JPH08269088A

JPH08269088A - 新規ペプチド及びその利用

Info

Publication number: JPH08269088A
Application number: JP7070156A
Authority: JP
Inventors: Hisatoshi Ito; 敞敏伊藤; Tadao Saito; 忠夫斎藤; Yutaka Wakao; 豊若生; Toshiaki Uchida; 俊昭内田; Kiyoshi Tatsumi; 清巽
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1995-03-28
Publication date: 1996-10-15
Anticipated expiration: 2019-09-15
Also published as: JP3567012B2

Abstract

(57)【要約】【目的】アンジオテンシン転換酵素阻害活性を有する
ペプチドを提供する。【構成】 κカゼイングリコマクロペプチドのアミノ酸
配列20〜25残基に相当する下記の配列（Ｉ）を有するペ
プチド。 Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro （Ｉ）【効果】このペプチドは、アンジオテンシン転換酵素
（ＡＣＥ）阻害活性を有し、血圧降下作用を有するの
で、ＡＣＥ阻害剤や血圧降下剤の有効成分として有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なペプチドに関す
る。また、本発明は、この新規なペプチドを活性成分と
して含有するアンジオテンシン転換酵素阻害剤に関す
る。さらに、本発明は、この新規なペプチドを活性成分
として含有する血圧降下剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）
は、血圧の調節においてレニン−アンジオテンシン系に
作用する酵素である。分子量約57,000のアンジオテンシ
ノーゲンは、腎臓から血管中に移行するレニンによりア
ンジオテンシンＩに変換される。このアンジオテンシン
Ｉは、殆ど血管収縮作用を示さない不活性型であるが、
ＡＣＥにより活性型のアンジオテンシンIIに変換され
る。このアンジオテンシンIIについては、動脈末梢毛細
血管の収縮作用[Furchgott,R. et al., J.PharmacolEx
p.Ther., vol.108, p.129, 1953]、血管透過性増大[Gim
brone,M.A. and Alexander,R.W., Science, vol.189,
p.219, 1975] 、交感神経におけるアドレナリン作動性
の神経伝達促進[Bell,C., Circ.Res., vol.31, p.348,
1972] 、副腎髄質からのカテコールアミンの放出促進作
用及び副腎皮質からのアルドステロンの分泌促進[Biro
n,P. et al., J.Clin.Invest, vol.44, p.1171, 1965]
などの作用が知られており、循環血流量の増加をもたら
し、血圧が上昇する。また、血管拡張作用により血圧降
下作用を示すブラジキニンは、ＡＣＥにより分解される
ため、結果的に血圧が上昇する。一方、ＡＣＥ阻害物質
は、上述したＡＣＥの作用を阻害するので、有効な血圧
降下作用を有し、血圧降下剤の有効成分として有用であ
ることが知られている。

【０００３】近年、成人病の増加や高齢化による疾患の
増加により、上述したような血圧降下作用を有する物質
が脚光を浴びており、医薬として提供されるに至ってい
るものもある。しかし、高血圧に関連する疾病は食事に
よる影響が強いと言われており、高血圧の予防効果を有
する物質としては、食品素材への利用性を有するものに
対して大きな期待が持たれる。

【０００４】そして、食品に含まれているＡＣＥ阻害物
質としては、イワシ筋肉由来のたんぱく質分解ペプチド
（日本水産製) 、オキアミからイオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及び逆層クロマト
グラフィーにより単離したＡＣＥ阻害物質 [河村幸雄
ら，微量栄養素研究, vol.7, p.37, 1990]、トウモロコ
シたんぱく質由来のオリゴペプチド [特開平2-240027号
公報] などが知られている。

【０００５】さらに、乳たんぱく質カゼイン由来の分解
物中にＡＣＥ阻害物質が多く存在することが知られてい
る。すなわち、ヒトβカゼインのアミノ酸配列39〜52残
基のペプチド[Kohmura,M. et al., Agric.Biol.Chem.,
vol.53, p.2107, 1989] 、ヒトκカゼインのアミノ酸配
列43〜52残基のペプチド[Kohmura,M. et al., Agric.Bi
ol.Chem., vol.54, p.835, 1990]、ウシα_S1カゼインの
アミノ酸配列23〜34残基及び 194〜199 残基のペプチド
[Maruyama,S. et al., Agric.Biol.Chem., vol.51, p.2
557, 1987]、ウシβカゼインのアミノ酸配列 177〜183
残基のペプチド[Maruyama,S., Agric.Biol.Chem., vol.
51, p.1581, 1987] 、カソキシンＣと称するウシκカゼ
インのアミノ酸配列25〜34残基のペプチド [戸塚護及び
上野川修一, 日本畜産学会報, vol.63, p.867, 1992]な
どである。また、ウシカゼインをたんぱく質分解酵素で
加水分解して得られるＡＣＥ阻害物質含有組成物とし
て、ウシαカゼイン又はウシβカゼインの酵素分解物が
高血圧の予防に有効であることが開示されている [特開
平2-167052号公報] 。あるいは、ウシκカゼインのキモ
シン分解により生成するアミノ酸配列 106残基以後のペ
プチドであるウシκカゼイングリコマクロペプチドが血
圧の上昇抑制効果を有することが開示されている [特開
平6-345664号公報] 。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、食品素
材として利用可能なＡＣＥ阻害活性を有する物質を見出
すべく、鋭意研究を進めていたところ、チーズホエー中
などに含まれているウシκカゼイングリコマクロペプチ
ドのプロテアーゼ分解物中にＡＣＥ阻害活性を有する新
規なペプチドを見出した。そして、動物実験を行ったと
ころ、このペプチドが血圧を降下する作用を有すること
を見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本
発明は、ＡＣＥ阻害活性を有する新規なペプチドを提供
することを課題とする。また、本発明は、このペプチド
を活性成分として含有するＡＣＥ阻害剤を提供すること
を課題とする。さらに、本発明は、このペプチドを活性
成分として含有する血圧降下剤を提供することを課題と
する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、食品素材
として利用可能なＡＣＥ阻害活性を有する物質を見出す
べく、甘性チーズホエーから得られるκカゼイングリコ
マクロペプチドについてもＡＣＥ阻害活性を調べたとこ
ろ、κカゼイングリコマクロペプチドのたんぱく質分解
酵素消化物中にＡＣＥ阻害活性を有する画分を見出し
た。そして、このＡＣＥ阻害活性を有する画分の活性本
体を単離同定したところ、下記のアミノ酸配列（Ｉ）を
有するペプチドであることが判明した。 Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro （Ｉ）

【０００８】このペプチドのアミノ酸配列は、κカゼイ
ングリコマクロペプチドのアミノ酸配列20〜25残基に相
当し、κカゼインのアミノ酸配列 125〜130 残基に相当
するペプチドであった。

【０００９】さらに、下記のアミノ酸配列（Ｉ）を有す
るペプチドが、血圧降下作用を有することも確認した。 Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro （Ｉ）

【００１０】本発明のペプチドを食品、化粧品、飼料あ
るいは医薬品に使用する場合には、精製品を用いても良
いが、純度が低くても本発明のペプチドはＡＣＥ阻害活
性が強いため、これらのペプチドを含む粗画分を用いて
も良いし、κカゼイングリコマクロペプチドのペプシン
又はパパイン消化物をそのまま用いることもできる。ま
た、化学合成により得られたものも用いることもでき
る。なお、ペプチドの化学合成法としては通常使用され
ている固相法などを用いることにより、例えば、アプラ
イドバイオシステムズ社のペプチド合成機などで簡単に
ペプチドを合成することができる。さらに、本発明のペ
プチドのアミノ酸配列に相当する塩基配列を用いてＤＮ
Ａを合成し、遺伝子操作により本発明のペプチドを製造
することもできる。既に、ウシκカゼインの塩基配列は
公知である[Alexander,L.J. et al., Eur.J.Biochem.,
vol.178, p.395, 1988] 。したがって、遺伝子操作によ
り本発明のペプチドを製造する際に使用する塩基配列と
しては、ATT GCT AGT GGT GAG CCT が適当である。

【００１１】次に、特に利用性の高い本発明のペプチド
の製造法を説明する。原料として有用であるκカゼイン
グリコマクロペプチドを得る方法としては、例えば、チ
ーズホエーパウダーを溶解し、加熱した後、冷却し、エ
タノール沈澱して得られる上清を陰イオン交換樹脂によ
り分画する方法[Saito.T. et al., J.Dairy Sci., vol.
74, p.2831, 1991] 、レンネットカゼインカードを調製
する際に得られる排液を原料とし、この排液のpHを酸性
領域に調製して生成する沈澱を除去し、次いで得られる
上澄を脱塩する方法 [特開昭 63-284199号公報] 、κカ
ゼイングリコマクロペプチドを含有する乳質原料物質を
pH４未満に調整した後、分画分子量10,000〜50,000の膜
を用い、限外濾過処理をして透過液を分画分子量50,000
以下の膜を用いて濃縮する方法 [特開平2-276542号公
報] 、ホエー蛋白含有溶液を加熱した後、凍結して凍結
物を得、更に該凍結物を解凍した後、ホエー蛋白と上清
とを分離し、この上清を処理して上清を回収する方法
[特開平3-294299号公報] などにより、κカゼイングリ
コマクロペプチドを製造することが可能であるが、ここ
では、いかなる方法で得られたκカゼイングリコマクロ
ペプチドであっても良い。

【００１２】このκカゼイングリコマクロペプチドをた
んぱく質分解酵素で加水分解する。使用するたんぱく質
分解酵素としては、ペプシンが好ましいが、パパインも
使用可能である。また、酸加水分解により本発明のペプ
チドを調製することも可能である。なお、ペプシンを使
用する場合、κカゼイングリコマクロペプチドに対しペ
プシンを重量比1/10〜1/10000 の割合で添加すれば良
い。酵素反応は通常30〜40℃で行うが、酵素活性が認め
られる温度域であれば構わない。酵素反応に適したpH領
域は１〜５が好ましいが、pH４以上では反応にかなり時
間を要するので、より好ましくはpH１〜４である。酵素
反応に使用する緩衝液としてはクエン酸緩衝液、酢酸緩
衝液、塩化カリウム−塩酸緩衝液、（グリシン＋食塩）
−塩酸緩衝液などを例示することができ、簡便的に塩酸
溶液などの酸溶液でpHを調整して使用することもでき
る。反応時間は10分間以上であり、好ましくは１〜48時
間である。反応時間が10分間未満ではＡＣＥ阻害活性が
20％以下であり、48時間を越えるとＡＣＥ阻害活性は60
％程度残存するが、反応時間が長くなると微生物汚染の
問題やペプシン活性の低下などが起こり好ましくない。
また、場合によっては反応途中でペプシンを再添加する
こともできる。酵素反応の停止は、 100℃で５分間加熱
して酵素を失活させることが簡便で良いが、冷アセトン
を添加して濾別する処理や水酸化ナトリウムなどの塩基
性物質でpHを 7.0に調整する処理を行っても良い。得ら
れた溶液は必要に応じて濾過して沈澱を除去し、必要に
応じてさらに減圧濃縮乾固、凍結乾燥又は噴霧乾燥を行
う。また、逆浸透膜、電気透析膜、薄膜下降式濃縮など
により濃縮した後、乾燥粉末としても良い。このように
して得られた本発明のペプチドを含む粗画分は、10〜 1
00μg/mlのオーダーでＡＣＥ阻害活性を示し、食品素材
などとして充分に使用可能である。なお、急性毒性試験
を行ったところ、本発明のペプチドは、経口で１g/kg以
上を示し、安全性の高いものであることが判明した。

【００１３】本発明のペプチドの使用形態については特
に制限がなく、溶液、粉、顆粒、錠剤などとして使用で
き、各種飲食品、化粧品、飼料に添加でき、医薬品の原
料として使用できる。本発明のペプチドは乳中より生成
したものであるため、安全に使用することができる。ま
た、本発明のペプチドの投与量は 150μg/kg/ 日以上が
好ましい。投与量が 150μg/kg/ 日以下では血圧降下作
用が弱くなる。

【００１４】

【参考例１】チーズホエーパウダー150gに12％(w/v) 濃
度となるようトリクロロ酢酸溶液を加え、４℃で１時間
振とう抽出した後、遠心分離(9,000×ｇ、15分間) し、
上清を回収して氷冷した。この上清を1N水酸化ナトリウ
ムで中和し、透析膜(ViskaseSales Corp.製) で蒸留水
に対して透析した後、遠心分離(9,000×ｇ、15分間)
し、上清を回収して凍結乾燥した。このようにして、純
度81％のκカゼイングリコマクロペプチド7gを得た。

【００１５】

【試験例１】参考例１で調製したκカゼイングリコマク
ロペプチドについて、５種類のたんぱく質分解酵素を用
い消化試験を行った。なお、酵素と緩衝液の組合せは以
下の通りである。（１）プロティナーゼＫ（シグマ製）と0.01M トリス−
塩酸緩衝液(pH 7.5) （２）アクチナーゼＥ（ナカライテスク製）と20mM塩化
カルシウム含有0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH 7.4) （３）ペプシン（シグマ製）と0.2Mクエン酸緩衝液(pH
3.0) （４）トリプシン（シグマ製）と20mM塩化カルシウム含
有0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH 8.0) （５）パパイン（シグマ製）と3.3mg シアン化ナトリウ
ム及び3.3mg ＥＤＴＡ含有0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.0)

【００１６】各緩衝液10mlにκカゼイングリコマクロペ
プチドを1mg/mlの濃度となるよう溶解し、５％(w/w) 濃
度の酵素を添加して充分に撹拌した。各試料は少量のト
ルエン共存下、37℃で24時間静置して酵素消化した。そ
の後、反応液に３倍量の冷アセトンを加え、−20℃で１
時間放置した後、溶液を濾過し、凍結乾燥して試験試料
とした。そして、各試験試料１mgを 200μl の蒸留水に
溶解した後、この試験試料溶液15μl を蒸留水で 150μ
l に希釈してＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を表
１に示す。

【００１７】

【表１】 ─────────────────────────── 酵素ＡＣＥ阻害活性 ─────────────────────────── プロティナーゼＫ 0 （％）アクチナーゼＥ 0 ペプシン 97 トリプシン 0 パパイン 5 κカゼイングリコマクロペプチド 0 ───────────────────────────

【００１８】なお、ＡＣＥ阻害活性の測定は、以下のよ
うに行った。まず、ＡＣＥ（うさぎ肺由来、和光純薬工
業製）１ユニットを50％グリセロール溶液２mlに溶解し
てＡＣＥ酵素溶液（Ａ）を調製した。また、馬尿酸−ヒ
スチジルロイシン53.688mgを1M食塩含有ホウ酸緩衝液(p
H 7.8)10mlに溶解した後、水酸化ナトリウム水溶液でpH
8.3に調整した基質溶液（Ｂ）を調製した。

【００１９】中型のネジ付き試験管に被験液 150μl 、
基質溶液（Ｂ） 100μl 及びＡＣＥ酵素溶液（Ａ）10μ
l を添加し、37℃で60分間反応させた後、反応を停止さ
せるために各試験管に酢酸エチル 1.5mlをガラス製ピペ
ットで加え、キャップをしてからボルテックスミキサー
で15秒振とうすることにより抽出した。抽出後、1,000r
pm、５分間遠心分離して得られた上層（酢酸エチル）部
を他の小型ネジ付き試験管に移し、80℃、窒素ガス噴霧
下で酢酸エチルを蒸発乾固させた。この蒸発乾固させた
試料を80℃、10分間処理し、室温に戻した後、 0.9％食
塩溶液 3.0mlを加え、15秒間ボルテックスミキサーで振
とうして溶解し、直ちに 228nmの紫外部吸光度を測定し
た。そして、以下の式によりＡＣＥ阻害活性を算出し
た。ＡＣＥ阻害活性（％）＝｛（Ｅ_C−Ｅ_S）／（Ｅ_C−Ｅ
_B）｝×100 Ｅ_S: 被験液 150μl を添加した試料の吸光度Ｅ_C: 被験液の代わりに蒸留水 150μl を添加したコン
トロールの吸光度Ｅ_B: 被験液の代わりに蒸留水 150μl を添加し、反応
開始直後に反応を停止させた試料の吸光度

【００２０】表１に示したように、各種たんぱく質分解
酵素消化物のＡＣＥ阻害活性は、ペプシンで最も強く、
パパインでもわずかに認められた。そこで、ペプシン消
化物中のＡＣＥ阻害活性を有する物質を探索した。

【００２１】

【参考例２】1mg/ml濃度となるようκカゼイングリコマ
クロペプチドを0.1N塩酸に溶解した溶液10mlに５％(w/
w) 濃度のペプシンを添加し、37℃で24時間静置して消
化した後、 100℃で正確に５分間加熱して酵素反応を停
止した。そして、この反応液を濾過し、凍結乾燥してκ
カゼイングリコマクロペプチドのペプシン消化物を得、
これを試料とした。

【００２２】ブチルトヨパール（東ソー製) 10mlを90％
メタノールで洗浄した後、蒸留水で洗浄し、カラム(1.7
×12cm) に充填した。次に、上述の試料を10mg/5ml濃度
となるよう蒸留水に溶解し、カラムに添加した。そし
て、カラムに蒸留水 200mlを流した後、10％刻みで調製
した10％〜 100％濃度のメタノール溶液各 100mlで段階
溶出した。この各溶出画分について、画分中のメタノー
ルを減圧濃縮し、凍結乾燥した後、試験例１に示した方
法と同様の方法によりＡＣＥ阻害活性を測定したとこ
ろ、非吸着画分に70％のＡＣＥ阻害活性が認められた。
そこで、この非吸着画分をさらに精製した。

【００２３】

【参考例３】参考例２で得られた非吸着画分を９mg/5ml
濃度となるよう蒸留水に溶解したものを試料とした。リ
クロプレップRP18 (メルク製)10gを90％メタノールで洗
浄した後、蒸留水で洗浄し、カラム(1.7×12cm) に充填
した。次に、上述の試料をカラムに添加し、蒸留水 200
mlを流した後、10％刻みで調製した10％〜 100％濃度の
メタノール溶液各 100mlで段階溶出した。この各溶出画
分について、画分中のメタノールを減圧濃縮し、凍結乾
燥した後、試験例１に示した方法と同様の方法によりＡ
ＣＥ阻害活性を測定したところ、10％〜20％濃度のメタ
ノール溶出画分に90％以上の強いＡＣＥ阻害活性が認め
られた。また、30％〜60％濃度のメタノール溶出画分に
も50％〜15％のＡＣＥ阻害活性が認められた。そこで、
10％〜60％濃度のメタノール溶出画分を回収し、ＡＣＥ
阻害活性粗画分とした。

【００２４】

【参考例４】参考例３で得られたＡＣＥ活性粗画分を７
mg/5ml濃度となるよう蒸留水に溶解し、リクロプレップ
RP18 (メルク製) によるリクロマトグラフィーを行っ
た。そして、５％、10％、12％、14％、16％、18％、20
％、30％及び90％濃度のメタノール溶液で段階溶出し
た。この各溶出画分について、画分中のメタノールを減
圧濃縮し、凍結乾燥した後、試験例１に示した方法と同
様の方法によりＡＣＥ阻害活性を測定したところ、５％
濃度のメタノール溶出画分、10％濃度のメタノール溶出
画分及び12％濃度のメタノール溶出画分に強いＡＣＥ阻
害活性が認められた。そこで、これらの画分についてさ
らに精製した。

【００２５】

【参考例５】参考例４で得られた活性画分について、OD
P-50 (アサヒパック製、 7.6×250mm)を用いたＨＰＬＣ
で精製した。カラムは、0.05％トリフルオロ酢酸含有10
％アセトニトリル水溶液（Ａ）で平衡化し、溶離液
（Ｂ）として、0.05％トリフルオロ酢酸含有60％アセト
ニトリル水溶液を用い、30分間で溶離液（Ｂ）のアセト
ニトリルが50％となるようにグラジュエント溶出した。
なお、流速は 0.5ml/minで行った。その結果、リテンシ
ョンタイムで10分〜18分までの画分に強いＡＣＥ阻害活
性が認められたので、この画分を回収し、さらに精製し
た。

【００２６】

【参考例６】参考例５で得られた活性画分について、ス
ペリオレックスODS(資生堂製、 4.6×150mm)を用いたＨ
ＰＬＣで精製した。カラムは、0.05％トリフルオロ酢酸
水溶液（Ａ）でカラムを平衡化し、溶離液（Ｂ）とし
て、0.05％トリフルオロ酢酸含有60％アセトニトリル水
溶液を用い、溶離液（Ｂ）のアセトニトリルが50％とな
るようにグラジュエント溶出した。なお、流速は 0.5ml
/minで行った。その結果、図１に示すように単一ピーク
が認められ、これを分取してアミノ酸配列を決定した。

【００２７】

【参考例７】参考例６で得られた単一ピークについて、
アミノ酸配列を決定するために、アミノ酸シークエンサ
ー（473A型、アプライドバイオシステムズ製）を使用
し、試料１μg をPVDF膜にドットブロットして分析し
た。その結果、ＡＣＥ阻害活性を有する物質の本体は、
下記のアミノ酸配列を有するペプチドであることが判明
した。 Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro

【００２８】

【参考例８】参考例７でアミノ酸配列を確認したペプチ
ドのＡＣＥ阻害活性を確認するために、ペプチドを合成
した。ペプチドの化学合成は、ペプチドシンセサイザー
(430A型、アプライドバイオシステムズ製) を用い、ｔ
−Ｍｏｃ法で行った。すなわち、 0.5mmolのＢｏｃ−ｌ
−Ｃｌｎ−Ｏ−ＣＨ₂ −ＰＡＭ樹脂及び２mmolの構成ア
ミノ酸をペプチドシンセサイザーに充填して合成を行
い、目的のペプチドを結合した樹脂を得た。この樹脂1.
5gに結合しているペプチドをチオアニソール及びエタン
ジチオール存在下、トリフルオロメタンスルホン酸によ
り切り出し、ジエチルエーテルで沈澱させた後、10％酢
酸で溶解し、同じく10％酢酸で置換した強塩基性陰イオ
ン交換樹脂(Bio-Rex MSZ 1-X8)に通して精製し、ペプチ
ド 140mgを得た。このペプチドをさらにAquapac RP-300
(アプライドバイオシステムズ製)による逆相ＨＰＬＣ
で、溶出液として 0.1％トリフルオロ酢酸／水及び 0.1
％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルを用い精製し、ペ
プチド白色粉末30mgを得た。そして、試験例１に示した
方法と同様の方法によりＡＣＥ阻害活性を測定した。そ
の結果を表２に示す。なお、参考例６で精製したペプチ
ドについてもＡＣＥ阻害活性を測定した。

【００２９】

【表２】 ────────────────────────────────── ＡＣＥ阻害活性 ────────────────────────────────── Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro のペプチド (参考例６） 100（％） Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro のペプチド（参考例７） 97 ──────────────────────────────────

【００３０】

【試験例２】下記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチ
ドの血圧改善効果について、確認した。 Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro （Ｉ）４週令の高血圧を自然発症するSHR/NCriラット（日本チ
ャールズリバーより購入）を下記に示したような群に分
け、動物実験を行った。Ａ群：アミノ酸配列（Ｉ）ペプチドを 300μg/日投与Ｂ群：アミノ酸配列（Ｉ）ペプチドを30μg/日投与Ｃ群：アミノ酸配列（Ｉ）ペプチドを３μg/日投与Ｄ群：ペプチド未投与

【００３１】１群５匹とし、カゼインを含まないＣＥ−
２（クレア製）を飼料として６週間飼育した。各試験試
料は１日２回、強制投与し、飲料水は自由摂取とした。
そして、６週間後の血圧を測定した。その結果を表３に
示す。

【００３２】

【表３】数値は、平均値±標準偏差で示した。Ａ群及びＢ群にお
いて、有意に血圧低下作用が認められた。

【００３３】

【実施例１】特開平2-276542号公報に記載された方法に
従い、ホエーたんぱく質濃縮物（ＷＰＣ）１kgからκカ
ゼイングリコマクロペプチド 50gを得た。このκカゼイ
ングリコマクロペプチド50g を水1,250gに溶解し、塩酸
でpHを 1.5に調整した後、ペプシン (シグマ製) 0.5gを
添加し、37℃で15時間酵素反応を行った。酵素反応の停
止は 100℃で５分間の加熱処理により行い、濾紙（アド
バンテック製) で濾過した後、凍結乾燥してκカゼイン
グリコマクロペプチドのペプシン消化物 37gを得た。次
に、この消化物37g を蒸留水1,850gに溶解し、蒸留水で
平衡化したバイオシルC18HL(バイオラッド製)5kgを充填
したカラム (20cm×20cm) に添加し、蒸留水でカラムを
洗浄した後、60％メタノール水溶液で溶出した。そし
て、この溶出画分を減圧濃縮し、凍結乾燥して活性画分
12gを得た。さらに、この活性画分300mgを0.1 ％トリ
フルオロ酢酸含有２％アセトニトリル水溶液１mlに溶解
し、0.1％トリフルオロ酢酸含有２％アセトニトリル水
溶液で平衡化したTSKgel ODS-120T カラム (55mm×60c
m、東ソー製) に添加し、 0.1％トリフルオロ酢酸含有5
0％アセトニトリル水溶液でグラジュエント溶出した。
そして、ＡＣＥ阻害活性が認められたアセトニトリル濃
度10％付近の単一ピークを分取した。この操作を繰り返
して分取した画分を遠心乾燥機で濃縮し、凍結乾燥して
ペプチド1.8gを得た。

【００３４】そして、スーペリオレックスODS (4.6mm×
150mm 、資生堂製) で確認したところ、このペプチドの
純度は93％であった。また、アミノ酸シークエンサーで
アミノ酸分析を行ったところ、このペプチドは下記のア
ミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチドであった。 Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro （Ｉ）本発明者らは、上記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプ
チドをκカゼイノシンと命名した。

【００３５】

【実施例２】0.5mmolのＢｏｃ−ｌ−Ｃｌｎ−Ｏ−ＣＨ₂
−ＰＡＭ樹脂及び２mmolの構成アミノ酸をペプチドシ
ンセサイザー (430A型、アプライドバイオシステムズ
製) に充填して合成を行い、目的のペプチドを結合した
樹脂を得た。この樹脂1.5gに結合しているペプチドをチ
オアニソール及びエタンジチオール存在下、トリフルオ
ロメタンスルホン酸により切り出し、ジエチルエーテル
で沈澱させた後、10％酢酸で溶解し、同じく10％酢酸で
置換した強塩基性陰イオン交換樹脂(Bio-Rex MSZ1-X8)
に通して精製し、ペプチド 140mgを得た。このペプチド
をさらにAquapacRP-300 (アプライドバイオシステムズ
製) による逆相ＨＰＬＣで、溶出液として0.1％トリフ
ルオロ酢酸／水及び 0.1％トリフルオロ酢酸／アセトニ
トリルを用い精製し、20％アセトニトリルで溶出した画
分からペプチドの白色粉末30mgを得た。このペプチドに
ついて、アミノ酸シークエンサーでアミノ酸分析を行っ
たところ、下記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチド
であった。 Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro （Ｉ）

【００３６】

【実施例３】斉藤らの方法[J.Dairy Sci., vol.74, p.2
831, 1991]に従い、チーズホエー粉１kgからκカゼイン
グリコマクロペプチド 13gを得た。このκカゼイングリ
コマクロペプチド13g をクエン酸緩衝液(pH3.0) 0.33リ
ットルに溶解し、ペプシン (シグマ製)0.01gを添加し、
32℃で48時間酵素反応を行った。酵素反応の停止は冷ア
セトン1.95リットルを添加することにより行った後、エ
バポレータで 0.5リットルとなるまで濃縮し、凍結乾燥
して活性画分11g を得た。この活性画分について、試験
例１に示した方法と同様の方法によりＡＣＥ阻害活性を
測定したところ、 100μg/mlにＡＣＥ阻害活性が 100％
存在した。

【００３７】

【実施例４】特開平2-276542号公報に記載された方法に
従い、チーズホエー粉１kgからκカゼイングリコマクロ
ペプチド17g を得た。このκカゼイングリコマクロペプ
チド17g を0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH 7.5)65リットル
に溶解した後、パパイン (シグマ製)0.17gを添加し、37
℃で20時間酵素反応を行った。酵素反応の停止は、冷ア
セトン1.95リットルを添加することにより行った。そし
て、この反応液をエバポレーターで 0.5リットルとなる
まで濃縮し、凍結乾燥してκカゼイングリコマクロペプ
チドのパパイン消化物15g を得た。なお、このパパイン
消化物について、試験例２に示した方法でＡＣＥ阻害活
性を測定したところ、 100μg/mlにＡＣＥ阻害活性が９
％存在していた。

【００３８】

【実施例５】実施例１で得られたペプチドを配合したド
リンク剤を試作した。本発明のペプチド150mg 、ショ糖
3.2g、クエン酸53g 、クエン酸ナトリウム53g 、ビタミ
ンＢ₂0.06g 、ビタミンＣ 0.37g、葉酸0.03g 、香料6.
7g、５倍濃縮アップル果汁134g及び水3.5Kg を混合した
組成物を90℃、10秒保持して加熱殺菌した後、５〜10℃
に冷却して殺菌済容器中に貯蔵した。次いで、この混合
液を殺菌済の 350ml容器に無菌充填し、高血圧予防用ド
リンク剤を製造した。

【００３９】

【実施例６】実施例２で得られたペプチドを配合した錠
剤を試作した。本発明のペプチド20mg、乳糖33.3mg、ト
ウモロコシデンプン16.4mg、カルボキシメチルセルロー
スカルシウム12.8mg及びステアリン酸マグネシウム1.5m
g を配合し、常法に従って高血圧抑制用錠剤を製造し
た。

【００４０】

【実施例７】実施例３で得られた本発明のペプチドを含
む活性画分を配合した動物用飼料を試作した。本発明の
ペプチドを含む活性画分1g、脱脂粉乳60g 、ホエーたん
ぱく質濃縮物（ＷＰＣ）14.3g 、脂肪17.2g 、グルコー
ス5.0g、ビタミン2.5g及びミネラル2.5gを配合して動物
用飼料を製造した。

【００４１】

【実施例８】実施例１で得られたペプチドを配合した高
血圧予防用ミルクを試作した。本発明のペプチド750mg
、脱脂乳1,195g、ホエー粉263g、植物油脂119g及びビ
タミン・ミネラル類5gを配合した高血圧予防用粉ミルク
を製造した。

【００４２】

【発明の効果】本発明のペプチドは乳由来の安全性の高
いペプチドであり、注射剤、糖衣錠、タブレット、カプ
セルなどとして、あるいは、清涼飲料水、果汁飲料、発
酵飲料、ゼリー、アイスクリームなどの各種飲食品に添
加して、高血圧症治療及び予防の目的で使用できる。ま
た、化粧品に添加して、血管拡張作用を付与することも
できる。さらには、動物飼料に添加して、家畜や動物の
高血圧治療及び予防の目的で使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例６におけるＨＰＬＣの結果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプ
チド。 Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro （Ｉ）
【請求項２】下記のアミノ酸配列（Ｉ）を活性成分と
して含有するアンジオテンシン転換酵素阻害剤。 Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro （Ｉ）
【請求項３】下記のアミノ酸配列（Ｉ）を活性成分と
して含有する血圧降下剤。 Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro （Ｉ）