JPH08269A - 融合遺伝子、組換プラスミド、形質転換体および変異原性試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 変異原性物質によりＤＮＡが損傷した場合
に、その程度を発光の強度として検出する変異原性試験
法であって、微生物細胞の破砕の必要がなく、簡単な操
作で、しかも短時間で高感度に変異原性の有無が判定で
きる試験法を提案する。 【構成】 レプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク質が
結合するオペレーター（ｌｅｘＡオペレーター）および
ｒｅｃＡ遺伝子のプロモーター（ｒｅｃＡプロモータ
ー）の下流にルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ遺
伝子が結合している融合遺伝子（ｌｅｘＡオペレーター
−ｒｅｃＡプロモーター−ｌｕｘＡＢ遺伝子）を有する
組換プラスミドが導入された形質転換体を、検体を含む
培地を用いて培養した後、ルシフェラーゼの基質となる
発光素を添加して発光させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規かつ有用な融合遺
伝子、この融合遺伝子を有する組換プラスミド、この組
換プラスミドが導入された形質転換体、ならびにこの形
質転換体を用いた変異原性試験法に関する。

【０００２】

【従来の技術】変異原性物質はその多くが発ガン性物質
でもあることから、環境中の変異原性物質を測定するこ
とは安全性評価の重要な項目のひとつになりつつある。
しかし環境中には多種多様の化学物質が存在するため、
機器分析により個々の変異原性物質を分離定量すること
は不可能である。そのため細胞ＤＮＡに対する変異原性
を総括的に評価できるような、生物を使用した変異原性
試験法が必要となる。

【０００３】現在までに数多くの変異原性試験法が開発
され、様々な生物材料が使用されている。それらの中で
微生物を用いて検体の変異原性の有無を測定する変異原
性試験法は短時間・安価な材料で簡便に行えるという利
点を有しており、既にいくつかの試験法が開発・汎用さ
れている。現在世界中で最も汎用されている変異原性試
験法のひとつにエイムズテスト（Ａｍｅｓ−ｔｅｓｔ）
がある。この試験法はヒスチジン要求性サルモネラ変異
株の菌液を、検体を含む平板最少培地に塗布・培養した
ときに出現する復帰突然変異株のコロニー数から、検体
の変異原性の有無を判断するものである。しかし、この
試験法は、ヒスチジンを含んだサンプルを使用できない
ほか、培養に比較的長時間（４８時間以上）かかるとい
う問題点がある。

【０００４】上記エイムズテストの他にも、ＳＯＳクロ
モテスト（例えば、特開平５−２１１８６５号など）や
ウムテスト（ｕｍｕ−ｔｅｓｔ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒ
ｅｓ．，１４７：２１９−２２９（１９８５））などが
提案されている。これらの変異原性試験法は、「変異原
性物質を感知するＳＯＳ遺伝子」および「定量可能な酵
素をコードする遺伝子」からなる融合遺伝子を導入して
形質転換した微生物を用いた試験法であり、ＳＯＳ遺伝
子としてｓｆｉＡまたはｕｍｕＤＣ、酵素をコードする
遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃ
Ｚを使用している。そしてこれらの変異原性試験法で
は、ＳＯＳ誘発状態においてｓｆｉＡまたはｕｍｕＤＣ
の制御下で誘発されるβ−ガラクトシダーゼの活性を測
定することにより、変異原性の有無を検出している。

【０００５】これらの変異原性試験法は、ＤＮＡの損傷
を直接感知するＳＯＳ遺伝子が読まれる頻度を変異原性
の指標としているので、復帰変異コロニーをカウントす
るエイムズテストに比べて直接的、本質的である。しか
し、酵素活性の測定には、界面活性剤やトルエン等によ
る細胞破砕の操作が必要であり、また酵素の基質である
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等の
多数の試薬類が必要であるなどの問題点がある。

【０００６】さらに別な試験法として、微生物の発光を
変異原性の指標とするマイクロトックス（Ｍｉｃｒｏｔ
ｏｘ）試験法、ミュータトックス（Ｍｕｔａｔｏｘ）試
験法がある。しかし、前者は発光細菌の発光量の減少を
変異原性の指標とする試験法であり、また逆に後者は発
光能を失った発光細菌の変異株を使用して、この変異株
の発光量の増加を変異原性の指標とする試験法であり、
ＤＮＡの損傷を直接感知する遺伝子が読まれる頻度を変
異原性の指標としている本発明とは原理的に異なる。

【０００７】ところで、特表平４−５０３００３号に
は、水銀イオンにより特異的に誘発可能な遺伝子系（ｍ
ｅｒ−オペロン）と、生物発光能を付与する細菌性ルシ
フェラーゼ遺伝子（ｌｕｘＡＢ）とからなる融合遺伝子
を含むプラスミドベクターにより形質転換した微生物を
用いて、水銀を検出する方法が記載されている。この方
法では、水銀イオンにより特異的に誘発されたｍｅｒ−
オペロンによりｌｕｘＡＢが翻訳されてルシフェラーゼ
が生成され、この酵素による発光の有無または強度によ
り、水銀の検出または定量が行われる。しかし、上記公
報には、ルシフェラーゼによる発光を変異原性試験に利
用することは示唆されていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、変異
原性物質によりＤＮＡが損傷した場合に、その程度を発
光の強度として検出することができ、これにより種々の
化合物の変異原性の有無の判定に利用することができる
新規かつ有用な融合遺伝子を提供することである。本発
明の他の目的は、上記融合遺伝子を組込んだ組換プラス
ミドを提供することである。本発明の別の目的は、上記
組換プラスミドを宿主細菌に導入した形質転換体を提供
することである。本発明のさらに別の目的は、上記形質
転換体を用いて、細胞破砕の必要がなく、簡単な操作
で、しかも短時間で高感度に変異原性の有無を判定する
ことができる変異原性試験法を提案することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、次の融合遺伝
子、組換プラスミド、形質転換体および変異原性試験法
である。 （１）レプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク質が結合
するオペレーターおよびｒｅｃＡ遺伝子のプロモーター
の下流に、ルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ遺伝
子が結合していることを特徴とする融合遺伝子。 （２）レプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク質が結合
するオペレーターおよびｒｅｃＡ遺伝子のプロモーター
の下流に、ルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ遺伝
子が結合している融合遺伝子を有することを特徴とする
組換プラスミド。 （３）レプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク質が結合
するオペレーターおよびｒｅｃＡ遺伝子のプロモーター
の下流に、ルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ遺伝
子が結合している融合遺伝子を有する組換プラスミドで
あって、下記制限酵素地図（１）で表されることを特徴
とする組換プラスミドｐＭＡＳ１０。

【化２】 （地図中、ｌｅｘＡｏｐはｌｅｘＡタンパク質が結合す
るオペレーター、ｒｅｃＡｐｒはｒｅｃＡ遺伝子のプロ
モーター、ｌｕｘＡＢはｌｕｘＡＢ遺伝子、Ａｍｐはア
ンピシリン耐性遺伝子、ｐＢＲ３２２はプラスミドｐＢ
Ｒ３２２由来の塩基配列を示す。） （４）上記（２）または（３）記載の組換プラスミドが
導入されたことを特徴とする形質転換体。 （５）上記（４）記載の形質転換体を、検体を含む培地
を用いて培養した後、ルシフェラーゼの基質となる発光
素を添加して発光させることを特徴とする変異原性試験
法。

【００１０】本発明の融合遺伝子を構成するオペレータ
ーは、レプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク質が結合
する結合部位である（以下、ｌｅｘＡオペレーターまた
はｌｅｘＡｏｐという場合がある）。ｌｅｘＡオペレー
ターの塩基配列は公知であり、配列表の配列番号：１に
記載した配列の存在位置1..20がこれに相当する。

【００１１】本発明の融合遺伝子を構成するｒｅｃＡ遺
伝子のプロモーター（以下、ｒｅｃＡプロモーターまた
はｒｅｃＡｐｒという場合がある）の塩基配列は公知で
あり、配列番号：１の配列の存在位置19..25がこれに相
当する。配列番号：１に示されているように、ｒｅｃＡ
プロモーターの配列とｌｅｘＡオペレーターの配列とは
一部重複しているので、ｒｅｃＡプロモーターはレプレ
ッサーにより調節される。ｌｅｘＡオペレーターとｒｅ
ｃＡプロモーターとは必ずしも重複している必要はな
く、レプレッサーであるｌｅｘＡタンパク質によりｒｅ
ｃＡプロモーターが調節されるような位置関係にあれば
よく、例えばｒｅｃＡプロモーターの下流にｌｅｘＡオ
ペレーターが存在しているＤＮＡ断片も、本発明で使用
することができる。

【００１２】配列番号：１に記載した塩基配列は、市販
のプラスミドまたは市販の微生物の染色体ＤＮＡから、
制限酵素によりｒｅｃＡプロモーターを含む部分を切出
すことにより得ることができる。この場合、配列番号：
１に記載した塩基配列の前後に他の塩基が結合している
が、このような断片をそのままｌｅｘＡオペレーターお
よびｒｅｃＡプロモーターを含むＤＮＡ断片として使用
することができるし、酵素処理などにより前後の他の塩
基を除去したり、場合によっては別の塩基を付加したも
のを使用することができる。すなわち、本発明で使用す
るｌｅｘＡオペレーターは、配列番号：１の存在位置
1..20に示す塩基配列が必須の最小単位であり、この配
列の前後に他の塩基が結合したＤＮＡ断片もｌｅｘＡオ
ペレーターとして使用することができる。またｒｅｃＡ
プロモーターも、配列番号：１の存在位置19..25に示す
塩基配列が必須の最小単位であり、この配列の前後に他
の塩基が結合したＤＮＡ断片もｒｅｃＡプロモーターと
して使用することができる。

【００１３】配列番号：１に記載した塩基配列を得る具
体的な方法としては、例えばｐＫＨ５０２プラスミド
（ＡＴＣＣからＮｏ．３７２９３のカタログ番号で市販
されている）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切出した
２３６ｂｐの断片として得ることができる。別な方法と
しては、エセリシア コリ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣから
Ｎｏ．２３７１６のカタログ番号で市販されている）の
染色体ＤＮＡを精製した後、ＢａｍＨＩが切断して約
３．１ｋｂのＤＮＡ断片を得、この断片をＰｓｔＩで切
断した約１．２ｋｂのＤＮＡ断片として得ることができ
る。

【００１４】本発明の融合遺伝子を構成するｌｕｘＡＢ
遺伝子は、ｌｕｘＡ遺伝子の下流にｌｕｘＢ遺伝子が結
合している遺伝子である。ｌｕｘＡＢ遺伝子はルシフェ
ラーゼ酵素をコードする遺伝子であり、ｌｕｘＡ遺伝子
およびｌｕｘＢ遺伝子がそれぞれルシフェラーゼのサブ
ユニットをコードしている。ｌｕｘＡ遺伝子およびｌｕ
ｘＢ遺伝子の塩基配列は公知であり、配列番号：２の配
列の中に記載されている。すなわち配列番号：２の存在
位置137..1201がｌｕｘＡ遺伝子であり、存在位置123
1..2202がｌｕｘＢ遺伝子である。

【００１５】配列番号：２に記載したｌｕｘＡＢ遺伝子
を含むＤＮＡ断片は、市販の微生物の染色体ＤＮＡから
切出すことができる。この場合、ｌｕｘＡ遺伝子の前、
ｌｕｘＡ遺伝子とｌｕｘＢ遺伝子との間、ｌｕｘＢ遺伝
子の後に、ｌｕｘＡ遺伝子およびｌｕｘＢ遺伝子以外の
他の塩基が結合しているが、このようなＤＮＡ断片をそ
のままｌｕｘＡＢ遺伝子として使用することができる。
また酵素処理などにより他の塩基の一部または全部を除
去したり、場合によっては別の塩基を付加したものを使
用することもできる。この点はｌｅｘＡオペレータやｒ
ｅｃＡプロモーターの場合と同様である。

【００１６】配列番号：２に記載したＤＮＡ断片を得る
具体的な方法としては、例えばＡＴＣＣからＮｏ．３３
８４３のカタログ番号で市販されているビブリオ ハル
ベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）の染色体ＤＮＡ
を精製した後、ＨｉｎｄIIIで切断して約３．９ｋｂの
ＤＮＡ断片を得、この断片をＳａｌＩおよびＰｖｕIIで
切断した約２．４ｋｂのＤＮＡ断片として得ることがで
きる。

【００１７】本発明の融合遺伝子は、前記のようなｌｅ
ｘＡオペレーターおよびｒｅｃＡプロモーターの下流
に、上記のようなｌｕｘＡＢ遺伝子が結合した融合遺伝
子である。このような融合遺伝子を有する組換プラスミ
ドを宿主細菌に導入することにより、本発明の形質転換
体を得ることができる。

【００１８】このような本発明の形質転換体では、通常
はレプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク質がｌｅｘＡ
オペレーターに結合しており、ｌｕｘＡＢ遺伝子の発現
は抑制されている。ところが、変異原性物質によりＤＮ
Ａが損傷を受けてＳＯＳ誘発状態になると、ｒｅｃＡの
産生するタンパク質がｌｅｘＡオペレーターに結合して
いるレプレッサーの自己分解能（プロテアーゼ活性）を
活性化することにより、レプレッサータンパク質が自己
分解する。このようなＳＯＳ誘発状態になると、ｒｅｃ
Ａプロモーターの下流にあるｌｕｘＡＢ遺伝子の翻訳が
開始され、ルシフェラーゼが生産される。ここにルシフ
ェラーゼの基質となる発光素（ルシフェリン）を添加す
ると、発光が生じる。

【００１９】発光の強度は変異原性物質の濃度と正の相
関関係があるので、発光の強度を測定することにより、
または発光の有無により、変異原性物質の有無、または
相対的な濃度の高低を検出することができる。このよう
に、ｌｅｘＡオペレーターおよびｒｅｃＡプロモーター
は、変異原性物質を感知するセンサーとして作用し、ｌ
ｕｘＡＢ遺伝子は感知した変異原性を容易に検出可能な
光に変換する発光源として作用している。

【００２０】本発明の組換プラスミドは前記融合遺伝子
を含むものであるが、宿主細菌中でプラスミドとして存
在するためには、自律複製を可能とするＤＮＡ領域が設
けられる。またクローニング時の微生物検出用のマーカ
ーとして薬剤耐性遺伝子を設けるのが好ましく、例えば
アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺
伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性
遺伝子等が使用できる。変異原性試験に使用する形質転
換体を得る場合に好ましく利用できる組換プラスミドと
しては、前記制限酵素地図（１）で表される組換プラス
ミドｐＭＡＳ１０があげられる。

【００２１】組換プラスミドｐＭＡＳ１０は、次のよう
に得ることができる。まず、前記方法によりエセリシア
コリ Ｋ−１２株から、ｌｅｘＡオペレーターおよび
ｒｅｃＡプロモーターを含む約１．２ｋｂのＤＮＡ断片
（ＢａｍＨＩ〜ＰｓｔＩ断片）を得る。この際、この断
片は、プラスミドｐＴｒｃ９９ＡをＢａｍＨＩおよびＰ
ｓｔＩで切断した約４．２ｋｂのプラスミドに組込んで
おく。ｐＴｒｃ９９ＡはＮｏ．２７−５００７−０１の
コード番号でファルマシア社から市販されている。次に
上記１．２ｋｂのＤＮＡ断片を含むプラスミドをＰｓｔ
Ｉで切断した後、Ｔ４ポリメラーゼで切断面を平滑化
し、次にＳａｌＩリンカーをライゲーションする。これ
により約５．４ｋｂのプラスミドが得られる。

【００２２】上記操作とは別に、前記方法によりビブリ
オ ハルベイ（ＡＴＣＣ３３８４３）からｌｕｘＡＢ遺
伝子を含む約２．４ｋｂのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ〜Ｐｖ
ｕII断片）を得る。次にＰｖｕII切断末端にＳａｌＩリ
ンカーをライゲーションした後、ＳａｌＩで切断し、両
末端がＳａｌＩで切断された約２．４ｋｂのＤＮＡ断片
を得る。

【００２３】この約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を、上記約
５．４ｋｂのプラスミドをＳａｌＩで切断した後脱リン
酸化処理を行ったプラスミドと混合し、ライゲーション
する。この操作により、本発明の融合遺伝子が作成され
る。ここで得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＨｉ
ｎｄIII（ＨｉｎｄIIIの切断点がＳａｌＩ切断点のすぐ
近くにある）で切断することにより、本発明の約３．６
ｋｂの融合遺伝子が得られる。

【００２４】上記により得られる約３．６ｋｂの融合遺
伝子を、ｐＢＲ３２２プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩで切断したプラスミドと混合することにより、
目的とする組換プラスミドｐＭＡＳ１０が得られる。な
お、ｐＢＲ３２２はＮｏ．ＤＮＡ−００３のコード番号
で東洋紡（株）から市販されている。

【００２５】組換プラスミドの宿主細菌への導入は、エ
レクトロポーレーション法、カルシウムおよびルビジウ
ム処理による方法、ヘルパープラスミドを用いた伝達に
よる方法等によって、容易に行うことができる。宿主細
菌としては、組換プラスミドが安定に維持され、かつＳ
ＯＳ修復能を有する細菌を用いることができる。このよ
うな宿主細菌としては、一連の腸内細菌、例えばＳａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， Ａｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ， Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃ
ｌｏａｃａｅ，Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉなど
があげられるが、中でもサルモネラチフィムリウム（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から作
成された変異株、例えば財団法人発酵研究所（ＩＮＳＴ
ＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ，ＯＳ
ＡＫＡ（ＩＦＯ））からＮｏ．１４２０９のカタログ番
号で市販されているサルモネラ チフィムリウムが好ま
しい。

【００２６】上記のようにして得られた形質転換体を用
いて変異原性試験を行うには、変異原性の有無を判定し
たい検体を含む培地を用いて形質転換体を培養し、ルシ
フェラーゼの基質となる発光素を添加して発光させるこ
とにより行うことができる。検出される変異原性物質の
種類は限定されず、例えば、検体中にメタンスルホン酸
メチル、マイトマイシンＣ、４−ニトロキノリン−Ｎ−
オキシド、ナリジキシン酸、９−アミノアクリジン、２
−ニトロフルオレン、Ｎ−エチル−Ｎ′−ニトロ−ニト
ロソグアニジンまたはこれらの混合物、あるいはこれま
でに知られていない変異原性物質があげられる。

【００２７】培養は形質転換体に適した条件で行われる
が、例えばサルモネラ チフィムリウム（ＩＦＯ１４２
０９）の場合は、３７℃の定温下で、大腸菌の培養に一
般的に使用される栄養培地、例えばＬＢ培地など、で行
うのが好ましい。培地は液体培地でも固体培地でもよい
が、液体培地が好ましい。培養時間は１２〜１６時間が
適当である。

【００２８】このようにして培養した後添加する発光素
としては、ｎ−デシルアルデヒド、ｎ−ノニルアルデヒ
ド等の長鎖アルデヒドなどがあげられる。検体中に変異
原性物質が含まれていた場合には、既に説明したように
ルシフェラーゼが生産されているので、発光素が分解さ
れて発光が生じる。この発光を検出することにより、変
異原性の有無を判定する指標とすることができる。

【００２９】変異原性物質を含まないコントロール試験
では、発光は生じないか、または比較的に弱い発光が生
じるだけなので、発光の有無または発光強度の変化によ
り変異原性の有無またはＤＮＡ損傷の程度を判定するこ
とができる。例えば、コントロールよりも発光強度が大
きくなった場合は、それだけＤＮＡの損傷が大きいと判
定することができる。通常、コントロールに対して発光
強度が２倍以上になった場合は、変異原性ありと判定す
ることができる。発光は、ルシフェラーゼの活性が高く
維持される条件で行うのが好ましく、通常温度３０〜３
７℃、ｐＨ７前後の条件で行うのが好ましい。

【００３０】発光はルミノメーターなどの装置により容
易に測定することができる。この場合、培養後の培地を
直接発光測定に供することができるので細菌の破砕は必
要なく、このため試験操作は簡単である。また発光は微
量でも定量可能であり、またＤＮＡの損傷を直接感知す
る遺伝子が読まれる頻度を変異原性の指標としているの
で、高感度で変異原性物質の検出が可能である。

【００３１】

【発明の効果】本発明の融合遺伝子によれば、変異原性
物質によりＤＮＡが損傷した場合に、その程度を発光の
強度により検出可能であり、このため変異原性試験に利
用することができる。また本発明の組換プラスミドは、
上記融合遺伝子を含み、変異原性試験に用いる形質転換
体を調製する際にベクターとして利用することができ
る。

【００３２】また本発明の形質転換体は、上記組換プラ
スミドを保持し、変異原性試験に利用することができ
る。さらに本発明の変異原性試験法によれば、上記形質
転換体を用いることにより、細胞破砕の必要はなく、簡
単な操作で、しかも短時間で高感度に変異原性試験を行
うことができる。

【００３３】

【実施例】次に本発明の実施例について説明する。実施
例で使用したプラスミドおよび微生物は次の通りであ
る。 １）エセリシア コリ Ｋ−１２株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ｋ−１２株） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３７１６のカタログ番号でＡＴＣＣ
（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ）から市販されている。この大腸菌の染
色体ＤＮＡ中にはｌｅｘＡオペレーター、ｒｅｃＡプロ
モーターおよびｒｅｃＡ遺伝子が含まれており、Ｂａｍ
ＨＩにより約３．１ｋｂのＤＮＡ断片として切出される
ことがわかっている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，７７：３１３−３１７（１９８０））。

【００３４】２）ビブリオ ハルベイ（Ｖｉｂｒｉｏ
ｈａｒｖｅｙｉ） ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３８４３のカタログ番号でＡＴＣＣ
から市販されているビブリオ ハルベイを使用した。こ
の菌体の染色体ＤＮＡ中にはｌｕｘＡＢ遺伝子が含まれ
ており、ＨｉｎｄIIIにより約４ｋｂのＤＮＡ断片とし
て切出されることがわかっている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ２３：３６６３−３６６７（１９８４））。

【００３５】３）エセリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１ ベセスダ・リサーチ社からライブラリー エフィシェン
シィ^TM ＨＢ１０１コンピテントセルの品名で市販され
ており、コスモバイオ社を通して入手可能である。 ４）エセリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）ＲＲ１ ベセスダ・リサーチ社からライブラリー エフィシェン
シィ^TM ＲＲ１コンピテントセルの品名で市販されてお
り、コスモバイオ社を通して入手可能である。 ５）ｐＢＲ３２２プラスミド 東洋紡（株）から市販されている。コードＮｏ．ＤＮＡ
−００３。 ６）ｐＴｒｃ９９Ａプラスミド ファルマシア社から市販されている。コードＮｏ．２７
−５００７−０１。

【００３６】７）サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＩＦＯ１４
２０９株 財団法人発酵研究所〔ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ Ｆ
ＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ，ＯＳＡＫＡ（ＩＦＯ）〕か
ら、Ｎｏ．１４２０９のカタログ番号で市販されてい
る。この株は本来エイムズテストに用いるためにサルモ
ネラ チフィリウムＬＴ−２株から作成された変異株で
あり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７
０：７８２−７８６（１９７３））、ヒスチジン要求
性、膜の変異ｒｆａ、切出し修復能を支配するｕｖｒＢ
遺伝子の欠損という３種類の変異を有する。膜変異によ
り化学物質の細胞膜透過性が良く、さらにｕｖｒＢ欠損
によりＤＮＡ修復能が損なわれているため変異原性物質
に対する感受性が良くなっている。このことから、この
株は前述の変異原性試験ウムテストにおいてもｕｍｕＤ
Ｃ−ｌａｃＺ融合遺伝子を含むプラスミドの宿主として
使用されている（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．，１４
７：２１９−２２９（１９８５））。

【００３７】実施例１ １）ｌｅｘＡオペレーター、ｒｅｃＡプロモーターおよ
びｒｅｃＡ遺伝子の単離ｌｅｘＡ オペレーター、ｒｅｃＡプロモーターおよびｒ
ｅｃＡ遺伝子をエセリシア コリ Ｋ−１２株の染色体
ＤＮＡから、ＢａｍＨＩにより約３．１ｋｂのＤＮＡ断
片として切出した。クローニングは文献（Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１６３：５６８−５７２（１９８５））
を参照し、ショットガン法により行い、下記式（２）に
示すプラスミドを得た。

【化３】 （式中、ｌｅｘＡｏｐ、ｒｅｃＡｐｒ、Ａｍｐおよびｐ
ＢＲ３２２は前記と同じものを示す。ｒｅｃＡはｒｅｃ
Ａ遺伝子を示す。）

【００３８】すなわち、エセリシア コリ Ｋ−１２株
の染色体ＤＮＡを精製し、ＢａｍＨＩにより切断した
後、ｐＢＲ３２２プラスミドと混合してライゲーション
を行った。ライゲーション溶液を、ＣａＣｌ₂処理によ
り作成したエセリシア コリＨＢ１０１のコンピテント
セル（加えたＤＮＡを取込む状態にある細胞）と混合
し、トランスフォーメーションを行った。その後、適当
に希釈した菌液を、０．０１％のメタンスルホン酸メチ
ル（この化合物は変異原性物質である。以下、ＭＭＳと
略す場合がある）を含むＬＢプレートに植菌した。３７
℃で一晩培養後、プレート上に出現したコロニーを液体
培地で培養した後、プラスミドを精製した。得られたプ
ラスミドをＢａｍＨＩで切断した後、アガロースゲル電
気泳動によりＢａｍＨＩによる切断パターンを調べた。
その結果、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサイトには約３．
１ｋｂのＤＮＡ断片が組込まれていた。さらに２種類の
制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ）を用いてプラスミド
の切断パターンを調べたところ、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７：３１３−３１７（１
９８０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
７７：２６１１−２６１５（１９８０））に等しい大き
さをもつＤＮＡ断片を確認できた。

【００３９】取得したＤＮＡ断片がｌｅｘＡオペレータ
ー、ｒｅｃＡプロモーターおよびｒｅｃＡ遺伝子を含ん
でいることを確認するため、以下のような実験を行っ
た。まず、約３．１ｋｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を組
込んだ前記式（２）のプラスミドを、もともとｒｅｃＡ
遺伝子をもたないエセリシア コリ ＨＢ１０１に導入
して組換菌〔ＨＢ１０１（ｐＢＲ３２２＋ｒｅｃＡ）〕
を作成した。またコントロールとしてｐＢＲ３２２のみ
を導入した組換菌〔ＨＢ１０１（ｐＢＲ３２２）〕を作
成した。これら２種類の組換菌を波長６００ｎｍの光の
吸光度（以下、ＯＤ₆₀₀という）が約２．４になるま
で、液体培地で培養した。次にこの培養液を１０⁷倍希
釈した後、この菌液を１００μｌずつ、メタンスルホン
酸メチルを適当量（０〜２ｍＭ）含んだＬＢプレートに
植菌した。３７℃で一晩培養後、各プレート上に出現し
たコロニーのカウントを行った。その結果、コントロー
ルとして用いたＨＢ１０１（ｐＢＲ３２２）はメタンス
ルホン酸メチル存在下で全くコロニーを形成できなかっ
た。これに対して、ＨＢ１０１（ｐＢＲ３２２＋ｒｅｃ
Ａ）では０〜２ｍＭの濃度範囲においてコロニー形成能
に対するメタンスルホン酸メチル濃度の影響は認められ
なかった。以上のことから、取得した約３．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片中にｌｅｘＡオペレーター、ｒｅｃＡプロモー
ターおよびｒｅｃＡ遺伝子が含まれていることが確認さ
れた。

【００４０】２）ｌｕｘＡＢ遺伝子の単離ｌｕｘＡＢ 遺伝子をビブリオ ハルベイの染色体ＤＮＡ
から、ＨｉｎｄIIIにより約４ｋｂのＤＮＡ断片として
切出した。クローニングは文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ２３：３６６３−３６６７（１９８４））を参照
し、ショットガン法により行い、下記式（３）に示すプ
ラスミドを得た。

【化４】 （式中、ｌｕｘＡＢ、ＡｍｐおよびｐＢＲ３２２は前記
と同じものを示す。）

【００４１】すなわち、ビブリオ ハルベイの染色体Ｄ
ＮＡを精製し、ＨｉｎｄIIIにより切断した後、ｐＢＲ
３２２プラスミドと混合してライゲーションを行った。
ライゲーション溶液を、ＣａＣｌ₂処理により作成した
エセリシア コリ ＲＲ１のコンピテントセルと混合
し、トランスフォーメーションを行った後、適当量の菌
液をＬＢプレートに植菌した。一晩３７℃で培養後、プ
レートの蓋に発光のための基質として２０μｌのｎ−デ
シルアルデヒドを添加し、コロニーを蒸気にさらしたと
ころ、発光コロニーが確認された。これらの１つを取り
液体培養後プラスミドを精製した。得られたプラスミド
を制限酵素により切断し、切断パターンを調べたとこ
ろ、ｐＢＲ３２２の内部にはｌｕｘＡＢ遺伝子が正しく
組込まれていることがわかった。

【００４２】３）融合遺伝子の作成 前記式（２）のプラスミドをＢａｍＨＩで切断し、ｌｅ
ｘＡオペレーター、ｒｅｃＡプロモーターおよびｒｅｃ
Ａ遺伝子を含む約３．１ｋｂのＤＮＡ断片を、アガロー
スゲル電気泳動により精製した。このＤＮＡ断片をｐＴ
ｒｃ９９ＡプラスミドのＢａｍＨＩサイトに導入し、下
記式（４）に示すプラスミドを得た。

【化５】 （式中、ｌｅｘＡｏｐ、ｒｅｃＡｐｒ、ｒｅｃＡおよび
Ａｍｐは前記と同じものを示す。ｐＴｒｃ９９Ａはプラ
スミドｐＴｒｃ９９Ａ由来の塩基配列、Ｐはｔｒｃプロ
モーターを示す。）

【００４３】上記式（４）のプラスミドをＰｓｔＩで切
断することにより、１．８ｋｂのＤＮＡ断片を除去し
た。残った５．４ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動により精製し、セルフライゲーションを行うこと
により下記式（５）に示すプラスミドを作成した。下記
式（５）のプラスミドにおいて、ＢａｍＨＩ〜ＰｓｔＩ
の１．２ｋｂのＤＮＡ断片中にｌｅｘＡオペレーターお
よびｒｅｃＡプロモーターが含まれることがわかってい
る（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７６：
３１４４−３１４８（１９７８））。

【化６】 （式中、ｌｅｘＡｏｐ、ｒｅｃＡｐｒ、Ａｍｐ、ｐＴｒ
ｃ９９ＡおよびＰは前記と同じものを示す。）

【００４４】上記式（５）のプラスミドをＰｓｔＩで切
断後、Ｔ４ポリメラーゼで切断面を平滑化し、さらにＳ
ａｌＩリンカーをライゲーションすることにより、下記
式（６）に示すｐＴＲ１０プラスミドを作成した。

【化７】 （式中、ｌｅｘＡｏｐ、ｒｅｃＡｐｒ、Ａｍｐ、ｐＴｒ
ｃ９９ＡおよびＰは前記と同じものを示す。）

【００４５】前記式（３）のプラスミドにおいて、発光
に必要なｌｕｘＡＢ遺伝子はＳａｌＩ〜ＰｖｕIIの２．
４ｋｂの部分に含まれることがわかっている（Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：８０９４−８１０１（１９
９２））。従って、前記式（３）のプラスミドをＰｖｕ
IIで切断し、切断末端にＳａｌＩリンカーをライゲーシ
ョンした。これをＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電
気泳動を行った後、２．４ｋｂのＤＮＡ断片を含むバン
ド部分を切出し、ＤＮＡを精製した。

【００４６】次に、上記で得たｌｕｘＡＢ遺伝子を含む
２．４ｋｂのＤＮＡ断片と、前記式（６）のｐＴＲ１０
プラスミドをＳａｌＩで切断して脱リン酸化処理を行っ
たｐＴＲ１０とを混合し、ライゲーションを行って下記
式（７）に示すプラスミドｐＴＲＬ１０を得た。このプ
ラスミドは、ｌｅｘＡオペレーター、ｒｅｃＡプロモー
ターおよびｌｕｘＡＢ遺伝子を含む新規な融合遺伝子を
有する新規なプラスミドである。

【化８】 （式中、ｌｅｘＡｏｐ、ｒｅｃＡｐｒ、ｌｕｘＡＢ、ｐ
Ｔｒｃ９９ＡおよびＰは前記と同じものを示す。）

【００４７】４）組換プラスミドの作成 上記式（７）のｐＴＲＬ１０はｐＴｒｃ９９Ａに融合遺
伝子を組込んだものであるので、変異原性物質が存在し
ない条件下であっても、ｐＴｒｃ９９Ａに含まれるｔｒ
ｃプロモーターから融合遺伝子への読みが起こり、その
結果、ｐＴＲＬ１０を含む微生物は発光してしまう。こ
のような、融合遺伝子の前方部分からの読みを回避する
ために、融合遺伝子を切出して他のプラスミドに導入し
た。まず、前記式（７）のｐＴＲＬ１０をＢａｍＨＩと
ＨｉｎｄIIIで切断し、融合遺伝子からなる３．６ｋｂ
のＤＮＡ断片を精製した。この３．６ｋｂのＤＮＡ断片
を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＢＲ３２
２と混合し、ライゲーションを行った。この操作により
前記制限酵素地図（１）に示す新規なプラスミドｐＭＡ
Ｓ１０を得た。なお文献（Ｇｅｎｅ ５０：３−４０
（１９８６））から、導入した融合遺伝子の前方には有
意なプロモーターは存在しないことがわかっている。

【００４８】５）形質転換体の作成 前記制限酵素地図（１）で示すｐＭＡＳ１０を、ＢＩＯ
−ＲＡＤ社製のジーンパルサーを用いてエレクトロポレ
ーション法によりＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ ＩＦＯ１４２０９株に導入して形質転換
し、ｐＭＡＳ１０を導入したサルモネラ菌（ＩＦＯ１４
２０９（ＴＡ１５３５））を得た。

【００４９】実施例２ 実施例１の５）で得たｐＭＡＳ１０を導入したサルモネ
ラ菌を用いて、次のようにして変異原性試験を行った。
なお、変異原性物質としてメタンスルホン酸メチル（Ｍ
ＭＳ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、４−ニトロキノ
リン−Ｎ−オキシド（４ＮＱＯ）の３種類の化学物質を
使用した。まず、実施例１で得たサルモネラ菌を５ｍｌ
のＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。この培養
液１ｍｌを新しい１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７
℃で２時間培養（ＯＤ₆₀₀＝０．４前後に達する）した
後、培養液を５ｍｌずつ試験管に分注した。これらの試
験管に上記変異原性物質を種々の濃度で加え、３７℃で
２時間培養した。

【００５０】この培養液１０μｌに新しいＬＢ培地９９
０μｌを加えて１００倍希釈とし、この希釈培養液２０
０μｌを発光測定に使用した。発光は、予めエタノール
で１０倍に希釈したｎ−デシルアルデヒド１０μｌを分
注した発光測定用のキュベットに、前記希釈培養液２０
０μｌを添加することにより開始させた。発光量の測定
は、発光開始後５秒〜１５秒までの１０秒間にかけて行
った。測定にはターナーデザイン社製のルミノメーター
Ｍｏｄｅｌ ２０ｅ（商標）を、ｄｅｌａｙｔｉｍｅ
５ｓｅｃ．，ｉｎｔｅｇｒａｔｅ ｔｉｍｅ １０ｓｅ
ｃ．の条件で使用した。なお、以上の操作は全て室温下
で行った。発光量はＯＤ₆₀₀＝１あたりの発光量実測値
（ルミノメーター実測値／培養液原液のＯＤ₆₀₀値）と
して表した。結果を図１〜図３に示す（測定は３回行
い、その平均値を発光量とした）。

【００５１】図１〜図３からわかるように、ＭＭＳ、Ｍ
ＭＣ、４ＮＱＯの添加濃度がそれぞれ１０μｇ／ｌ、
０．０３μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ以上の範囲
で、変異原性物質濃度に対応した発光量の増加が確認さ
れた。既存の変異原性試験の一つであるｕｍｕテストに
よるＭＭＳ、ＭＭＣ、４ＮＱＯの検出感度（変異原性物
質を含まない条件での値の２倍のβ−ガラクトシダーゼ
活性を示す変異原性物質の濃度）がそれぞれ２７、０．
０５、０．０８μｇ／ｍｌであるから、これに匹敵する
感度が得られている。

【００５２】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：エセリシア コリ(Escherichia coli) 株名：K-12 配列の特徴 特徴を表す記号：binding-site 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：promoter 存在位置：19..25 特徴を決定した方法：S 配列 TACTGTATGA GCATACAGTA TAATT 25

【００５３】配列番号：2 配列の長さ：2403 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒ゛フ゛リオ ハルヘ゛イ（Vibrio herveyi) 配列の特徴 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：1..6 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：peptide 存在位置：137..1201 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1231..2202 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：2398..2403 特徴を決定した方法：S 配列 GTCGACTTTA TCGAGCCTGA TTTTGAACAA CTCACCATCG CGACTGTGAA TGAACGTCGC 60 TTGAAAGCGG AAATTGAAAG CCGTACGCCA GAAATGGCTT AGGTCTTATC GTAATACCAA 120 CAAATAAGGA AATGTT ATG AAA TTT GGA AAC TTC CTT CTC ACT TAT CAG CCA 172 Met Lys Phe Gly Asn Phe Leu Leu Thr Tyr Gln Pro 1 5 10 CCT GAG CTA TCT CAG ACC GAA GTG ATG AAG CGA TTG GTT AAT CTG GGC 220 Pro Glu Leu Ser Gln Thr Glu Val Met Lys Arg Leu Val Asn Leu Gly 15 20 25 AAA GCG TCT GAA GGT TGT GGC TTC GAC ACC GTT TGG TTG CTA GAG CAC 268 Lys Ala Ser Glu Gly Cys Gly Phe Asp Thr Val Trp Leu Leu Glu His 30 35 40 CAC TTC ACT GAA TTT GGG TTG TTA GGG AAT CCT TAT GTT GCT GCC GCA 316 His Phe Thr Glu Phe Gly Leu Leu Gly Asn Pro Tyr Val Ala Ala Ala 45 50 55 60 CAC CTA TTA GGT GCG ACA GAA ACG CTC AAC GTT GGC ACT GCA GCT ATC 364 His Leu Leu Gly Ala Thr Glu Thr Leu Asn Val Gly Thr Ala Ala Ile 65 70 75 GTA TTG CCG ACT GCC CAT CCG GTT CGA CAA GCA GAA GAC GTA AAC CTA 412 Val Leu Pro Thr Ala His Pro Val Arg Gln Ala Glu Asp Val Asn Leu 80 85 90 CTG GAT CAA ATG TCA AAA GGA CGA TTC CGT TTT GGT ATT TGT CGC GGT 460 Leu Asp Gln Met Ser Lys Gly Arg Phe Arg Phe Gly Ile Cys Arg Gly 95 100 105 TTG TAC GAT AAA GAT TTT CGT GTC TTT GGT ACA GAC ATG GAT AAC AGC 508 Leu Tyr Asp Lys Asp Phe Arg Val Phe Gly Thr Asp Met Asp Asn Ser 110 115 120 CGA GCC TTA ATG GAC TGT TGG TAT GAC TTG ATG AAA GAA GGC TTC AAT 556 Arg Ala Leu Met Asp Cys Trp Tyr Asp Leu Met Lys Glu Gly Phe Asn 125 130 135 140 GAA GGC TAT ATC GCG GCG GAT AAC GAA CAT ATT AAG TTC CCG AAA ATC 604 Glu Gly Tyr Ile Ala Ala Asp Asn Glu His Ile Lys Phe Pro Lys Ile 145 150 155 CAA CTG AAT CCA TCG GCT TAC ACA CAA GGT GGT GCT CCT GTT TAT GTC 652 Gln Leu Asn Pro Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Gly Ala Pro Val Tyr Val 160 165 170 GTC GCG GAG TCA GCA TCA ACG ACA GAA TGG GCT GCA GAG CGT GGC CTA 700 Val Ala Glu Ser Ala Ser Thr Thr Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Leu 175 180 185 CCA ATG ATT CTA AGC TGG ATC ATC AAC ACT CAC GAG AAG AAA GCG CAG 748 Pro Met Ile Leu Ser Trp Ile Ile Asn Thr His Glu Lys Lys Ala Gln 190 195 200 CTT GAT CTT TAC AAC GAA GTC GCG ACT GAA CAT GGC TAC GAT GTG ACT 796 Leu Asp Leu Tyr Asn Glu Val Ala Thr Glu His Gly Tyr Asp Val Thr 205 210 215 220 AAG ATT GAC CAC TGT TTG TCT TAC ATC ACC TCC GTC GAT CAT GAC TCA 844 Lys Ile Asp His Cys Leu Ser Tyr Ile Thr Ser Val Asp His Asp Ser 225 230 235 AAT AGA GCC AAA GAT ATT TGC CGC AAC TTC TTG GGC CAT TGG TAC GAC 892 Asn Arg Ala Lys Asp Ile Cys Arg Asn Phe Leu Gly His Trp Tyr Asp 240 245 250 TCA TAC GTG AAT GCC ACC AAG ATT TTT GAC GAC TCT GAC CAA ACA AAA 940 Ser Tyr Val Asn Ala Thr Lys Ile Phe Asp Asp Ser Asp Gln Thr Lys 255 260 265 GGT TAC GAC TTC AAT AAA GGT CAA TGG CGT GAT TTT GTG TTG AAA GGC 988 Gly Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Gln Trp Arg Asp Phe Val Leu Lys Gly 270 275 280 CAC AAA GAC ACC AAT CGC CGA ATT GAT TAC AGC TAC GAA ATC AAC CCA 1036 His Lys Asp Thr Asn Arg Arg Ile Asp Tyr Ser Tyr Glu Ile Asn Pro 285 290 295 300 GTA GGG ACG CCT GAA GAG TGT ATC GCG ATT ATC CAG CAA GAT ATT GAT 1084 Val Gly Thr Pro Glu Glu Cys Ile Ala Ile Ile Gln Gln Asp Ile Asp 305 310 315 GCG ACG GGT ATT GAC AAT ATT TGT TGT GGT TTT GAA GCA AAC GGT TCT 1132 Ala Thr Gly Ile Asp Asn Ile Cys Cys Gly Phe Glu Ala Asn Gly Ser 320 325 330 GAA GAA GAA ATT ATC GCA TCT ATG AAG CTA TTC CAG TCT GAT GTG ATG 1180 Glu Glu Glu Ile Ile Ala Ser Met Lys Leu Phe Gln Ser Asp Val Met 335 340 345 CCA TAT CTC AAA GAA AAA CAG TAATTAATAT TTTCTAAAAG GAAAGAGAC ATG 1233 Pro Tyr Leu Lys Glu Lys Gln Met 350 355 1 AAA TTT GGA TTA TTC TTC CTC AAT TTT ATG AAT TCA AAG CGT TCT TCT 1281 Lys Phe Gly Leu Phe Phe Leu Asn Phe Met Asn Ser Lys Arg Ser Ser 5 10 15 GAT CAA GTC ATC GAA GAA ATG TTA GAT ACC GCA CAT TAC GTA GAT CAG 1329 Asp Gln Val Ile Glu Glu Met Leu Asp Thr Ala His Tyr Val Asp Gln 20 25 30 TTG AAG TTT GAC ACG TTG GCT GTT TAC GAA AAC CAT TTC TCG AAC AAT 1377 Leu Lys Phe Asp Thr Leu Ala Val Tyr Glu Asn His Phe Ser Asn Asn 35 40 45 GGT GTG GTT GGT GCC CCA CTA ACA GTG GCT GGT TTT TTA CTT GGT ATG 1425 Gly Val Val Gly Ala Pro Leu Thr Val Ala Gly Phe Leu Leu Gly Met 50 55 60 65 ACA AAG AAC GCC AAA GTG GCT TCG TTG AAT CAC GTC ATT ACC ACG CAT 1473 Thr Lys Asn Ala Lys Val Ala Ser Leu Asn His Val Ile Thr Thr His 70 75 80 CAT CCA GTA CGT GTG GCG GAA GAA GCG TGT CTA CTT GAC CAA ATG AGT 1521 His Pro Val Arg Val Ala Glu Glu Ala Cys Leu Leu Asp Gln Met Ser 85 90 95 GAA GGC CGT TTT GCC TTT GGC TTT AGT GAT TGT GAA AAG AGT GCA GAT 1569 Glu Gly Arg Phe Ala Phe Gly Phe Ser Asp Cys Glu Lys Ser Ala Asp 100 105 110 ATG CGC TTC TTT AAT CGA CCA ACG GAT TCT CAG TTT CAG TTG TTC AGT 1617 Met Arg Phe Phe Asn Arg Pro Thr Asp Ser Gln Phe Gln Leu Phe Ser 115 120 125 GAG TGT CAC AAG ATC ATC AAT GAT GCA TTC ACT ACT GGG TAC TGC CAT 1665 Glu Cys His Lys Ile Ile Asn Asp Ala Phe Thr Thr Gly Tyr Cys His 130 135 140 145 CCA AAC AAT GAT TTT TAT AGT TTT CCT AAA ATC TCC GTT AAC CCA CAC 1713 Pro Asn Asn Asp Phe Tyr Ser Phe Pro Lys Ile Ser Val Asn Pro His 150 155 160 GCG TTC ACT GAA GGC GGT CCT GCG CAA TTT GTG AAT GCG ACG AGC AAA 1761 Ala Phe Thr Glu Gly Gly Pro Ala Gln Phe Val Asn Ala Thr Ser Lys 165 170 175 GAA GTG GTT GAA TGG GCG GCT AAG TTA GGG CTT CCA CTC GTG TTT AGA 1809 Glu Val Val Glu Trp Ala Ala Lys Leu Gly Leu Pro Leu Val Phe Arg 180 185 190 TGG GAC GAC TCA AAC GCT CAA AGA AAA GAA TAC GCC GGT TTG TAC CAC 1857 Trp Asp Asp Ser Asn Ala Gln Arg Lys Glu Tyr Ala Gly Leu Tyr His 195 200 205 GAA GTT GCT CAG GCA CAT GGT GTC GAT GTT AGT CAG GTT CGA CAC AAG 1905 Glu Val Ala Gln Ala His Gly Val Asp Val Ser Gln Val Arg His Lys 210 215 220 225 CTG ACG CTG CTG GTC AAC CAA AAT GTA GAT GGT GAA GCA GCA AGG GCA 1953 Leu Thr Leu Leu Val Asn Gln Asn Val Asp Gly Glu Ala Ala Arg Ala 230 235 240 GAA GCT CGC GTG TAT TTG GAA GAG TTT GTC CGT GAA TCT TAC TCA AAT 2001 Glu Ala Arg Val Tyr Leu Glu Glu Phe Val Arg Glu Ser Tyr Ser Asn 245 250 255 ACC GAC TTT GAG CAA AAA ATG GGA GAG CTG TTG TCA GAA AAT GCC ATC 2049 Thr Asp Phe Glu Gln Lys Met Gly Glu Leu Leu Ser Glu Asn Ala Ile 260 265 270 GGT ACT TAT GAA GAA AGT ACT CAG GCA GCG CGA GTT GCG ATT GAG TGT 2097 Gly Thr Tyr Glu Glu Ser Thr Gln Ala Ala Arg Val Ala Ile Glu Cys 275 280 285 TGT GGT GCC GCG GAC CTA TTG ATG TCT TTT GAG TCG ATG GAA GAT AAA 2145 Cys Gly Ala Ala Asp Leu Leu Met Ser Phe Glu Ser Met Glu Asp Lys 290 295 300 305 GCG CAG CAA AGA GCG GTT ATC GAT GTG GTA AAC GCC AAC ATC GTC AAA 2193 Ala Gln Gln Arg Ala Val Ile Asp Val Val Asn Ala Asn Ile Val Lys 310 315 320 TAC CAC TCG TAACGTTTAA CTGATGCTGA AGGGGCAGCG ATGCCCCTTA 2242 Tyr His Ser TATCACCATT CTTTTCGCCG ATAGCGCTAA CTAATAGAGG CATTTATATG GACGTACTTT 2302 CAGCGGTTAA GCAGGAAAAC ATCGCAGCGA GCACAGAAAT CGATGACTTG ATTTTCATGG 2362 GAACTCCTCA GCAATGGTCA TTGCAGGAAC AAAAACAGCT G 2403

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２の結果を示すグラフである。

【図２】実施例２の結果を示すグラフである。

【図３】実施例２の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:63）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク
   質が結合するオペレーターおよびｒｅｃＡ遺伝子のプロ
   モーターの下流に、ルシフェラーゼをコードするｌｕｘ
   ＡＢ遺伝子が結合していることを特徴とする融合遺伝
   子。
2. 【請求項２】 レプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク
   質が結合するオペレーターおよびｒｅｃＡ遺伝子のプロ
   モーターの下流に、ルシフェラーゼをコードするｌｕｘ
   ＡＢ遺伝子が結合している融合遺伝子を有することを特
   徴とする組換プラスミド。
3. 【請求項３】 レプレッサーとしてのｌｅｘＡタンパク
   質が結合するオペレーターおよびｒｅｃＡ遺伝子のプロ
   モーターの下流に、ルシフェラーゼをコードするｌｕｘ
   ＡＢ遺伝子が結合している融合遺伝子を有する組換プラ
   スミドであって、下記制限酵素地図（１）で表されるこ
   とを特徴とする組換プラスミドｐＭＡＳ１０。 【化１】 （地図中、ｌｅｘＡｏｐはｌｅｘＡタンパク質が結合す
   るオペレーター、ｒｅｃＡｐｒはｒｅｃＡ遺伝子のプロ
   モーター、ｌｕｘＡＢはｌｕｘＡＢ遺伝子、Ａｍｐはア
   ンピシリン耐性遺伝子、ｐＢＲ３２２はプラスミドｐＢ
   Ｒ３２２由来の塩基配列を示す。）
4. 【請求項４】 請求項２または３記載の組換プラスミド
   が導入されたことを特徴とする形質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を、検体を含
   む培地を用いて培養した後、ルシフェラーゼの基質とな
   る発光素を添加して発光させることを特徴とする変異原
   性試験法。