JPH0827188A - 新規な造血抑制因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記の性質を有することを特徴とする造血抑
制因子。 （ａ）１３０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で小麦胚
芽レクチンに吸着する。 （ｂ）ゲル濾過で分子量が１５００００±５００００の
位置に溶出される。 （ｃ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）条件下でブルー
色素に吸着する。 （ｄ）マウス骨髄巨核球増幅活性を抑制する。 【効果】 巨核球の増幅を抑制する活性を有し、急性白
血病、突発性骨髄線維症等に対する治療に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、巨核球の増幅を抑制す
る活性を有する造血抑制因子及び該因子を含有する造血
抑制用医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】造血組織は生体内の中で最も活発に新生
と崩壊を繰り返している組織の一つである。多数の血球
成分が日々産生され、傍らでは機能を果たした血球は死
滅していく。このような激しい細胞の交換にもかかわら
ず、各血球は過不足がなく、恒常性が保たれている。こ
うした血球数の調節は、造血細胞の増殖、分化、成熟に
多数の造血促進因子と造血抑制因子が作用することによ
り行われていると考えられる。即ち、赤血球を増加させ
る因子としてはエリスロポエチン(1)が、白血球を増加
させる因子としてはコロニー刺激因子(2)が、血小板を
増加させる因子としてはトロンボポエチン(3)が作用し
ていることが明らかにされている。また、最近ではトロ
ンボポエチンが貧血のブタから精製され、ヒトのＤＮＡ
も単離された(3)。この様に造血を促進する因子につい
ては研究が進められているが、逆に造血を抑制する因子
についてはほとんど研究がなされていない。トラスフォ
ーミンググロースファクター−β（ＴＧＦ−β）は、未
熟な造血前駆細胞に作用し、分化増殖抑制効果を有する
ことが知られている(4)。しかしＴＧＦ−βは多くの組
織において発現し、しかも多くの細胞に対して増殖抑制
因子として作用することが明らかになっており(5)、造
血を特異的に調節しているとは考えがたい上に、分子量
が２５０００の２量体から形成されているものである。

【０００３】急性白血病は造血幹細胞腫瘍であり、腫瘍
化した１個の幹細胞に由来し、分化成熟能に欠陥を生じ
た幼若芽球の無制限の増殖を特徴としている。白血病細
胞の無制限増殖機構はいまだ十分に解明されていない
が、サイトカインネットワークを中心とする細胞増殖調
節機構と、細胞応答の破綻が、主たる原因のひとつと考
えられている。急性白血病の治療法の基本は、代謝拮抗
剤、抗生物質やアルキル化剤を中心とした化学療法であ
り、近年その発達と補助療法の進歩により完全寛解率が
飛躍的に向上した。しかし完全寛解率の上昇にもかかわ
らず、現在なお完全寛解に達した患者の少なくとも過半
数は、再発により死亡している。その原因の１つには薬
剤耐性があげられ、現在の白血病化学療法における最大
の課題となっている(6)(7)。

【０００４】また、突発性骨髄線維症は骨髄系幹細胞が
異常増殖し、二次的に骨髄の線維化が起こる疾患であ
る。病期の進行と共に貧血や出血、脾腫による圧迫症状
がみられる。骨髄系幹細胞の異常増殖をきたす病因自体
は不明であるが、骨髄線維化の原因として各種の繊維芽
細胞増殖因子が挙げられる。その中でも骨髄中で過剰に
増殖した巨核球から放出される血小板由来成長因子（Ｐ
ＤＧＦ）が、繊維芽細胞の増殖を促進して骨髄の線維化
を起こすと考えられている。この疾患は有効な治療法が
なく、脾腫による各種の病態を改善するために摘脾が比
較的よく行われているにすぎない(7)。〔（１）平嶋邦
猛，臨床透析，５，８９１，１９８９（２）Ｄｏｎａｈ
ｕｅ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
１，１８２０，１９８８（３）Ｆｒｅｄｅｒｉｃ
Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５３３，
１９９４（４）Ｓｉｎｇ，Ｇ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂ
ｌｏｏｄ，７２，１５０４，１９８８（５）宮園浩平，
蛋白質核酸酵素，３６，１３５０，１９９１（６）血液
・腫瘍科，２７，１９６，１９９３（７）最新内科学大
系，第１９巻白血病，１９９２，中山書店〕

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、薬剤
耐性が白血病化学療法の問題点となっているが、これは
本来生体内に存在しない物質を投与することが原因であ
り、非自己を排除する生体防御の１例であると考えられ
る。本来生体が持っている造血抑制作用を利用すれば、
即ち造血抑制因子を急性白血病の薬剤として使用すれ
ば、薬剤耐性という問題点を解決できると考えられる。
また同様に巨核球の増幅を押さえるような造血抑制因子
は、突発性骨髄線維症の治療薬にもなると考えられる。
しかし生体内成分である造血抑制因子は、その存在すら
明確でなく、その物性がわからない上に極めて微量であ
ることが考えられ、その解明には困難を極めていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の技
術的背景にあって、特異的に且つ強力に造血細胞の増
殖、分化、成熟を抑制する作用を有する新規な造血抑制
因子を見いだすべく鋭意研究を重ねた。その結果、造血
抑制因子に親和性を持ったアフィニティーカラムを使用
することにより、微量な同因子を正常な動物及び健常人
の血漿中から単離、精製することに成功し、次いで血小
板減少症モデル動物の血漿から同じく単離、精製するこ
とが可能であることを確認し、その諸性質を明らかにす
ると共に、その作用を確認して、薬剤としての有用性を
示した。本発明は、これらの知見に基づいて完成された
ものである。

【０００７】従って、本発明の一つの目的は、強力な作
用を有する実質的に純粋な新規な造血抑制因子を提供す
ることにある。また、本発明の他の目的は、有効量の造
血抑制因子を活性成分として含有する医薬組成物を提供
することにある。本発明によれば、巨核球の増幅を抑制
する造血抑制因子が提供される。更に詳しくは、下記の
性質を有する造血抑制因子が提供される。 （ａ）１３０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液条件下で小麦胚芽レクチンに吸着す
る。 （ｂ）ゲル濾過で分子量が１５００００±５００００の
位置に溶出される。 （ｃ）ＰＢＳ条件下でブルー色素に吸着する。 （ｄ）マウス骨髄巨核球増幅活性を抑制する。

【０００８】また本発明の他の態様によれば、該因子を
分離、精製することを含む造血抑制因子の製造方法が提
供される。造血抑制因子の製造に際して用いる原料は血
漿、特に好ましくはヒトの血漿が挙げられ、その他にウ
サギ及び他の哺乳動物の血漿が挙げられる。即ち、該因
子の分離・精製方法としては、通常使用される方法、例
えば、担体による吸着法、塩析法、電気泳動法、および
イオン交換、ゲル濾過、適当なリガンドへのアフィニテ
ィーを応用した各種のクロマトグラフィー法等を単独
で、または組み合わせて使用できる。クロマトグラフィ
ー法として、好ましくは、カルボキシメチル（ＣＭ）基
を結合させた担体を用いるＣＭカラムクロマトグラフィ
ー、第４級アミノエチル基（Ｑ）を結合させた担体を用
いるＱカラムクロマトグラフィー、架橋したデキストラ
ンゲル等の粒子を用いるゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィー、フェニル基やブチル基を結合させた担体を用いる
疎水性カラムクロマトグラフィー、色素やレクチン等の
該因子に親和性がある物質を結合させた担体を用いるア
フィニティーカラムクロマトグラフィーを使用できる。

【０００９】本発明の製造方法においては、特に小麦胚
芽レクチンまたはブルー色素の少なくともいずれか一方
を用いることが好ましく、これを用いることで他の方法
に比べて特に効率良く精製することが可能である。ブル
ー色素としてはシグマ社１９９４年度試薬カタログに記
載のシバクロンブルー３ＧＡが好ましい。小麦胚芽レク
チンまたはシバクロンブルー３ＧＡの使用に当たって
は、ハロゲン化シアンやエポキシドを作用させて活性化
した適当な担体例えば、活性化セルロース、活性化アガ
ロース、活性化デキストラン等に固定化して用いると好
適であり、カラムクロマトグラフィーとなすと、特に操
作、効率において好ましい。

【００１０】本発明製造方法の具体的１例についてさら
に説明する。ジイソプロピルフルオロリン酸処理によ
り、内在性のセリンプロテアーゼを失活させた血漿を、
硫酸アンモニウム（硫安）塩析により分画する。造血抑
制活性を有する画分をｐＨ７．０−７．５の適当な緩衝
液、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液にて透析する。次に同緩衝
液で平衡化した適当なレクチンアフィニティーカラム例
えば小麦胚芽レクチン固定化担体、好ましくはホィート
ジャームレクチン（ＷＧＬ）セファロース６ＭＢ（スウ
ェーデン、ファルマシア社）にアプライし、十分にカラ
ムを洗浄して非吸着物を除く。吸着物は、常法に従って
適当な糖例えばＮ−アセチルグルコサミンを含む緩衝液
により溶出する。溶出液を限外濾過膜等により適当な濃
度、好ましくは１０−３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、予め
適当な緩衝液、例えばＰＢＳで平衡化したゲル濾過カラ
ム、好ましくはスーパーデックス２００ｐｇ（ファルマ
シア社）カラムで分画する。造血抑制活性を有する画分
を同緩衝液で予め平衡化したシバクロンブルー３ＧＡ固
定化担体、好ましくはブルーセファロース・ファースト
フロー（ファルマシア社）カラムにアプライし、同緩衝
液で十分にカラムを洗浄して非吸着物を除く。造血抑制
因子は、１．５Ｍ食塩を含む緩衝液により溶出し、回収
することができる。これらの操作により得られる該造血
抑制因子は蛋白質であると予想される。

【００１１】このようにして得られる新規な造血抑制因
子は、巨核球の増幅を抑制する活性を有するものであ
る。該因子は、巨核球の増幅を抑制する研究用試薬とし
て、また該因子単独で、あるいは有効量の該因子に、製
薬剤的に許容される担体、例えば希釈液、賦形剤、増粘
剤、ｐＨ調製剤等を添加して適当な剤形とし、造血抑制
用医薬組成物として使用することができる。本発明の医
薬組成物は、急性白血病、突発性骨髄線維症等の治療に
有用である。本発明の医薬組成物は、特に好ましくは注
射剤として用いることができる。例えば、注射用蒸留
水、ブドウ糖、ショ糖、グリセリン、メチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース、食塩、リン酸ナトリ
ウム等の希釈液、増粘剤、等張剤、ｐＨ調整剤等を加え
ることができる。

【００１２】本発明の造血抑制因子の成人１回当りの投
与量は、年齢、性別、体重、症状などによって異なる
が、一般に約０．１μｇ〜１００ｍｇであり、１日当り
１回または必要に応じて数回投与することができる。本
発明をより詳細に記述するために、参考例及び実施例に
より説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定
されるものではない。

【００１３】

【参考例】

造血活性測定法 細胞内アセチルコリンエステラーゼ活性を巨核球増幅の
指標にした（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ．Ｓ．Ａ．，Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇ
ｙ，１２２，１５９，１９８５）。なお適宜顕微鏡観察
により培養後の巨核球の大きさを比較し、巨核球増幅及
びその抑制の程度が反映されていることを確認した。以
下のＩＭＤＭ液（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｅｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｏｆＤａｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕ
ｍ）は粉末ＩＭＤＭ（１リットル用）（米国、ギブコ
社）に重曹３．０２４ｇを加え、ｐＨを７．１に調整し
た後、１リットルにメスアップし、更に５０ＩＵ／ｍｌ
ペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（い
ずれも米国、フローラボラトリーズ社）を加えて調製し
たものである。

【００１４】６〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス
（雌）３匹の大腿骨及び脛骨を採取し、その両端を切断
し、１０％牛胎児血清（ギブコ社）を含む１０ｍｌのＩ
ＭＤＭ液を入れた１０ｍｌのプラスチック注射器（２２
Ｇ針）を用いて、１００ｍｍプラスチックディッシュ中
に、骨髄を押しだした。数回（１９Ｇ針と２２Ｇ針使
用）のピペッティング操作によって、細胞を分散した
後、１５ｍｌのチュ−ブに移し、１００ｇで２０分間遠
心し、沈降性の細胞を回収した。この細胞を１０ｍｌの
１０％牛血清を含むＩＭＤＭに懸濁し、１００ｍｍプラ
スチックディッシュ内で３７℃、５％二酸化炭素下で１
時間培養した。非付着細胞懸濁液に単球除去試薬ＫＡＣ
−２（日本国、日本抗体研究所）を１０％添加し、１０
分毎に撹拌しながら３７℃、５％二酸化炭素下で１時間
培養した。細胞懸濁液を１０ｍｌのリンフォライト−Ｍ
（日本国、和光純薬工業）に重層し、４℃、４００ｇで
２０分間遠心した。中間層を採取し、ＩＭＤＭで２回洗
浄した後に１％ニュートリドーマＳＰ（ドイツ、ベーリ
ンガーマンハイム社）及び０．１％牛血清アルブミン
（米国、シグマ社）を含むＩＭＤＭ液に、細胞密度が５
×１０⁵ ｃｅｌｌｓ/ｍｌとなるように懸濁した。細胞
濃度は、トリパンブル−（米国、フロ−ラボラトリ−ズ
社）染色にて血球計算盤で測定した。９６穴培養用ディ
ッシュ（日本国、住友ベークライト社）に、１穴当り２
００μｌの細胞懸濁液を分注し、３７℃、５％ＣＯ2 の
条件下で４日間培養した。必要に応じてサイトカインあ
るいは試料溶液を１０％添加した。培養後プレートを顕
微鏡観察し、各穴の巨核球の大きさを比較した。

【００１５】プレートを４００ｇ、１０分間遠心して細
胞を沈め上清を除去した後、各穴に１５０μｌのＰＢＳ
及び５０μｌの０．８ｍＭの５，５’−ヂチオビス（２
−ニトロ安息香酸）（シグマ社）を含む１％トリトンＸ
溶液を添加し、十分撹拌した後に４０５ｎｍと６５０ｎ
ｍの吸光度差を測定した（０時間）。各穴に２０μｌの
７．５ｍＭのヨウ化アセチルチオコリン（シグマ社）溶
液を添加し、反応を開始した。室温で遮光して６０分間
放置後、４０５ｎｍと６５０ｎｍの吸光度差を測定し、
０時間の測定値を差し引いて、細胞内アセチルコリンエ
ステラーゼ活性とした。活性の強さは巨核球増幅を促進
する因子及び試料無添加での値を１００％としてその比
率で表した。即ち１００％以上は、巨核球増幅を促進す
る造血促進活性を、１００％以下は巨核球増幅を抑制す
る造血抑制活性を表す。

【００１６】

【実施例】

実施例１ ヒト血漿からの造血抑制因子の精製 健常人の血液７５ｍｌに当量の１５０ｍＭの食塩及び１
０ｍＭのエチレンジアミン４酢酸２ナトリウムを含むｐ
Ｈ８．５の２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液を加え、１，０
００ｇで２０分間遠心し、上清を得た。上清に２ｍＭの
ジイソプロピルフルオロリン酸を加え、４℃で４時間撹
拌して内在性のセリンプロテアーゼを失活させた後、ア
ンモニア水でｐＨ８．５に調整しながら５５％飽和とな
るように硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌した。５５
％飽和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで２０分間遠心
後、その上清にさらに８０％飽和となるように硫安を添
加し、４℃で約１時間撹拌した。８０％飽和硫安溶液を
４℃、１０，０００ｇで２０分間遠心後、得られた沈殿
を少量の１３０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭ
のＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、同緩衝液に対して透析し
たものを粗精製品１とした。

【００１７】粗精製品１を予め１３０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社）カ
ラム（直径５．０ｃｍ×高さ２．５ｃｍ）にアプライし
た。約２００ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、約２００ｍ
ｌの２００ｍＭのＮ-アセチルグルコサミンを含む同緩
衝液で吸着物を溶出し、粗精製品２とした。流速は３ｍ
ｌ／分で行った。図１に精製２段目のＷＧＬセファロー
スクロマトグラフィーの結果の一例を示した。

【００１８】粗精製品２を限外濾過中空糸（旭化成工
業）を用いて２ｍｌに濃縮し、これを予めＰＢＳ（１．
１５ｇリン酸二ナトリウム、０．２ｇリン酸一カリウ
ム、８ｇ食塩、０．２ｇ塩化カリウム／リットル、ｐＨ
７．３）で十分に平衡化したスーパーデックス２００ｐ
ｇ（ファルマシア社）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ６
５ｃｍ）でゲル濾過した。巨核球増幅を抑制する本発明
の因子は分子量が約１５００００付近にピークを有する
画分、即ち約１０ｍｌの粗精製品３として回収された。
流速は０．５ｍｌ／分で行った。図２に精製３段目のス
ーパーデックス２００ｐｇカラムクロマトグラフィーの
結果の一例を示した。

【００１９】粗精製品３を予めＰＢＳで十分に平衡化し
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ１．０ｃｍ）にア
プライした。約３０ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、約２
０ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液で吸着物を溶出
し、最終精製品とした。流速は３ｍｌ／分で行った。図
３に精製４段目のブルーセファロースカラムクロマトグ
ラフィーの結果の一例を示した。

【００２０】最終精製品を予めＰＢＳで十分に平衡化し
たスーパーデックス２００ｐｇ（ファルマシア社）カラ
ム（直径１．６ｃｍ×高さ６２ｃｍ）で再びゲル濾過し
たところ、分子量約１５００００付近に単一のピークが
得られ、実質的な純化が確認された。なお、このカラム
において分子量は±５００００程度の誤差があるものと
考えられる。

【００２１】各精製工程における蛋白質の回収率を表に
示した。

【００２２】

【表１】

【００２３】

【実施例２】 正常ウサギ血漿からの造血抑制因子の精
製 ２．５〜３．０ｋｇのニュージーランドホワイトウサギ
の血液６０ｍｌに当量の１５０ｍＭの食塩及び１０ｍＭ
のエチレンジアミン４酢酸２ナトリウムを含むｐＨ８．
５の２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液を加え、１，０００ｇ
で２０分間遠心し、上清を得た。各上清に２ｍＭのジイ
ソプロピルフルオロリン酸を加え、４℃で４時間撹拌し
て内在性のセリンプロテアーゼを失活させた後、アンモ
ニア水でｐＨ８．５に調整しながら５５％飽和となるよ
うに硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌した。５５％飽
和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで２０分間遠心後、
その上清にさらに８０％飽和となるように硫安を添加
し、４℃で約１時間撹拌した。８０％飽和硫安溶液を４
℃、１０，０００ｇで２０分間遠心後、得られた沈殿を
少量の１３０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、同緩衝液に対して透析した
ものを粗精製品１とした。

【００２４】粗精製品１を予め１３０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社）カ
ラム（直径５．０ｃｍ×高さ２．５ｃｍ）にアプライし
た。約２００ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、約２００ｍ
ｌの２００ｍＭのＮ-アセチルグルコサミンを含む同緩
衝液で吸着物を溶出し、粗精製品２とした。流速は３ｍ
ｌ／分で行った。図４に精製２段目のＷＧＬセファロー
スクロマトグラフィーの結果の一例を示した。

【００２５】粗精製品２を限外濾過中空糸（旭化成工
業）を用いて２ｍｌに濃縮し、これを予めＰＢＳで十分
に平衡化したスーパーデックス２００ｐｇ（ファルマシ
ア社）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ６５ｃｍ）でゲル
濾過した。巨核球増幅を促進する活性は、分子量が約５
００００付近にピークとして溶出されたが、巨核球増幅
を抑制する本発明の因子は分子量が約１５００００付近
にピークを有する画分、即ち約１０ｍｌの粗精製品３と
して回収された。流速は０．５ｍｌ／分で行った。図５
に精製３段目のスーパーデックス２００ｐｇカラムクロ
マトグラフィーの結果の一例を示した。

【００２６】粗精製品３を予めＰＢＳで十分に平衡化し
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ１．０ｃｍ）にア
プライした。約３０ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、約２
０ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液で吸着物を溶出
し、最終精製品とした。流速は３ｍｌ／分で行った。図
６に精製４段目のブルーセファロースカラムクロマトグ
ラフィーの結果の一例を示した。

【００２７】最終精製品を予めＰＢＳで十分に平衡化し
たスーパーデックス２００ｐｇ（ファルマシア社）カラ
ム（直径１．６ｃｍ×高さ６２ｃｍ）で再びゲル濾過し
たところ、分子量約１５００００付近に単一のピークが
得られ、実質的な純化が確認された。なお、このカラム
において分子量は±５００００程度の誤差があるものと
考えられる。

【００２８】

【実施例３】 血小板減少症ウサギ血漿からの造血抑制
因子の精製 ニュージーランドホワイトウサギからクエン酸ナトリウ
ムを用いて全採血後、１００ｇで２０分間遠心し、上清
の血小板を集めた。これに１．５ｍＭのエチレンジアミ
ン４酢酸２ナトリウムを含むＰＢＳを当量加え、４００
ｇで１５分間遠心し、沈殿の血小板を集めた。血小板を
同緩衝液で同様にして２回洗浄した後、少量の同緩衝液
に懸濁した。血小板懸濁液にフロイント完全アジュバン
ドを適量加え乳化して、ヤギの皮下または皮内の数か所
に２週間おきに接種した。一回の接種にはウサギ２羽分
の血小板を用いた。７回目の接種から２週間後に全採血
し、抗ウサギ血小板ヤギ抗血清約１０００ｍｌを取得し
た。

【００２９】２．５〜３．０ｋｇのニュージーランドホ
ワイトウサギに、上記により得られた抗ウサギ血小板ヤ
ギ抗血清を３ｍｌ静注することにより血小板減少症を引
き起こした。抗血清投与５〜６時間後に心臓採血して得
た血液を血小板減少症血液とし、血液６０ｍｌに当量の
１５０ｍＭの食塩及び１０ｍＭのエチレンジアミン４酢
酸２ナトリウムを含むｐＨ８．５の２０ｍＭのトリス塩
酸緩衝液を加え、１，０００ｇで２０分間遠心し、上清
を得た。上清に２ｍＭのジイソプロピルフルオロリン酸
を加え、４℃で４時間撹拌して内在性のセリンプロテア
ーゼを失活させた後、アンモニア水でｐＨ８．５に調整
しながら５５％飽和となるように硫安を添加し、４℃で
約１時間撹拌した。５５％飽和硫安溶液を４℃、１０，
０００ｇで２０分間遠心後、その上清にさらに８０％飽
和となるように硫安を添加し、４℃で約１時間撹拌し
た。８０％飽和硫安溶液を４℃、１０，０００ｇで２０
分間遠心後、得られた沈殿を少量の１３０ｍＭの食塩を
含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解
し、同緩衝液に対して透析したものを粗精製品１とし
た。

【００３０】粗精製品１を予め１３０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡
化したＷＧＬセファロース６ＭＢ（ファルマシア社）カ
ラム（直径５．０ｃｍ×高さ２．５ｃｍ）にアプライし
た。約２００ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、約２００ｍ
ｌの２００ｍＭのＮ-アセチルグルコサミンを含む同緩
衝液で吸着物を溶出し、粗精製品２とした。流速は３ｍ
ｌ／分で行った。図７に精製２段目のＷＧＬセファロー
スクロマトグラフィーの結果の一例を示した。

【００３１】粗精製品２を限外濾過中空糸（旭化成工
業）を用いて２ｍｌに濃縮し、これを予めＰＢＳで十分
に平衡化したスーパーデックス２００ｐｇ（ファルマシ
ア社）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ６５ｃｍ）でゲル
濾過した。巨核球増幅を促進する活性は、分子量が約５
００００付近にピークとして溶出されたが、巨核球増幅
を抑制する本発明の因子は分子量が約１５００００付近
にピークを有する画分、即ち約１０ｍｌの粗精製品３と
して回収された。流速は０．５ｍｌ／分で行った。図８
に精製３段目のスーパーデックス２００ｐｇカラムクロ
マトグラフィーの結果の一例を示した。

【００３２】粗精製品３を予めＰＢＳで十分に平衡化し
たブルーセファロース・ファーストフロー（ファルマシ
ア社）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ１．０ｃｍ）にア
プライした。約３０ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、約２
０ｍｌの１．５Ｍ食塩を含む同緩衝液で吸着物を溶出
し、最終精製品とした。流速は３ｍｌ／分で行った。図
９に精製４段目のブルーセファロースカラムクロマトグ
ラフィーの結果の一例を示した。

【００３３】最終精製品を予めＰＢＳで十分に平衡化し
たスーパーデックス２００ｐｇ（ファルマシア社）カラ
ム（直径１．６ｃｍ×高さ６２ｃｍ）で再びゲル濾過し
たところ、分子量約１５００００付近に単一のピークが
得られ、実質的な純化が確認された。なお、このカラム
において分子量は±５００００程度の誤差があるものと
考えられる。

【００３４】

【実施例４】 本発明の造血抑制因子の造血抑制活性 ヒト、正常ウサギ及び血小板減少症ウサギの血漿から得
た粗精製品３について、それぞれの造血抑制活性を参考
例に示した方法で検討した。ヒト由来造血抑制因子の結
果を図１０に、正常ウサギ由来造血抑制因子の結果を図
１１に、血小板減少症ウサギ由来造血抑制因子の結果を
図１２に示した。共に添加量依存的に巨核球増幅を抑制
し、該因子粗精製品１μｇ／ｍｌの濃度で５０％以上抑
制した。また巨核球増幅を促進する因子を共存させた条
件下でも同様に検討した。即ち１０ｎｇ／ｍｌのヒト組
換え型ＩＬ−６（米国、アップステートバイオテクノロ
ジー社）共存下及び５０μｇ／ｍｌのウサギトロンボポ
エチン粗精製品共存下のそれぞれで、ヒト、正常ウサギ
及び血小板減少症ウサギのそれぞれの血漿から得た粗精
製品３について、造血抑制活性を参考例に示した方法で
検討した。ヒト由来造血抑制因子の結果を図１３に、正
常ウサギ由来造血抑制因子の結果を図１４に、血小板減
少症ウサギ由来造血抑制因子の結果を図１５に示した。
巨核球増幅を促進する因子、即ちＩＬ−６およびウサギ
トロンボポエチン粗精製品をそれぞれ共存させたいずれ
の条件下においても、添加量依存的に巨核球増幅を抑制
し、該因子粗精製品１０μｇ／ｍｌの濃度で５０％以上
抑制した。なお、ウサギトロンボポエチン粗精製品とし
て、実施例３に記載のゲル濾過で５００００付近に溶出
された巨核球増幅活性を有する画分を用いた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 硫安塩析により得られたヒト由来造血抑制
因子粗精製品１のＷＧＬセファロース６ＭＢカラムクロ
マトグラムである。

【図２】 ＷＧＬセファロース６ＭＢカラムクロマト
グラフィーにより得られたヒト由来造血抑制因子粗精製
品２のスーパーデックス２００ｐｇクロマトグラムであ
る。

【図３】 スーパーデックス２００ｐｇカラムクロマ
トグラフィーにより得られたヒト由来造血抑制因子粗精
製品３のブルーセファロースカラムクロマトグラムであ
る。

【図４】 硫安塩析により得られた正常ウサギ由来造
血抑制因子粗精製品１のＷＧＬセファロース６ＭＢカラ
ムクロマトグラムである。

【図５】 ＷＧＬセファロース６ＭＢカラムクロマト
グラフィーにより得られた正常ウサギ由来造血抑制因子
粗精製品２のスーパーデックス２００ｐｇクロマトグラ
ムである。

【図６】 スーパーデックス２００ｐｇカラムクロマ
トグラフィーにより得られた正常ウサギ由来造血抑制因
子粗精製品３のブルーセファロースカラムクロマトグラ
ムである。

【図７】 硫安塩析により得られた血小板減少症ウサ
ギ由来造血抑制因子粗精製品１のＷＧＬセファロース６
ＭＢカラムクロマトグラムである。

【図８】 ＷＧＬセファロース６ＭＢカラムクロマト
グラフィーにより得られた血小板減少症ウサギ由来造血
抑制因子粗精製品２のスーパーデックス２００ｐｇクロ
マトグラムである。

【図９】 スーパーデックス２００ｐｇカラムクロマ
トグラフィーにより得られた血小板減少症ウサギ由来造
血抑制因子粗精製品３のブルーセファロースカラムクロ
マトグラムである。

【図１０】 スーパーデックス２００ｐｇカラムクロ
マトグラフィーにより得られたヒト由来造血抑制因子粗
精製品３の造血抑制活性を示した。

【図１１】 スーパーデックス２００ｐｇカラムクロ
マトグラフィーにより得られた正常ウサギ由来造血抑制
因子粗精製品３の造血抑制活性を示した。

【図１２】 スーパーデックス２００ｐｇカラムクロ
マトグラフィーにより得られた血小板減少症ウサギ由来
造血抑制因子粗精製品３の造血抑制活性を示した。

【図１３】 スーパーデックス２００ｐｇカラムクロ
マトグラフィーにより得られたヒト由来造血抑制因子粗
精製品３の、巨核球増幅因子共存下における造血抑制活
性を示した。

【図１４】 スーパーデックス２００ｐｇカラムクロ
マトグラフィーにより得られた正常ウサギ由来造血抑制
因子粗精製品３の、巨核球増幅因子共存下における造血
抑制活性を示した。

【図１５】 スーパーデックス２００ｐｇカラムクロ
マトグラフィーにより得られた血小板減少症ウサギ由来
造血抑制因子粗精製品３の、巨核球増幅因子共存下にお
ける造血抑制活性を示した。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の性質を有することを特徴とする
   造血抑制因子。 （ａ）１３０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
   Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
   エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で小麦胚
   芽レクチンに吸着する。 （ｂ）ゲル濾過で分子量が１５００００±５００００の
   位置に溶出される。 （ｃ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）条件下でブルー
   色素に吸着する。 （ｄ）マウス骨髄巨核球増幅活性を抑制する。
2. 【請求項２】 造血抑制因子がヒト由来である請求項
   １に記載の造血抑制因子。
3. 【請求項３】 有効量の請求項１に記載の造血抑制因
   子、及び製薬剤的に許容される担体を含有することを特
   徴とする造血抑制用医薬組成物。
4. 【請求項４】 小麦胚芽レクチンまたはブルー色素を
   用いることを特徴とする請求項１に記載の造血抑制因子
   の製造方法。