液ｂで該ポリスチレン孔を６回洗浄
し、緩衝液ｃで希釈した抗RNP抗体を含有する患者血清2
00μｌを添加して室温で１時間反応させた。その後更
に、緩衝液ｂで該ポリスチレン孔を６回洗浄し、緩衝液
ｃに溶解したアルカリフオスフアターゼ標識抗ヒトIgG
＋IgA＋IgM抗体〔KPL社製（酵素／抗体＝３）〕の500ng
/ml溶液の200μｌを添加して室温で１時間反応させた。
し、緩衝液ｃで希釈した抗RNP抗体を含有する患者血清2
00μｌを添加して室温で１時間反応させた。その後更
に、緩衝液ｂで該ポリスチレン孔を６回洗浄し、緩衝液
ｃに溶解したアルカリフオスフアターゼ標識抗ヒトIgG
＋IgA＋IgM抗体〔KPL社製（酵素／抗体＝３）〕の500ng
/ml溶液の200μｌを添加して室温で１時間反応させた。
その後これら２段階の抗原抗体反応にひきつづき、緩
衝液ｂで該ポリスチレン孔を６回洗浄し、パラニトロフ
エニル燐酸の1mg/mlアルカリ溶液の200μｌを加え室温
で１時間酵素反応を行い、生成されるパラニトロフエノ
ールの量をプレート分光光度計（コロナ電気社製）を用
い405nmの吸光度増加量として測定した結果を第３図に
示す。
衝液ｂで該ポリスチレン孔を６回洗浄し、パラニトロフ
エニル燐酸の1mg/mlアルカリ溶液の200μｌを加え室温
で１時間酵素反応を行い、生成されるパラニトロフエノ
ールの量をプレート分光光度計（コロナ電気社製）を用
い405nmの吸光度増加量として測定した結果を第３図に
示す。
免疫ブロッティング法による抗体の測定 例３ 得られた両ポリペプチド鎖の免疫化学的交叉性を免疫
ブロティング法により分析した。
ブロティング法により分析した。
Towbinらの方法に従って、SDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動後の蛋白バンドをニトロセルロース膜上に転
写した。なお、この転写操作は、転写蛋白の抗原性保持
のため０℃水浴中で行った。転写完了後、ニトロセルロ
ース膜を２％牛血清アルブミンを含むトリス緩衝食塩液
（15mM トリス−塩酸、pH7.4、0.2M塩化ナトリウム）
で未転写部位を１晩被覆した。翌日、このニトロセルロ
ース膜を0.2％牛血清アルブミンを含む上記トリス緩衝
食塩液で500分の１に希釈した１次抗体液および同様に
希釈した２次抗体（パーオキシダーゼ標識抗ヒトIgG＋
Ａ＋Ｍ抗体）液に順次浸漬し、それぞれ室温で20分間反
応させた。１次抗体液としては、抗RNP抗体、抗Sm抗体
および正常ヒト血清を用いた。また、それぞれの抗原抗
体反応後に残存する未反応の１次抗体および２次抗体
は、過剰量の洗浄液（15mM トリス−塩酸、pH7.4、0.1
5％トリトンＸ−100、0.2M 塩化ナトリウム）で、５分
間３回洗浄除去した。これらの抗原抗体反応終了後、ニ
トロセルロース膜を基質溶液（50mM トリス−塩酸、pH
8.0、0.9％塩化ナトリウム、0.05％過酸化水素水、0.05
％3,3′ジアミノベンジジン４塩酸）に浸漬、発色させ
た。
ル電気泳動後の蛋白バンドをニトロセルロース膜上に転
写した。なお、この転写操作は、転写蛋白の抗原性保持
のため０℃水浴中で行った。転写完了後、ニトロセルロ
ース膜を２％牛血清アルブミンを含むトリス緩衝食塩液
（15mM トリス−塩酸、pH7.4、0.2M塩化ナトリウム）
で未転写部位を１晩被覆した。翌日、このニトロセルロ
ース膜を0.2％牛血清アルブミンを含む上記トリス緩衝
食塩液で500分の１に希釈した１次抗体液および同様に
希釈した２次抗体（パーオキシダーゼ標識抗ヒトIgG＋
Ａ＋Ｍ抗体）液に順次浸漬し、それぞれ室温で20分間反
応させた。１次抗体液としては、抗RNP抗体、抗Sm抗体
および正常ヒト血清を用いた。また、それぞれの抗原抗
体反応後に残存する未反応の１次抗体および２次抗体
は、過剰量の洗浄液（15mM トリス−塩酸、pH7.4、0.1
5％トリトンＸ−100、0.2M 塩化ナトリウム）で、５分
間３回洗浄除去した。これらの抗原抗体反応終了後、ニ
トロセルロース膜を基質溶液（50mM トリス−塩酸、pH
8.0、0.9％塩化ナトリウム、0.05％過酸化水素水、0.05
％3,3′ジアミノベンジジン４塩酸）に浸漬、発色させ
た。
なお、当法に用いた抗RNP抗体および抗Sm抗体は、ア
メリカCDC標準血清と同種抗体を含む患者血清を使用し
た。
メリカCDC標準血清と同種抗体を含む患者血清を使用し
た。
その結果、いずれのポリペプチド鎖（33000,34000）
とも抗RNP抗体を含有する血清とは強く反応し、正常ヒ
ト血清、抗Sm抗体を含有する血清とは全く反応しなかっ
た。この結果から、これらのポリペプチド鎖が抗RNP抗
体に対し特異的であることが評価できる。
とも抗RNP抗体を含有する血清とは強く反応し、正常ヒ
ト血清、抗Sm抗体を含有する血清とは全く反応しなかっ
た。この結果から、これらのポリペプチド鎖が抗RNP抗
体に対し特異的であることが評価できる。
従来、リボ核蛋白質複合体に対する抗体測定時に使用
する抗原としては細胞の抽出物がそのまま用いられてき
た。
する抗原としては細胞の抽出物がそのまま用いられてき
た。
しかし近年該複合体を構成する要素の分子的性質が明
らかにされつつあり、これらの機能と自己免疫疾患患者
血清中に存在する、これらに対する抗体の機能および病
因との関連についても諸説が議論され、該複合体の構成
成分単位での役割の認識が重要となつてきている。
らかにされつつあり、これらの機能と自己免疫疾患患者
血清中に存在する、これらに対する抗体の機能および病
因との関連についても諸説が議論され、該複合体の構成
成分単位での役割の認識が重要となつてきている。
したがつて、本発明のごとく、該複合体を構成するポ
リペプチド鎖単位で、それに対応する被検対象物中の抗
体を測定する方法の確立は重要な医学的情報を提供して
くるものであり、自己免疫病等の診断に、非常に有効な
ものとなる。
リペプチド鎖単位で、それに対応する被検対象物中の抗
体を測定する方法の確立は重要な医学的情報を提供して
くるものであり、自己免疫病等の診断に、非常に有効な
ものとなる。
第１図は本発明の実施例におけるリボ核蛋白質（UsnRN
P）複合体に由来するポリペプチド鎖を含有する画分の
イオン交換クロマトグラフイによる分別溶離を示す図、
第２図は本発明の実施例におけるリボ核蛋白質（UsnRN
P）複合体に由来するポリペプチド鎖の分子篩クロマト
グラフイによる分別を示す図である。さらに第３図は、
本発明の方法で単離精製したリボ核蛋白質（UsnRNP）複
合体に由来するポリペプチド鎖のELISAによる該ポリペ
プチド鎖に対する抗体を含有する被検対象の測定範囲を
示す図である。
P）複合体に由来するポリペプチド鎖を含有する画分の
イオン交換クロマトグラフイによる分別溶離を示す図、
第２図は本発明の実施例におけるリボ核蛋白質（UsnRN
P）複合体に由来するポリペプチド鎖の分子篩クロマト
グラフイによる分別を示す図である。さらに第３図は、
本発明の方法で単離精製したリボ核蛋白質（UsnRNP）複
合体に由来するポリペプチド鎖のELISAによる該ポリペ
プチド鎖に対する抗体を含有する被検対象の測定範囲を
示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】動物の組織抽出物からUsnRNP複合体を抽出
し、次いで非イオン系界面活性剤の存在下に、単離対象
であるポリペプチド鎖を他のUsnRNP複合体構成要素から
解離させた状態でイオン交換クロマトグラフイを行な
い、該ポリペプチド鎖を含有する画分を分取し、その後
に分子篩クロマトグラフィにより単離対象であるポリペ
プチド鎖を分別することによって得られ、精製されたUs
nRNP複合体を構成し、かつ、抗RNP抗体と特異的に反応
するポリペプチド鎖。 - 【請求項２】動物の組織抽出物からUsnRNP複合体を抽出
し、次いで非イオン系界面活性剤の存在下に、単離対象
であるポリペプチド鎖を他のUsnRNP複合体構成要素から
解離させた状態でイオン交換クロマトグラフイを行な
い、該ポリペプチド鎖を含有する画分を分取し、その後
に分子篩クロマトグラフィにより単離対象であるポリペ
プチド鎖を分別し、抗RNP抗体と特異的に反応する画分
を取得することを特徴とする、精製されたUsnRNP複合体
を構成するポリペプチド鎖の製造法。 - 【請求項３】請求項１記載のポリペプチド鎖を抗原とし
て使用し、該ポリペプチド鎖に対する抗体を検出又は定
量することを特徴とする抗UsnRNP抗体の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2112129A JPH0826073B2 (ja) | 1990-01-11 | 1990-04-27 | 精製されたＵｓｎＲＮＰ複合体を構成するポリペプチド鎖、その製造法および抗ＵｓｎＲＮＰ抗体の測定法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP430390 | 1990-01-11 | ||
| JP2-4303 | 1990-01-11 | ||
| JP2112129A JPH0826073B2 (ja) | 1990-01-11 | 1990-04-27 | 精製されたＵｓｎＲＮＰ複合体を構成するポリペプチド鎖、その製造法および抗ＵｓｎＲＮＰ抗体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03251600A JPH03251600A (ja) | 1991-11-11 |
| JPH0826073B2 true JPH0826073B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
ID=26338045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2112129A Expired - Lifetime JPH0826073B2 (ja) | 1990-01-11 | 1990-04-27 | 精製されたＵｓｎＲＮＰ複合体を構成するポリペプチド鎖、その製造法および抗ＵｓｎＲＮＰ抗体の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0826073B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115112656B (zh) * | 2022-07-08 | 2024-09-20 | 四川大学华西医院 | 一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法 |
-
1990
- 1990-04-27 JP JP2112129A patent/JPH0826073B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03251600A (ja) | 1991-11-11 |
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