JPH08268911A - アミロイド前駆体タンパク質プロセシング酵素を検出する方法 - Google Patents

アミロイド前駆体タンパク質プロセシング酵素を検出する方法

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JPH08268911A JP5132535A JP13253593A JPH08268911A JP H08268911 A JPH08268911 A JP H08268911A JP 5132535 A JP5132535 A JP 5132535A JP 13253593 A JP13253593 A JP 13253593A JP H08268911 A JPH08268911 A JP H08268911A
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Robert N Dreyer
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】アミドイド前駆体タンパク質に対して特異的な
プロテアーゼのインヒビターを同定する方法の提供。 【構成】アルツハイマー病のベータ−アミロイドタンパ
ク質に対する前駆体に対して特異的な少なくとも１種の
プロテアーゼのインヒビター、例えば、アスパラギン酸
のプロテアーゼ、カテプシンＤおよびキモトリプシン様
セリンプロテアーゼのインヒビターでベータ−アミロイ
ドのタンパク質の形成を調節する方法；アミロイド前駆
体タンパク質の分解に必要な特異性を有する分子のため
のｉｎｖｉｔｒｏプロテアーゼ活性を検出する方法；お
よびアミロイド前駆体タンパク質に対して特異的なイン
ヒビターを同定するアッセイ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、アルツハイマー病のベータ−ア
ミロイドタンパク質に対する前駆体をプロセシングする
特異性をもつタンパク質分解酵素を同定する方法；アミ
ロイド前駆体タンパク質に対して特異的なインヒビター
を同定する方法；およびアルツハイマー病のベータ−ア
ミロイドタンパク質に対する前駆体に対して特異的な少
なくとも１種のプロテアーゼのインヒビター、例えば、
アスパラギン酸のプロテアーゼ、カテプシンＤおよびキ
モトリプシン様セリンプロテアーゼのインヒビターでベ
ータ−アミロイドのタンパク質の形成を調節する方法に
関する。
【０００２】本発明のアッセイは、アルツハイマー病の
患者の脳の中のアミロイドのペプチドの形成速度を抑制
するプロテアーゼの同定における実用性を有する。それ
ら自体として、それらはこのようなプロテアーゼの分離
に使用することができ、そしてアルツハイマー病の治療
剤として使用できるプロテアーゼインヒビターの同定に
また使用することができる。アミロイド前駆体タンパク
質（以後「ＡＰＰ）」）をプロセシングするための、主
要なアミロイド発生のプロテアーゼとして、アスパラギ
ン酸のプロテアーゼ、カテプシンＤを同定するアッセイ
の応用を後述する。また、ＡＰＰホロタンパク質からア
ミロイド前駆体を形成できる第２のセリンプロテアーゼ
の部分的特性決定が提供される。
【０００３】アルツハイマー病（以後「ＡＤ」と略す）
は、通常前頭、壁および後頭の皮質における、進行性萎
縮により特徴づけられる、脳の進行性変質の障害であ
る。ＡＤの臨床的発現は、進行性記憶障害、言語および
視覚空間的能力の損失、および行動の欠乏を包含する
（Ｍｃｋｈａｎら、１９８６、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３
４：９３９）。全体の認識の障害は、大脳半球を通して
位置する神経細胞の変質に起因する（Ｐｒｉｃｅ、１９
８６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９：４８
９）。
【０００４】病理学的には、ＡＤ患者の死後の脳の主な
顕著な特徴は、１）もつれた神経細線維の蓄積を含有す
る神経細胞形質から構成された病理学的病変；２）脳血
管性アミロイドの堆積；および３）神経炎の班である。
脳血管性アミロイド（Ｗｏｎｇら、１９８２、ＰＮＡＳ
８２：８７２９）および神経炎の班（Ｍａｓｔｅｒｓ
ら、１９８５、ＰＮＡＳ ８２：４２４９）の両者は、
単に「Ａ４」または「ベータ−アミロイド」と表示する
明確なペプチドを含有する。
【０００５】ベータ−アミロイドは相対分子量４，５０
０の不溶性の、高度に凝集性の、小さいポリペプチドで
あり、そして３９〜４２アミノ酸配から構成されてい
る。証拠の数行はＡＤの病変の病原性におけるベータ−
アミロイドの役割を支持する。例えば、ベータ−アミロ
イドおよび関係する断片はＰＣ−１２細胞系に対する毒
性（Ｙａｎｋｎｅｒら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４５：４１７）；ニューロンの初代培養物に対する毒性
（Ｙａｎｋｎｅｒら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５
０：２７９）であり；そして齧歯類の脳におけるニュー
ロンの変質および齧歯類における対応する記憶消失の応
答を引き起こす（Ｆｌｏｏｄら、１９９１、ＰＮＡＳ
８８：３３６３；Ｋｏｗａｌｌら、１９９１、ＰＮＡＳ
８８：７２４７）ことが示された。
【０００６】より大きい前駆体の調製から由来するとし
てかつ一部分としてベータ−アミロイドタンパク質は、
Ｋａｎｇら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７３３
に記載されている。この前駆体を同定するために、この
タンパク質をコードする全長の相補的ＤＮＡクローンを
分離し、そして、既知のベータ−アミロイドの配列から
設計したオリゴヌクレオチドのプローブを使用して配列
決定された。予測された前駆体は６９５残基を含有し、
そして現在「ＡＰＰ６９５」（アミロイド前駆体タンパ
ク質６９５）と表示されている。
【０００７】ＡＰＰタンパク質をエンコードする遺伝子
の引き続くクローニングにより、Ａ４の蓄積が選択的に
スプライスされたｍＲＮＡの直接の発現の結果である可
能性を除外して、Ａ４領域は２つの隣接するエキソヌク
レアーゼ上でエンコードされることが明らかにされた
（Ｌｅｍａｉｒｅら、１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１７：５１７）。これは、Ａ４の蓄積はＡＰＰ
内のペプチド領域に対してＮ末端およびＣ末端の両者の
部位におけるＡＰＰの異常なタンパク質分解的分解から
生じなくてはならないことを意味した。
【０００８】最近、家族性アルツハイマー病の稀な形態
における遺伝のパターンはＡＰＰ遺伝子のオープンリー
ディングフレーム内の点突然変異との同時の分離を示す
ことが証明され、ＡＤの病原性におけるベータ−アミロ
イドの役割についての証拠をさらに提供する。これらは
ベータ−アミロイド領域に対してＣ末端の突然変異（Ｇ
ｏａｔｅら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７０
４；Ｙｏｓｈｉｏｋａら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７８：１１４
１；Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら、１９９１、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３５３：８４４；Ｍｕｒｒｅｌｌら、１９
９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：９７）、ならびにベー
タ−アミロイド領域のＮ末端に対して近位の突然変異
（Ｍｕｌｌａｎら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ １：３４５）を含む。このような突然変異
は、ＡＰＰの正常の分類および／またはプロセシングを
混乱させることによるか、あるいはベータ−アミロイド
の発生に関係する特定のプロテアーゼのための認識部位
を変更することによって、家族性アルツハイマー病にお
けるベータ−アミロイドのペプチドの形成速度を増加す
る推測されたが、証明されなかった。
【０００９】ＡＰＰ６９５はヒトの脳において見いださ
れるＡＰＰの最も富んだ形態であるが、３つの他の形態
が存在する、ＡＰＰ７１４、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ
７７０（Ｔａｎｚｉら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３５
１：５２８；Ｐｏｎｔｅら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ
３３１：５２５；Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、１９８８Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３１：５３０）。異なる長さのイソ型はヒ
ト染色体２１上に位置する単一のＡＰＰ遺伝子からの別
のスプライシングから生ずる（Ｇｏｌｄｇａｂｅｒら、
１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：８７７；Ｔａｎｚ
ｉら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：８８０）。
【００１０】ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０は、ウシ
膵臓トリプシンインヒビターと４０％の相同性を共有す
る、５６アミノ酸のクニツ（Ｋｕｎｔｚ）インヒビター
のドメインを含有する。これらのＡＰＰの両者の形態は
プロテアーゼ阻害活性を有し（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、
１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５３０；Ｓｍｉｔｈ
ら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１１２６）、
そしてこれらの形態の１つの形態は多分前にプロテアー
ゼネキシンＩＩとして同定されたものである（Ｏｌｔｅ
ｒｓｄｏｒｆら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：１
４４；ＶａｎＮｏｓｔｒａｎｄら、１９８９、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３４１：５４６）。
【００１１】アミロイド前駆体タンパク質のための生理
学的役割はまだ確証されてきていない。それは細胞表面
のレセプター（Ｋａｎｇら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ
３２５：７３３）；付着分子（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、１
９８９、Ｎｅｕｒｏｎ ３：６８９）；成長または栄養
の因子（Ｓａｉｔｏｈら、１９８９、Ｃｅｌｌ ５８：
６１５；Ａｒａｋｉら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８１：２６５；Ｍ
ｉｌｗａｒｄら、１９９２、Ｎｅｕｒｏｎ ９：１２
９）；創傷の治癒のレギュレーター（Ｖａｎ Ｎｏｓｔ
ｒａｎｄら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：７４
５；Ｓｍｉｔｈら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
８：１１２６）であるか、あるいは細胞骨格系において
ある役割を演ずる（Ｒｅｆｏｌｏら、１９９１、Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１：３８８８）ことが提案
された。
【００１２】ＡＤにおける変更されたＡＰＰの発現の役
割を検査するために多数の研究がなされてきたが、結果
は対立していた（例えば、次の論文を参照：Ｕｎｔｅｒ
ｂｅｃｋら、Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎＡｇｉｎｇ、Ｗｉｌｅｙ−
Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、４：１３９）。
【００１３】また、ＡＰＰの異なる形態の相対量の変化
がアミロイドの蓄積の原因となるかどうかを検査するた
めに、研究が実施された。このような研究の結果は等し
い混乱したが、一般にＡＰＰを含有するクニツドメイン
の相対発現レベルがＡＤにおいて増加するという結論を
支持した（Ｊｏｈｎｓｏｎｌａ、１９９０、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４８：８５４）。したがって、増加したＡＰＰ
７５１を発現するトランスジェニック動物は皮質および
海馬のベータ−アミロイド反応性堆積物を表すことが発
見された（Ｑｕｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５
２：２３９）。最近の研究により、Ａ４のＮ末端からの
全長のＡＰＰ分子のＣ末端に延びるＡＰＰ断片（それは
ほぼ１００アミノ酸から構成されているので、以後「Ｃ
−１００」と呼ぶ）は、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｄｙ
ｒｋｓら、１９８８、ＥＭＢＯＪ．７：９４９）および
トランスフェクションされた細胞（Ｗｏｌｆら、１９９
０、ＥＭＢＯ Ｊ．９：２０７９；Ｍａｒｕｙａｍａ
ら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４７：５６６）の両者
の中で凝集することができることが示された。トランス
フェクションされたＰ１９中のＣ−１００断片の過度の
発現は細胞障害性を引き起こすことが示された（Ｆｕｃ
ｋｕｃｈｉら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８２：１６５）。
【００１４】さらに、ベータ−アミロイドおよびＣ末端
ドメインの両者を含有するＣ末端の断片はヒトの脳の中
に存在することが示され（Ｅｓｔｕｓら、１９９２、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５５：７２６）、そしてトランスフェ
クションされた細胞系における研究により、これらの断
片がエンドソーム−リソゾームの経路で生成することが
できることが示唆される（Ｇｏｌｄｅら、１９９２、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５５：７２８）。
【００１５】集合的に、上の報告が示唆するように、Ａ
４領域のＮ末端におけるＡＰＰの単一のタンパク質分解
的切断はＡＤに関連する病態生理学を開始するために十
分である。最近の研究により、初代細胞および細胞系の
培養物（ＡＰＰのトランスフェクション体を包含する）
は３〜４ｋＤａのペプチドを分泌し、前記ペプチドはベ
ータ−アミロイドと同一のＮ末端を有し（１〜４２アミ
ノ酸）、そして全長のベータ−アミロイドからなると考
えられることが示された（Ｈａａｓら、１９９２、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４９：３２２；Ｓｈｏｊｉら、１９９２、
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１２６）。このようなペプチ
ドは、また、ＡＤおよびＡＤ以外の患者のＣＳＦの中に
見いだされた（Ｓｅｕｂｅｒｔら、１９９２、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３９５：３２５；Ｓｈｏｊｉら、１９９２、前
掲）。
【００１６】ＡＰＰは、また、ＡＰＰの細胞外ドメイン
の分泌のための生理学的経路におけるＡ４領域内の部位
で切断される（Ｅｓｃｈら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４８：１１２２；Ｗａｎｇら、１９９１、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１６９６０）。この経路はい
くつかの細胞系において操作可能であり、そして必然的
にＡ４、前駆体のアミロイド領域の破壊を生ずる。この
ような経路がヒトの脳の中でまた操作的であるという証
拠が得られた（Ｐａｌｍｅｒｔら、１９８９、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６５：
１８２）。
【００１７】ＡＰＰの正常の、非病理学的プロセシング
は「セクレターゼ」と命名された。分泌作用から生ずる
Ｃ末端の断片はＣ−１００断片（上に定義した）より１
７アミノ酸だけ小さく、そして以後「生理学的Ｃ末端の
断片」と呼ぶ。
【００１８】Ａ４の正味の病理学的蓄積はＡＰＰの分解
の病理学的および生理学的経路の相対的活性によりコン
トロールされることが仮定された。
【００１９】こうして、アルツハイマー病で悩む人の脳
の中のベータ−アミロイドの蓄積を説明するいくつかの
可能性が、次のように、存在しする： １）アミロイド発生領域の破壊に関係する１種または２
種以上のセクレターゼの活性またはレベルの欠乏； ２）ＡＰＰが病理学的経路のプロテアーゼに暴露される
ようになるような、ＡＰＰの変更した細胞の分類； ３）１種または２種以上の病理学的プロテアーゼの局所
的の増加； ４）そうでなければアミロイドをそれが生産されると同
じように速く分解する、分解酵素のレベルの欠乏；また
は ５）ＡＰＰのアミノ酸配列の突然変異により引き起こさ
れる病理学的タンパク質分解的分解に対するＡＰＰの感
受性の増加。
【００２０】細胞系のＡＰＰ分類の調節について比較的
殆ど知られていない。少なくとも一部分タンパク質キナ
ーゼ活性の変更のためであるリン酸化の変更は、ＡＰＰ
の交換（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を引き起こし、究極
的にＡＰＰプロセシングの変化に導くという、増大しつ
つある仮説が存在する（Ｂｕｘｂａｕｍら、１９９０、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
７：６００３）。こうして、細胞のリン酸化を変更する
ように設計された処理は、ＡＰＰのＣ末端の断片のパタ
ーンの定性的および定量的な両者の変化を引き起こし
た。
【００２１】より最近、（Ｎｉｔｓｃｈら、１９９２、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：３０４）、ある種のアセチル
コリンレセプター型を使用する細胞系のトランスフェク
ションおよび引き続くレセプターの活性化は、タンパク
質キナーゼ活性の変化により引き起こされると結論され
たプロセスにおいて、ＡＰＰのプロセシングおよび分泌
を増加させることが示された。変更されたリン酸化につ
いての役割を包含する外に、この後者の研究は班の病理
学とアルツハイマー病のコリン作動性神経機能の特性に
おける確立された混乱との間の連携を提供する。
【００２２】上の観察にかかわらず、細胞の分類の下に
横たわる変更に対するバランスを回復することができ
る、選択的かつ特定の治療剤の設計を可能とするＡＰＰ
の分類の知識が現在不足している。
【００２３】ベータ−アミロイドは１種または２種以上
のプロテアーゼの直接の作用により形成されるにちがい
ない。Ｃ−１００またはベータ−アミロイドの形成の原
因となる、いわゆる「病理学的」脳プロテアーゼの同定
は、アミロイドの蓄積をブロックするように設計された
治療のプロテアーゼインヒビターを開発するための努力
の必須の段階である。このような酵素の同定は、脳の抽
出物の中に存在する他の脳のタンパク質分解酵素の存在
下にプロテアーゼの活性を特別に測定できるようにす
る、このようなプロテアーゼ活性についての特別のアッ
セイの開発を必要とする。
【００２４】次いで、このようなアッセイを使用してプ
ロテアーゼ精製の間にプロテアーゼを検出する。最後
に、アッセイを使用して、鉛の治療用化合物についての
製剤学的スクリーニングにおいて要求されるような、酵
素のプロテアーゼインヒビターの作用を測定することが
できる。
【００２５】セクレトアーゼおよび主張された病理学的
プロテアーゼの両者の精製および特性決定のために、い
くつかの研究がなされた。初期の研究は、ＡＰＰ内の期
待された切断部位のみをまねる合成ペプチド基質を特徴
づけるアッセイを利用した。このようなアッセイは精製
されたプロテアーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の測定に有
用であるが、プロテアーゼの精製のモニターに要求され
るような、プロテアーゼの混合物中の１つのプロテアー
ゼの検出を可能とするために十分な特異性をめったにも
たない。こうして、これらのプロテアーゼのアッセイは
必要なプロテアーゼの特異性を提供することができず、
そしてこうして定量されたプロテアーゼ活性はヒトの脳
の組織から酵素活性を有する候補のＡＰＰを精製するた
めに使用されたが、成功しなかった。この開示以前に、
いずれの方法のためにも信頼できる候補の１種または２
種以上のプロテアーゼは出現せず、そして種々の研究の
結果は対立した。
【００２６】例えば、多数の有効な研究は病理学的プロ
テアーゼが次のものであることを提案した：由来がリソ
ソームである（Ｃａｔａｌｄｏら、１９９０、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３８
６１；Ｈａａｓら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：
５００）；カルシウム依存性セリンプロテアーゼまたは
金属依存性システインプロテアーゼ（Ａｂｔａｈａｍｓ
ら、１９９１、Ａｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６４
０：１６１）；カルペイン（Ｃａｌｐａｉｎ）Ｉ（Ｓｉ
ｍａｎら、１９９０、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
１０：２４００）；多重触媒性プロテアーゼ（Ｉｓｈｉ
ｈａｒａら、１９８９、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５７：
３８８）；セリンプロテアーゼ（Ｎｅｌｓｏｎら、１９
９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３８３６）；
トロンビン（Ｉｇａｒａｓｈｉら、１９９２、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８５：
１０００）；または亜鉛メタロ−ペプチダーゼ（ＷＩＰ
Ｏ出願、ＷＯ９２／０７０６８、Ａｔｈｅｎａ Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）。
【００２７】セクレターゼを同定する努力において同様
な不一致が存在し、セクレターゼは次のものであると主
張されてきている：メタロ−ペプチダーゼ（ＭｃＤｅｒ
ｍｏｔｔら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：アセチルコリンエステ
ラーゼ関連プロテアーゼ（Ｓｍａｌｌら、１９９１、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０７９５）；カテプ
シンＢ（Ｔａｇａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７７：３７７）；または広
い下位部位の特異性の血漿膜関連プロテアーゼ（Ｓｉｓ
ｏｄｉａ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６０７５；Ｍａｒｕｙａｍａ
ら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：１６７０）。
【００２８】ＡＰＰプロセシング酵素の性質を同定する
過去および現在の努力が一般に成功しなかった理由は、
使用したアッセイの特異性が劣っていること、および大
脳に関連するプロテアーゼの複雑な異種性にある。
【００２９】本発明は、反応生成物の免疫化学的検出と
組み合わせた組み換えＡＰＰのタンパク質分解的分解に
基づく特定のアッセイを使用して、ＡＰＰプロセシング
酵素のいくつかを同定する方法を記載する。本発明のア
ッセイは、ＡＰＰからのベータ−アミロイドの形成にお
いてある役割を演ずる正しい特異性および適当な局在化
を有する、ヒトの脳のプロテアーゼを同定する。
【００３０】同定されたプロテアーゼと組み合わせて現
在開示するアッセイのフォーマットは、多数の試料を合
理的に処理する能力を与えそして検出の免疫化学的のた
めにすぐれた感度を生ずる。さらに、このアッセイの簡
素性は、実験室の技術により日常的使用のための容易な
適合性を可能とし、そして首尾一貫した、再現性ある結
果を生ずる。これらおよび他の改良を下に記載する。
【００３１】現在開示する本発明の１つの目的は、アル
ツハイマー病の患者を処理するために使用することがで
きる薬物を開発する方法を提供することである。前述し
たように、３９〜４２アミノ酸のペプチドのベータ−ア
ミロイドを生ずるＡＰＰのタンパク質分解的分解は、ア
ミロイドの班の形成の病態生理学的プロセスにおける第
１段階である。証拠の数行は、ＡＤの脳の中に見いださ
れる神経変質特性におけるベータ−アミロイドの原因と
なる役割およびアミロイドの班を指摘する。これらは次
のものを包含する： ｉ）変質性ニューロンおよびジストロフィーを使用する
班物質の同時局在化（Ｐｒｉｃｅら、１９８９、Ｂｉｏ
Ｅａｓｓａｙｓ １０：６９に概観されている］； ｉｉ）ベータ−アミロイドは培養においてニューロンに
対して毒性であることができるという証拠（Ｙａｎｋｎ
ｅｒら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：２７
０）； ｉｉｉ）ベータ−アミロイドはニューロンの変質に関連
し、そしてある種の動物のモデルにおいて試験したとき
記憶を変更するという証拠（Ｆｌｏｏｄら、１９９１、
ＰＮＡＳ ８８：３３６３；Ｋｏｗａｌｌら、１９９
１、１９９１、ＰＮＡＳ ８８：７２４７）；および ｉｖ）アミロイド前駆体タンパク質の中に点突然変異を
もつ遺伝したＡＤのある種の形態の共分離（Ｇｏａｔｅ
ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７０４；Ｙｏｓ
ｈｉｏｋａら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７８：１１４１；Ｃｈａｒ
ｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ
３５３：８４４；Ｍｕｒｒｅｌｌら、１９９１、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２５４：９７；Ｍｕｌｌａｎら、１９９２、Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１：３４５）。
【００３２】こうして、ベータ−アミロイドへのＡＰＰ
のタンパク質分解的転化はＡＤの病因論、例えば、治療
的関与のための重要なターゲットであるように思われ
る。関係するプロテアーゼ活性の同定、ならびに適当な
ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイの開発は、し
たがって、アルツハイマー病の患者におけるアミロイド
班の形成をブロックするための処理として使用できる治
療的プロテアーゼインヒビターの開発のための必須の前
提条件である。
【００３３】本発明は、タンパク質分解的ベータ−アミ
ロイドの形成のインヒビターを発見するために使用でき
る２つの開発を含有する： １）ホロ−ＡＰＰ基質およびＡＰＰを分解する高度に精
製されたプロテアーゼまたはＡＰＰを分解することがで
きる同定されないプロテアーゼを含有する粗製の生物学
的抽出物からなるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ。
【００３４】このアッセイはＣ末端のＡＰＰ断片を生ず
るｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＰＰの分解活性の検出を可能と
する。粗製の生物学的抽出物を使用するとき、このアッ
セイを使用して検出されたの原因となるプロテアーゼの
精製をモニターするか、あるいは特性決定することがで
きる。
【００３５】さらに、精製されたプロテアーゼまたは未
同定のＡＰＰ分解性酵素活性を含有する粗製の生物学的
抽出物を使用するとき、このアッセイを使用して、アッ
セイ混合物の中で共インキュベーションする化学的また
は生物学的化合物による、ＡＰＰプロセシング活性の阻
害を測定することができる。これにより同定された阻害
化合物は、アルツハイマー病の患者のｉｎ ｖｉｖｏア
ミロイド班形成の治療的インヒビターとして用途を有す
る。
【００３６】２）上の（１）に記載するｉｎ ｖｉｔｒ
ｏアッセイ系と組み合わせて使用するとき、アミロイド
または前アミロイドのＡＰＰのＣ末端の断片を形成する
ことができる、ヒト脳からの特定のプロテアーゼの同定
および精製。
【００３７】このような酵素は、アスパラギン酸のプロ
テアーゼ、カテプシンＤおよびキモトリプシン様セリン
プロテアーゼ（カテプシンＧと区別されそしてＴＰＣＫ
およびアルファ−２抗プラスミンおよびジャガイモから
のキモトリプシンインヒビターＩＩにより阻害される）
を包含する。カテプシンＤの同定はとくに意味がある。
カテプシンＤは、それぞれ、１０．０ｋＤａおよび５．
６ｋＤａのＣ−１００様およびベータ−アミロイド様断
片を形成することができることをわれわれは示す。 こ
の発見により、精製されたまたは単離されたカテプシン
Ｄを使用して、上の（１）に記載するｉｎ ｖｉｔｒｏ
アッセイによるか、あるいはより簡単な高い処理量のペ
プチダーゼアッセイ、例えば、本発明において記載する
アッセイにより、インヒビターをその活性について探索
することができる。
【００３８】さらに、カテプシンＤの特異性ならびに特
定のアスパラギン酸のプロテアーゼのインヒビターの設
計について知られているので、アミロイド生成プロテア
ーゼとしてのカテプシンＤの同定は、確立された方法を
使用する特定のカテプシンＤインヒビターの開発、なら
びに確立されたカテプシンＤのインヒビターの利用の両
者を可能とする。
【００３９】また、下に示すように、カテプシンＤは、
予期せざることには、ＡＰＰをＧｌｕ−Ｖａｌの間のペ
プチドにおいて加水分解する（カテプシンＤの好ましい
特異性は、本来、疎水性残基の間に存在する）。この情
報をカテプシンＤのインヒビターの設計においてさらに
使用することができる。
【００４０】前述したように、これにより同定された阻
害化合物はアルツハイマー病の患者のｉｎ ｖｉｖｏア
ミロイド班形成の治療的インヒビターとしての用途を有
する。 本発明の使用により同定されたＡＰＰ分解性酵
素は、精製し、そして、 ｉ）プロテアーゼの共局在化とＡＤ脳病理学とをさらに
関係づけるために必要な免疫化学的試薬を開発するため
に；そして ｉｉ）対応するプロテアーゼｃＤＮＡを分離するため
に、使用することができる。次いで、クローニングされ
たｃＤＮＡを使用して、プロテアーゼの過度の発現の効
果をアッセイする、ＡＤのためのトランスジェニック動
物のモデルを構成するために使用できる。
【００４１】合成ペプチドの基質を組み込んだアッセイ
は高度に精製されたプロテアーゼ調製物のｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ酵素学的研究のために有用であるが、一般に過度の
プロテアーゼを含有する粗製の生物学的抽出物の中の所
望のプロテアーゼ活性を選択的に検出するために十分な
特異性をもたない。例えば、脳の組織は広い種々の範囲
のペプチドをプロセシングおよび分解する酵素に富んで
おり、そのために合成ペプチド基質を使用して特定の脳
のＡＰＰ分解性プロテアーゼを分離する努力が不成功の
終わった（上の背景の節を参照のこと）。
【００４２】したがって、実施例３において、本発明の
開示が示すように、合成ペプチドのアッセイにより特定
したアッセイの条件下にＡＰＰを分解してＣ末端の断片
を生成できないいくつかのペプチドが同定され、そして
ＡＰＰ分解性プロテアーゼのパターンは脳のペプチダー
ゼの対応するパターンにいずれの方法においても類似し
ない。
【００４３】この問題に対するより明確なアプローチ
は、プロテアーゼを含有する分画とのインキュベーショ
ン後にその特異的分解をアッセイする方法と組み合わせ
て、ホロ−ＡＰＰを使用することである。この目的で、
本発明はこのような方法を記載し、この方法において脳
のプロテアーゼの分画による組み換えＡＰＰの酵素分解
をＡＰＰのＣ末端領域に対して抗体を使用するイムノブ
ロットによりモニターする。
【００４４】われわれのアッセイの手順は、全長のベー
タ−アミロイドのペプチドを含むために十分な大きさの
ＡＰＰからＣ末端の断片を形成することに集中する（エ
ンドタンパク質分解を必要とする方法、Ａ４領域に対し
てＮ末端）。
【００４５】ヒト脳組織（非−ＡＤ対照またはアルツハ
イマー）を均質化し、次いで普通の超遠心により、可溶
性分画（以後「Ｓ」）、１５，０００ｇ後の沈澱物（以
後「Ｐ−２」）およびミクロソームの分画（以後
「Ｍ」）に細分画する。膜のＭおよびＰ−２の分画をト
リトンＸ−１００調製物で可溶化する。次いで、Ｍおよ
びＰ−２から生ずる可溶性分画、ならびにＳ分画を別々
にモノ−Ｑの強いアニオン交換カラムのクロマトグラフ
ィーにかけ、これにより異なる脳のプロテアーゼが分割
される。
【００４６】ベータ−アミロイドのＮ末端を取り囲むア
ミノ酸配列をまねる合成ペプチドを使用して、Ｍ、可溶
性およびＰ−２の分画の精製からの個々のモノ−Ｑの分
画のプロテアーゼ活性を評価する。カラムの分画の隣接
するプールをプロテアーゼ活性の個々のポリヌクレオチ
ドキナーゼの回収に基づいてつくる。
【００４７】プロテアーゼ活性のプールを使用して、ト
ランスフェクションしたＣＨＯ細胞系から精製した高度
に純粋な組み換えアミロイド前駆体のタンパク質分解的
分解の検出のための条件を確立する。ＡＰＰのＣ末端ド
メインまたはベータ−アミロイド領域に対して向けられ
た抗体を使用してＣ末端のＡＰＰ断片を局在する、イム
ノブロットアッセイを開発する。このアッセイを使用し
て、全長のベータ−アミロイドを潜在的に含有するため
に十分に大きい大きさのＡＰＰのＣ末端の断片を形成で
きる、６つの潜在的に異なるタンパク質分解的活性を同
定する。モノ−Ｑのプールの間でＡＰＰ分解活性の回収
は、工程２において確立されたプロテアーゼ活性のプロ
フィルとよく相関関係づけられないことがわかった。イ
ンヒビターの研究により、ＡＰＰ分解活性はセリンおよ
びアスパラギン酸の両者のプロテアーゼ活性を含むこと
が明らかにされる。
【００４８】酵素の精製をモニターするためのペプチダ
ーゼのアッセイはよく使用されている。バキュロウイル
スの特異的昆虫細胞の系の中で発現し、タンパク質の精
製の間のＡＰＰ分解活性をモニターする主要な方法とし
て、ＡＰＰ分解アッセイを使用できるようにすることに
よって、より多くの組み換えＡＰＰが得られる。主要な
アスパラギン酸のプロテアーゼ活性はＰ−２分画のモノ
−Ｑ精製からの分画の中で同定される。
【００４９】それ以上の精製および特性決定の実験によ
り、この酵素はカテプシンＤであることが証明される。
カテプシンＤはホロ−ＡＰＰを加水分解して、５．６ｋ
Ｄのベータ−アミロイド様断片を形成であることが示さ
れる。
【００５０】アプロニチンセファローズ親和クロマトグ
ラフィーを使用して、上で同定されたアプロニチン感受
性ＡＰＰ分解活性を分離する試みをする。キモトリプシ
ン様セリンプロテアーゼ活性を部分的に精製し、これは
ＡＰＰを分解して１１、１４および１８ｋＤａの特定の
Ｃ末端の断片を形成することができ、これらは免疫化学
的手段により全長のベータ−アミロイドを含有すること
が示された。
【００５１】この手順により、高い確率で、ＡＰＰのア
ミロイド生成分解においてある役割を演ずる、いくつか
の脳のプロテアーゼ活性をわれわれは同定した。ここに
記載する同定または未同定の酸の各々を、ＡＰＰの分解
と組み合わせて、使用して治療的価値の選択的プロテア
ーゼインヒビターについてスクリーニングすることがで
きる。
【００５２】ここで使用するとき、「ＡＰＰの基質」
は、生物学的源から分離または精製によるか、あるいは
ＡＰＰまたはその類似体をエンコードするクローニング
した遺伝子の発現により誘導された全長のＡＰＰ、およ
び任意のこのようなタンパク質の断片、タンパク質また
はその一部分の消化により得られた断片を包含する、Ａ
ＰＰタンパク質の一部分をコードする遺伝子の発現によ
り得られた断片、およびＡＰＰタンパク質の一部分に相
当するアミノ酸配列を有する合成ペプチドを意味する。
【００５３】本発明のアッセイのためのＡＰＰの基質は
種々の形態で被検試薬として提供される。好ましくはＡ
ＰＰ６９５から誘導されるか、あるいはそれらのアミノ
酸配列に少なくとも一部分相当するが、他のＡＰＰのイ
ソ型（前掲）の誘導体または類似体は本発明の方法にお
ける使用が同様によく考えられる。ＡＰＰ６９５は、例
えば、Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２０６６に記
載されているように天然源からの生化学的分離または精
製によるか、あるいはタンパク質またはその機能的部分
をエンコードする組み換えＤＮＡクローンの発現により
得るすることができる（Ｋｎｏｐｓラ、１９９１、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：７２８５；Ｂｈａｓｉｎ
ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８８：１０３０７）。ＡＰＰタンパク質の
断片は、関係するタンパク質分解的被検試料の活性（前
掲）による認識および切断について十分なアミノ酸配列
からなるであろう。生物学的物質からのＡＰＰの分離
は、通常、普通の技術、例えば、クロマトグラフィー、
とくに親和クロマトグラフィーによる精製を包含する。
精製されたＡＰＰまたはその断片を使用してモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体を調製し、次いでこ
れを普通の手順に従う親和精製において使用することが
できる。生ずる精製されたＡＰＰ物質は、例えば、化学
的または酵素的消化によりさらに処理することができ
る。有用な断片は、関係するタンパク質分解的被検試料
の活性（前掲）に対する所望の感受性についてスクリー
ニングすることによって同定される。 前述したよう
に、ＡＰＰの基質はまたＡＰＰまたはその一部分をコー
ドする組み換えＤＮＡクローンの発現により調製するこ
とができる。クローニングされたＡＰＰ遺伝子はそれ自
体天然または合成であることができ、天然の遺伝子は既
知のアミノ酸配列に基づく縮重プローブを使用してｃＤ
ＮＡまたはゲノムのライブラリーについて得ることがで
きる（Ｋａｎｇら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ ３２５：
７３３）。適当な組み換えＤＮＡクローンを得る他の技
術、ならびにクローニングされた遺伝子を発現する方法
は当業者にとって明らかである。
【００５４】被検試料の存在下にＡＰＰの基質のタンパ
ク質分解的切断を検出するために、種々の便利な方法を
使用するすることができる。現在より好ましい方法のい
くつかを下に記載するが、当業者は認識するように、本
発明の特徴を逸脱しないでこの工程に多数の他の方法を
適用することができる。一般に、ＡＰＰの基質のタンパ
ク質分解的切断の発生を検出することができる任意の方
法をこの目的に使用することができる。このような方法
は、切断がシグナル生成種、例えば、光学的に応答性の
生成物、例えば、着色したまたは蛍光性の色素を生成す
るようにＡＰＰの基質を適当に設計することによって、
得ることができる。
【００５５】他の原理的アプローチは１種または２種以
上の生成物を、例えば、イムノアッセイにより感受性の
検出を包含する。現在、このような切断生成物は優先的
にＡＰＰの基質のＣ末端の断片である；しかしながら、
試料とインキュベーションするとき、現れる任意の断片
は検出の対象であることができる。
【００５６】病理学的タンパク質分解的活性の１種また
は２種以上の切断生成物の特性の検出は、多数のの方法
で達成することができる。１つのこのような方法は、さ
らに下の実施例において例示し、普通にブロットとして
知られている手順を包含する。典型的には、ＡＰＰを被
検試料とインキュベーションした後、ゲル電気泳動を実
施して反応混合物の中に生ずる成分を分離する。次い
で、分離したタンパク質成分を固体マトリックス、例え
ば、ニトロセルロース膜に移す。
【００５７】次いで、ＡＰＰの分解の特徴を示す断片に
対して特異的な抗体を膜に固定した成分と反応させ、そ
して二次酵素−標識抗体接合体の添加により検出する。
生ずる結合した接合体の位置を酵素標識のための発色性
基質で現像する。
【００５８】現在入手可能な試験系に適用可能な種々の
イムノアッセイのフォーマットを、また、ＡＰＰ断片の
検出に適用することができる。典型的には、ＡＰＰの基
質とインキュベーションし、そして生ずる完全なＡＰＰ
を固定化する（例えば、固体相への捕捉による）か、あ
るいは被検試料を固定化した形態のＡＰＰの基質とイン
キュベーションする。次いで、ＡＰＰの基質から切断さ
れるか、あるいは切断部位を定めるＡＰＰの基質の部分
に対して向けられた抗体試薬と固定化されたＡＰＰの基
質と反応させることによって、タンパク質分解的切断を
検出する。
【００５９】抗体試薬は、全抗体からなることができる
か、あるいは抗原結合部位、例えば、ＦａｂまたはＦａ
ｂ’からなる抗体断片からなることができ、そしてモノ
クローナルまたはポリクローナルのタイプであることが
できる。固定化された相に結合した抗体試薬の検出は、
特徴あるタンパク質分解的切断の不存在を示す。逆に、
固定化された相への抗体の結合の損失はＡＰＰの切断を
示す。抗体試薬の結合の検出は、一般に、このような抗
体試薬の標識した形態の使用、あるいは第２の、または
抗−（抗体）、標識した抗体の使用を包含する。
【００６０】ＡＰＰの捕捉または固定化は多数の方法で
達成することができる。切断可能な断片上に存在しない
ＡＰＰのエピトープに対して特異的な抗体を発生させる
ことができる。このような抗体を固定化し、そして完全
なＡＰＰの捕捉または固定化に使用することができる。
あるいは、リガンドまたはハプテンをＡＰＰに共有結合
で取り付けることができ、そして対応する固定化された
レセプターまたは抗体を使用してＡＰＰを捕捉または固
定化することができる。この目的に有用な典型的なリガ
ンド：レセプターの対はビオチン：アビジンである。こ
の目的に有用なハプテンの例はフルオレセインまたはジ
ギトキシゲニンである。
【００６１】ＡＰＰの基質をその上に固定化または捕捉
する固相は種々の材料から構成することができ、このよ
うな材料はマイクロタイタープレートのウェル、試験
管、ストリップ、ビーズ、粒子などを包含する。とくに
有用な固相は磁性または常磁性の粒子である。このよう
な粒子は、簡単な化学的反応により種々の化合物にカッ
プリングすることができる化学的に活性な基を含有する
ように誘導化することができる。粒子を含有する容器に
磁石を近づけることによって粒子を懸濁液から除去する
ことができる。こうして、粒子はめんどうな遠心または
濾過なしに反復して洗浄することができ、アッセイの手
順を完全に自動化するための基礎が得られる。
【００６２】一次または二次の抗体試薬のための標識は
この分野においてよく知られているものから選択するこ
とができる。いくつかのこのような不安定なは蛍光性ま
たは化学発光性の標識、放射性同位元素であり、そし
て、より好ましくは、この目的のための酵素はアルカリ
性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびβ−ガラク
トシダーゼである。これらの酵素は種々の条件下に安定
であり、そして簡単な発色性基質を使用して検出するこ
とができる。
【００６３】ＡＰＰの基質のタンパク質分解的切断は、
また、ＡＰＰ断片を分離し、次いで検出するクロマトグ
ラフの技術により検出することができる。高性能液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）はこれに関してとくに有
用である。この技術を適用するとき、蛍光標識したＡＰ
Ｐの基質を調製する。被検試料とインキュベーションし
た後、反応混合物をクロマトグラフィーのカラムに適用
し、そして蛍光性断片／完全なＡＰＰの移動の示差的速
度を観測する。
【００６４】
【実施例】
実施例１ ヒト脳プロテアーゼの分離 ２つの一般的アプローチをプロテアーゼの分離のために
採用した。初期の研究において、脳のプロテアーゼの活
性を下の「方法１」に記載されているように分離した。
イオン交換クロマトグラフィーから得られた生ずる酵素
活性を実施例３および８に記載し、そして６つの異なる
活性の同定に導き、これらは活性は組み換えＣＨＯ細胞
誘導ＡＰＰ（実施例８）を分解することができたが、ペ
プチダーゼとして比較的不活性であった（実施例３）。
【００６５】６つの活性の１つは引き続いてカテプシン
Ｄとして同定され（実施例９）、そしてそのゲル濾過ク
ロマトグラフィーに従いさらに特性決定した。
【００６６】実施例８に記載するヒト脳セリンプロテア
ーゼのいくつかの親和精製を試みる別のアプローチにお
いて（表４）、「方法４」を実施した。この手順は早期
の段階におけるアプロチニンセファローズを使用するセ
リンプロテアーゼのＡＰＰの基質に基づき、そして１種
または２種以上のセリンプロテアーゼの同定に導き（実
施例１０）、これらはまたＡＰＰＣ末端のプロセシング
のための能力を示した。
【００６７】方法１： ｉ）下位細胞の分別 別々の、年令が合致したアルツハイマー病の患者からの
ヒト前頭皮質の極９の領域の切片（４．５ｇ）を凍結
（−７０℃）の間に秤量し、１５０ｍｌの０．３２Ｍの
スクロースに４℃において添加し、そしてはさみで細か
く切った。懸濁液をバッチで１００ｍｌのエルベジェム
（Ｅｌｖｅｈｊｅｍ）ガラステフロンのポッター（ｐｏ
ｔｔｅｒ）（１０回の戻りのストローク）を使用して均
質化した。一緒にしたホモジネートをソーバル（Ｓｏｒ
ｖａｌ）ＳＳ−３４ローター遠心（１０００ｇ×１０
分）した。
【００６８】ゆるいペレットを取り出し、前述したよう
に再均質化しそして遠心した。各抽出についての上澄み
液を一緒にし、そしてソーバル（Ｓｏｒｖａｌ）ＳＳ−
３４ローターの中で１５，０００ｇ×３０分遠心した。
生ずる「Ｐ−２」ペレットを１００ｍｌの氷冷した０．
３２Ｍのスクロースの中に渦形成により再懸濁させ、そ
して−７０℃において貯蔵した。最後の回転からの上澄
み液を１０５，０００ｇ×６０分で遠心して、上澄み液
または可溶性分画（「Ｓ」）およびミクロソームの分画
（「Ｍ」）を生成し、これらを６０ｍｌの０．３２Ｍの
スクロースの中に再懸濁させた。ＳおよびＭの両者を−
７０℃において貯蔵した。
【００６９】
【表１】
【００７０】ｉｉ）可溶化 膜の対照またはＡＤの細分画（Ｐ−２またはＭ）を次の
条件に調節することによって可溶化した：２５のトリト
ンＸ−１００を含有する５０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝
液、ｐＨ７．５。４℃において３．５時間撹拌した後、
懸濁液をベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）７０Ｔｉロータ
ーの中で１０５，０００ｇ×６０分遠心した。次の最終
のタンパク質濃度を可溶化においてＰ−２（３．９〜
４．０ｍｇ／ｍｌ）およびＭ（１．４〜１．６ｍｇ／ｍ
ｌ）について使用した。可溶化した上澄み液を−７０℃
においてのちの使用のために貯蔵した。可溶性分画を洗
浄剤で処理しないで、むしろストックの１Ｍの緩衝液の
添加によりトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５の中で５０ｍＭに
調節した。
【００７１】ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィー ５０ｍｌのレオダイン（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）ステンレス
鋼のループのインジェクター７１２５型を装備しそして
モノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ ＨＲ１０／１０カラム［ファーマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージイ州ピス
カタウェイ］に接続したギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）勾配
液体クロマトグラフィー（３０５型および３０６型ポン
プ）を使用して、クロマトグラフィーを実施した。カラ
ムの流出液の吸収を２８０ｎｍにおいてファーマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＵＶ−Ｍ検出器およびキッペン
（Ｋｉｐｐｅｎ）−ゾウネンチャート記録装置を使用し
てモニターした。
【００７２】Ｐ−２のタンパク質分画、ミクロソーム
（Ｍ）または（Ｓ）をカラム上に負荷し、そして５０ｍ
ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５（４℃における導電性
１．８ｍＵ）と２ｍｌ／分の流速で平衡化した。次い
で、溶離液のＡ２８０ｎｍが０に減少するまでカラムを
平衡化緩衝液で洗浄し、次いでカラムの流速を４ｍｌ／
分に増加した。
【００７３】タンパク質を次のようにして溶離した： 溶媒：Ａ＝５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５ Ｂ＝５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ＭのＨＣ
ｌを含有する。
【００７４】 プログラム：７０分かけて０〜５０％のＢ １０分間５０％に保持する １０分かけて５０〜１００％のＢ １０分間１００％に保持する 再平衡化。
【００７５】４ｍｌの分画をクロマトグラフィーを通じ
て集めた。次のタンパク質の負荷をカラム当たりに適用
した：Ｐ−２、９７ｍｇ（対照）および９５ｍｇ（Ａ
Ｄ）；Ｓ、５０ｍｇ（対照）および６８ｍｇ（ＡＤ）；
およびＭ、３６ｍｇ（対照）および３１ｍｇ（ＡＤ）。
【００７６】初期の研究において、溶離した分画をＡ２
８０ｎｍ、合計のタンパク質（ブラッドフォードアッセ
イ）、およびペプチダーゼ活性（実施例２および３に記
載するように）についてモニターした。次いでペプチダ
ーゼ活性に基づいてつくったプールを調製し（実施例
３）次いでＣＨＯ誘導ＡＰＰをＣ末端でプロセシングす
るそれらの能力について試験した（実施例８に記載する
ように）。
【００７７】しかしながら、すべての他の研究におい
て、溶離された分画をまた、バキュロウイルス特異的発
現により誘導された組み換えＡＰＰのＣ末端のプロセシ
ングするそれらの能力について試験した（実施例９）。
【００７８】ｉｖ）ゲル濾過の典型的な実施例を図１３
に描写する。より一般に、ｃｖｐを後述するように実施
した。Ｐ−２の精製からおよびＣ末端のプロセシング活
性を含有するモノ−Ｑの分画をプールし、０．２５ｍｌ
に濃縮し、そして１０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ
７．５と平衡化しそして１５０ｍＭのＮａＣｌを含有す
る２つのスパロース６ＨＲカラムの直列の配置に適用し
た。０．３ｍｌ／分の流速を全体を通して使用した。分
画をＡ２８０ｎｍ、合計のタンパク質（ブラッドフォー
ドアッセイ）、および組み換えＡＰＰのＣ末端のプロセ
シングの活性についてモニターした。
【００７９】方法２： ｉ）下位細胞の分別 これは本質的に上の方法１に記載するように実施した。
【００８０】ｉｉ）可溶化 これは本質的に上の方法１に記載するように実施した。
【００８１】ｉｉｉ）アプロチニン−セファローズのク
ロマトグラフィー 前述の可溶性（２３０ｍｇ）、Ｐ−２（２１６ｍｇ）ま
たはミクロソームの分画（４７ｍｇ）を、前以て２０ｍ
ＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．０と平衡化した、アプ
ロチニンセファローズのカラム（シグマ、カタログＮ
ｏ．４２２６８、１．５×１０ｃｍ）に適用した。いっ
たん負荷したカラムを平衡化緩衝液（１００ｍｌ）で洗
浄し、次いで６０ｍｌの５０ｍＭの塩化ナトリウムを含
有する５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０で溶
離した。全体を通して流速は１．０ｍｌ／分であった。
溶離した分画（４ｍｌ）を２８０ｎｍにおいてモニター
し、ブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して分
析し、そして実施例８に記載するようにＡＰＰのＣ末端
のプロセシング活性について、バキュロウイルス系中の
発現により誘導された組み換えＡＰＰを使用して検査し
た。活性の分画は１１、１４および１８ｋＤａ（概算）
の断片を形成することができ、これらの断片は抗ＡＰＰ
ｎｏＣ末端抗体を使用してイムノブロット上で検出可能
であった（参照、抗体の生成方法について方法６）。
【００８２】ｉｖ）イオン交換クロマトグラフィー アプロチニン−セファローズ上のＰ−２分画の精製から
の活性分画をプールし、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ
７．５に対して透析し、そして透析緩衝液と前以て平衡
化したモノ−Ｑカラム（ＨＲ５／５）に適用した。いっ
たん負荷すると、カラムを本質的に上の方法１に記載す
るように実施した。活性の分画をＡ２８０ｎｍ、合計の
タンパク質（ブラッドフォードアッセイ）、およびバキ
ュロウイルス誘導ＡＰＰのＣ末端のプロセシングの活性
についてモニターした。ＡＰＰ分解活性の広いピークが
観察され、これは１１、１４および１８ｋＤａのＡＰＰ
のＣ末端の断片を形成することができ、これらの断片は
ＡＰＰのＣ末端の抗体ならびにベータ−アミロイドのペ
プチドのＮ末端に対して向けられたモノクローナル抗体
の両者と反応した（参照、抗体の生成について実施例
６）。
【００８３】活性の分画を含有する領域をを横切るＡ２
８０ｎｍのプロフィルに基づいて、各々が明確なＡ２８
０ｎｍのピークとオーバーラップする活性の３つのプー
ルを調製した。プールは次の導電性の領域からなってい
た：プールＸ（１２．２〜１４．４ｍｍｈｏ）、プール
Ｙ（１４．９〜１８９．９ｍｍｈｏ）およびプールＺ
（２０．２〜２２．９ｍｍｈｏ）。
【００８４】ｖ）ゲル濾過クロマトグラフィー プールＸ、ＹおよびＺの各々を２ｍｌ（プールＸおよび
Ｙ）または３．６ｍｌ（プールＺ）に濃縮し、そして前
以て１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭの
トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５と平衡化したセファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）７５カラム（ファーマシア、ニュ
ージャージイ州ピスカタウェイ）に別々に適用した。い
ったん負荷すると、カラムを平衡化緩衝液で溶離した。
クロマトグラフィーを全体を通して１．０ｍｌ／分の流
速で実施した。分画（１ｍｌ）をＡ２８０ｎｍ、合計の
タンパク質（ブラッドフォードアッセイ）、およびバキ
ュロ発現ＡＰＰのＣ末端のプロセシングの活性について
モニターした。ゲル濾過は次の標準タンパク質の各々の
クロマトグラフィーにより目盛り定めした：チログロブ
リン（６７０ｋＤ）、ウシガンマグロブリン（１５８ｋ
Ｄ）、オボアルブミン（４４ｋＤ）、ミオグロビン（１
７．５ｋＤ）およびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤ）。
【００８５】実施例２ ペプチダーゼアッセイの開発 ベータ−アミロイドのペプチド領域の「細胞外」ドメイ
ンとＮ末端との間の接合におけるＡＰＰの加水分解に適
当な特異性を有するかもしれない、ヒト脳の組織の中の
エンドプロテアーゼの高い処理量の検出を可能とするペ
プチダーゼのアッセイを開発した。選択した技術におい
て、ダンシル化ペプチドの基質を、引き続くＰＲ−ＨＰ
ＬＣ分割による蛍光性ペプチド生成物の検出、およびカ
ラム後の蛍光性の検出と組み合わせて利用した。
【００８６】ペプチド基質の配列の発生：ヒトＡＰＰの
ベータ−アミロイドのペプチドのＮ末端領域を取り囲ん
で観察されるのと同一のアミノ酸配列を含有する蛍光的
に標識したドデカ−ペプチドを、固相ペプチド合成によ
り調製した。ペプチドはアプライド・バイオシステムス
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３０Ａペ
プチド合成装置でＦｍｏｃ／ＮＭＰ−ＨｏＢｔ化学を使
用して合成した（Ｆｉｅｌｄｓら、１９９０、Ｊ．Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１；
Ｋｏｈｒｒら、１９８９、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ、３０：１９２７）。通常、ペプチドを切
断し、そして９０％のトリフルオロ酢酸、４％のチオア
ニソール、２％のエタンジチオールおよび４％の液化フ
ェノールの中で室温において２時間脱プロトン化した。
【００８７】しかしながら、ペプチド：Ｎ−ダンシル−
Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａ
ｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列
同定番号：２）は、粗製の組織分画とインキュベーショ
ンしたとき、不都合なカルボキシペプチダーゼの消化を
行うことが発見された。ペプチダーゼ消化を減少するた
めに、修飾した基質を設計した：Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2（配列同定番
号：７）およびＮ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ（配列同定番号：１）．この後者のペプチドは粗製
の組織分画の存在下でさえカルボキシペプチダーゼ消化
に対して比較的不感受性であり、そして実施例３のペプ
チダーゼプロフィル化の研究において使用した。カルボ
キシ末端のアルファアミド基質（配列同定番号：７）
は、より精製した酵素分画を使用する実施例９のペプチ
ダーゼの研究において使用した。ペプチドのいずれの分
解も下の実施例３のＨＰＬＣプロトコルを使用してモニ
ターした。
【００８８】実施例３ 正常の−対照およびＡＤの脳の細分画の中でペプチダー
ゼ活性の決定 ｉ）インキュベーション 実施例１に記載するカラムの分画のアリコート（２０μ
ｌ）を１０μｌの反応混合物とインキュベーションし
て、次の最終成分濃度を達成した：１００ｍＭの各々の
Ｍｅｓ、トリスおよび酢酸塩ｐＨ６．５からなるカクテ
ル緩衝液中の、Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ（配列同定番号：１））５０μＭ）、カプトプリル
（３００μＭ）。
【００８９】イオン交換の分画とのインキュベーション
を３７℃において２４時間実施し、次いでＴＦＡの中で
３％（ｖ／ｖ）の最終濃度に調節することによって反応
を停止させた。
【００９０】ｉｉ）タンパク質分解生成物のＨＰＬＣ定
量 バイナリー溶媒のデリバリー、加熱したカラムの隔室お
よびオートインゼクターを装備したヘウレット−パッカ
ード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅｒｄ）ＨＰ１０９０
を使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。インラインギル
ソン（Ｇｉｌｓｏｎ）１２１型フィルターのフルオロメ
ーター（励起３１０〜４１０ｎｍ、放射４８０〜５２０
ｎｍ）とＨＰＬＣカラムケム−ステーション（ＤＯＳ系
列）およびデータ分析のための適当なソフトウェアとの
組み合わせを使用して、蛍光の検出（カラム後）を実施
した。
【００９１】上の酸性化インキュベーション混合物のア
リコート（通常１０μｌ）を、ガードｃ１８の５μＭの
ガード（２０×４．６ｍｍ）ハイパーシル（Ｈｙｐｅｒ
ｓｉｌ）５μＭのＣ１８カラム（１００×４．６ｍｍ）
上に注入した。２７％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルを含
有する１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５を
使用して、無勾配分割を達成した。分割された代謝物質
の同定および定量は、合成ペプチド生成物の移動との比
較により可能となった。それらの構造をＰＴＣ−アミノ
酸分析およびＦＡＢ−ＭＳにより確証した（参照、下表
２）。
【００９２】
【表２】
【００９３】すべての実験において、ＨＰＬＣカラムは
実験試料と平行に合成生成物の標準の分析により酵素的
に発生した生成物の保持時間の毎日の変動について目盛
り定めした。個々のイオン交換の分画のタンパク質分解
的代謝物質のプロフィルを、ＨＰ ＣＨＥＭのステーシ
ョンデータ獲得のソフトウェアを使用して集めた。
【００９４】６つの切断生成物の各々についての曲線の
下の面積およびそれらの保持時間をピークの表のファイ
ルの中に貯蔵した。すべてのピークの表を集め、そして
ＥＸＣＥＬ（プログラミングランゲージＣに書かれたカ
スタムの利用を使用する）の中の面積の列（６×ｎ）に
移す、ここでｎ＝モノＱの分画の数。列の各うねはモノ
Ｑの分画からの単一のペプチダーゼの分析を表す。ゼロ
はデータの各欄の間に挿入して、うねの方向の値の勾配
を人工的に確立する。
【００９５】スパイグラス（Ｓｐｙｇｒａｓｓ）はこの
列を取り、そしてそれを３次元表面に転化し、ここで形
成した生成物のためのモノＱの分画の数、切断部位およ
び面積％を３本の軸に存在する。スパイグラスのプログ
ラム内にマニュアル的に設定された次の基準に従い輪郭
を定める：第１の輪郭の線はプロットの連続的領域を接
続し、ここで特定の生成物への１．５％の基質の転化率
が観測された。同様に、５％、１０％、２０％、３０
％、４０％および５０％の基質の転化率の連続する輪郭
の線を、また、表示した。生ずる輪郭のプロットは脳の
ペプチダーゼの地図を表し、ここで分画の数は縦座標に
スパンし、そしてペプチド結合の切断部位は横座標に存
在し、そして形成した生成物の量は輪郭により表され
る。
【００９６】対照およびＡＤの脳の細分画のペプチダー
ゼのプロフィルの結果 図１は、イオン交換クロマトグラフィーによりさらに細
分別した、対照およびＡＤのＰ−２、ＳおよびＭ分画の
両者によるＮ−ダンシルペプチド基質の切断について得
られた、ペプチダーゼのプロフィルの比較を示す。分析
により、対照およびＡＤの脳の細分画を通して、高い数
の潜在的に異なるペプチダーゼ活性を同定することがで
きる。
【００９７】各分析について（図１〜６において）、各
ペプチド結合における切断の活性の数は系列を通して減
少した：Ｖ−Ｋ＞Ｋ−Ｍ＞Ｍ−Ｄ＞Ｓ−Ｅ＞Ｅ−Ｖ、し
かしながら、Ｋ−ＭおよびＭ−Ｄの切断は、Ｃ−１００
の形成に導くＡＰＰの加水分解の部位を表す傾向がより
大きいために、最も重要である。１．６ｍｎに回収され
た代謝物質は、多分、同一の保持時間（ｒｔ）の生成物
を発生する過酸化水素を使用する基質の処理するとき、
基質の中のメチオニンがスルホキシドに酸化するためで
ある。１．０および１．３および３．３分で形成した代
謝物質は現在同定されない。
【００９８】Ｋ−Ｍの切断について、対照およびＡＤに
ついての酵素およびピーク活性の両者のスペクトルによ
りを表す活性の全体のレベルは系列Ｐ−２＞Ｓ＝Ｍを通
して下降した。これはまたＡＤにおけるＭ−Ｄの切断に
ついて真実であるが、これに対して対照の分画について
順序はＳ＞Ｐ−２＝Ｍであった。
【００９９】ＡＤにおいて見いだされる最も豊富なペプ
チダーゼのピーク（１本より多い輪郭線により境界され
ているもののみ）に関すると、次の数の明らかに分割さ
れたペプチダーゼのピークを判別することができた：Ｐ
−２、３つのＫ−Ｍピークおよび１つのＭ−Ｄピーク；
Ｍ、３つのＫ−Ｍピークおよび２つのＭ−Ｄピーク；
Ｓ、Ｋ−Ｍピークなしおよび１つのＭ−Ｄピーク。対応
する対照およびＡＤの細分画の間のより豊富なピークの
レベルの間の定量的比較は、１つのみの顕著な差を明ら
かにした。この差はミクロソームの分画において観察さ
れ、ここにおいて対照のＭのプロフィルは分画７５付近
の単一のＭ−Ｄ生成物を含有したが、ＡＤのプロフィル
において、同一の領域は明らかに二重線を含有した。
【０１００】正常および病気の状態の集団におけるペプ
チダーゼレベルの間の潜在的な変動のために、対照とＡ
Ｄとの間のペプチダーゼレベルの際立った定量的差はほ
とんど重要ではない。
【０１０１】要約すると、小さいペプチドの形態のレベ
ルにおける対照とＡＤの分画の間の定性的または有意に
定量的な差が存在しうるということは無視することがで
きないが、全体のプロフィルは非常に同様に見え、ただ
１つの明らかな定性的な差ははペプチダーゼ活性のより
豊富なピークの間で明らかである。
【０１０２】ｉｉｉ）ペプチダーゼ活性の明確なプール
への合同 Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙ
ｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定
番号：１）基質を使用して得られたペプチダーゼ活性の
プロフィルに基づいて、Ｐ−２、可溶性（Ｓ）およびミ
クロソーム（Ｍ）の分画のイオン交換分割からのカラム
の分画を隣接するプールに合同した（Ｍについて１２の
プール、Ｐ−２について１３プール、およびＳについて
１４プール）。各場合においてＡＤおよび対照の両者の
分画についてのクロマトグラフィーのプロフィルの同一
領域をプールするように注意し（プロテアーゼが対応す
る対照領域において検出可能でない場合でさえ）、そし
てＹＳＩモデル３５の導電性メーターを使用して各プー
ルの導電性をモニターすることによって、この方法の精
度をチェックした。分画をプールを通して４℃に維持
し、次いで−７０℃において貯蔵した。アミコン・セン
トリプレプ（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１
０）膜を使用して、各ペプチダーゼのプールを濃縮し
た。濃縮の前に、各セントリプレプ膜を５０ｍＭのトリ
スＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄した。１５ｍｌのセントリ
プレプを５ｍｌの体積以上を含有するペプチダーゼのプ
ールについて使用した。これらのプールをデュポン社の
ソーバル（Ｓｏｒｖａｌ）テーブルトップの遠心機で２
７００ｒｐｍでほぼ４０分間濃縮した。４ｍｌより小を
含有するプールを、デュポン社のソーバルＲＣ遠心機
（ＳＳ３４ローター）上の２ｍｌのセントリプレプを５
０００ｒｐｍで４０分間濃縮した。
【０１０３】遠心後、各濃縮したプールを等しい体積の
５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄した。濃縮
を通じてプールを４℃に維持し、そして−７０℃におい
て貯蔵した。プールを下表３に導電性および最終濃度の
体積とともに記載する。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】実施例４ 組み換えＡＰＰ６９５の発現 この実施例はホロ−ＡＰＰ６９５を発現する方法を記載
し、次いで実施例８〜１０に記載するＡＰＰ分解のアッ
セイのための組み換え基質として使用した。２つのアプ
ローチを使用した。
【０１０６】最初に、ＣＨＯ細胞の発現系を使用してＡ
ＰＰ６９５を発生した。基質としてＡＰＰのこの源を使
用する実験は初期の活性の測定を含み、この測定はヒト
脳のＰ−２、可溶性およびミクロソームの分画の精製か
らのモノ−Ｑの分画の隣接するプールにおいて検出可能
な６つの異なるプロテアーゼ活性の同定に導いた。これ
らの研究を実施例８に記載する。
【０１０７】引き続いて、バキュロウイルス特異的系を
使用する発現により、組み換えＡＰＰ６９５を得た。こ
れにより発生したＡＰＰ６９５のより大きい量は、実施
例９および１０において概説するより詳細な研究の実施
を可能とし、ある種のＡＰＰ分解酵素の同定に導く。
【０１０８】両者の発現法を下に記載する。
【０１０９】方法１：ホロ−ＡＰＰ６９５を発現するチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系の開発 ａ）ベクターの構成 ＦＣ−４からのＡＰＰ６９５ｃＤＮＡの既知の２．３６
ＫｂのＮｒｕＩ／ＳｐｅＩ断片（Ｋａｎｇら、前掲）を
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩの大き
い断片によりフィルインし、そしてＫＳブルースクリプ
ト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｍ１３＋（Ｓｔｒａｔｇｅ
ｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニ
ア州ラジョラ）のＳｍａＩクローニング部位の中に平滑
末端挿入して、ｐＭＴＩ−５（Ｔ３プロモーター下のＡ
ＰＰ６９５）をつくった。次いで、部位特異的突然変異
（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４：３６７−３８２）をオ
リゴ：５’−ＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＧＴＣＧ
ＡＣＡＣＧＡＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＴＴＴＧ−３’（配
列同定番号：８）とともに使用してＰＭＴＩ−３９をつ
くって、新しい最適なコザク（Ｋｏｚａｋ）コンセンサ
ス配列を生成した。次に、このプラスミドを部位特異的
突然変異（Ｋｕｎｋｅｌら、前掲）により変更して、位
置６１４におけるバリンをグルタミンに変化させた（Ｋ
ａｎｇら、前掲、に従い番号を付したオープンリーディ
ングフレーム）。
【０１１０】次いで、最適なコザクコンセンサス配列お
よびＶａｌ→Ｇｌｕ突然変異を含有する全長のＡＰＰの
ｃＤＮＡを、ＰＭＴＩ−３９から、ＮｏｔＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩの部分的消化により切断した。次いで２．３
６ＫｂのＡＰＰ６９５断片をゲル精製し、そしてＮｏｔ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断したｐｃＤＮＡＩＮｅｏ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州サン
ジエゴ）の中に結合してＰＭＴＩ９０をつくり、ここで
ＡＰＰ６９５の発現はＣＭＶプロモーターのコントロー
ル下に位置する。Ｖａｌ→Ｇｌｕ突然変異の配列を確証
し、そしてこのベクターを使用してＣＨＯ細胞を安定に
形質転換した。
【０１１１】ｂ）ＡＰＰ６９５突然変異を発現する安定
なＣＨＯ細胞系の発生 チャイニーズハムスター卵巣Ｋ−１細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ ６１）を、ＡＰＰ６９５構成体を使用するトラン
スフェクションのために使用した。ＡＰＰ６９５および
ネオマイシン薬物耐性マーカーを含有する発現プラスミ
ドの２０ｇを、バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）遺伝子
装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カ
リフォルニア州リッチモンド）を使用する電気泳動によ
り、０．５ｍｌのＰＢＳ中で１×１０7細胞の中にトラ
ンスフェクションした。２５μｆにおいて１２０Ｖのキ
ャパシタンスの単一パルスを細胞に投与した。
【０１１２】電気泳動後、細胞を氷の中で１０分間イン
キュベーションし、そして遠心により集めた。細胞のペ
レットをアルファＭＥＭ、１０％の胎児仔ウシ血清の中
に５×１０4細胞／ｍｌの密度に再懸濁させ、そして１
ｍｌのアリコートを２４ウェルの組織培養のクラスター
プレートの各ウェルの中に分配した。４８時間後、ネオ
マイシン薬物耐性マーカーを含有する細胞を１ｍｇ／ｍ
ｌのゲネチシン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、ニューヨーク州
グランドアイランド）を含有する１ｍｌの培地の添加に
より選抜し、そしてインキュベーションを続け、そして
薬物を含有する培地を２週毎に交換した。
【０１１３】薬物耐性細胞をウェスタンブロッティング
によりＡＰＰ６９５の発現について試験した。ＡＰＰ６
９５の発現について陽性の細胞を制限希釈培養法により
クローニングし、そして個々のクローンを分離し、そし
てＡＰＰ６９５の発現について試験した。ＡＰＰ６９５
の発現について陽性のクローンを二次培養し、そしてＡ
ＰＰ６９５の発現の大規模生産のためにローラーびんの
中に拡張し、引き続いて組み換えタンパク質を分離し
た。
【０１１４】方法２：バキュロウイルス感染昆虫細胞を
使用する組み換えホロ−ＡＰＰ６９５の発現 ａ）組み換えベクターの構成 バキュロウイルスのベクターｐＶＬ１３９２（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）をＸｂａＩ（リンカーの中）で切断し、
そしてｐＭＴＩ−３９からのゲル分離した２．３６Ｋｂ
のＸｂａＩ断片と結合した（ＡＰＰ６９５のＮｒｕＩ／
ＳｐｅＩをＫＳブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ）Ｍ１３＋ＳｍａＩ部位の中に、Ｔ３のオリエンテー
ション、新しいコザクおよびＳｍａＩ／ＮｒｕＩ平滑融
合部位におけるＸｂａＩ部位を使用する）。このつくら
れたｐＭＴＩ−１０３をＤＨ５αの中に形質転換し、Ａ
ｍｐで選抜し、そしてプラスミドＤＮＡのリチウムプレ
プ（ｐｒｅｐ）をトランスフェクションのためにつくっ
た。
【０１１５】ｂ）細胞およびウイルス スポドプテラ・フルギペイダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｉｄａ）（Ｓｆ９）細胞を、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から
購入し、そして２８℃において１０％の胎児仔ウシ血清
を含有するＴＮＭＦＨ培地（Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｍ．Ｄ．
およびＳｍｉｔｈ、Ｇ．Ｅ．（１９８７）、バキュロウ
イルスおよび昆虫細胞の手順のための方法のマニュアル
（Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉ
ｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）（Ｂｕ
ｌｌｅｔｉｎ ｎｏ．１５５５、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉ
ｃ Ｅｘｐ．Ｓｔｎ．およびＴｅｘａｓ Ａ ＆ Ｍ
Ｕｎｉｖ．、テキサス州ユニバーシティステーション）
の中で成長させた。野生型ＡｃＭＮＰＶのＤＮＡをイン
ビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア
州サンディゴ、から購入した。
【０１１６】ｃ）ＤＮＡのトランスフェクションおよび
プラークのアッセイ リン酸カルシウムの手順を使用してＳｆ９細胞の中に精
製したプラスミドＤＮＡ（４μｇ）および線状ウイルス
ＤＮＡを共トランスフェクションすることによって、相
同性組み換えにより外来ＤＮＡをＡｃＭＮＰＶのゲノム
の中にポリヘドリン遺伝子位置において挿入した（Ｓｕ
ｍｍｅｒｓら（１９８７）前掲）。トランスフェクショ
ンした細胞により解放されたウイルスを２ラウンドのプ
ラークのアッセイにより精製し（Ｓｕｍｍｅｒｓら（１
９８７）前掲）し、ここで組み換えウイルスをポリヘド
リン陰性プラークについての視的スクリーニングにより
同定した。引き続いて精製した組み換えウイルスの培養
物を、感染した細胞の中でＡＰＰを生産するそれらの能
力についてウェスタンブロット分析によりスクリーニン
グした。
【０１１７】ｄ）組み換えタンパク質の生産 １０％の胎児仔ウシ血清を含有するＴＭＮＦＨ培地の中
で１×１０6細胞／ｍｌに懸濁培養として成長させた５
リットルのＳｆ９細胞を、組み換えウイルスで１のＭ．
Ｏ．Ｉ．で感染させた。細胞を感染後２４時間に収獲
し、そして細胞リゼイトを組み換えタンパク質の精製の
ために調製した。
【０１１８】実施例５ 哺乳動物細胞の一時的感染による組み換えＣ−１００標
準の生産についての発現ベクターの開発 Ｃ−１００ペプチド断片は、Ａ４ペプチドのＮ末端から
全長のＡＰＰのＣ末端に及ぶＡＰＰのＣ末端部分を含有
する（上の背景の節を参照）。Ｃ−１００断片は、Ａ４
ペプチドの究極の形成に導く主張される最初の分解生成
物である。
【０１１９】本発明の１つの実施態様において、脳の分
画をインキュベーションし、モノ−Ｑクロマトグラフィ
ーにより細分別された組み換えＡＰＰ試料と平行にイム
ノアッセイにおいて、組み換えＣ−１００を発現するＨ
ｅｌａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ ２．２）からの細
胞リゼイトを分析する（参照、実施例３）。Ｃ−１００
の断片の移動および検出は、病理学的プロテアーゼによ
り形成される生成物の発生のための大きさのマーカーな
らびに一般にＣ末端のＡＰＰ断片の免疫検出のための陽
性の対照の両者として働く。
【０１２０】酵素的に発生した生成物の大きさをＣ−１
００断片の大きさと比較すると、酵素的に発生した断片
がＡ４ペプチドのＮ末端に近いか、あるいはセクレター
ゼによりクロットさせるようにＡ４セグメント内の切断
から生ずるか否かを知ることができる。
【０１２１】ａ）プラスミドの構成 ２つの方法を使用してＣ−１００の発現のためのプラス
ミドをつくった。各プラスミドをＰＭＴＩ７３またはＰ
ＭＴＩ１００として別々に同定すべきである。 ＰＭＴＩ７３の構成 商業的に入手可能なプラスミドＰＵＣ−１９をＥｃｏＲ
Ｉで消化してそのポリリンカーを除去した。次いで商業
的に入手可能なＰＷＥ１６を消化したＰＵＣ−１９の中
に挿入してＰＭＴＩ２３００をつくった。ＰＭＴＩ２３
０１をＰＭＴＩ２３００からオリゴヌクレオチドのアダ
プターを使用するＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化後に
誘導した。ＡＰＰのＥｃｏＲＩ断片をＰＭＴＩ２３０１
のＨｉｎｄＩＩＩ部位の中に平滑末端の結合により挿入
して、ＰＭＴＩ２３０７を生成した。
【０１２２】ＦＣ−４（Ｋａｎｇら、前掲）からのＢａ
ｍＨＩ断片をＰＭＴＩ２３０７のＢａｍＨＩ部位の中に
結合することによって、ＰＭＴＩ２３１１を発生させ
た。ＦＣ−４からのＸｈｏＩ断片をＰＭＴＩ２３１１の
ＸｈｏＩ部位の中に挿入して、ＰＭＴＩ２３１２を発生
させた。マウスメタロチオネイン−Ｉ遺伝子のＥｃｏＲ
Ｉゲノムのクローンからの２．２ｋｂのＢｇｌＩＩ／Ｅ
ｃｏＲＩ断片をＰＭＴＩ２３１２のＣｌａＩ部位の中に
挿入することによって、ＰＭＴＩ２３２３を発生させ
た。ミニ遺伝子ＰＭＴＩ２３３７を発生させるために、
ＰＭＴＩ２３２３のＫｐｎＩとＢｇｌＩＩの間の配列を
欠失し、そしてクローンを合成オリゴヌクレオチドのア
ダプター、ｓｐ−スペーサー−Ａ４を使用して結合し
た。
【０１２３】ＰＭＴＩ２３３７をＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ
で切断し、そして断片をブルースクリプト（ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ）ＫＳ（＋）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ））のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ認識部位の中に
結合してＰＭＴＩ２３７１をつくった。ＰＭＴＩ２３７
１をＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩで切断して、ＡＰＰ６９
５の１００アミノ酸をコードする０．７ｋｂの断片を解
放した。また、シグナルペプチドのための配列がエンコ
ードされた。このインサートをｐｃＤＮＡＩＮＥＯ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）のＨｉｎｄＩＩＩ／
ＮｏｔＩ部位の中に結合して、プラスミドＰＭＴＩ７３
をつくった。
【０１２４】ＰＭＴＩ１００の構成 ＰＭＴＩ９０（参照、実施例１）をＸｂａＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで切断して、ＡＰＰ６９５の末端の１００アミノ
酸を再びコードする０．６ｋｂの断片を解放し、そして
これをｐｃＤＮＡＩＮＥＯのＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
部位に結合した。各場合において、ベクター、インサー
トおよびプラスミドを当業者に知られている方法によっ
て精製した。
【０１２５】ｂ）Ｃ−１００断片のトランスフェクショ
ンおよび発現 使用の２４前に６ウェルのコスタークラスター（直径
３．５ｃｍ）の各ウェルの中に５×１０-5細胞のＨｅ１
ａ Ｓ１細胞を接種することによって、Ｃ−１００の標
準の小規模の発現のための調製を開始した。
【０１２６】十分なワクシニアウイルスｖＴＦ７−３を
トリプシン処理して２０プラーク形成単位／細胞の多重
度に感染させ、等しい体積の粗製のウイルスのストック
および０．２５ｍｇ／ｍｌのトリプシンを混合し、次い
で激しく渦形成した。トリプシン処理したウイルスを３
７℃において３０分間インキュベーションし、１０分の
間隔で渦形成した。塊が残留するとき、インキュベーシ
ョン混合物を０℃に冷却し、そして超音波処理水浴の中
で３０秒間超音波処理した。塊がそれ以上検出されなく
なるまで、冷却した超音波処理を反復した。
【０１２７】次いでトリプシン処理したウイルスを十分
な血清不含ＤＭＥＭで各ウェルについて希釈し、Ｈｅ１
ａ Ｓ１細胞は０．５ｍｌのウイルスを有した。培地を
吸引除去し、１０分の間隔でロッキングしてウイルスを
分配した。
【０１２８】感染を停止するほぼ５分前に、新鮮なトラ
ンスフェクション混合物を次のようにして調製した：各
ウェルに、ポリスチレン管の中の１ｍｌのＯＰＴＩＭＥ
Ｍ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）、
マリイランド州ガイサーバーグ］に０．０１５ｍｌのリ
ポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）試薬［ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）、マリイ
ランド州ガイサーバーグ］を添加し、おだやかに混合し
た。次いで、３μｇのＣｓＣｌ精製したＤＮＡを添加
し、そしておだやかに混合した。
【０１２９】ウイルス混合物を細胞から吸引により除去
し、次いでトランスフェクション溶液を導入した。生ず
る混合物を３７℃において３時間インキュベーションし
た。次いでウェルに１ｍｌのＯＰＴＩＭＵＭをオーバー
レイし、そしてＣＯ2インキュベーターの中で一夜イン
キュベーションした。
【０１３０】細胞を感染後２０時間に遠心により収獲
し、そして０．２ｍｌの溶解緩衝液の添加により氷上で
リゼイトを調製し、前記溶解緩衝液は１％のトリトンＸ
−１００、１０μｇ／ｍｌのＢＰＴＩ、１０μｇ／ｍｌ
のロイペプチン、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ、１ｍＭのＣｕＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１
ｍＭのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ７．５に調節されてい
た。完全な溶解を光学顕微鏡によりモニターし、そして
直ちに収獲した。溶解は完結するまでに１分以内を要
し、この工程における遅延はゼラチン状の塊を生ずる核
の溶解を引き起こす。組み換えリゼイトを−２０℃にお
いて後の使用のために貯蔵した。好ましくは、組み換え
リゼイトは、凍結前に２−メルカプトエタノールを含ま
ない（３×）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の中で、１：
５０に希釈すべきである。
【０１３１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＡＰＰのＣ末端の抗体
を使用するイムノブロットを使用して、ＰＭＴＩ７３ま
たはＰＭＴＩ１００で発現により生産されたタンパク質
の大きさの比較を実施した（図１１）。この研究によ
り、ＰＭＴＩ１００は単一の免疫反応性バンドの発現を
指令したが、ＰＭＴＩ７３は同様な分子大きさの２つの
主要なバンドの発現を指令したことが示された。中間の
大きさの強くないバンドは、また、より高い量でゲルに
適用したとき、ＰＭＴＩ７３について明らかであった
（図７〜１０）。
【０１３２】ＰＭＴＩ１００タンパク質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルにより高い量で適用すると、より淡いバンドを
出現させる（例えば、図１０）。見掛けのＭｒ１１．７
ｋＤａのＣ−１００モノマーの強いバンドの外に、より
淡いバンドはＭｒ２５．５ｋＤａ、３５ｋＤａおよび４
５ｋＤａにおいて観察され、これらはＣ−１００モノマ
ーの、それぞれ、２量体、３量体および４量体の集合体
の形成に帰属される。Ｍｒ１８．９ｋＤａの追加の淡い
バンドがまた観察される。同様な現象は同様な解釈を伴
って文献の中に報告されている（Ｄｙｒｋｓら、１９８
８、ＥＭＢＯＪ．７：９４９）。
【０１３３】ＰＭＴＩ７３により生産された３つのバン
ドの最大のものは、ＰＭＴＩ１００で観察された単一の
バンドよりわずかに大きかった。ＰＭＴＩ７３の発現か
らの最大のバンドのアミノ酸配列の分析により、シグナ
ルペプチド配列は最初の翻訳生成物から切断されて、Ｎ
末端に５つの余分のアミノ酸を含有するＣ−１００断片
を生ずることが示された。
【０１３４】実施例６ 免疫化学的試薬の生成 ３つの異なる免疫化学的試薬を本発明の研究において使
用した： ｉ）ＡＰＰのＣ末端を認識するウサギポリクローナル抗
血清を入手し、そして実施例８に従うタンパク質分解的
方法により発生したＣ末端のＡＰＰ断片のイムノブロッ
ト検出のために使用した； ｉｉ）ＡＰＰのＣ末端を認識する親和精製した抗体を調
製し、そしてバキュロウイルス特異的系において発現し
たＡＰＰの親和精製のための免疫親和カラムの合成に使
用した（参照、実施例７）；および ｉｉｉ）ベータ−アミロイドのペプチドのＮ末端を認識
するマウスモノクローナル抗体を発生させ、そしてイム
ノブロットアッセイにおいて使用して、ホロ−ＡＰＰ６
９５のタンパク質分解的消化により発生したＣ末端のＡ
ＰＰ断片が全長のベータ−アミロイドのペプチドを含有
するかどうかを決定した（参照、実施例９および１０、
特定の適用について）。
【０１３５】３つの免疫化学的物質の各の発生方法を下
に記載する。
【０１３６】ｉ）ＡＰＰのＣ末端ドメインに対するウサ
ギポリクローナル抗血清 抗血清をヒトＡＰＰ６９５のＣ末端ドメインに対して引
き出し、そして次の文献に記載されている方法に従い調
製した：Ｂｕｃｂａｕｍら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６００３−６００６。
ＡＰＰ６９５のＣＯＯＨ−末端領域に相当する合成ペプ
チド（以後「βＡＰＰ６４５−６９４」）をエール大学
（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｎｄＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
Ｆａｃｉｌｉｔｙ、コネチカット州ニューヘブン）。
【０１３７】βＡＰＰ６４５−６９４を使用してウサギ
を免疫化してポリクローナル抗体を引き出した。ヒトＡ
ＰＰ６９５のアミノ酸１９−６９５を含む融合タンパク
質を発現した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のリゼイトのイム
ノブロット分析により、血清をスクリーニングした。組
み換え融合タンパク質に対して免疫反応性である血清を
［35S］メチオニン標識したＡＰＰ６９５に対する免疫
沈澱活性についてさらにスクリーニングし、前記ＡＰＰ
６９５はβＡＰＰ６９５ｃＤＮＡから連続する転写［ス
トラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニ
ア州ラジョラ、から購入したキット］および翻訳［ウイ
スコンシン州マジソン、プロメガ・コーポレーション
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）から購入した網状赤血
球のリゼイト］により調製した。
【０１３８】ｉｉ）ホロ−ＡＰＰの精製についてのポリ
クローナル抗体の親和カラム合成ＡＰＰのＣ末端のペプチドの免疫原の精製 Ｎ末端
におけるシステイン残基をもつＡＰＰ（６４９−６９
５）のＣ末端をスパンする８０〜９０ｍｇの粗製の合成
ペプチド（Ｐ−１４２）をＨＰＬＣにより精製した（収
率４２％；３４ｍｇ）。アミノ酸分析、Ｎ末端の配列の
分析およびフライト・マス・分光光度測定のレーザー脱
着時間は、精製されたペプチドが全長およびＮ末端が切
頭されたペプチドの混合物（２／１全長／切頭）である
ことが示された。
【０１３９】精製されたＰ−１４２免疫原によるウサギ
の免疫化 ＨＰＬＣ精製されたペプチドＡＰＰ（６４９
−６９５）を使用してウサギを免疫化した。２羽のウサ
ギの各々に完全フロインドアジュバント中の１２５μｇ
のペプチドで最初の対抗を与え、次いで３週の間隔で不
完全フロインドアジュバント中の同一量のペプチドの引
き続く促進を与えた。１４の採血を９月の間隔にわたっ
て集め、そしてＡｂの最適な生産を１６−３２週におい
て採血について観測した（ワクシニアＣ１００およびＣ
ＨＯ ＡＰＰを使用するウェスタン分析により示され
た）。この間隔における採血を９０〜１００ｍｌの抗血
清の概算体積についてプールした。
【０１４０】抗血清のための免疫化したＡＰＰ（６４９
−６９５）親和性マトリックスの調製 ９．７ｍｇの精
製されたペプチドＡＰＰ（６４９−６９５）を、ＢＳＡ
を有するピアース・インジェクト活性化免疫原接合キッ
トを使用して、マレイミド活性化ＢＳＡにカップリング
した。約４０％のペプチド（３．８８ｍｇ）を、エルマ
ン試薬により決定して、ＢＳＡにカップリングした。Ｂ
ＳＡカップリングしたペプチドをカップリングしないペ
プチドからゲル濾過により分離した（キットからの精製
緩衝液＝８３ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4 ｐＨ７．２；９００
ｍＭのＮａＣｌ）。ゲル濾過カラムからプールした空隙
体積（２．９ｍｇのＢＳＡに接合したＰ−１４２／１
２．５ｍｌ）を１ｇ（３．５ｍｌ）のＣｎＢｒ活性化セ
ファローズにカップリングさせた（標準のファーマシア
のプロトコルによりカップリングされた＞９０％のペプ
チド接合体）。残りの部位をエタノールアミンでブロッ
クした。セファローズ親和性マトリックスを１．０×
３．５ｃｍのガラスのカラムに詰めた。
【０１４１】ＡＰＰ（６４９−６９５）親和カラムを使
用するウサギポリクローナル抗血清の精製 最適なＡｂ
生産の採血からの一緒にしたウサギ抗血清をプールし
（１００ｍｌ／３．９ｇのタンパク質）そして洗浄緩衝
液で１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、そしてペプチド親和カ
ラム上に４℃において１．０ｍｌ／分で負荷した。負荷
（２００ｍｌ）後、このカラムを洗浄緩衝液（７５ｍ
ｌ）でＡ２８０が０に戻るまで洗浄した。ＩｇＧを１０
０ｍＭのグリシンｐＨ２．５（４０ｍｌ）で溶離した。
１分の分画を１００μｌの１．０ＭのトリスＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０を含有する管の中に集めた。中和した低いｐＨ
のＩｇＧ溶離液をプールし（３５ｍｌ；１４．７ｍｇ）
そして１．０リットルの１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3、ｐ
Ｈ８．５；５００ｍｌのＮａＣｌ、４℃に対して透析し
た。
【０１４２】免疫親和カラムの調製：精製したウサギＩ
ｇＧのセファローズへのカップリング ５．０ｇのＣｎ
Ｂｒセファローズを５０ｍｌのカップリング緩衝液（１
００ｍＭのＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．３；５００ｍＭのＮ
ａＣｌ）で活性化し、そして４℃において２１時間オー
ビトロン上で透析したＩｇＧのプールと混合した。カッ
プリング後、樹脂を１×のカップリング緩衝液で焼結ガ
ラスのフィルターを通してすすぎ、次いで３×１００ｍ
ｌの各ブロッキング緩衝液（１００ｍＭのＮａＨＣ
Ｏ3、ｐＨ８．３；５００ｍＭのＮａＣｌ；１．０Ｍの
エタノールアミン）ですすいだ。カップリング緩衝液
（１００ｍｌ）、次いで低いｐＨの緩衝液（１００ｍＭ
のＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０；５００ｍＭのＮａＣｌ（１
００ｍｌ）を使用する２つの連続する中間のすすぎ工程
および最後のカップリング緩衝液（１００ｍｌ）を使用
するすすぎは樹脂の調製を完結する。カップリングは合
計１７．５ｍｌの樹脂について８７％であった（０．７
２７ｍｇのＩｇＧ／ｍｌの樹脂）。
【０１４３】ｉｉｉ）ベータ−アミロイドのペプチドに
対してモノクローナル抗体の発生およびエピトープのマ
ッピングハイブリドーマの方法 Ｂａｌｂ／Ｃマウスを次の２つ
の合成ペプチドの混合物の多数回の注射により免疫化し
た：１）ベータ−アミロイドを含有するホロ−ＡＰＰ６
９５のＡＰＰアミノ酸５９７−６３８（番号はＫａｎｇ
ら、前掲、に従う）、および２）Ｃ末端のドメインを含
有するＡＰＰ６９５アミノ酸６４５−６９５。免疫化し
た動物からの脾細胞をＸ６３／Ａｇ８．６５３マウス骨
髄腫細胞と標準の手順を使用して融合した［Ｈｅｒｚｅ
ｎｂｅｒｇら、１９７８、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編）、実
験の免疫学的のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｎｏｌｏｇｙ、ｐｐ
２５．１−２５．７、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、英国オックス
フォード）。生ずるハイブリッドからの上澄み液をＥＩ
Ａを使用して抗ペプチド特異的抗体の存在について試験
し、ここでベータ−アミロイドのペプチドの免疫原をマ
イクロタイタープレートに結合した。免疫原としてを使
用した合成ペプチドと反応した抗体を分泌する培養物を
制限希釈培養法により２回クローニングし、そしてそれ
らのアイソタイプを記載されているように決定した（Ｗ
ｕｎｄｅｒｌｉｃｈら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４７：１）。使用済
み培養流体のプロテインＡ親和クロマトグラフィーによ
りクローニングしたハイブリドーマの細胞の血清不含発
酵ブロスから、分泌されたＩｇＧを精製した。
【０１４４】エピトープのマッピング 抗ペプチドモノ
クローナル抗体の１つ、Ｃ２８６．８Ａと表示するＩｇ
Ｇ２ｂは、ＥＩＡならびにイムノブロットアッセイの両
者により、合成ベータ−アミロイドのペプチドとのすぐ
れた反応性を与えた。モノクローナルのエピトープ反応
性は競合ＥＩＡを使用して決定した。ヒトＡＰＰ６９５
のアミノ酸５９７−６１２、５９７−６２４、５９７−
６３８、６２１−６３１および６４５−６９５を含有す
る合成ペプチド（番号はＫａｎｇら、前掲、に従う）な
らびにＮ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配
列同定番号：１）を、ＡＰＰ５９７−６３８へのＣ２８
６．８Ａの結合をブロックする能力について試験した。
【０１４５】抗体により認識されるペプチドは、溶液の
中で抗体と前インキュベーションする場合、マイクロタ
イタープレートに結合したベータ−アミロイドのペプチ
ドとの引き続く反応のために利用可能な溶液濃度を消耗
するであろう。このような実験の結果を図１４に示しそ
して下に記載する。
【０１４６】ペプチドのＡＰＰ５９７−６１２、５９７
−６２４、５９７−６３８、およびＮ−ダンシル−Ｉｌ
ｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番号：１）のみは、
投与量依存性方式でＣ２８６．８Ａの結合を阻害するこ
とができた。これらのペプチドは、それぞれ、ベータ−
アミロイド配列のアミノ酸１−１６、１−２８、１−４
２および１−７を含有する（Ｎ末端のアスパラギン酸塩
残基からの番号）。ベータ−アミロイド配列、例えば、
このようなＡＰＰ６４５−６９５を欠くか、あるいはベ
ータ−アミロイドのペプチドの配列１２−２８または２
５−３５（それぞれ、ＡＰＰ６０８−６２４およびＡＰ
Ｐ６２１−６３１）を含有するペプチドは、相同性抗原
に対するモノクローナル抗体の結合を阻害しない。これ
らの結果が示すように、このモノクローナル抗体のため
の反応性エピトープは、少なくとも一部分、ヒトＡＰＰ
のＡ４領域の最初の７アミノ酸、すなわち、ＡＰＰ５９
７−６０１の中に存在する。
【０１４７】実施例７ 組み換えホロ−ＡＰＰ６９５の精製 ＡＰＰのＣ末端のプロセシングの最初の研究は、上の実
施例４に記載するようにＣＨＯ細胞の中で発現された組
み換えＡＰＰ６９５を使用して実施し、そして下の方法
１に記載するように精製した。この基質を使用する特性
決定の実験は下の実施例８に記載し、そしてＣ末端のプ
ロセシングを実施できる６つの潜在的に異なるＡＰＰ分
解性酵素の同定に導いた。
【０１４８】引き続いて、バキュロウイルスの発現系を
開発し（参照、実施例４）、ＣＨＯの発現系で達成でき
るより高いＡＰＰのレベルを得た。バキュロウイルスの
系からのホロ−ＡＰＰ６９５の精製は下の方法２に記載
する。精製したバキュロウイルス誘導ホロ−ＡＰＰ６９
５を使用して、下の実施例９および１０に記載するプロ
テアーゼ特性決定実験を実施した。
【０１４９】すべての工程は、特記しない限り、０〜４
℃において実施した。ホロ−ＡＰＰ６９５は、下の実施
例８に本質的に記載するように抗ヒトＡＰＰ６９５Ｃ末
端の抗体を使用するイムノブロット分析により検出し
た。
【０１５０】方法１ 安定にトランスフェクションされ
たＣＨＯ細胞系からのホロ−ＡＰＰ６９５の精製 ａ）プラスミド膜の分離 ローラーびんの中でＣＨＯ細胞の連続的培養からの全細
胞ペレット（１７９ｇ）（参照、実施例４）を遠心（１
５００ｇ×５分）により集め、そして塩化ナトリウム
（３０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ
（１０ｍＭ）、ＰＭＳＦ（２００μｇ／ｍｌ）、Ｅ−６
４（４２μｇ／ｍｌ）およびペプスタチン（３．８μｇ
／ｍｌ）を含有する５０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ
８．０の中で６００ｍｌの合計の体積に再懸濁させた。
細胞をテフロンポッター（１０回の戻りストローク）を
使用して均質化し、次いで４１％のスクロースを含有
し、そしてプロテアーゼインヒビターＥＤＴＡ、ＰＭＳ
Ｆ、Ｅ−６４およびペプスタチンを欠く均質化緩衝液の
１０ｍｌ上に層状に配置した（２５ｍｌ／遠心管）。遠
心（２６，８００ＲＰＭ×６０分、ベックマンＳＷ−２
８ローター）後、界面の層を注意して除去し（一緒にし
た体積中のほぼ１５０ｍｌ）、等しい体積の均質化緩衝
液（プロテアーゼインヒビター不含）で希釈し、テフロ
ンッポッター（３回の戻りストローク）で再懸濁させ、
そして前述したように再遠心して密に充填されたペレッ
トを生成した。上澄み液をデカンテーションし、そして
ペレットを５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０で１０
０ｍｌの合計の体積に再懸濁させた（テフロンッポッタ
ーで３回のストローク）。再遠心（５０，０００ＲＰＭ
×６０分、ベックマン７０Ｔｉローター）はペレットを
生成し、このペレットを５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ
８．０の中に５７ｍｌの合計の体積に再懸濁させた。 ｂ）プラスミド膜の可溶化 引き続いて３７ｍｌの上の再懸濁したＣＨＯプラスミド
膜の調製物をプロテアーゼインヒビターおよびストック
の２０％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００のカクテルに
添加して、次の成分濃度を達成した：前述の均質化緩衝
液（４５ｍｌの合計の可溶化体積）中のＥＤＴＡ（１ｍ
Ｍ）、Ｅ−６４（２４μｇ／ｍｌ）、ＰＭＳＦ（５３μ
ｇ／ｍｌ）、ペプスタチンＡ（１１μｇ／ｍｌ）、およ
びトリトンＸ−１００（２．２％ｖ／ｖ、最終）。この
混合物を４℃において３０分間おだやかにロッキングし
た後、非可溶化物質を遠心（５０，０００ＲＰＭ×４０
分、ベックマン７０Ｔｉローター）により除去した。可
溶化したホロ−ＡＰＰを含有する上澄み液を０．４５ｍ
Ｍのディスクフィルターを通してフィルターした。
【０１５１】ｃ）強いアニオン交換クロマトグラフィー
による可溶化ホロ−ＡＰＰ６９５の精製 ホロ−ＡＰＰ６９５を含有する上の上澄み液を等しい体
積の蒸留水で希釈し、そして０．１％のトリトンＸ−１
００を含有する２０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．
０と前以て平衡化したモノ−Ｑ ＲＨ１０／１０カラム
に適用した。いったん負荷された細胞を２１０ｍｌの合
計の体積の平衡化緩衝液中の０〜１ＭのＮａＣｌの直線
の勾配で溶離した。流速を全体を通して３ｍｌ／分に維
持した。１７〜２２ｍｍＨｏ（４℃）の導電性の範囲で
溶離するタンパク質は免疫反応性ＡＰＰ６９５の大部分
を含有し、そして一緒にし、そして０．０２５％のトリ
トンＸ−１００ｃｔ５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０の
２リットルに対して４時間透析し、そして遠心（２６，
８００×６０分、ベックマンＳＷ２８ローター）により
清浄にしてわずかの濁りを除去した。
【０１５２】ｄ）ヘパリンアガロースクロマトグラフィ
ー 清浄にした試料を透析緩衝液で前以て平衡化したヘパリ
ンアガロース（１５×１．６ｃｍ）のカラムに適用し
た。負荷すると、薄褐色のバンドがカラムの上部の１／
３内で形成した。いったん負荷すると、５分の分画を集
めた（１ｍｌ／分の流速を全体を通して使用した）。次
いでカラムを８５ｍｌの平衡化緩衝液で段階的に溶離
し、ここで塩化ナトリウムを次の最終濃度に連続して調
節した：０、３００、６００および２０００ｍＭ。免疫
検出可能なホロ−ＡＰＰの大部分は６００ｍＭのＮａＣ
ｌにおいて溶離し、次の定量的分画は３００ｍＭにおい
て回収された。次の研究において使用したＡＰＰは３０
０ｍＭの分画からであった。３００ｍＭのヘパリンアガ
ロース溶離液からの部分的に精製されたＡＰＰの収量は
５．５μｇ（ブラッドフォードアッセイ）／ｇの湿潤Ｃ
ＨＯ細胞のペレットであった。調製物の中のＡＰＰはＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて約２５％の純度であると
判定された。
【０１５３】方法２ 組み換えバキュロウイルス感染し
た昆虫細胞からのホロ−ＡＰＰ６９５の精製 ａ）細胞ペレットの可溶化 ２つの５リットルの発酵の実験から収獲した細胞ペレッ
トを一緒にし（合計８．９ｇの検出可能タンパク質）、
次のインヒビターを含有する１６０ｍｌの０．３２Ｍの
スクロースに添加した：ペプスタチンＡ（２５μｇ／ｍ
ｌ）；ロイペプチン（２５μｇ／ｍｌ）；キモトリプシ
ン（２５μｇ／ｍｌ）；アンチパイン（２５μｇ／ｍ
ｌ）、ベンズアミジン（４ｍｇ／ｍｌ）、ＰＭＳＦ
（０．８７ｍｇ／ｍｌ）およびＥＤＴＡ（２５ｍＭ）、
そしてテフロンポッター（１０回の戻りストローク）に
より均質化した。ホモジネートを遠心し（１０５，００
０×１時間、ベックマン７０Ｔｉローター）次いでペレ
ットを０．５ＭのＮａＣｌおよび上に列挙したのと同一
のインヒビターおよび濃度を含有する１６０ｍｌの１０
ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５の中でテフロンポ
ッター（１０回の戻りストローク）により再懸濁させ
た。簡単な超音波処理（ブランソン・ソニファー・セ
ル、２分のパワーレベル４）後、トリトンＸ−１００を
次いで５％（ｖ／ｖ）の最終濃度に添加し、そして懸濁
液を４℃において２０分間おだやかに撹拌した。この混
合物を遠心し（５０，０００ＲＰＭ×６０分、ベックマ
ンＴｉ７０ローター）、そして最初の上澄み液（５７４
ｍｇのタンパク質）をヘパリン−アガロースクロマトグ
ラフィーのために注意して除去した。ペレットを０．５
ＭのＮａＣｌおよび上に列挙したインヒビターの各々を
前述の濃度で含有する１６０ｍｌの１０ｍＭトリスＨＣ
ｌ緩衝液ｐＨ７．５の中でテフロンポッター（２０回の
戻りストローク）により再懸濁させた。５％（ｖ／ｖ）
のトリトンＸ−１００を使用する可溶化および引き続く
遠心を前述したように実施して、第２の可溶化した上澄
み液が得られた（６８３ｍｇのタンパク質）。
【０１５４】ｂ）ヘパリン−アガロース上のラジアルフ
ロークロマトグラフィー 上で得られる上澄み液の両者を次のようにしてヘパリン
−アガロースで別々に精製した。精製したおよび１Ｍの
トリスｐＨ９．５を３．５リットルの体積、１．８ｍｍ
ｈｏのコンダクタンスおよびｐＨ８．０に添加すること
によって上澄み液を希釈し、そして２５０ｍｌの詰めた
樹脂を含有しそして０．１％のトリトンＸ−１００を含
有する５ｍｌのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０と前以て
平衡化したスーパーフロー２５０カラム（セプラゲン）
に適用した。いったん負荷すると、カラムを３リットル
の平衡化した緩衝液で洗浄し、次いで６００ｍＭのＮａ
Ｃｌを含有する平衡化緩衝液で洗浄した。３０ｍｌ／分
の流速を全体を通して使用した。分画（４５ｍｌ）をＡ
２８０ｎｍ、合計のタンパク質（ブラッドフォード・ア
ッセイ）についてモニターし、そして免疫反応性ＡＰＰ
のレベルを実施例６ｉ）の抗ＡＰＰＣ末端の抗血清に対
するイムノブロットにより検出した。有意のＡＰＰを含
有する分画を一緒にし、そして抗体親和クロマトグラフ
ィーにかけた。 ｃ）抗体親和クロマトグラフィー ヘパリン−アガロース上の第１（２７６ｍｇのタンパク
質を含有する）および第２上澄み液（１１３ｍｇのタン
パク質を含有する）の精製からの６００ｍＭの溶離プー
ルを一緒にし、ｐＨ８．３に調節し、そして実施例６ｉ
ｉ）に記載するようにセファローズにカップリングした
親和精製したＣ末端の抗体からなる抗体親和クロマトグ
ラフィー（１０．５×１．５ｃｍ）に適用し、そして５
００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００を
含有する１００ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．
３と前以て平衡化した。クロマトグラフィーを全体を通
して１ｍｌ／分の流速で実施した。いったん負荷する
と、カラムを７０ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄し、次いで
０．１％のトリトンＸ−１００を含有する５０ｍｌの１
００ｍＭのグリシンｐＨ２．４で溶離した。分画（５ｍ
ｌ）を０．５ｍｌの各１ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０
の中に集め、そして上のようにしてＡ２８０ｎｍ、合計
のタンパク質（ブラッドフォード・アッセイ）および免
疫検出可能なＡＰＰについてモニターした。有意のＡＰ
Ｐを含有する分画を一緒にした。一緒にしたヘパリン−
アガロースの溶離液を親和精製手順を通して合計の５回
循環させた。各連続する精製から回収されたＡＰＰのプ
ールを合計９ｍｇのＡＰＰについて一緒にした。
【０１５５】ｄ）強いアニオン交換クロマトグラフィー 抗体親和クロマトグラフィーからの一緒にした分画
（９．０ｍｇのタンパク質）を、０．０２５％（ｖ／
ｖ）のトリトンＸ−１００および１５０ｍＭのＮａＣｌ
を含有する２０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０と
前以て平衡化したモノ−Ｑ ＨＲ５／５カラムに適用し
た。いったん負荷すると、カラムを合計７０ｍｌで直線
の０．１５〜１ＭのＮａＣｌの勾配で溶離した。有意な
免疫検出可能なＡＰＰを含有する溶離した分画を一緒に
し、そして使用するまで−８０℃において貯蔵した。Ａ
ＰＰの最終の調製物はクーマッシー・ブリリアント・ブ
ルーの染色で現像したＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて＞９
５％の純度であった、理論的組成と８６％一致するアミ
ノ酸組成を示し、そして次の成熟タンパク質のためのＮ
末端の配列を示した：Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−。５．６ｍｇの精製したタンパク質が２つの５リット
ルの発酵の実験からのペレットから得られた。
【０１５６】アミノ酸分析をどこかで本質的に記載され
ているように実施した（ＤｕＰｏｎｔ、Ｄ．Ｒ．、Ｋｅ
ｉｍ、Ｐ．Ｓ．、Ｃｈｕｉ、Ａ．Ｈ．、Ｂｅｌｌｏ、
Ｒ．、Ｂｏｚｚｉｎｉ、Ｍ．およびＷｉｌｓｏｎ、Ｋ．
Ｊ．、「アミノ酸分析に対する包括的アプローチ」、Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、Ｔｏｎｙ Ｅ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、２８４−２９４（１９８９））。試料をアル
ゴン雰囲気下に蒸気相の中で６Ｎ塩酸ｗｏ２．０％のフ
ェノールとともに使用して１６０℃で２時間加水分解し
た。オンラインの１３０Ａ型セパレーション・システム
およびネルソン・アナリティカル２６００型クロマトグ
ラフィーのソフトウェアを有するアプライド・バイオシ
ステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４
２０Ａ型で、フェニルチオカルバモイル−アミノ酸分析
を実施した。
【０１５７】実施例８ ヒト脳プロテアーゼの細分画に
より触媒されるＡＰＰ６９５の分解の検出のためのイム
ノブロットアッセイ ａ）基質ＡＰＰとのインキュベーション ｉ）イオン交換の分画（実施例１に記載するように工程
から得られた）または分画の濃縮されたプール（実施例
３）の５ｍｌのアリコートを、組み換えヒトＡＰＰ６９
５（１０．７５μｌ）と３７℃において２４時間インキ
ュベーションし、これを要求される量の２Ｍのストック
緩衝液の添加によりＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５の中で１４
０ｍＭの最終濃度に調節した。インキュベーションにお
ける最終の緩衝液濃度は９５ｍＭ、ｐＨ６．５であっ
た。
【０１５８】ｉｉ）タンパク質分解反応を７．５ｍｌの
次の３×ラエムリ（Ｌａｅｍｌｉｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料緩衝液の添加により停止させた：３６％（ｖ／ｖ）
のグリセロールおよび１２％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ、１０
％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール、および微量
のブロモフェノールブルーのトラッキング色素を含有す
る、１．５ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．４５。試料を加
熱し（１００℃×８分）、次いで冷却した。
【０１５９】ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 反応混合物（１５μｌ）を２０％までのアクリルアミド
の勾配トリシンゲルのウェルに適用した（日常的に１．
０ｍｍの厚さ、１５ウェルのノベックス（Ｎｏｖｅｘ）
プレキャストゲル、ノベックス・イクスペリメンタル・
テクノロジー、カリフォルニア州サンディアゴ）。ゲル
を一定の電圧の条件下に展開しそして試料がゲルに入る
まで５０Ｖにし、次いで電圧を１００Ｖに上げた。トラ
ッキング色素がゲルの下部の０．５ｃｍ以内に到達そた
とき、電気泳動を停止した。ゲルを３〜１９５ｋＤａの
Ｍｒ範囲の前以て染色したＭｒマーカー（ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ、マリイランド州ガイスバー
グ）を使用して目盛り定めした。高い分子量および低い
分子量のマーカーを含有するキットの各々の１０μｌを
１０μｌの３×試料緩衝液と混合し、そして節（ａ）
（ｉｉ）に記載するように処理した。次の分子量マーカ
ーのタンパク質が前以て染色したマーカーとしてキット
内に存在した：ミオシンＨ−鎖（１９５ｋＤａ）；ホス
ホリラーゼＢ（１０６ｋＤａ）；ウシ血清アルブミン
（７１ｋＤａ）；オボアルブミン（４５．３ｋＤａ）；
カーボネートデヒドラターゼ（２６．１ｋＤａ）；ベー
タラクトグロブリン（１８．１ｋＤａ）；リゾチーム
（１４．４ｋＤａ）；ウシトリプシンインヒビター
（５．８ｋＤａ）；およびインスリンＡおよびＢ鎖（３
ｋＤａ）。
【０１６０】ｃ）イムノブロッティング ｉ）次いでゲルをミニトランス−ブロット電気泳動セル
に移した（バオラド・ラブス、カリフォルニア州リッチ
モンド）。タンパク質をタンパク質をプロブロット（Ｐ
ｒｏＢｌｏｔｔ）（ＴＭ）膜（アプライド・バイオシス
テムス、カリフォルニア州フォスターシティイ）上に、
次の４℃に維持した転移緩衝液を使用して、１００Ｖ
（一定）で１時間移した：１５０ｍＭのグリシンおよび
２０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含有するを含有する２
０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５。
【０１６１】ｉｉ）プロブロット膜を取り出し、そして
次の組成の１５ｍｌのブロッキング緩衝液の中に室温に
おいて１時間配置した：１５０ｍＭのＮａＣｌを含有す
る１０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０中の５％
（ｗ／ｖ）の脂肪不含の乾燥ミルク。
【０１６２】ｄ）ＡＰＰおよびＣ末端の分解生成物の免
疫検出 合成ヒトＡＰＰ６９５Ｃ末端ペプチドの免疫原に対して
引き出されたウサギポリクローナル抗血清の１：１００
０希釈物を含有する１５ｍｌのブロッキング緩衝液に膜
を移し、そして４℃において一夜インキュベーションし
た。
【０１６３】膜を３×連続する１５ｍｌの体積のブロッ
キング緩衝液で、おだやかに震盪しながら５分間すすい
だ。次いで膜をアスパラギン酸のプロテアーゼ−カップ
ルドヤギ抗ウサギＩｇＧ（フィッシャー・サイエンティ
フィク、ペンシルベニア州ピッツバーグ）の１：１００
０希釈物を含有する１．５ｍｌのブロッキング緩衝液に
移し、そして室温において９０分間インキュベーション
した。次いで３×連続する１５ｍｌの体積のブロッキン
グ緩衝液で、おだやかに震盪しながら１０分間すすい
だ。
【０１６４】次に膜連続するを３×１５ｍｌの体積の各
々次の成分からなるアスパラギン酸のプロテアーゼの緩
衝液で洗浄した：１００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭの
ＭｇＣｌ2を含有する、１００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐ
Ｈ９．５。次にゲルを暗所で次の成分を含有する１５ｍ
ｌの１００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ９．５とインキュ
ベーションした：１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ2および５０μｌのＢＣＩＰ基質（５０ｍｇ／ｍ
ｌ、プロメガ、ウイスコンシン州マジソン）および９９
μｌのＮＢＴ基質（５０ｍｇ／ｍｌ、プロメガ）。低い
Ｍｒの免疫反応性バンドの明らかなそれ以上の同定が存
在しなくなるまで（典型的には室温において３時間）イ
ンキュベーションを続けた。次いでゲルを蒸留水ですす
ぎ、そして乾燥した。
【０１６５】ＡＰＰ６９５を酵素的に分解してＣ末端の
断片の分画を発生する細分別したヒトＡＤ皮質のモノ−
Ｑのプールの能力の分析 実施例３に記載するＰ−２、ＳおよびＭのプールの各を
前述したようにイムノブロットアッセイした。免疫学的
検出方法の特異性と真性のＡＰＰ基質の分子の使用との
組み合わせは、比較的粗製の生物学的抽出物の中のＡＰ
Ｐ分解性酵素の活性を検出する選択的方法を提供し、高
度に精製した酵素調製物の使用の必要性を回避する。こ
うして、部分的に精製したプールのあるものは、時間依
存性の方法で、Ｃ末端のＡＰＰ断片を形成することがで
きたタンパク質分解活性を有する。ヒトＡＤ脳のイムノ
ブロット分析の代表的な例は、Ｐ−２ Ｖ（パネル
ａ）、Ｍ ＩＩＩ（パネルｂ）およびＳ Ｉ（パネル
ｃ）について、ならびにＰ−２ＶＩＩプール（プール
ｄ）をプールする前の個々の分画について、図７〜１２
に示されている。
【０１６６】例えば、プールＭ ＩＩＩについて図１２
に記載されているような、時間経過の実験は、これらの
断片が時間０における基質または酵素の分画の中に存在
しないことを示した。さらに、基質単独のインキュベー
ションはそれらの形成を生じなかった（例えば、図７、
レーン２、図１０、レーン２、図１２、レーン８を参照
のこと）。バンドの大きさの範囲はＭｒほぼ１１．５ｋ
Ｄａと２５ｋＤａとの間で、酵素分画に依存して変化し
たが、反応において形成した異なる生成物の数は驚くほ
ど低かった。ｐＨ６．５において、合計３９のＡＤプー
ルのうちの８つはこのような活性を有することが発見さ
れた。プールはｉ）脳の細分画、ｉｉ）カラムの溶離の
イオン強度、およびｉｉｉ）定量的ＡＰＰ切断のパター
ンに基づいて互いに区別することができた。
【０１６７】６つの選択したプール（「Ｍ−ＩＩＩ、Ｍ
−ＶＩＩＩ、Ｓ−Ｉ、Ｓ−ＩＩＩ、Ｐ−２ Ｖ、および
Ｐ−２ ＶＩＩＩ）は有意なＡＰＰ分解活性を含有する
ことが発見された。対応する対照の脳のプールは、ま
た、上の活性のいくつかを含有したが、対照のプールと
ＡＤとの間で、活性のレベルが異なるか否かを決定する
ことができなかった。上の６つのプールの各々は、１
１．５ｋＤａのＡＰＰのＣ−末端の断片を形成できる酵
素活性を有した。
【０１６８】ＭＲ１１．５ｋＤａのタンパク質分解生成
物とくに重要であった。なぜなら、それ以上の研究にお
いて、それは通常主要な免疫検出可能なＣ末端生成物で
あり、そしてベータ−アミロイドのペプチドのＮ末端の
アスパラギン酸塩で開始しそして全長の分子のＣ末端へ
延びる（Ｃ−１００断片）オープンリーディングフレー
ムからなる組み換えＣ末端の断片と共に移動することが
発見されたからである。この共移動は図１０に例示され
ている。これが暗示するように、１１．５ｋＤａのバン
ドはＡ４領域のＮ末端またはその付近におけるＡＰＰの
エンドタンパク質分解的生成物であり、そしてこの形成
を形成できる上のプロテアーゼ活性は、アミロイド発生
ペプチドの発生において、ｉｎ ｖｉｖｏである役割を
演ずるすることができる。
【０１６９】図１０が示すように、少なくともＰ−２プ
ールＶＩＩの場合において、ＡＰＰのタンパク質分解の
１１．５ｋＤａのＣ末端の酵素生成物は凝集することが
できる。ＰＭＴＩ１００推進Ｃ−１００標準、および１
８ｋＤａの断片と共移動するＭｒ１１．５ｋＤａにおけ
るペプチドのバンドに加えて、Ｍｒ２４．３、２７．４
および３５．５ｋＤａにおいて他のバンドが現れる。２
４．３および３５．５ｋＤａのバンドはＣ−１００断片
の、それぞれ、２量体および３量体について期待される
Ｍｒであり、そして凝集のためにＣ−１００における対
応する淡いバンドとおおよそ共に移動する（詳細につい
て実施例５を参照のこと）。
【０１７０】図７〜９は、また、このアッセイを古典的
プロテアーゼインヒビターの効果を検査するために使用
できることを示す。例えば、図７から明らかなように、
Ｐ−２ Ｖはメタノールにより部分的にそしてメタノー
ル性ペプスタチンＡにより完全に阻害されるが、Ｍ−Ｉ
ＩＩ（図８）およびＳ−Ｉ（図９）の両者はアプロチニ
ンおよびシステインにより完全に阻害される。こうし
て、１つの実施態様において、このアッセイはＡＰＰ分
解性酵素の新規なｉｎ ｖｉｔｒｏのインヒビターにつ
いてサーチするために適用される。これにより同定され
る効力のある化合物を、ＡＰＰまたはベータ−アミロイ
ドを含有するその断片を過剰に発現するように設計され
た、適当な動物のモデル、例えば、トランスジェニック
動物を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏの効能について試験す
る。
【０１７１】ペプチド生成物の大きさ、生成物の形成に
ついての明らかなｐＨ依存性，および商業的に入手可能
なプロテアーゼインヒビターの効果を包含する、モノＱ
の分画から回収されたＡＰＰ分解活性の６つの主なプー
ルの性質のいくつかを、下表４に要約する。
【０１７２】
【表４】
【０１７３】活性のいくつかはアルカリ性の範囲におけ
る最適なｐＨを有し、そしてリソソームのカテプシンの
作用のためであるように思われなかった。この観察は意
味がある。なぜなら、幾人かの研究者が報告したよう
に、病理学的ＡＰＰのプロセシングはエンドソーム−リ
ソソームの経路内のプロテアーゼにより実施されるから
である（Ｃａｔａｌｄｏら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３８６１；Ｂ
ｅｎｚｏｗｉｔｚら、１９８９、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １０６：２３７；Ｃｏｌｅ
ら、１９８９、Ｎｕｅｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ １４：９
３３）。この経路内の酵素は酸性ｐＨの最適値を示すこ
とが期待されるであろう。
【０１７４】入手可能なデータに基づいて、Ｍ−ＩＩＩ
およびＳ−Ｉはすべての列挙した基準により高度に類似
し、そして多分ＳおよびＭの分画の各々の同一酵素の交
差汚染を表す。したがって、ヒト脳は１１．５ｋＤａの
Ｃ−１００様生成物の断片を生ずることができる最小５
つの異なる活性を含有する。
【０１７５】表４が示すように、活性のいくつかは試験
したインヒビターの任意のものによる阻害に対して不感
受性であり、そしてこれらの酵素は異常な群の構成員を
表すことがある。Ｍ−ＩＩＩおよびＳ Ｉにおける１
１．５ｋＤａのＣ−１００断片の形成に関係する活性
は、セリンまたはシステイン型であるか、あるいは異常
な群の構成員を表す。あるいは、これらの分画はセリン
およびシステインの両者のプロテアーゼを含有すること
ができ、両者の酵素はＣ−１００の生成において義務的
な（順次の）役割を演ずる。Ｐ２Ｖはアスパラギンのプ
ロテアーゼ活性およびセリンプロテアーゼのプロテアー
ゼ活性の両者を含有する。Ｐ２ＶＩＩはＰＭＳＦに対す
るその感受性に基づくセリンプロテアーゼ活性を含有す
る。しかしながら、引き続く研究において、ペプスタチ
ン−インヒビターの活性はまた認められ、アスパラギン
酸のプロテアーゼのＰ２における共局在化ならびに表４
におけるセリンプロテアーゼの活性を示す。Ｓ ＩＩＩ
またはＭ ＶＩＩＩにおける酵素活性は試験したインヒ
ビターのいずれに対しても感受性ではなかった。いずれ
の場合においても、酵素のプールを実施例３において使
用したＮ−ダンシルペプチドの基質と共インキュベーシ
ョンすることによって、ＡＰＰの分解の阻害を実証する
ことができなかった。
【０１７６】ＡＰＰ分解活性（実施例８）をモノ−Ｑプ
ールのペプチダーゼ活性（実施例３および図１）の回収
を比較すると、２つの活性の間に相関関係がほとんど存
在しないこと明瞭に示される。こうして、ＡＰＰ分解活
性の大部分はペプチダーゼ活性を比較的ほとんど示さな
いプールの中に含有される。これが示唆するように、Ａ
ＰＰ分解活性は劣ったペプチダーゼであり、そして完全
なフォルディングされたＡＰＰ基質を活性のために必要
とすることがあるか、あるいは選択したペプチドは病理
学的ＡＰＰのプロセシングのために誤った部位を表す
（がその傾向は少ない）。それにかかわらず、この発見
は他の研究者がペプチドの基質に基づくアッセイを使用
して普通のＡＰＰ分解性酵素の同定に成功しなかった理
由説明する。
【０１７７】上の考察から結論されるように、本発明の
アッセイはヒト脳から特定のＡＰＰ分解性酵素の分離を
可能とするために十分な特異性を有する。
【０１７８】他の研究において、われわれはイムノブロ
ットアッセイを使用してＰ−２ＶＩＩ関連ＡＰＰアーゼ
の回収をトラッキングした。研究はこのプールに集中さ
れた。なぜなら、それは最も豊富な６つの特性決定され
た活性を表し、そしてアミロイドであると思われるＣ末
端の断片を発生したからである（図１０）。
【０１７９】ＡＰＰアーゼを表示するＰ−２ＶＩＩ分画
をプールし、そして２つの直列のスパロース１２カラム
（ファーマシア）上の大きさ排除クロマトグラフィーに
かけた。溶離された分画の中のペプチダーゼおよびＡＰ
Ｐアーゼの活性を分析した（図１３）。Ｋ−Ｍ切断活性
は一部分オーバーラップするように思われたが、Ｍ−Ｄ
活性のピークはまた再びＡＰＰアーゼのピークと一致し
なかった。既知の分子量マーカーに対するクロマトグラ
フィーの目盛り定めは、Ｐ−２ＶＩＩ分画のＡＰＰアー
ゼ活性について−または＋６．５ｋＤａの不明瞭さを有
する、３１．６ｋＤａのメジアン見掛けのＭｒを生じた
（図１３）。
【０１８０】実施例９ ＡＰＰのＣ末端のプロセシング酵素としてのカテプシン
Ｄの同定 実施例４、方法２に記載するバキュロウイルスの発現
系、および実施例７、方法２の精製のスキームを使用す
ることによって、より大きい量のホロ−ＡＰＰ６９５が
得られたので、ペプチダーゼ活性に基づいてつくった分
画のプール中のＡＰＰ分解性酵素の含量を評価するより
むしろ、ヒト脳の酵素の精製からの個々のカラムの分画
の中のＡＰＰ分解性酵素の回収をトラッキングすること
ができるようになった（実施例８において実施したよう
に）。
【０１８１】ＡＰＰ分解性酵素活性の含量は、実施例１
の方法に従い可溶化されたＰ−２の分画の精製からの個
々のモノＱの分画について、図１〜６に示されている。
モノ−Ｑのクロマトグラフィーにかけた可溶性およびミ
クロソームの分画の同様な分析と比較したとき、ＡＰＰ
断片はモノ−ＱからのＰ−２の細分画において絶えず最
大であった。Ｐ−２中のＡＰＰ分解活性は、２つの明確
なピークとしてモノ−Ｑから回収された（ＡおよびＢ、
図１５）。
【０１８２】ピークＡは、われわれの初期の研究におい
て見られた、負荷および低いイオン強度の洗浄におい
て、すなわちＰ−２Ｖの回収におおよそ相当する領域に
おいて溶離された（表４）が、ピークＢはＰ−２ＶＩＩ
活性が前に観測されたプールした領域とオーバーラップ
し（表４）、そしてセリンおよびアスパラギン酸の両者
のプロテアーゼからなることが示された。同様な大きさ
の分解生成物はＭｒほぼ２８、１８および１４および＜
１１ｋＤａにおける両者のピークＡおよびＢで観察され
たが、１８ｋＤａの相対的染色強度はピークＡにおける
よりピークＢにおいて非常に大きかった。ピークＢをプ
ールし、そして実施例１、方法１に記載するようにスパ
ロース６ＨＲ上で精製した。溶離した分画は、それらの
溶離のプロフィルがオーバーラップする２つの定量的に
明確な型の活性を含有した。もとのピークＢの分画を使
用して観察された、最も密接に類似するＡＰＰの破壊の
パターンを生成した活性（図１５）が、１５〜２５ｋＤ
ａの見掛けのＭｒと一致する、ゲル濾過からの分画５１
〜５６の中に回収された（図１６ｂおよびｃ）。この溶
離のピークは１８ｋＤａの破壊生成物を主として形成し
た活性の溶離より後であり、そして多分より大きい見掛
けのＭｒにより触媒される。この後者の活性は、実施例
８、表４のＰ−２ＶＩＩにおいて前述したセリンプロテ
アーゼ活性に多分相当する。ピークＢ（および１５〜２
５ｋＤａのＭｒ領域内）のゲル濾過精製からの活性な分
画を、古典的なプロテアーゼインヒビターによる阻害に
ついて試験した（図１７）。これらの研究が確証するよ
うに、ピークＢの活性はペプスタチンＡによる定量的阻
害により決定して、アスパラギン酸のプロテアーゼによ
り大きく触媒される。
【０１８３】比較的わずかのヒトアスパラギン酸のプロ
テアーゼが知られている。同定されたものは、カテプシ
ンＤおよびＥ、レニンおよびペプシンを包含する。われ
われが観測した活性がこれらの酵素のいくつかに相当す
る可能性を試験するために、、ヒトレニンの商業的調製
物（カルバイオケム、カリフォルニア州サンジエゴ、カ
タログＮｏ．５５３８６４）、およびヒトカテプシンＤ
（ヒト肝臓、カルバイオケム、カリフォルニア州サンジ
エゴ、カタログＮｏ．２１９５４０１）をバキュロ誘導
ホロ−ＡＰＰを酵素的に分解するそれらの能力について
検査した。
【０１８４】ここに記載する研究を通して使用したカテ
プシンＤの商業的調製物は銀染色で現像したＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上で電気泳動的に均質であり、そして既知のタン
パク質配列に基づく理論的値と９３％の合致を示した。
【０１８５】レニンは不活性であった（示されていな
い）が、カテプシンＤはＡＰＰを選択的に切断して、モ
ノ−Ｑからの前述のＰ−２のピークＢで観察されたもの
（図１５）に対して、Ｃ末端の分解生成物の同様なパタ
ーンを生成した。こうして、商業的カテプシンＤの調製
物は時間依存性の方式でホロ−ＡＰＰを分解して、１８
および２８ｋＤａの概算Ｍｒの主要なＣ末端の生成物を
生成した。ペプスタチンＡにより活性の阻害は、この反
応においてカテプシンＤの関与を確証した（図１８）。
【０１８６】ヒトカテプシンＤに対する商業的ポリクロ
ーナル抗体が得られ（ダコ・コーポレーション、カリフ
ォルニア州カピンテリア、カタログＮｏ．Ａ５６１）、
そしてイムノブロット上でヒトカテプシンＤに対して反
応性であり、Ｍｒ２８ｋＤａの免疫反応性バンドを発生
することが発見された。抗体をイムノブロットアッセイ
において使用して、Ｐ−２、可溶性またはミクロソーム
の分画のモノ−Ｑ精製からのクロマトグラフィーの分画
が免疫反応性カテプシンＤを含有するかどうかを検査し
た。
【０１８７】有意な量のカテプシンＤは、Ｐ−２および
ＡＰＰ分解活性を有する分画（データは示されていな
い）のモノＱの分画の中に観測された。興味あることに
は、カテプシンＤ反応性の２つのクロマトグラフィー的
に明確なピークはＰ−２のモノＱの分画の分析において
観測され、それらの各々はピークＡおよびＢと一致した
（示されていない）。ピークＡ活性に関連する免疫反応
性アスパラギン酸のプロテアーゼ、カテプシンＤは、実
施例８のＰ２Ｖを前に同定された領域と一致した。これ
が示唆するように、ピークＡおよびＢはカテプシンＤの
多数の形態のためであることがある。カテプシンＤの多
数の形態はどこかに記載されてきており、そして単一の
遺伝子生成物の翻訳後の修飾の差に起因した。Ｐ−２の
ピークＢのそれ以上の精製からのゲル濾過、カラムの分
画のイムノブロット分析（図１５）は、ＡＰＰ分解活性
のピークと正確に共に発生するカテプシンＤの免疫反応
性のピークの存在を示した（図１６Ｂ）。
【０１８８】カテプシンＤ免疫反応性と共に移動するこ
とおよびカテプシンＤと同様にＡＰＰを分解することに
加えて、ゲル濾過によりさらに精製したピークＢのプロ
テアーゼは、Ｃ末端のＡＰＰの分解生成物の形成につい
て、カテプシンＤと同一の最適なｐＨ（ｐＨ４〜５）お
よびイオン強度の依存性を示した（図１９）。最後に、
Ｐ−２の分画において観察された免疫反応性バンドは、
バイオラドのミニフォル（Ｍｉｎｉｐｈｏｒ）クロマト
グラフィー系の調製用ＩＥＦにかけたとき、カテプシン
Ｄについて報告されたものに対して同様なＰＩ（４〜
６）を示した（示されていない）。総合すると、これら
のデータが強く支持するように、ヒト脳のＰ−２のモノ
−Ｑの分別後に観察されるペプスタチン感受性ＡＰＰプ
ロテアーゼ活性はカテプシンＤの作用のためである。
【０１８９】次いで、基質として合成ペプチドＮ−ダン
シル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅ
ｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2
（配列同定番号：７）を使用して、ピークＢのプロテア
ーゼ（ゲル濾過で精製された）およびカテプシンＤのペ
プチダーゼ活性を比較した。両者の酵素は非常に低い割
合にもかかわらず時間依存性の方式でペプチドを加水分
解した。両者の酵素について、主要な切断は−Ｇｌｕ−
Ｖａｌ−結合において観察され、そして少ない程度に−
Ｍｅｔ−Ａｓｐ−結合において観察された（図２０）。
図２０において、Ｍｅｔ−Ａｓｐ切断生成物の大部分
は、描写する２４時間の時点までに、Ｇｌｕ−Ｖａｌ生
成物にさらに転化された、ことに注意すべきである。期
待するように、カテプシンＤおよびＰ−２酵素調製物に
より触媒されるペプチダーゼ反応の両者はペプスタチン
Ａにより阻害された。
【０１９０】両者の酵素は、−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−結合に
おける加水分解についてｐＨ４の酸性の最適値を示した
（図２１）。−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−結合における加水分解
は、また、カテプシンＤで酸性の最適値（＜ｐＨ３．
０）を示したが、Ｐ−２酵素では、２つの最適値が観測
され（ｐＨ３．０およびｐＨ７．０）、これは多分中性
のｐＨ最適値との反応における追加の汚染性Ｐ−２プロ
テアーゼの参加のためである（図２１）。しかしなが
ら、酸性のｐＨ値において、ＡｓｐおよびＧｌｕの側鎖
のプロトン化された（中性の）形態は十分に疎水性であ
って、プロテアーゼの下位部位の結合の要件を満足する
ことができる。Ａｓｐ側鎖のｐＫａはＧｌｕ残基よりも
酸性であり、そして図２１において検査したｐＨ範囲を
通じてＧｌｕ残基より少ない程度にプロトン化されるで
あろう。これはカテプシンＤによる−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−
結合の切断速度は低いことを説明ことができ、そしてこ
のヒントは、−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−結合と比較したとき、
この部位における切断のためのｐＨの最適値は低い（ｐ
Ｈ＜３）ことを説明することができる。
【０１９１】それ以上の実験により、カテプシンＤによ
り切断されたＡＰＰ中のペプチド結合の同一性を探索し
た。より大きい量のＡＰＰをｐＨ５．０においてカテプ
シンＤで加水分解した。非変性条件下の制限されたタン
パク質分解を使用した。インキュベーション混合物をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、イムノブロットし、次い
で個々のバンドをクーマッシー染色によるか、あるいは
実施例６（ｉｉｉ）に記載する抗ベータ−アミロイドモ
ノクローナルを使用する免疫検出により局在した。クー
マッシーブルーで局在した主なバンドをＮ末端配列決定
した。
【０１９２】図２２は、このような反応混合物のクーマ
ッシー染色したブロットならびにイムノブロット（抗ベ
ータ−アミロイドモノクローナル抗体を使用する）の両
者を示す。対照として、インキュベーションをまたカテ
プシンＤの不存在下に（ここでカテプシンＤはＳＤＳ−
ＰＡＧＥの試料緩衝液のＡＤ後にインキュベーション混
合物に添加し戻した）あるいはＡＰＰ６９５基質の不存
在下に実施した。８つの主要な生成物のバンドが完全な
インキュベーション混合物のクーマッシー染色（図２２
ａ）により観察され、そしてこれらはまた対照のいずれ
においても存在しなかった。それらのバンドのすべてで
ないが、いくつかはまたＡ４モノクローナルと反応し
（図２２ｃ）、この抗体はベータ−アミロイドのペプチ
ドの最初の５残基内のエピトープを認識する。クーマッ
シー染色した生成物のＮ末端の分析は下表に列挙する配
列を生じた。
【０１９３】
【表５】
【０１９４】期待するように、他の基質のカテプシンＤ
の加水分解について報告されたものと大きく一致する切
断に相当する、いくつかの生成物が観察された（Ｍｏｒ
ｉｙａｍａら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８
８：６１９）。報告されたカテプシンＤ特異性に対する
例外は、バンド３の主要な生成物、およびバンド５の少
ない生成物を形成する−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−の切断、なら
びにバンド１および２の−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−の切断生成
物を包含した（表５）。
【０１９５】ＡＰＰ５９３−５９４における−Ｇｌｕ−
Ｖａｌ−結合の切断は、ペプスタチン阻害可能な反応に
おけるペプチドの基質（前述したように）における対応
する結合を切断するカテプシンＤの観察された能力と一
致する。カテプシンＤは通常ある種の疎水性残基の対の
間を加水分解する。Ｇｌｕ−Ｖａｌ結合における切断
は、予期されないが、グルタメート残基の塩化ナトリウ
ムのプロトン化（ｐＫａ＝４．２５）のために酸性（ｐ
Ｈ５）条件下に多分起こり、それを中性とする。事実、
−Ｇｌｕ−残基の１８％はｐＨ５．０においてプロトン
化されるであろうことを結論することができる。このよ
うな酸性条件は溶菌および分泌顆粒において起こるか、
あるいは組織の損傷、または低酸素または局所的虚血後
に誘発されることがある。
【０１９６】最も有意には、カテプシンＤは、普通の形
態のベータ−アミロイドの主張されたＮ末端の−Ａｓｐ
−残基に対してＮ末端の３アミノ酸残基を−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ−結合において不規則に加水分解することによっ
て、５．６ｋＤａの生成物（バンド３、表５）を発生し
た。この断片はカテプシンＤを含まないインキュベーシ
ョンから取ったブロットの同等の区画に存在しなかっ
た。さらに、この断片は全長のベータ−アミロイドのペ
プチドを含有するために正しい大きさ（５．６ｋＤａ）
をもち、そしてその発生はカテプシンＤがまたベータ−
アミロイドのペプチドのＣ末端領域に近い第２部位でＡ
ＰＰを切断しなくてはならないことを示唆する。
【０１９７】事実、このようなＣ末端の切断のための前
駆体の基質は、また、Ｍｒ（１０．０ｋＤａ）を示すバ
ンド５において同定された。この断片の大きさが示唆す
るように、それはＣ末端ドメインのすべてでないにして
も大部分を含有し、そしてそれはＡＰＰ５９３−５９４
における単一の−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−の切断により発生す
る。
【０１９８】ＡＰＰ６９５は、カテプシンＤによりまだ
切断されないが、カテプシンＤの切断のための理想的な
基質であったと思われる、多数の他のペプチド結合を含
有する。それらが加水分解されなかったという事実は、
フォルディングされたＡＰＰ構造体内のカテプシンＤへ
のアクセスから離れたこれらの部位の高度のキレート化
を反映する：疎水性対の大部分は疎水性ＡＰＰタンパク
質コアに位置することが期待されるであろう。同一の考
察は、カテプシンＤにより加水分解することが示された
部位（表５）が常に最適なカテプシンＤの認識モチーフ
を含有するとは限らなかった理由を説明する。タンパク
質表面上に位置するためには、カテプシンＤが触媒する
切断のために理想的であるより大きい程度の極性または
電荷を含有するしなくてはならないであろう。これに関
して、５つの内部の切断部位のうちの３つは各々が切断
する結合の８つの残基内にある２つのプロリン残基を含
有したことは注目に値する。このような残基はしばしば
二次構造の中のブレーキに関連するか、あるいはしばし
ばタンパク質表面に見いだされる回転に関連する。平行
のイムノブロット（図２２ｃ）において、いくつかの生
成物のペプチド（矢印で示す）はベータ−アミロイドの
Ｎ末端の残基に対するモノクローナル抗体Ｃ２８６．８
Ａと反応した。これらは図２２ａにおけるバンド３と同
一の位置において移動したＭｒ５．６におけるバンド
（表５）、図２２ａ（表５）におけるバンド５と共移動
するＭｒ９〜１０ｋＤａの二重線、およびＭｒ１４ｋＤ
ａにおける二重線、バンド６、図２２ａ、と共移動する
１６〜１８ｋＤａにおける二重線、およびＭｒ４０ｋＤ
ａにおけるバンドを含んだ。配列決定したバンド（表
５）のうちで、図２２ｃにおけるイムノブロットにより
検出されたバンドとバンド３、５および６のみは共移動
した。これと一致して、表５においてこれらの同一の３
つのバンドはベータ−アミロイドのエピトープを含有す
るために適当なＮ末端の配列および大きさを有した。
【０１９９】図２２に記載するベータ−アミロイドの免
疫反応性分解生成物の形成の時間経過を、カテプシンＤ
およびＡＰＰのわずかに異なるモル比で、ペプスタチン
Ａの不存在または存在下に、実施した。インヒビターの
不存在下に、低分子量の断片の時間依存性蓄積を観察
し、最初に、それぞれ、ほぼ１６〜１８および２８ｋＤ
ａのＭｒにおけるバンドを形成して出発した。１６〜１
８および４０ｋＤａのバンドを２時間を越えてさらに強
化し、２８ｋＤａのバンドの強度はこの時点を越えて一
定に維持した。１６〜１８および４０ｋＤａの強度は８
時間を越えて増加しなかった。８時間と２１時間との間
において、ほぼ１４、１０および５．６ｋＤａのＭｒに
おける検出可能なバンドの強度は実質的に増加した。こ
れらの後者の３つのバンドは１６〜１８または４０ｋＤ
ａのいずれとも平行に増強しなかったので、１４、１０
および５．６ｋＤａのバンドは１６〜１８または４０ｋ
Ｄａのいずかまたはすべての二次的分解から誘導された
可能性が存在する。図２３に記載する１６〜１８、１０
および５．６ｋＤａは表５の中に列挙しそして図２２ｃ
に示す同一のＭｒバンドに相当する。図２３において観
察されるバンドのすべてはペプスタチンＡにより阻害さ
れ、それらはカテプシンＤの作用により発生したことが
確証された。
【０２００】アルツハイマー病のアミロイドシスにおけ
る主要なプロテアーゼとしてのカテプシンＤの関係は、
ここで、この疾患に関してなした他の観察を説明する。
第１に、ＡＰＰがリソソームの中に蓄積し、そしてそこ
でプロセシングされてアミロイドを有する断片を生ずる
という成長する証拠が存在する（Ｈａａｓら、１９９
２、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：５００）。アミロイドの堆
積はリソソームの酸性ｐＨにおいて好適である（Ｂｕｒ
ｄｉｃｋら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
７：５４６）。第２に、カテプシンＤはリソソームのプ
ロテアーゼであるが、組織化学によりアルツハイマー病
の脳中のアミロイドの堆積に関連する有意なレベルで存
在することがまた示された（Ｃａｔａｌｄｏら、１９９
０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８７：３８６１）。
【０２０１】第３に、培養において細胞により解放され
たベータ−アミロイドは残基Ｖａｌ５９４において出発
する小さいＮ末端の配列からなり（Ｈａａｓら、１９９
２、Ｎａｔｕｒｅ ３５９：３２２）この配列はベータ
−アミロイド１−４２において普通に見られるＡｓｐ５
９７残基で開始するより豊富な配列に対してＮ末端の３
アミノ酸である。小さい配列は多分位置５９３−５９
４、すなわち、現在カテプシンＤによる特異的タンパク
質分解を行うことが示されたのと同一の部位の−Ｇｌｕ
−Ｖａｌ−結合におけるエンドタンパク質分解により発
生する。ここにおいて、カテプシンＤは−Ｇｌｕ−Ｖａ
ｌ−および−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−の両者の結合を加水分解
することができるので、Ｈａａｓらにより配列決定され
たベータ−アミロイドの断片の両者を形成するために必
要な特異性を有することが強調される。
【０２０２】第４に、システインプロテアーゼのインヒ
ビターＥ−６４およびロイペプチンはＬＣ−９９細胞に
よるベータ−アミロイドの解放に効果をもたないが、一
般のリソソームのインヒビターは解放をブロックし（Ｓ
ｈｏｊｉら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１２
６）、これらの細胞によるベータ−アミロイドの形成は
システインプロテアーゼ以外のリソソームの酵素により
触媒された。このような反応のための残りの候補のプロ
テアーゼは、それらの研究において使用されたシステイ
ンプロテアーゼのインヒビターにより阻害されないリソ
ソームのカテプシンＤであろう。
【０２０３】最後に、ＡＰＰはベータ−アミロイドのＣ
末端と膜のアンカー配列との間の疎水性残基のストレッ
チを含有する。この領域におけるペプチド結合のいくつ
かはカテプシンＤにより加水分解することができるであ
ろう。事実、位置６４５−６４６におけるＬｅｕ−Ｖａ
ｌ−ペプチド結合は、ＰＥＰＴＩＤＥＳＯＲＴコンピュ
ータープログラムにより、可能なカテプシンＤの認識部
位であるとして強調される。家族性アルツハイマー病の
ある種の形態と共分離することが示された３つの点突然
変異の位置に、この部位は近接する。この部位における
ＦＡＤ突然変異はこの領域内のカテプシンＤによるＡＰ
Ｐの切断を増大することができる。
【０２０４】最後に、位置５９５〜５９６における−Ｌ
ｙｓ−Ｍｅｔ−から−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−へのＡＰＰの二
重の突然変異は、また、家族性ＡＤと共分離する。この
突然変異はこのような酵素による酵素により切断を増大
するよりむしろ妨害することが期待されるので、この突
然変異は特定のアミロイド発生のプロテアーゼを−Ｌｙ
ｓ−Ｍｅｔ−結合付近で切断させる特異性をもって存在
させることはないであろう。むしろ、ベータ−アミロイ
ドを生ずる主なエンドタンパク質分解がこのジペプチド
に隣接してかつ好ましくはそれ対してＮ末端で起こる可
能性は増加する。−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−結合はＳ１および
Ｓ１’位置において影響を受けないままである最も近い
Ｎ末端の部位を表す。
【０２０５】考えられるように、−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−の
切断の結合に対するＳ２’およびＳ３’部位における−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−突然変異はカテプシンＤによる切断を
増強することができるであろう。これがそうであるかど
うかを試験するために、われわれは基質のＮ−ダンシル
−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2（配
列同定番号：７）およびＫ−Ｍ対がＮＬで置換し、これ
により前述のＦＡＤ突然変異をまねる同様なペプチドを
加水分解するカテプシンＤおよびＰ−２酵素のピークＢ
の両者の能力を比較した（図２４）。両者の酵素は野生
型ペプチドをより長い時間のフレームでＭ−ＤおよびＥ
Ｖ結合において切断したが、図２４に示す短いインキュ
ベーション時間において非常にわずかの切断が観察され
た。対照的に、両者の酵素による突然変異のペプチドの
切断は野生型ペプチドで観測されるより３０〜５０倍の
開始速度で起こった。これにより発生した単一の代謝物
質は４．４分の保持時間を示し、そして従来野生型ペプ
チドを使用して見られなかった。したがって、このまた
同定されない生成物はＮ−Ｌ対またはＬ残基に対してＣ
末端の間の加水分解から生じなくてはならない。いずれ
の場合においても、この結果は次の見解と一致する。す
なわち、この特定の早期に開始されたＦＡＤにおいて観
察された−ＮＬ−突然変異は、アミロイド発生のプロテ
アーゼのカテプシンＤによりいっそう急速に切断される
部位を提供することによって、ベータ−アミロイドの形
成速度を増大させる。生じうるベータ−アミロイドの蓄
積速度の増加は、このＡＰＰの突然変異の関係するアル
ツハイマー病の早期に開始された形態をトリガーするこ
とができる。
【０２０６】アルツハイマー病の主なアミロイド発生の
プロテアーゼのために重大な候補としてのカテプシンＤ
の同定は、この病気のための治療的インヒビターの開発
の努力を有意に促進する。例えば、特定のカテプシンＤ
のインヒビターはベータ−アミロイドの毒性の蓄積を阻
害することによって治療的利益を提供することができ
る。ここにおいて提供される新しい情報は、他のアスパ
ラギン酸のプロテアーゼ、例えば、レニンおよびＨＩＶ
−プロテアーゼの新規なインヒビターの設計のために達
成されたように、緊密に結合するインヒビターを合理的
に設計するための比較的直接の方法をつくる。
【０２０７】あるいは、カテプシンＤは、今回、化学的
ライブラリーのランダムまたは準ランダムのサーチによ
り、治療的インヒビターを同定するｉｎ ｖｉｔｒｏの
プロテアーゼのアッセイを使用する高い処理物質のスク
リーンにおける使用に適合させることができる。このよ
うな目的に適当なアッセイは、本発明の実施例２および
３に記載するＮ−ダンシル−ペプチドのアッセイを包含
する。
【０２０８】実施例１０ Ｃ末端のＡＰＰのプロセシングに対する特異性を使用す
るセリンプロテアーゼの同定 表４が示すように、ヒト脳は組み換えＡＰＰのＣ末端の
プロセシングを可能とするセリンプロテアーゼを含有
し、そしてある場合において、これらのセリンプロテア
ーゼはアプロチニンで阻害することができた。このよう
なプロテアーゼのより滑らかな分離を試みるために、早
期の工程としてアプロチニン−セファローズの親和精製
を組み込んだ別の分離のスキームを案出した（実施例
１、方法２）。
【０２０９】Ｐ−２分画のそれ以上の精製のためのこの
手順の応用は、ＡＰＰ分解活性の分離において有望であ
った（図２５）。酸性溶離によるアプロチニン−セファ
ローズのカラムから回収された活性分画をモノ−Ｑカラ
ムでさらに精製した（図２６）。ＡＰＰのＣ末端に対し
てポリクローナル抗体を使用するイムノブロットにより
分析したとき、活性分画（図２６ａ）は１１ｋＤａ、１
４ｋＤａおよび１８ｋＤａのＡＰＰのＣ−末端の断片を
形成する能力を示した。最小の生成物は組み換えＣ−１
００の標準と共移動した。抗ベータ−アミロイドのモノ
クローナル抗体Ｃ２８６．８Ａを使用する活性分画の中
のＡＰＰの分解の再アッセイは、同一の３つの生成物の
バンドの検出に導いた（図２６ｂ）。抗体Ｃ２８６．８
Ａは、実施例６（ｉｉｉ）におけるように、ベータ−ア
ミロイドのペプチドの最初の７アミノ酸残基を認識する
ので、この実験はすべての３つの生成物が全長のベータ
−アミロイドを含有したことを示す。
【０２１０】これらの生成物のペプチドの１または２以
上はアミロイド性であるか、あるいはベータ−アミロイ
ド領域に対してＣ末端のこれらのペプチドのそれ以上の
プロセシングによりベータ−アミロイドを生ずることが
できた。したがって、これらの生成物の形成に関係する
セリンプロテアーゼ活性はアミロイドシスにおいてある
役割を演ずることができた。
【０２１１】前述の１１、１４および１８ｋＤａの生成
物のバンドを形成した酵素活性は、モノ−Ｑからの広い
ピークとして溶離し、そして多分１より多いプロテアー
ゼの作用から生ずることができた。モノ−Ｑカラムから
のＡ２８０ｎｍ吸収性成分の回収に基づいて、タンパク
質分解活性の３つの異なるプールはプールＸ、Ｙおよび
Ｚと命名するモノ−Ｑカラムの分画から調製した（方法
２、実施例１）。
【０２１２】酵素活性はスーパーデックス７５上の各プ
ールのクロマトグラフィーの間に空隙体積で回収され
（データは示されていない）、見掛けのＭｒ＞７５ｋＤ
ａと一致するが、クロマトグラフィーの間の起こりうる
タンパク質の凝集は除外することができなかった。プー
ルＹはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析したとき、最も純粋な
プールを表し、そしてほぼ１００ｋＤａのＭｒにおいて
主要な染色されたバンドを示した。プールＹをそれ以上
の特性決定のために選択した。プールＹによるＡＰＰの
加水分解についてのｐＨ依存性はｐＨ７と９との間の最
適性を示し（図２７ａ）、そして酵素活性は４２ｍＭを
越える塩化ナトリウム濃度の増加により徐々に阻害され
た（図２７）。酵素のインヒビター感受性の研究（図２
８ａ）により、それはセリンプロテアーゼであり、ＰＭ
ＳＦおよびアプロチニンにより阻害されるが、ペプスタ
チンＡ、Ｅ−６４およびＥＤＴＡにより影響を受けない
ことが確証された（図２８ａ）。セリンプロテアーゼの
インヒビターのベンズアミジンは酵素に影響を与えず、
それはトリプシン様エンドプロテアーゼである可能性が
ないことが示唆された。この酵素はキモトリプシンの族
である可能性が強く、Ｓ１下位部位に疎水性残基を含有
する基質の切断に対する特異性をもつ。
【０２１３】したがって、他のインヒビターの研究（図
２８ｂ）により、プールＹのプロテアーゼの活性はキモ
トリプシンのインヒビターＩＩ、アルファ−２−抗プラ
スミンおよびＴＰＣＫにより強く阻害されることが示さ
れた。弱い阻害は、また、キモスタチンおよびアルファ
−１−抗キモトリプシンで観察されたが、ＴＬＣＫはま
ったく阻害しなかった。カテプシンＧは他の研究者によ
りＡＰＰのプロセシングにおいてある役割を演ずること
が示唆されたが、カテプシンＧに対するポリクローナル
抗体を使用するプールＹのプロテアーゼ分画のイムノブ
ロット分析はこのセリンプロテアーゼの存在を検出する
ことができなかった。１１、１４および１８ｋＤａのＮ
末端の配列決定は切断部位を同定し、そして既に実施さ
れている。
【０２１４】実施例１１ 治療的カテプシンＤのインヒビターの設計 この実施例はＳｃｈｅｃｈｔｅｒら、１９６７、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７：
１５７の命名法を使用してペプチドの特異性を記載し、
ここにおいて切断のバンドをフランキングする基質の中
のアミノ酸を酵素により切断されているペプチド結合に
関するそれらの位置に従い番号を付す。切断の結合に対
してＮ末端のペプチド基質のアミノ酸側鎖は、切断の結
合から増加する距離でＰ１→Ｐｎとして連続的に番号を
付す。切断の結合に対してＣ末端のペプチド基質のアミ
ノ酸側鎖はＰ１’→Ｐｎ’として連続的に番号を付す。
Ｐ１およびＰ１’アミノ酸側鎖は、切断すべきペプチド
結合の形成に関係するアミノ酸に相当する。側鎖Ｐ１→
ＰｎおよびＰ１’→Ｐｎ’は、それぞれ、酵素の下位部
位Ｓ１→ＳｎおよびＳ１’→Ｓｎ’の対応する系列との
特異的相互作用を形成すると考えられる。Ｐ側鎖と対応
するＳ下位部位との間の相互作用は、プロテアーゼ−基
質複合体の安定化のための結合エネルギーに寄与し、こ
うして相互作用に対する特異性を付与する。
【０２１５】ペプチド模倣のインヒビターの開発のため
に採ったアプローチは、実施例２および３のＮ−ダンシ
ルペプチドの基質のアッセイ、あるいは実施例８に記載
するホロ−ＡＰＰの分解のアッセイを、精製したカテプ
シンＤと組み合わせて、利用して酵素学的測定を実施す
ることができる。
【０２１６】ｉｎ ｖｉｔｒｏのカテプシンＤによるタ
ンパク質分解的切断のために最適なペプチドの長さおよ
び配列の定量 配列Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ2（配列同定番号：７）のドデカペプチドの
ペプチドを使用して出発して、酵素の加水分解について
の見掛けの反応速度論的パラメーターへのＮ末端または
Ｃ末端からペプチドの短縮の効果を酸性のｐＨおよび最
適なイオン強度で決定する。最適な長さのペプチド中の
各位置におけるアミノ酸の変動の加水分解のＫｍおよび
Ｖｍａｘへの効果を決定する。
【０２１７】インヒビターの合成 最適な切断のために必要な必須アミノ酸配列（上の１
ａ、ｂから）、および適当なスペーサーを含有するペプ
チド模倣の化合物を合成する。これらのペプチドの中の
アミノ酸配列はＡＰＰ基質中の切断部位付近において観
察されるものと同一、例えば、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ（配列同定
番号：４）およびＴｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列同定番号：５）で
あるか、あるいはカテプシンＤのｉｎ ｖｉｔｒｏの阻
害についての効能の研究に基づいてカテプシンＤに対す
る最適な結合を与えることが発見された配列から選択す
ることができる。Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ（配列同定番号：４）お
よびＴｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列同定番号：５）の場合におい
て、Ｐ１−Ｐ１’結合は、それぞれ、Ｅ−ＶおよびＦ−
Ｇである。
【０２１８】上の配列を含有するか、あるいは最適なカ
テプシンＤの阻害を示す配列（Ｎ−および／またはＣ−
置換を多分含有するより短い変異型を包含する）を含有
するプロテアーゼインヒビターを合成し、ここにおいて
Ｐ１とＰ１’との間のペプチド結合の−ＣＯ−ＮＨ−原
子は次のスペーサー基のいずれかで置換されておりそし
て適当な合成ルートを使用して、任意の可能な立体化学
的立体配置を得る：還元されたアミド、ヒドロキシアイ
ソスター、ケトンアイソスター、ジヒドロキシアイソス
ター、スタチン類似体、ホスホネートまたはホスホアミ
ド、逆転された（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）アミド。このイン
ヒビターの大部分はトランジション状態の類似体として
機能するであろう。
【０２１９】本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（ホロ
−ＡＰＰ分解アッセイのＮ−ダンシル−ペプチドのアッ
セイ）のいずれかを使用して決定したこれらの第１の発
生化合物の効能は次の任意のものまたはすべてにより最
適化することができる： ｉ）フランキングアミノ酸残基の付加または欠失； ｉｉ）インヒビター中の各位置におけるアミノ酸の側鎖
の型の変更； ｉｉｉ）ブロッキング基、例えば、ｂｏｃまたはアセチ
ル（Ｎ末端）、またはＯ−Ｍｅ、Ｏ−ベンジル、Ｎ−ベ
ンジル（Ｃ末端）とのＮ末端およびＣ末端の置換。 上
の方法に従い合理的に開発されたインヒビターの外に、
他の既知のカテプシンＤのインヒビターの全体または一
部分をアルツハイマー病のための治療的インヒビターと
して、あるいは阻害効能の最適化およびアルツハイマー
病の治療のための新しい誘導体の開発の出発点として使
用することができる。このようなインヒビター次のもの
を包含する：１−デオキシノジリミシン（Ｌｅｍａｎｓ
ｋｙら、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：
１０１２９）；ジアゾアセチル−ノルロイシンメチルエ
ステル（Ｋｅｉｌｏｖａら、１９７０、Ｆｅｂｓ Ｌｅ
ｔｔ、９：３４８）；Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列同定
番号：６）（Ｇｕｂｅｎｓｅｃｋら、１９７６、Ｆｅｂ
ｓ Ｌｅｔｔ、７１：４２）；回虫属（Ａｓｃａｒｉ
ｓ）からのペプシンインヒビター（Ｋｅｉｌｏｖａら、
１９７２、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ．２８４：４６１）；ペプスタチン（Ｙａｍａｍｏｔ
ｏら、１９７８、Ｅｕｒｏｐｅａａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ９８：４９９２）。
【０２２０】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
【０２２１】１、アルツハイマー病のベータ−アミロイ
ドタンパク質に対する前駆体に対して特異的な少なくと
も１種のプロテアーゼのインヒビターでベータ−アミロ
イドのタンパク質の形成を調節する方法。
【０２２２】２、前記インヒビターをアスパラギン酸プ
ロテアーゼおよびセリンプロテアーゼに対して特異的な
ものから成るインヒビターの群から選択する上記第１項
記載の方法。
【０２２３】３、アスパラギン酸プロテアーゼの前記イ
ンヒビターがカテプシンＤを特異的に阻害する上記第２
項記載の方法。
【０２２４】４、セリンプロテアーゼの前記インヒビタ
ーが、アルファ−２−抗プラスミン、キミトリプシンイ
ンヒビターＩＩまたはＴＰＣＫにより阻害され、そして
ｐＨ７〜９において１１、１４および１８ｋＤａのＡＰ
ＰのＣ末端の断片を形成するセリンプロテアーゼを特異
的に阻害する、上記第２項記載の方法。
【０２２５】５、前記インヒビターが１−デオキシノジ
リミシン、ジアゾアセチル−ノルロイシンメチルエステ
ル、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列同定番号：６）、回虫属（Ａｓ
ｃａｒｉｓ）のペプシンインヒビターおよびペプスタチ
ンから成る群より選択される上記第３項記載の方法。 ６、治療量のインヒビターをカテプシンＤに投与するこ
とからなる、アルツハイマー病におけるアミロイドのプ
ラークの形成を防止する方法。
【０２２６】７、前記インヒビターが還元されたアミ
ド、ヒドロキシアイソスター、ケトンアイソスター、ジ
ヒドロキシアイソスター、スタチン類似体、ホスホネー
ト、ホスホアミド、および逆転（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）ア
ミドから成る群より選択される反応性スペーサーを含有
するトランジション状態の類似体である上記第６項記載
の方法。
【０２２７】８、ａ）カテプシンＤをカテプシンＤによ
り切断可能なペプチドの基質と、カテプシンＤが触媒的
に活性である条件下に、インキュベーションして第１イ
ンキュベーション物を形成し、 ｂ）カテプシンＤをカテプシンＤにより切断可能なペプ
チド基質と潜在的なインヒビターの存在下にインキュベ
ーションして、第２インキュベーション物を形成し、 ｃ）ある時間にわたって形成したペプチド生成物の量を
分析して、前記第１インキュベーション物および前記第
２インキュベーション物における生成物の形成割合を計
算し、そして ｄ）前記潜在的なインヒビターの存在下に観察された酵
素活性の減少を計算し、前記減少は阻害活性を示す、 ことからなる、カテプシンＤのインヒビターを同定する
方法。
【０２２８】９、前記カテプシンＤがヒトカテプシンＤ
である、上記第８項記載の方法。
【０２２９】１０、前記ペプチド基質がＮ−ダンシル化
されている上記第８項記載の方法。 １１、ａ）ヒトから得られた生理学的試料をアミロイド
前駆体タンパク質基質の存在下にインキュベーション
し、前記インキュベーションは前記試料中のアミロイド
前駆体タンパク質分解プロテアーゼが触媒的に活性であ
る条件下に実施し、 ｂ）工程（ａ）の停止したインキュベーション混合物の
一部分を有するゲルを形成し、 ｃ）工程（ｂ）のゲルを電気泳動させて別々のポリペプ
チドの構成成分を表す電気泳動の移動のパターンを得、 ｄ）工程（ｃ）の前記構成成分を膜上にブロットし、 ｅ）工程（ｄ）からの前記ブロットした膜を抗アミロイ
ド前駆体タンパク質抗体と接触させ、 ｆ）前記抗アミロイド前駆体タンパク質抗体を認識する
第２抗体と前記ブロットした膜を反応させ、前記第２抗
体は検出可能なリガンドにカップリングされており、そ
して ｇ）ベータ−アミロイドのペプチド配列を含有するため
に十分な大きさの断片に相当する領域におけるブロット
の染色強度を検査する、ことからなる、アミロイド前駆
体タンパク質を分解することができる分子のタンパク質
分解活性を測定する方法。
【０２３０】１２、前記生理学的試料が脳の組織および
脳脊髄液から成る群より選択される上記第１１項記載の
方法。
【０２３１】１３、前記生理学的試料がカテプシンＤを
含有する上記第１２項記載の方法。 １４、前記生理学的試料を処理して、粗製のホモジネー
ト、可溶性分画または洗浄剤で可溶化した膜の分画をえ
ることをさらに含む上記第１１項記載の方法。 １５、前記アミロイド前駆体タンパク質基質が点突然変
異を含有する遺伝子配列から翻訳される上記第１１項記
載の方法。
【０２３２】１６、前記アミロイド前駆体タンパク質基
質がアミロイド前駆体タンパク質のＣ末端部分に相当す
る上記第１１項記載の方法。
【０２３３】１７、前記抗アミロイド前駆体タンパク質
抗体がベータ−アミロイドのペプチドおよびアミロイド
前駆体タンパク質のＣ末端の断片から成る群より選択さ
れるペプチドを認識する上記第１１項記載の方法。
【０２３４】１８、前記Ｃ末端の断片が、組み換えＣ−
１００またはベータ−アミロイドの大きさのマーカーと
の同時移動により検出される、Ｃ−１００またはベータ
−アミロイドのペプチド断片からなる、上記第１７項記
載の方法。
【０２３５】１９、ａ）ヒトから得られた生理学的試料
の一部分および選択したアミロイド前駆体タンパク質基
質を有する第１インキュベーション物を形成し、そして
ヒトから得られた前記生理学的試料の第２部分、前記選
択したアミロイド前駆体タンパク質基質および被検イン
ヒビターを有する第２インキュベーション物を形成し、 ｂ）前以て決定した期間後工程（ａ）におけるインキュ
ベーションを停止し、 ｃ）工程（ｂ）の停止したインキュベーション混合物の
一部分を有するゲルを形成し、 ｄ）工程（ｃ）のゲルを電気泳動させて別々のポリペプ
チドの構成成分を表す電気泳動の移動のパターンを得、 ｅ）工程（ｄ）の前記構成成分を膜上にブロットし、 ｆ）工程（ｅ）からの前記膜を抗アミロイド前駆体タン
パク質抗体と接触させ、 ｇ）前記抗アミロイド前駆体タンパク質抗体を認識する
第２抗体と前記ブロットした膜を反応させ、前記第２抗
体は検出可能なマーカーにカップリングされており、 ｈ）ベータ−アミロイドのペプチド配列を含有するため
に十分な大きさの断片に相当する領域におけるブロット
の染色強度を検査し、そして ｉ）前記第１インキュベーション物および前記第２イン
キュベーション物から観測された同一大きさのバンドの
強度を比較する、ことからなる、アミロイド前駆体タン
パク質に対して特異的なプロテアーゼのインヒビターを
同定する方法。
【０２３６】２０、前記アミロイド前駆体タンパク質に
対して特異的な前記プロテアーゼがカテプシンＤである
上記第１９項記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図２】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図３】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図４】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図５】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図６】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図７】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−２
の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプール
に関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット分
析を描写する。プールは実施例３に記載するようにプロ
テアーゼ活性のそれらの含量に基づいてつくった。イム
ノブロットアッセイは実施例８に記載するように実施し
た。次のプールについての代表的なアッセイを示す： Ｐ−２のプールＶに関連する活性：ＡＰＰはレーン２〜
６の各々の中に存在した。ＰＭＴＩ７３からのＣ−１０
０（レーン１）、Ｐ２−Ｖなしのブランク（レーン
２）、Ｐ２−Ｖ（レーン３）、Ｐ２−Ｖ＋ＥＤＴＡ（レ
ーン４）、Ｐ２−Ｖ＋メタノール（レーン５）、メタノ
ール中のＰ２−Ｖ＋ペプスタチンＡ（レーン６）。
【図８】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−２
の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプール
に関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット分
析を描写する。プールは実施例３に記載するようにプロ
テアーゼ活性のそれらの含量に基づいてつくった。イム
ノブロットアッセイは実施例８に記載するように実施し
た。次のプールについての代表的なアッセイを示す： ＭのプールＩＩＩに関連する活性：ＡＰＰはレーン２〜
７の各々の中に存在した。ＰＭＴＩ７３からのＣ−１０
０（レーン１）、Ｍ−ＩＩＩ＋シスタチンＣ（レーン
２）、Ｍ−ＩＩＩ＋アプロチニン（レーン３）、Ｍ−Ｉ
ＩＩ＋カプトプリル（レーン４）、Ｍ−ＩＩＩ＋ＥＧＴ
Ａ（レーン５）、Ｍ−ＩＩＩ＋Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番号：１）（レーン
６）、インヒビターなしのＭ−ＩＩＩ（レーン７）、前
以て染色した分子量マーカー（レーン８）。
【図９】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−２
の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプール
に関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット分
析を描写する。プールは実施例３に記載するようにプロ
テアーゼ活性のそれらの含量に基づいてつくった。イム
ノブロットアッセイは実施例８に記載するように実施し
た。次のプールについての代表的なアッセイを示す： ＳのプールＩに関連する活性：ＡＰＰはレーン２〜６の
各々の中に存在した。Ｓ−Ｉ＋Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番号：１）（レーン
２）、Ｓ−Ｉ＋ＥＧＴＡ（レーン３）、Ｓ−Ｉ＋カプト
プリル（レーン４）、Ｓ−Ｉ−アプロチニン（レーン
５）、Ｓ−Ｉ＋シスタチンＣ（レーン６）、ＰＭＴＩ７
３からのＣ−１００（レーン７）。レーン１は前以て染
色した分子量マーカーを含有する。
【図１０】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−
２の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプー
ルに関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット
分析を描写する。プールは実施例３に記載するようにプ
ロテアーゼ活性のそれらの含量に基づいてつくった。イ
ムノブロットアッセイは実施例８に記載するように実施
した。次のプールについての代表的なアッセイを示す： ＡＤのＰ−２の分離からの個々のモノ−Ｑの分画の中に
回収された活性：そうでなければＰ−２のプールＶＩＩ
観測されるコンダクタンス領域に相当するモノ−Ｑの分
画３８〜４３を、ＡＰＰ分解活性について個々に検査し
た。各分画について、インキュベーションは組み換えＡ
ＰＰ６９５の不存在（−）または存在（＋）の両者にお
いて実施した。分画の番号は図２に示されている。使用
したＣ−１００の標準はＰＭＴＩ１００からのものであ
った。Ｍｒは分子の大きさのマーカーを示す。
【図１１】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−
２の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプー
ルに関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット
分析を描写する。プールは実施例３に記載するようにプ
ロテアーゼ活性のそれらの含量に基づいてつくった。イ
ムノブロットアッセイは実施例８に記載するように実施
した。次のプールについての代表的なアッセイを示す： ＰＭＴＩ７３またはＰＭＴＩ１００により指令されたＣ
−１００生成物の移動の位置の比較：ＰＭＴＩ７３（レ
ーン１および３）およびＰＭＴＩ１００（レーン２およ
び４）のタンパク質生成物を分子マーカー（レーン５）
と比較して示す。
【図１２】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−
２の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプー
ルに関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット
分析を描写する。プールは実施例３に記載するようにプ
ロテアーゼ活性のそれらの含量に基づいてつくった。イ
ムノブロットアッセイは実施例８に記載するように実施
した。次のプールについての代表的なアッセイを示す： 生成物の形成の典型的な時間経過：ＡＰＰ＋Ｍ−ＩＩＩ
を時間ｔ＝０時間（レーン１）、５時間（レーン２）、
２０．５時間（レーン３）、４４．５時間（レーン４）
および５５時間（レーン５）に分析した。分子量マーカ
ー（レーン６）、Ｃ−１００のＭ−ＩＩＩ（レーン６）
およびＭ−ＩＩＩなしのＡＰＰ（レーン８）をまた示
す。上の図７〜１２の各々について、移動は上部から下
部へであった。図７〜１０および１２において、上の濃
い矢印はホロ−ＡＰＰの移動の位置を示し、そして下の
濃い矢印はＣ−１００の移動の位置を示す。図１０にお
いて、白抜きの矢印は酵素的に発生したＣ−１００の断
片推定上のオリゴマーの移動の位置を示す。すべてはイ
ンヒビターの濃度を下表４に記載する。
【図１３】ゲル濾過によるＰ−２のプールＶＩＩのそれ
以上の精製からの結果を描写する。 図１３ａ：モノ−Ｑ１０／１０のクロマトグラフィーか
らのＰ−２−プールＶＩｉの分画をプールし、０．２ｍ
ｌに濃縮し、そして１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１
０ｍＭのＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５の中で平衡化したセフ
ァローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６ＨＲ１０／３０カラ
ムの直列の配置に適用した。溶離は０．３ｍｌ／分の流
速で実施し、そしてカラムの溶離液を２８０ｎｍにおい
てモニターした。分画（０．２４ｍｌ）を集め、そして
イムノブロットを使用してプロテアーゼ活性およびＡＰ
Ｐ分解についてアッセイした。矢印はＡＰＰ分解活性が
回収されたクロマトグラムの領域を示す。また、プロテ
アーゼ活性はＫ−Ｍ（黒い円）およびＭ−Ｄ（白抜きの
円）の結合の切断に関連して示されている。クロマトグ
ラフィーは２２℃において実施した。 図１３ｂ：既知のマイクロタイターウェルの示したタン
パク質に関するＡＰＰ分解活性の移動を使用して、実施
例８に列挙するＡＰＰ分解性プロテアーゼの見掛けのＭ
ｒを計算した。
【図１４】ベータ−アミロイドのペプチドに対してレイ
ズされたネズミのモノクローナル抗体Ｃ２８６．８Ａの
ペプチドのエピトープのマッピングを示す。マイクロタ
イタープレートを５０ｎｇの合成ＡＰＰ６９５（５９７
−６３８）（ベータ−アミロイド１−４２）で被覆し、
ブロックし、次いで示した濃度の競合ペプチドの存在ま
たは不存在において前インキュベーションした（室温に
おいて６０分）した１００μｌのＣ２８６．８Ａ（８０
ｎｇのＩｇＧ）とインキュベーションした。注、ペプチ
ド１−７はペプチド配列同定番号：１を意味する。室温
において６０分間インキュベーションした後、プレート
を洗浄し、そして結合した抗体の量を標準の手順に従い
セイヨウワサビペルオキシダーゼ−カップルド−ヤギ−
抗マウスポリクローナル抗体を使用する現像により決定
した（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈら、１９９２、Ｊ．ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４７：１）。プレ
ートに結合する抗体の競合百分率（％）を、次の方程式
を使用して４５０ｎｍにおける吸収のデータから計算し
た：
【数１】Ｃ％＝１．０−［Ｏ．Ｄ．（＋競合因子）−
Ｏ．Ｄ．ブランク］／［Ｏ．Ｄ．（−競合因子）−Ｏ．
Ｄ．ブランク］×１００
【図１５】ヒト脳Ｐ−２細分画の精製からのイオン交換
分画の中に回収されたＡＰＰ６９５プロセシング活性 合計１２３の分画をカラムから集めた。最初の３２分画
は負荷および洗浄相に相当する。塩の勾配は分画３３で
開始した。分画３〜１８（フェニルａ）、２１〜３２
（フェニルｂ）、３３〜３８（フェニルｃ）および３９
〜４４（フェニルＤ）のスクリーンが示されている。各
分画について、インキュベーションはＰ２−Ｖ基質の不
存在（−）および存在（＋）において実施した。０また
は２４時間のインキュベーションは、適当な場合に、示
されている。インキュベーションは次のようにして実施
した。バキュロ誘導されたホロ−ＡＰＰ６９５（８０ｎ
Ｍ）を、１００ｍＭのＭｅｓ緩衝液ｐＨ６．５、０．０
０８％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００、１６０ｍＭの
ＮａＣｌ、６．７ｍＭのトリスを含有する合計１５μｌ
の各カラムの分画（ＡＰＰストック）とインキュベーシ
ョンした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料緩衝液の添加後２４
時間に、反応を停止した。実施例８に記載するように、
実施例６のＣ末端のポリクローナル抗血清を使用して、
イムノブロットを展開した。矢印は生成物の断片を示
す。分画４５〜８６をまた試験したが、これらの分画は
比較的わずかの活性を示した（したがって、示されてい
ない）。ピークＡおよびＢは主要な活性を示す。
【図１６】ゲル濾過のときのＰ−２誘導されたＡＰＰ分
解活性の精製の結果を示す：カテプシンＤの溶離との相
関関係。 パネル（ａ）スパロース６ＨＲカラム上のＰ−２のピー
クＢの精製についての２８０ｎｍの溶離のプロフィル。
パネル（ｂ）および（ｃ）実施例５に本質的に記載する
ように決定した、溶離した分画４９〜６０中の対応する
ＡＰＰのＣ末端のプロセシング活性。矢印は主要な生成
物のバンドを示す。カテプシンＤに対してウサギポリク
ローナル抗体（１／３００、希釈）を使用する、溶離し
た分画のイムノブロット分析。矢印は免疫反応性バンド
の移動の位置を示す。ヒト肝臓のカテプシンＤをまた比
較のために分析した。
【図１７】Ｐ−２の細分画から分離されたプロテアーゼ
活性のプロテアーゼインヒビターの特異性を描写する。
次の初期の成分の条件を達成するようにＡＰＰを添加す
ることによって、３７℃において反応（３２μｌ）を開
始した：ゲル濾過の１５〜２５ｋＤの領域からのＰ−２
酵素（２．５４μｇ／ｍｌ）（図６）；９６ｍＭの緩衝
液ｐＨ６．５中のＡＰＰ（１６８ｎＭ）。１５μｌの３
×試料緩衝液の添加後２６時間に反応を停止し、そして
次のインヒビターの添加の効果を示す：インヒビターな
し（レーン７および２０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（レーン
５）；エタノール中の４００ｍＭのＰＭＳＦ（レーン
９）；エタノール単独（レーン１１）；１００μＭのＥ
−６４（レーン１３）；１０μｇ／ｍｌのアプロチニン
（レーン２２）；ＤＭＳＯの中で１００μＭのペプスタ
チンＡ（レーン２６）；ＤＭＳＯのみ（レーン２４）。
０時間（レーン２および３０）および１６時間の間のＡ
ＰＰのインキュベーションの効果をまた示す。レーン
６、１０、１４、１７、２１および２５は酵素単独を含
有した。レーン４、８、１２、１９、２３および１７は
Ｃ−１００の標準を含有した。前染色した分子量マーカ
ーはレーン１および２９において存在する。１８および
２８ｋＤのＣ末端の生成物の断片は矢印で示されてい
る。
【図１８】ＡＰＰのＣ末端ドメインに対する抗体を使用
してモニターしたカテプシンＤを触媒とするＡＰＰの切
断の時間経過を示す。パネル（ａ）は、８６μＭのペプ
スタチンＡの不存在（レーン１０〜１４）または存在
（レーン４〜８）におけるカテプシンＤによるＡＰＰの
タンパク質分解の時間経過を示す。ＡＰＰをまた単独で
インキュベーションした（レーン１〜３）。番号は反応
の開始後の時間（時間）を示す。次の初期の成分の濃度
を達成するためにＡＰＰの添加により、３７℃において
反応を開始した：８９Ｍｅｓ緩衝液ｐＨ６．４中の、Ａ
ＰＰ（ｎＭ）、カテプシンＤ（９．２μｇ／ｍｌ）。ペ
プスタチンを含まない試料に同一量の溶媒（１．３％ｖ
／ｖのメタノール）。ｔ＝０、４３、８４、１４０およ
び２１５分において、アリコート（１５μｌ）を取り出
し、７．５μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料緩衝液と混合
し、そしてＡＰＰのＣ末端ドメインに対するウサギ抗血
清を使用してイムノブロット分析した。１８および２５
ｋＤの反応生成物を矢印で示す。
【図１９】Ｐ−２誘導の酵素またはカテプシンＤによる
ＡＰＰのＣ末端のプロセシングのｐＨおよびイオン依存
性を描写する。パネル（ａ）はカテプシンＤおよびＰ−
２酵素を使用して観測されたｐＨ依存性を示す（ピーク
Ｂ、図１５ゲル濾過クロマトグラフィー後、図１６）。
パネル（ｂ）はｐＨ６．５における両者の酵素について
のイオン強度依存性である。次の初期の成分の濃度を達
成するために酵素の添加により、３７℃において反応を
開始した：カテプシンＤ（９．２μｇ／ｍｌ）または図
１６からのＰ−２酵素（１１．７μｇ／ｍｌ）、酢酸ナ
トリウム、Ｍｅｓ、およびトリス−ＨＣｌ、および精製
されたＡＰＰ（７９ｎＭ）の各々の中の１００ｍＭ。ｔ
＝０および３時間において、アリコート（１５μｌ）を
取り出し、７．５μｌの３×試料緩衝液と混合し、そし
て実施例８に従いＣ末端のポリクローナル抗血清を使用
してイムノブロット分析した。２８、１８および１４ｋ
Ｄの反応生成物を矢印で示す。
【図２０】スパロース６ＨＲでさらに精製した後のカテ
プシンＤおよびＰ−２酵素によるＮ−ダンシル−Ｉｌｅ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2（配列同定番
号：７）の切断を示す。酵素／インヒビターを添加し、
これにより次のｔ＝０の成分の濃度を達成することによ
って、反応（３０μｌ）を開始した：酢酸塩、Ｍｅｓお
よびトリスｐＨ５．０の各々中の１３０ｍＭからなるカ
クテル緩衝液の中のカテプシンＤ（２．８μｇ／ｍ
ｌ）、または図１６からのＰ−２酵素（１７．５μｇ／
ｍｌ）、Ｎ−ダンシル−ペプチド（２４μＭ）、カプト
プリル（０．３ｍＭ）。試料はペプスタチンＡ（３％ｖ
／ｖの最終のメタノール中の２１３μＭ）または等しい
最終濃度のメタノールのみを含有した。０、２、４、８
および２４時間において、反応を１２％（ｖ／ｖ）のＴ
ＦＡ（１０μｌ）の添加により停止し、そして実施例２
および３に従いＨＰＬＣ分析した。代表的な軌跡を次に
ついて示す：Ｐ−２酵素、ｔ＝０時間（パネルＡ）；Ｐ
−２酵素、ｔ＝２４時間（パネルＢ）；Ｐ−２酵素＋ペ
プスタチンＡ、ｔ＝２４時間（パネルＣ）；カテプシン
Ｄ、ｔ＝０時間（パネルＤ）；カテプシンＤ、ｔ＝２４
時間（パネルＥ）；カテプシンＤ＋ペプスタチンＡ、２
４時間（パネルＦ）。
【図２１】反応条件は本質的に実施例１０に記載する通
りであったが、ただしカクテル緩衝液を示したｐＨ値に
調節した。（ａ）カテプシンＤによる切断、そして
（ｂ）Ｐ−２酵素による切断。−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−（黒
い円）および−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−（白抜きの円）の結合
における切断割合を各場合において示す。
【図２２】カテプシンＤによるＡＰＰの調製的消化のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析。 パネル（ａ）はバンドの切断前のクーマッシー染色した
エレクトロブロットの写真であり、パネル（ｂ）はバン
ド切断後の対応するブロットであり、そしてパネル
（ｃ）はパネル（ａ）および（ｃ）における描写するも
のに対して閉口な系列の反応の対応するイムノブロット
分析（モノクローナル２８６．８Ａの１／１００希釈
物）である。３７℃において基質を添加し、これにより
次の初期の成分の濃度を達成することによって反応を開
始した：３０ｍＭのＮａＣｌを含有する４０ｍＭの酢酸
ナトリウムｐＨ５．０中のＡＰＰ（１５．６μＭ）、カ
テプシンＤ（０．１７μＭ、７．１４５μｇ／ｍｌ）。
ｔ＝１６時間において、反応混合物をスピードｖａｃに
より１５μｌに濃縮し、７．５ｍｌの３×試料緩衝液と
混合し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。（ｃ）にお
ける反応は本質的に同一の方法で実施したが、ただしＡ
ＰＰの濃度を３．２μＭに減少した。両者の実験（ａお
よびｃ）について、インキュベーションは完全なインキ
ュベーション系を使用して（レーン３）、そしてカテプ
シンＤの不存在において（レーン４、試料緩衝液の添加
直後にカテプシンＤを添加し戻した）実施した。各場合
においてレーン５はカテプシンＤのみの対照を含有した
が、レーン６は移動標準として精製したＡＰＰを含有し
た。前染色した分子量マーカーはレーン１に存在する。
（ｃ）において、主な免疫反応性生成物を矢印で示す。
【図２３】ベータ−アミロイドのＮ末端に対するモノク
ローナル抗体を使用してモニターしたカテプシンＤを触
媒とするＡＰＰの切断の時間経過を示す。３７℃におい
て添加し、これにより次の初期の成分の濃度を達成する
ことによって反応を開始した：８３ｍＭの酢酸ナトリウ
ムｐＨ５．０中のＡＰＰ（４４８ｎＭ）、カテプシンＤ
（３０ｎＭ）、そして含めるときペプスタチンＡ（９
７．２μＭ）。示した時点において、アリコート（２０
μｌ）を取り出し、１０μｌの３×ＳＤＳ−ＰＡＧＥの
試料緩衝液と混合し、そしてモノクローナル抗体２８
６．８Ａ（１／１００）を使用してイムノブロット分析
した。反応はペプスタチンＡ（メタノールの中で供給し
た）の不存在（−）またはの存在下に実施した。すべて
の試料に２．７％（ｖ／ｖ）のメタノールを添加した。
レーン１およびレーン１２は前染色したマーカーを含有
し、レーン１０およびレーン１８はＣ−１００のＭｒマ
ーカーを含有した。レーン１１およびレーン１３は、そ
れぞれ、０および２４時間の間カテプシンＤなしでイン
キュベーションしたＡＰＰを含有した。主な生成物の断
片を矢印で示す。
【図２４】カテプシンＤおよびＰ−２誘導酵素（ピーク
Ｂ）による合成ペプチドの加水分解の時間経過へのアミ
ノ酸置換の効果を示す。３７℃において基質を添加し、
これにより次の初期の成分の濃度を達成することによっ
て反応を開始した：トリス、Ｍｅｓおよび酢酸塩の緩衝
液ｐＨ５．０の各々の中のカテプシンＤ（２．５μｇ／
ｍｌ）またはＰ−２ピークＢ酵素（７．５μｇ／ｍ
ｌ）；Ｎ−ダンシル−ペプチド（５８μＭ）、カプトプ
リル（０．３ｍＭの）、ペプスタチンＡ（２１３μＭ）
を含むか、あるいは含まない、塩化ナトリウム（７５ｍ
Ｍ）。種々の時間において、アリコート（３０μｌ）を
取り出し、ＴＦＡ中の１２．５％（ｖ／ｖ）に調節し、
そしてＲＰ−ＨＰＬＣ分析にかけた。次の基質／プロテ
アーゼの組み合わせについての加水分解の時間経過を示
す： ａ）Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ2（配列同定番号：７）、カテプシンＤによ
る； ｂ）Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ2（配列同定番号：３）、カテプシンＤによ
る； ｃ）Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ2（配列同定番号：７）、Ｐ−２酵素による
（ピークＢ、図１５ゲル濾過後、図１６）； ｄ）Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ2（配列同定番号：３）、Ｐ−２酵素による
（ピークＢ、図１５）。 Ｅ−Ｖ結合（正方形、パネルＡおよびＣ）、Ｍ−Ｄ結合
（黒いダイアモンド形、ＡおよびＣ）における切断、あ
るいは保持時間４．４分において代謝物質を発生させる
ために（ＢおよびＤにおいて）を示す。
【図２５】アプロチニンセファローズ上の可溶化Ｐ−２
分画の精製を示す。実験は実施例１に従い実施した。
（ａ）は典型的な２８０ｎｍの溶離のプロフィルであ
り、そして（ｂ）溶離した分画の中でＡＰＰプロセシン
グ活性についてのイムノブロットアッセイ（ＡＰＰのＣ
末端のドメインに対するウサギ抗体）である。矢印は主
なＡＰＰ分解生成物の移動を示す。注、酸性溶離から分
画８〜１３の中の破壊生成物の出現。
【図２６】モノ−Ｑ上のＰ−２誘導アプロチニン結合性
プロテアーゼの精製を示す。 （ａ）２８０ｎｍの溶離のプロフィル、（ｂ）検出のた
めにウサギ抗Ｃ末端のＡＰＰの抗血清（１／１０００希
釈）を使用する溶離された分画の活性、および（ｃ）分
画のためにＭａｂ２８６．８Ａ（１．６ｍｇ／ｍｌの純
粋なＩｇＧの１／１００希釈）を使用して溶離された分
画の活性。３つの矢印は１１．１４および１８ｋＤのの
Ｃ末端のＡＰＰの分解生成物の移動を示す。
【図２７】プールＹのセリンプロテアーゼにより触媒さ
れるＡＰＰの分解のｐＨおよびイオン強度依存性を示
す。パネル（ａ）はｐＨ依存性を示す。反応は３７℃に
おいて次のｔ＝０の成分濃度を達成して開始した：示し
たｐＨ値に調節した酢酸塩、Ｍｅｓおよびトリスの各々
の中の３２ｍＭからなるカクテル緩衝液中の、プールＹ
のプロテアーゼ（図２６からの５μｌの分画）、ＡＰＰ
（３８ｎＭ）。反応混合物（１６μｌ）を７．５μｌの
３×試料緩衝液の添加により２時間後に停止させた。イ
ムノブロットは本質的に実施例８に記載するように、Ａ
ＰＰのＣ末端ドメインに対するウサギポリクローナル抗
血清を使用して現像シた。レーン１およびレーン１２は
前染色したマーカーを含有した。レーン９はＣ−１００
を含有し、そしてレーン１０およびレーン１１はプール
Ｙの不存在下にｐＨ６．５において、それぞれ、０およ
び３時間インキュベーションしたＡＰＰを含有した。パ
ネル（ｂ）はイオン強度の依存性を示す。反応は本質的
に（ａ）に記載するように実施したが、ただし緩衝液は
示したモル濃度の塩化ナトリウムを含有する９５ｍＭの
Ｍｅｓ ｐＨ６．５であった。プールＹの不存在（レー
ン２〜７）または存在（レーン９〜１４）におけるＡＰ
Ｐの切断を塩化ナトリウムの各濃度について示す。レー
ン１および８は、それぞれ、ＭｒマーカーおよびＣ−１
００の標準を含有する。矢印は１１、１４および１８ｋ
ＤａのＡＰＰ断片の移動を示す。
【図２８】プールＹのプロテアーゼのインヒビターの選
択性を描写する。反応を３７℃において酵素の添加によ
り開始して、次の初期成分濃度を達成した：３０ｍＭの
Ｍｅｓ緩衝液ｐＨ６．５中の、スーパーデックス７５カ
ラムにより精製後のプールＹ＃３〜５（１４μｇ／ｍ
ｌ）、ＡＰＰ（３５ｎＭ）。反応は７．５μｌの３×試
料緩衝液の添加により停止させた。実施例８に従いＡＰ
ＰのＣ末端ドメインに対するウサギ抗血清を使用して、
イムノブロットを現像した。次のインヒビターの効果に
ついてのデータを示す：パネル（ａ）メタノール中の８
６０μＭのＰＭＳＦ（レーン４）、メタノール中の４０
０μＭのペプスタチン（レーン６）、５ｍＭのベンズア
ミジン（レーン８）、３５０μＭのＥ−６４（レーン
９）、７．７ｍＭのＥＤＴＡ（レーン１０）、１５μＭ
のアプロチニン（レーン１１）、および０．１％（ｖ／
ｖ）のデオキシコレート（レーン１５）。次の対照をま
た実験した：インヒビターなし（レーン１２）、エタノ
ール（レーン３）、メタノール（レーン５）、プールＹ
のみ（レーン２）、時間０におけるＡＰＰのみ（レーン
１３）および４時間におけるＡＰＰのみ（レーン１
４）。レーン１およびレーン７は、それぞれ、前染色し
たＭｒマーカーおよびＣ−１００の標準を示す。パネル
（ｂ）１．８μＭのアルファ−１−抗キモトリプシン
（レーン２）、１５６μＭのＴＬＣＫ（レーン３）、４
６μＭのキモトリプシンインヒビターＩ（レーン４）、
１１９μＭのキモトリプシンインヒビターＩＩ（レーン
５）、４μＭのアルファ−２−抗プラスミン（レーン
６）、アルファ−１−抗トリプシン（レーン７）、ＤＭ
ＳＯ（レーン１１）、およびメタノール（レーン１
３）。前染色した分子量マーカーおよびＣ−１００の標
準を、それぞれ、レーン１およびレーン９に適用した。
４および２時間のインキュベーションを、それぞれ、パ
ネルａ）およびｂ）において使用した。矢印は１１、１
４および１４ｋＤのＡＰＰの分解生成物の移動を示す。
【配列表】
配列のリスト （１）全体的情報 （ｉ）出願人：ポール Ｐ．タンブリニおよびロバート
Ｎ．ドレイアー （ｉｉ）発明の名称：ベータ−アミロイド前駆体タンパ
ク質プロセシング酵素を検出する方法 （ｉｉｉ）配列の数：８ （ｉｖ）通信の住所： （Ａ）住所：マイルス・インコーポレーテッド （Ｂ）ストリート：マーガンレーン４００ （Ｃ）シティイ；ウェストヘブン （Ｄ）州：コネチカット （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：０６５１６ （ｖ）コンピューター読み取り可能なフォーム： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ （Ｃ）操作システム：ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト５．１ （ｖｉ）現在の出願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）代理人の情報： （Ａ）名前：ジャエ Ｈ．キム、Ｅｓｑ． （Ｂ）登録番号：３２，９０７ （Ｃ）参照／整理番号：ＭＴＩ ２２４ （ｖｉｉｉ）電信の情報： （Ａ）ＴＥＬ：（２０３）９３７−２３４０ （Ｂ）ＦＡＸ：（２０３）９３７−２７９５ （２）配列同定番号：１についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１６アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：１
【表１】 （３）配列同定番号：２についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：２
【表２】 （４）配列同定番号：３についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：３
【表３】 （５）配列同定番号：４についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：４
【表４】 （６）配列同定番号：５についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：５
【表５】 （７）配列同定番号：６についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：６
【表６】 （８）配列同定番号：７についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：７
【表７】 （９）配列同定番号：８についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３９アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型： ｃＤＮＡ→ｍＲＮＡ （ｉｉｉ）刊行物の情報： （Ａ）著者：カングら （Ｂ）雑誌：ネイチャー （Ｃ）巻：３２５ （Ｄ）ページ：７３５ （Ｅ）日付：１９８７ （ｉｖ）配列の記載：配列同定番号：８
【表８】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年３月３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２３６】２０、前記アミロイド前駆体タンパク質に
対して特異的な前記プロテアーゼがカテプシンＤである
上記第１９項記載の方法。
【配列表】 配列のリスト （１）全体的情報 （ｉ）出願人：ポール Ｐ．タンブリニおよびロバート
Ｎ．ドレイアー （ｉｉ）発明の名称：ベータ−アミロイド前駆体タンパ
ク質プロセシング酵素を検出する方法 （ｉｉｉ）配列の数：８ （ｉｖ）通信の住所： （Ａ）住所：マイルス・インコーポレーテッド （Ｂ）ストリート：マーガンレーン４００ （Ｃ）シティイ；ウェストヘブン （Ｄ）州：コネチカット （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：０６５１６ （ｖ）コンピューター読み取り可能なフォーム： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ （Ｃ）操作システム：ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト５．１ （ｖｉ）現在の出願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）代理人の情報： （Ａ）名前：ジャエ Ｈ．キム、Ｅｓｑ． （Ｂ）登録番号：３２，９０７ （Ｃ）参照／整理番号：ＭＴＩ ２２４ （ｖｉｉｉ）電信の情報： （Ａ）ＴＥＬ：（２０３）９３７−２３４０ （Ｂ）ＦＡＸ：（２０３）９３７−２７９５ （２）配列同定番号：１についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１６アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：１
【表１】 （３）配列同定番号：２についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：２
【表２】 （４）配列同定番号：３についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：３
【表３】 （５）配列同定番号：４についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：４
【表４】 （６）配列同定番号：５についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：５
【表５】 （７）配列同定番号：６についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：６
【表６】 （８）配列同定番号：７についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉｉ）配列の記載：配列同定番号：７
【表７】 （９）配列同定番号：８についての情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３９アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型： ｃＤＮＡ→ｍＲＮＡ （ｉｉｉ）刊行物の情報： （Ａ）著者：カングら （Ｂ）雑誌：ネイチャー （Ｃ）巻：３２５ （Ｄ）ページ：７３５ （Ｅ）日付：１９８７ （ｉｖ）配列の記載：配列同定番号：８
【表８】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図２】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図３】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図４】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直に表されている。輪
郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を示
す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、Ａ
Ｄ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２（ｆ）
からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプロット
の右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載し、次
いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡＰＰ分
解活性を含有することが見いだされた、プールした領域
を示す。
【図５】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図６】ＡＤヒト皮質の細分画と比較した対照のプロテ
アーゼ活性の２次元の輪郭プロットを示す。細分画は実
施例１に従い、Ｐ−２、ＳおよびＭの分画のイオン交換
（モノ−Ｑ）分離により調製された。モノ−ＱによるＮ
−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番
号：１）の酵素的切断は実施例３に記載するように実施
した。各プロットは、同一のインキュベーション条件下
に各モノ−Ｑの分画（縦座標）のインキュベーションに
より得られた各蛍光性生成物（横座標）の相対量を示
す。生成物の量は輪郭線により垂直ｎｉ表されている。
輪郭線のより大きい量は特定の生成物のより大きい量を
示す。対照Ｓ（ａ）、ＡＤ Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、
ＡＤ Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、ＡＤ Ｐ−２
（ｆ）からのモノ−Ｑの分画を分析した。３つのＡＤプ
ロットの右の縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載
し、次いで実施例８に従いアッセイし、そして有意なＡ
ＰＰ分解活性を含有することが見いだされた、プールし
た領域を示す。
【図７】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−２
の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプール
に関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット分
析結果を示すゲル電気泳動図に代わる写真である。プー
ルは実施例３に記載するようにプロテアーゼ活性のそれ
らの含量に基づいてつくった。イムノブロットアッセイ
は実施例８に記載するように実施した。次のプールにつ
いての代表的なアッセイを示す： Ｐ−２のプールＶに関連する活性：ＡＰＰはレーン２〜
６の各々の中に存在した。ＰＭＴＩ７３からのＣ−１０
０（レーン１）、Ｐ２−Ｖなしのブランク（レーン
２）、Ｐ２−Ｖ（レーン３）、Ｐ２−Ｖ＋ＥＤＴＡ（レ
ーン４）、Ｐ２−Ｖ＋メタノール（レーン５）、メタノ
ール中のＰ２−Ｖ＋ペプスタチンＡ（レーン６）。
【図８】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−２
の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプール
に関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット分
析結果を示すゲル電気泳動図に代わる写真である。プー
ルは実施例３に記載するようにプロテアーゼ活性のそれ
らの含量に基づいてつくった。イムノブロットアッセイ
は実施例８に記載するように実施した。次のプールにつ
いての代表的なアッセイを示す： ＭのプールＩＩＩに関連する活性：ＡＰＰはレーン２〜
７の各々の中に存在した。ＰＭＴＩ７３からのＣ−１０
０（レーン１）、Ｍ−ＩＩＩ＋シスタチンＣ（レーン
２）、Ｍ−ＩＩＩ＋アプロチニン（レーン３）、Ｍ−Ｉ
ＩＩ＋カプトプリル（レーン４）、Ｍ−ＩＩＩ＋ＥＧＴ
Ａ（レーン５）、Ｍ−ＩＩＩ＋Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番号：１）（レーン
６）、インヒビターなしのＭ−ＩＩＩ（レーン７）、前
以て染色した分子量マーカー（レーン８）。
【図９】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−２
の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプール
に関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット分
析結果を示すゲル電気泳動図に代わる写真である。プー
ルは実施例３に記載するようにプロテアーゼ活性のそれ
らの含量に基づいてつくった。イムノブロットアッセイ
は実施例８に記載するように実施した。次のプールにつ
いての代表的なアッセイを示す： ＳのプールＩに関連する活性：ＡＰＰはレーン２〜６の
各々の中に存在した。Ｓ−Ｉ＋Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列同定番号：１）（レーン
２）、Ｓ−Ｉ＋ＥＧＴＡ（レーン３）、Ｓ−Ｉ＋カプト
プリル（レーン４）、Ｓ−Ｉ−アプロチニン（レーン
５）、Ｓ−Ｉ＋シスタチンＣ（レーン６）、ＰＭＴＩ７
３からのＣ−１００（レーン７）。レーン１は前以て染
色した分子量マーカーを含有する。
【図１０】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−
２の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプー
ルに関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット
分析結果を示すゲル電気泳動図に代わる写真である。プ
ールは実施例３に記載するようにプロテアーゼ活性のそ
れらの含量に基づいてつくった。イムノブロットアッセ
イは実施例８に記載するように実施した。次のプールに
ついての代表的なアッセイを示す： ＡＤのＰ−２の分離からの個々のモノ−Ｑの分画の中に
回収された活性：そうでなければＰ−２のプールＶＩＩ
観測されるコンダクタンス領域に相当するモノ−Ｑの分
画３８〜４３を、ＡＰＰ分解活性について個々に検査し
た。各分画について、インキュベーションは組み換えＡ
ＰＰ６９５の不存在（−）または存在（＋）の両者にお
いて実施した。分画の番号は図２に示されている。使用
したＣ−１００の標準はＰＭＴＩ１００からのものであ
った。Ｍｒは分子の大きさのマーカーを示す。
【図１１】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−
２の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプー
ルに関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット
分析結果を示すゲル電気泳動図に代わる写真である。を
描写する。プールは実施例３に記載するようにプロテア
ーゼ活性のそれらの含量に基づいてつくった。イムノブ
ロットアッセイは実施例８に記載するように実施した。
次のプールについての代表的なアッセイを示す： ＰＭＴＩ７３またはＰＭＴＩ１００により指令されたＣ
−１００生成物の移動の位置の比較：ＰＭＴＩ７３（レ
ーン１および３）およびＰＭＴＩ１００（レーン２およ
び４）のタンパク質生成物を分子マーカー（レーン５）
と比較して示す。
【図１２】ＡＤの皮質から誘導されたＭ、ＳまたはＰ−
２の分画のイオン交換分離から選択したモノ−Ｑのプー
ルに関連する、ＡＰＰ６９５分解活性のイムノブロット
分析結果を示すゲル電気泳動図に代わる写真である。プ
ールは実施例３に記載するようにプロテアーゼ活性のそ
れらの含量に基づいてつくった。イムノブロットアッセ
イは実施例８に記載するように実施した。次のプールに
ついての代表的なアッセイを示す： 生成物の形成の典型的な時間経過：ＡＰＰ＋Ｍ−ＩＩＩ
を時間ｔ＝０時間（レーン１）、５時間（レーン２）、
２０．５時間（レーン３）、４４．５時間（レーン４）
および５５時間（レーン５）に分析した。分子量マーカ
ー（レーン６）、Ｃ−１００のＭ−ＩＩＩ（レーン６）
およびＭ−ＩＩＩなしのＡＰＰ（レーン８）をまた示
す。上の図７〜１２の各々について、移動は上部から下
部へであった。図７〜１０および１２において、上の濃
い矢印はホロ−ＡＰＰの移動の位置を示し、そして下の
濃い矢印はＣ−１００の移動の位置を示す。図１０にお
いて、白抜きの矢印は酵素的に発生したＣ−１００の断
片推定上のオリゴマーの移動の位置を示す。すべてはイ
ンヒビターの濃度を下表４に記載する。
【図１３】ゲル濾過によるＰ−２のプールＶＩＩのそれ
以上の精製からの結果を描写する。 図１３ａ：モノ−Ｑ１０／１０のクロマトグラフィーか
らのＰ−２−プールＶＩｉの分画をプールし、０．２ｍ
ｌに濃縮し、そして１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１
０ｍＭのＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５の中で平衡化したセフ
ァローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６ＨＲ１０／３０カラ
ムの直列の配置に適用した。溶離は０．３ｍｌ／分の流
速で実施し、そしてカラムの溶離液を２８０ｎｍにおい
てモニターした。分画（０．２４ｍｌ）を集め、そして
イムノブロットを使用してプロテアーゼ活性およびＡＰ
Ｐ分解についてアッセイした。矢印はＡＰＰ分解活性が
回収されたクロマトグラムの領域を示す。また、プロテ
アーゼ活性はＫ−Ｍ（黒い円）およびＭ−Ｄ（白抜きの
円）の結合の切断に関連して示されている。クロマトグ
ラフィーは２２℃において実施した。 図１３ｂ：既知のマイクロタイターウェルの示したタン
パク質に関するＡＰＰ分解活性の移動を使用して、実施
例８に列挙するＡＰＰ分解性プロテアーゼの見掛けのＭ
ｒを計算した。
【図１４】ベーターアミロイドのペプチドに対してレイ
ズされたネズミのモノクローナル抗体Ｃ２８６．８Ａの
ペプチドのエピトープのマッピングを示す。マイクロタ
イタープレートを５０ｎｇの合成ＡＰＰ６９５（５９７
−６３８）（ベーターアミロイド１−４２）で被覆し、
ブロックし、次いで示した濃度の競合ペプチドの存在ま
たは不存在において前インキュベーションした（室温に
おいて６０分）した１００μｌのＣ２８６．８Ａ（８０
ｎｇのＩｇＧ）とインキュベーションした。注、ペプチ
ド１−７はペプチド配列同定番号：１を意味する。室温
において６０分間インキュベーションした後、プレート
を洗浄し、そして結合した抗体の量を標準の手順に従い
セイヨウワサビペルオキシダーゼ−カップルド−ヤギ−
抗マウスポリクローナル抗体を使用する現像により決定
した（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈら、１９９２、Ｊ．ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４７：１）。プレ
ートに結合する抗体の競合百分率（％）を、次の方程式
を使用して４５０ｎｍにおける吸収のデータから計算し
た：
【数１】
【図１５】ヒト脳Ｐ−２細分画の精製からのイオン交換
分画の中に回収されたＡＰＰ６９５プロセシング活性に
関し、イムノブロット分析結果を示すゲル電気泳動図に
代わる写真である。合計１２３の分画をカラムから集め
た。最初の３２分画は負荷および洗浄相に相当する。塩
の勾配は分画３３で開始した。分画３〜１８（フェニル
ａ）、２１〜３２（フェニルｂ）、３３〜３８（フェニ
ルｃ）および３９〜４４（フェニルＤ）のスクリーンが
示されている。各分画について、インキュベーションは
Ｐ２−Ｖ基質の不存在（−）および存在（＋）において
実施した。０または２４時間のインキュベーションは、
適当な場合に、示されている。インキュベーションは次
のようにして実施した。バキュロ誘導されたホロ−ＡＰ
Ｐ６９５（８０ｎＭ）を、１００ｍＭのＭｅｓ緩衝液ｐ
Ｈ６．５、０．００８％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１０
０、１６０ｍＭのＮａＣｌ、６．７ｍＭのトリスを含有
する合計１５μｌの各カラムの分画（ＡＰＰストック）
とインキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料緩
衝液の添加後２４時間に、反応を停止した。実施例８に
記載するように、実施例６のＣ末端のポリクローナル抗
血清を使用して、イムノブロットを展開した。矢印は生
成物の断片を示す。分画４５〜８６をまた試験したが、
これらの分画は比較的わずかの活性を示した（したがっ
て、示されていない）。ピークＡおよびＢは主要な活性
を示す。
【図１６】ゲル濾過のときのＰ−２誘導されたＡＰＰ分
解活性の精製の結果の溶出パターンを示す図である。
【図１７】ゲル濾過のときのＰ−２誘導されたＡＰＰ分
解活性の精製の結果を示す：カテプシンＤの溶離との相
関関係について、イムノブロット分析結果を示すゲル電
気泳動図に代わる写真である。パネル（ａ）スパロース
６ＨＲカラム上のＰ−２のピークＢの精製についての２
８０ｎｍの溶離のプロフィル。パネル（ｂ）および
（ｃ）実施例５に本質的に記載するように決定した、溶
離した分画４９〜６０中の対応するＡＰＰのＣ末端のプ
ロセシング活性。矢印は主要な生成物のバンドを示す。
カテプシンＤに対してウサギポリクローナル抗体（１／
３００、希釈）を使用する、溶離した分画のイムノブロ
ット分析。矢印は免疫反応性バンドの移動の位置を示
す。ヒト肝臓のカテプシンＤをまた比較のために分析し
た。
【図１８】Ｐ−２の細分画から分離されたプロテアーゼ
活性のプロテアーゼインヒビターの特異性を描写する、
イムノブロット分析結果のゲル電気泳動図に代わる写真
である。次の初期の成分の条件を達成するようにＡＰＰ
を添加することによって、３７℃において反応（３２μ
ｌ）を開始した：ゲル濾過の１５〜２５ｋＤの領域から
のＰ−２酵素（２．５４μｇ／ｍｌ）（図６）；９６ｍ
Ｍの緩衝液ｐＨ６．５中のＡＰＰ（１６８ｎＭ）。１５
μｌの３×試料緩衝液の添加後２６時間に反応を停止
し、そして次のインヒビターの添加の効果を示す：イン
ヒビターなし（レーン７および２０）、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ（レーン５）；エタノール中の４００ｍＭのＰＭＳＦ
（レーン９）；エタノール単独（レーン１１）；１００
μＭのＥ−６４（レーン１３）；１０μｇ／ｍｌのアプ
ロチニン（レーン２２）；ＤＭＳＯの中で１００μＭの
ペプスタチンＡ（レーン２６）；ＤＭＳＯのみ（レーン
２４）。０時間（レーン２および３０）および１６時間
の間のＡＰＰのインキュベーションの効果をまた示す。
レーン６、１０、１４、１７、２１および２５は酵素単
独を含有した。レーン４、８、１２、１９、２３および
１７はＣ−１００の標準を含有した。前染色した分子量
マーカーはレーン１および２９において存在する。１８
および２８ｋＤのＣ末端の生成物の断片は矢印で示され
ている。
【図１９】ＡＰＰのＣ末端ドメインに対する抗体を使用
してモニターしたカテプシンＤを触媒とするＡＰＰの切
断の時間経過を示す、イムノブロット分析結果のゲル電
気泳動図に代わる写真である。パネル（ａ）は、８６μ
ＭのペプスタチンＡの不存在（レーン１０〜１４）また
は存在（レーン４〜８）におけるカテプシンＤによるＡ
ＰＰのタンパク質分解の時間経過を示す。ＡＰＰをまた
単独でインキュベーションした（レーン１〜３）。番号
は反応の開始後の時間（時間）を示す。次の初期の成分
の濃度を達成するためにＡＰＰの添加により、３７℃に
おいて反応を開始した：８９Ｍｅｓ緩衝液ｐＨ６．４中
の、ＡＰＰ（ｎＭ）、カテプシンＤ（９．２μｇ／ｍ
ｌ）。ペプスタチンを含まない試料に同一量の溶媒
（１．３％ｖ／ｖのメタノール）。ｔ＝０、４３、８
４、１４０および２１５分において、アリコート（１５
μｌ）を取り出し、７．５μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥの試
料緩衝液と混合し、そしてＡＰＰのＣ末端ドメインに対
するウサギ抗血清を使用してイムノブロット分析した。
１８および２５ｋＤの反応生成物を矢印で示す。
【図２０】Ｐ−２誘導の酵素またはカテプシンＤによる
ＡＰＰのＣ末端のプロセシングのｐＨおよびイオン依存
性を描写する、イムノブロット分析結果のゲル電気泳動
図に代わる写真である。パネル（ａ）はカテプシンＤお
よびＰ−２酵素を使用して観測されたｐＨ依存性を示す
（ピークＢ、図１５ゲル濾過クロマトグラフィー後、図
１６）。パネル（ｂ）はｐＨ６．５における両者の酵素
についてのイオン強度依存性である。次の初期の成分の
濃度を達成するために酵素の添加により、３７℃におい
て反応を開始した：カテプシンＤ（９．２μｇ／ｍｌ）
または図１６からのＰ−２酵素（１１．７μｇ／ｍ
ｌ）、酢酸ナトリウム、Ｍｅｓ、およびトリス−ＨＣ
ｌ、および精製されたＡＰＰ（７９ｎＭ）の各々の中の
１００ｍＭ。ｔ＝０および３時間において、アリコート
（１５μｌ）を取り出し、７．５μｌの３×試料緩衝液
と混合し、そして実施例８に従いＣ末端のポリクローナ
ル抗血清を使用してイムノブロット分析した。２８、１
８および１４ｋＤの反応生成物を矢印で示す。
【図２１】スパロース６ＨＲでさらに精製した後のカテ
プシンＤおよびＰ−２酵素によるＮ−ダンシル−Ｉｌｅ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列同定番
号：７）の切断を示すクロマトグラフである。酵素／イ
ンヒビターを添加し、これにより次のｔ＝０の成分の濃
度を達成することによって、反応（３０μｌ）を開始し
た：酢酸塩、ＭｅｓおよびトリスｐＨ５．０の各々中の
１３０ｍＭからなるカクテル緩衝液の中のカテプシンＤ
（２．８μｇ／ｍｌ）、または図１６からのＰ−２酵素
（１７．５μｇ／ｍｌ）、Ｎ−ダンシル−ペプチド（２
４μＭ）、カプトプリル（０．３ｍＭ）。試料はペプス
タチンＡ（３％ｖ／ｖの最終のメタノール中の２１３μ
Ｍ）または等しい最終濃度のメタノールのみを含有し
た。０、２、４、８および２４時間において、反応を１
２％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ（１０μｌ）の添加により停止
し、そして実施例２および３に従いＨＰＬＣ分析した。
代表的な軌跡を次について示す：Ｐ−２酵素、ｔ＝０時
間（パネルＡ）；Ｐ−２酵素、ｔ＝２４時間（パネル
Ｂ）。
【図２２】スパロース６ＨＲでさらに精製した後のカテ
プシンＤおよびＰ−２酵素によるＮ−ダンシル−Ｉｌｅ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列同定番
号：７）の切断を示すクロマトグラフである。酵素／イ
ンヒビターを添加し、これにより次のｔ＝０の成分の濃
度を達成することによって、反応（３０μｌ）を開始し
た：酢酸塩、ＭｅｓおよびトリスｐＨ５．０の各々中の
１３０ｍＭからなるカクテル緩衝液の中のカテプシンＤ
（２．８μｇ／ｍｌ）、または図１６からのＰ−２酵素
（１７．５μｇ／ｍｌ）、Ｎ−ダンシル−ペプチド（２
４μＭ）、カプトプリル（０．３ｍＭ）。試料はペプス
タチンＡ（３％ｖ／ｖの最終のメタノール中の２１３μ
Ｍ）または等しい最終濃度のメタノールのみを含有し
た。０、２、４、８および２４時間において、反応を１
２％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ（１０μｌ）の添加により停止
し、そして実施例２および３に従いＨＰＬＣ分析した。
代表的な軌跡を次について示す：Ｐ−２酵素＋ペプスタ
チンＡ、ｔ＝２４時間（パネルＣ）；カテプシンＤ、ｔ
＝０時間（パネルＤ）；カテプシンＤ、ｔ＝２４時間
（パネルＥ）；カテプシンＤ＋ペプスタチンＡ、２４時
間（パネルＦ）。
【図２３】反応条件は本質的に実施例１０に記載する通
りであったが、ただしカクテル緩衝液を示したｐＨ値に
調節した。（ａ）カテプシンＤによる切断、そして
（ｂ）Ｐ−２酵素による切断。−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−（黒
い円）および−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−（白抜きの円）の結合
における切断割合を各場合において示す。
【図２４】カテプシンＤによるＡＰＰの調製的消化のゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析結果を示す図に代
わる写真である。パネル（ａ）はバンドの切断前のクー
マッシー染色したエレクトロブロットの写真であり、パ
ネル（ｂ）はバンド切断後の対応するブロットであり、
そしてパネル（ｃ）はパネル（ａ）および（ｃ）におけ
る描写するものに対して閉口な系列の反応の対応するイ
ムノブロット分析（モノクローナル２８６．８Ａの１／
１００希釈物）である。３７℃において基質を添加し、
これにより次の初期の成分の濃度を達成することによっ
て反応を開始した：３０ｍＭのＮａＣｌを含有する４０
ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０中のＡＰＰ（１５．６
μＭ）、カテプシンＤ（０．１７μＭ、７．１４５μｇ
／ｍｌ）。ｔ＝１６時間において、反応混合物をスピー
ドｖａｃにより１５μｌに濃縮し、７．５ｍｌの３×試
料緩衝液と混合し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
（ｃ）における反応は本質的に同一の方法で実施した
が、ただしＡＰＰの濃度を３．２μＭに減少した。両者
の実験（ａおよびｃ）について、インキュベーションは
完全なインキュベーション系を使用して（レーン３）、
そしてカテプシンＤの不存在において（レーン４、試料
緩衝液の添加直後にカテプシンＤを添加し戻した）実施
した。各場合においてレーン５はカテプシンＤのみの対
照を含有したが、レーン６は移動標準として精製したＡ
ＰＰを含有した。前染色した分子量マーカーはレーン１
に存在する。（ｃ）において、主な免疫反応性生成物を
矢印で示す。
【図２５】ベーターアミロイドのＮ末端に対するモノク
ローナル抗体を使用してモニターしたカテプシンＤを触
媒とするＡＰＰの切断の時間経過を示す、イムノブロッ
ト分析結果を示すゲル電気泳動図に代わる写真である。
３７℃において添加し、これにより次の初期の成分の濃
度を達成することによって反応を開始した：８３ｍＭの
酢酸ナトリウムｐＨ５．０中のＡＰＰ（４４８ｎＭ）、
カテプシンＤ（３０ｎＭ）、そして含めるときペプスタ
チンＡ（９７．２μＭ）。示した時点において、アリコ
ート（２０μｌ）を取り出し、１０μｌの３×ＳＤＳ−
ＰＡＧＥの試料緩衝液と混合し、そしてモノクローナル
抗体２８６．８Ａ（１／１００）を使用してイムノブロ
ット分析した。反応はペプスタチンＡ（メタノールの中
で供給した）の不存在（−）またはの存在下に実施し
た。すべての試料に２．７％（ｖ／ｖ）のメタノールを
添加した。レーン１およびレーン１２は前染色したマー
カーを含有し、レーン１０およびレーン１８はＣ−１０
０のＭｒマーカーを含有した。レーン１１およびレーン
１３は、それぞれ、０および２４時間の間カテプシンＤ
なしでインキュベーションしたＡＰＰを含有した。主な
生成物の断片を矢印で示す。
【図２６】カテプシンＤおよびＰ−２誘導酵素（ピーク
Ｂ）による合成ペプチドの加水分解の時間経過へのアミ
ノ酸置換の効果を示す。３７℃において基質を添加し、
これにより次の初期の成分の濃度を達成することによっ
て反応を開始した：トリス、Ｍｅｓおよび酢酸塩の緩衝
液ｐＨ５．０の各々の中のカテプシンＤ（２．５μｇ／
ｍｌ）またはＰ−２ピークＢ酵素（７．５μｇ／ｍ
ｌ）；Ｎ−ダンシル−ペプチド（５８μＭ）、カプトプ
リル（０．３ｍＭの）、ペプスタチンＡ（２１３μＭ）
を含むか、あるいは含まない、塩化ナトリウム（７５ｍ
Ｍ）。種々の時間において、アリコート（３０μｌ）を
取り出し、ＴＦＡ中の１２．５％（ｖ／ｖ）に調節し、
そしてＲＰ−ＨＰＬＣ分析にかけた。次の基質／プロテ
アーゼの組み合わせについての加水分解の時間経過を示
す： ａ）Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ２（配列同定番号：７）、カテプシンＤによ
る； ｂ）Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ２（配列同定番号：３）、カテプシンＤによ
る； ｃ）Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ２（配列同定番号：７）、Ｐ−２酵素による
（ピークＢ、図１５ゲル濾過後、図１６）； ｄ）Ｎ−ダンシル−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ＮＨ２（配列同定番号：３）、Ｐ−２酵素による
（ピークＢ、図１５）。 Ｅ−Ｖ結合（正方形、パネルＡおよびＣ）、Ｍ−Ｄ結合
（黒いダイアモンド形、ＡおよびＣ）における切断、あ
るいは保持時間４．４分において代謝物質を発生させる
ために（ＢおよびＤにおいて）を示す。
【図２７】アプロチニンセファローズ上の可溶化Ｐ−２
分画の精製を示す。実験は実施例１に従い実施した。
（Ａ）は典型的な２８０ｎｍの溶離のプロフィルを示す
図である。
【図２８】アプロチニンセファローズ上の可溶化Ｐ−２
分画の精製を示す。実験は実施例１に従い実施した。
（Ｂ）は溶離した分画の中でＡＰＰプロセシング活性に
ついてのイムノブロットアッセイ（ＡＰＰのＣ末端のド
メインに対するウサギ抗体）分析結果を示すゲル電気泳
動図に代わる写真である。矢印は主なＡＰＰ分解生成物
の移動を示す。注、酸性溶離から分画８〜１３の中の破
壊生成物の出現。
【図２９】モノ−Ｑ上のＰ−２誘導アプロチニン結合性
プロテアーゼの精製の溶離プロフィル（２８０ｎｍ検
出）を示す図である。
【図３０】モノ−Ｑ上のＰ−２誘導アプロチニン結合性
プロテアーゼの精製を示す：溶離プロフィルと各分画の
イムノブロット分析結果を示すゲル電気泳動図に代わる
写真である。 （ａ）２８０ｎｍの溶離のプロフィル、（ｂ）検出のた
めにウサギ抗Ｃ末端のＡＰＰの抗血清（１／１０００希
釈）を使用する溶離された分画の活性、および（ｃ）分
画のためにＭａｂ２８６．８Ａ（１．６ｍｇ／ｍｌの純
粋なＩｇＧの１／１００希釈）を使用して溶離された分
画の活性。３つの矢印は１１．１４および１８ｋＤのの
Ｃ末端のＡＰＰの分解生成物の移動を示す。
【図３１】プールＹのセリンプロテアーゼにより触媒さ
れるＡＰＰの分解のｐＨおよびイオン強度依存性を示す
各試料のイムノブロット分析結果を示すゲル電気泳動図
に代わる写真である。パネル（ａ）はｐＨ依存性を示
す。反応は３７℃において次のｔ＝０の成分濃度を達成
して開始した：示したｐＨ値に調節した酢酸塩、Ｍｅｓ
およびトリスの各々の中の３２ｍＭからなるカクテル緩
衝液中の、プールＹのプロテアーゼ（図２６からの５μ
ｌの分画）、ＡＰＰ（３８ｎＭ）。反応混合物（１６μ
ｌ）を７．５μｌの３×試料緩衝液の添加により２時間
後に停止させた。イムノブロットは本質的に実施例８に
記載するように、ＡＰＰのＣ末端ドメインに対するウサ
ギポリクローナル抗血清を使用して現像シた。レーン１
およびレーン１２は前染色したマーカーを含有した。レ
ーン９はＣ−１００を含有し、そしてレーン１０および
レーン１１はプールＹの不存在下にｐＨ６．５におい
て、それぞれ、０および３時間インキュベーションした
ＡＰＰを含有した。パネル（ｂ）はイオン強度の依存性
を示す。反応は本質的に（ａ）に記載するように実施し
たが、ただし緩衝液は示したモル濃度の塩化ナトリウム
を含有する９５ｍＭのＭｅｓ ｐＨ６．５であった。プ
ールＹの不存在（レーン２〜７）または存在（レーン９
〜１４）におけるＡＰＰの切断を塩化ナトリウムの各濃
度について示す。レーン１および８は、それぞれ、Ｍｒ
マーカーおよびＣ−１００の標準を含有する。矢印は１
１、１４および１８ｋＤａのＡＰＰ断片の移動を示す。
【図３２】プールＹのプロテアーゼのインヒビターの選
択性を描写する各試料のイムノブロット分析結果を示す
ゲル電気泳動図に代わる写真である。反応を３７℃にお
いて酵素の添加により開始して、次の初期成分濃度を達
成した：３０ｍＭのＭｅｓ緩衝液ｐＨ６．５中の、スー
パーデックス７５カラムにより精製後のプールＹ＃３〜
５（１４μｇ／ｍｌ）、ＡＰＰ（３５ｎＭ）。反応は
７．５μｌの３×試料緩衝液の添加により停止させた。
実施例８に従いＡＰＰのＣ末端ドメインに対するウサギ
抗血清を使用して、イムノブロットを現像した。次のイ
ンヒビターの効果についてのデータを示す：パネル
（ａ）メタノール中の８６０μＭのＰＭＳＦ（レーン
４）、メタノール中の４００μＭのペプスタチン（レー
ン６）、５ｍＭのベンズアミジン（レーン８）、３５０
μＭのＥ−６４（レーン９）、７．７ｍＭのＥＤＴＡ
（レーン１０）、１５μＭのアプロチニン（レーン１
１）、および０．１％（ｖ／ｖ）のデオキシコレート
（レーン１５）。次の対照をまた実験した：インヒビタ
ーなし（レーン１２）、エタノール（レーン３）、メタ
ノール（レーン５）、プールＹのみ（レーン２）、時間
０におけるＡＰＰのみ（レーン１３）および４時間にお
けるＡＰＰのみ（レーン１４）。レーン１およびレーン
７は、それぞれ、前染色したＭｒマーカーおよびＣ−１
００の標準を示す。パネル（ｂ）１．８μＭのアルファ
−１−抗キモトリプシン（レーン２）、１５６μＭのＴ
ＬＣＫ（レーン３）、４６μＭのキモトリプシンインヒ
ビターＩ（レーン４）、１１９μＭのキモトリプシンイ
ンヒビターＩＩ（レーン５）、４μＭのアルファ−２−
抗プラスミン（レーン６）、アルファ−１−抗トリプシ
ン（レーン７）、ＤＭＳＯ（レーン１１）、およびメタ
ノール（レーン１３）。前染色した分子量マーカーおよ
びＣ−１００の標準を、それぞれ、レーン１およびレー
ン９に適用した。４および２時間のインキュベーション
を、それぞれ、パネルａ）およびｂ）において使用し
た。矢印は１１、１４および１４ｋＤのＡＰＰの分解生
成物の移動を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１９】
【図２２】
【図１７】
【図１８】
【図２０】
【図２１】
【図２３】
【図２６】
【図２７】
【図２４】
【図２９】
【図２５】
【図２８】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｚ Ｇ０１Ｎ 21/78 33/53 Ｄ 33/53 Ｙ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アルツハイマー病のベータ−アミロイド
    タンパク質に対する前駆体に対して特異的な少なくとも
    １種のプロテアーゼのインヒビターでベータ−アミロイ
    ドのタンパク質の形成を調節する方法。
  2. 【請求項２】 治療量のインヒビターをカテプシンＤに
    投与することからなる、アルツハイマー病におけるアミ
    ロイドのプラークの形成を防止する方法。
  3. 【請求項３】 ａ）カテプシンＤをカテプシンＤにより
    切断可能なペプチド基質と、カテプシンＤが触媒的に活
    性である条件下に、インキュベーションして第１インキ
    ュベーション物を形成し、 ｂ）カテプシンＤをカテプシンＤにより切断可能なペプ
    チド基質と潜在的なインヒビターの存在下にインキュベ
    ーションして、第２インキュベーション物を形成し、 ｃ）ある時間にわたって形成したペプチド生成物の量を
    分析して、前記第１インキュベーション物および前記第
    ２インキュベーション物における生成物の形成割合を計
    算し、そして ｄ）前記潜在的なインヒビターの存在下に観察された酵
    素活性の減少を計算し、前記減少は阻害活性を示す、こ
    とを特徴とするカテプシンＤのインヒビターを同定する
    方法。
  4. 【請求項４】 ａ）ヒトから得られた生理学的試料をア
    ミロイド前駆体タンパク質基質の存在下にインキュベー
    ションし、前記インキュベーションは前記試料中のアミ
    ロイド前駆体タンパク質分解プロテアーゼが触媒的に活
    性である条件下に実施し、 ｂ）工程（ａ）の停止したインキュベーション混合物の
    一部分を有するゲルを形成し、 ｃ）工程（ｂ）のゲルを電気泳動させて別々のポリペプ
    チドの構成成分を表す電気泳動の移動のパターンを得、 ｄ）工程（ｃ）の前記構成成分を膜上にブロットし、 ｅ）工程（ｄ）からの前記ブロットした膜を抗アミロイ
    ド前駆体タンパク質抗体と接触させ、 ｆ）前記抗アミロイド前駆体タンパク質抗体を認識する
    第２抗体と前記ブロットした膜を反応させ、前記第２抗
    体は検出可能なリガンドにカップリングされており、そ
    して ｇ）ベータ−アミロイドのペプチド配列を含有するため
    に十分な大きさの断片に相当する領域におけるブロット
    の染色強度を検査する、ことを特徴とするアミロイド前
    駆体タンパク質を分解することができる分子のタンパク
    質分解活性を測定する方法。
  5. 【請求項５】 ａ）ヒトから得られた生理学的試料の一
    部分および選択したアミロイド前駆体タンパク質基質を
    有する第１インキュベーション物を形成し、そしてヒト
    から得られた前記生理学的試料の第２部分、前記選択し
    たアミロイド前駆体タンパク質基質および被検インヒビ
    ターを有する第２インキュベーション物を形成し、 ｂ）前以て決定した期間後工程（ａ）におけるインキュ
    ベーションを停止し、 ｃ）工程（ｂ）の停止したインキュベーション混合物の
    一部分を有するゲルを形成し、 ｄ）工程（ｃ）のゲルを電気泳動させて別々のポリペプ
    チドの構成成分を表す電気泳動の移動のパターンを得、 ｅ）工程（ｄ）の前記構成成分を膜上にブロットし、 ｆ）工程（ｅ）からの前記膜を抗アミロイド前駆体タン
    パク質抗体と接触させ、 ｇ）前記抗アミロイド前駆体タンパク質抗体を認識する
    第２抗体と前記ブロットした膜を反応させ、前記第２抗
    体は検出可能なマーカーにカップリングされており、 ｈ）ベータ−アミロイドのペプチド配列を含有するため
    に十分な大きさの断片に相当する領域におけるブロット
    の染色強度を検査し、そして ｉ）前記第１インキュベーション物および前記第２イン
    キュベーション物から観測された同一大きさのバンドの
    強度を比較する、ことを特徴とするアミロイド前駆体タ
    ンパク質に対して特異的なプロテアーゼのインヒビター
    を同定する方法。
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