JPH08289794A - 大腸菌における抗体、抗体フラグメントおよび抗体フラグメント融合分子の細胞質発現 - Google Patents

大腸菌における抗体、抗体フラグメントおよび抗体フラグメント融合分子の細胞質発現

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JPH08289794A JP8087788A JP8778896A JPH08289794A JP H08289794 A JPH08289794 A JP H08289794A JP 8087788 A JP8087788 A JP 8087788A JP 8778896 A JP8778896 A JP 8778896A JP H08289794 A JPH08289794 A JP H08289794A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 これまで、抗体、抗体フラグメントまたは抗
体フラグメント融合分子は大腸菌内ではペリプラズムへ
の輸送を制御するシグナル配列を用いることによっての
み発現可能で、しかも機能的に活性な抗体フラグメント
を得るためには再フォールディングが要求される場合が
多かった。 【解決手段】 本発明は大腸菌における抗体、抗体フラ
グメントおよび抗体フラグメント融合分子の細胞質発現
に関し、チオレドキシンリダクターゼ欠損大腸菌株を用
い、発現産物をその細胞質から単離することを特徴とす
る抗体、抗体フラグメント、または哺乳動物もしくは大
腸菌細胞質酵素を融合パートナーとして含有する抗体フ
ラグメント−酵素融合分子の組換え発現方法を提供す
る。 【効果】 大腸菌において、抗体、抗体フラグメントお
よび抗体フラグメント融合分子とくに、腫瘍に向けられ
た抗体の残基と非毒性プロドラッグを切断して毒性薬剤
を与える酵素の残基を有する抗体フラグメント融合蛋白
質がそれらそれぞれの機能特性を維持したまま有利に製
造できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は大腸菌における抗
体、抗体フラグメントおよび抗体フラグメント融合分子
の細胞質発現に関する。とくに、腫瘍に向けられた抗体
の残基と非毒性プロドラッグを切断して毒性薬剤を与え
る酵素の残基を有する抗体フラグメント融合蛋白質が、
この方法によって、それらそれぞれの機能特性を維持し
たまま有利に製造できる。
【０００２】
【従来の技術】これまで、抗体または抗体フラグメント
は大腸菌内ではペリプラズムへの輸送を制御するシグナ
ル配列を用いることによってのみ発現可能であった。大
腸菌のペリプラズムで発現が起こる場合、発現収率は培
養培地１リットルあたり数μｇの範囲で変動する（Ayal
aら, Bio Techniques 13, 790〜799頁, 1992）。しかも
機能的に活性な抗体フラグメント（Ｆａｂ）または抗原
結合領域（ｓＦｖ）を得るためには再折りたたみ(refol
ding)実験を要求されることが多い。
【０００３】
【発明が解決しようとする手段】したがって、機能的に
活性な抗体または抗体フラグメントの発現には、なお、
改良方法の開発が必要であった。ＡＤＥＰＴの考え方
（Bagshawe, Br.J.Cancer,60巻, 275〜281頁, 1989）に
関連して、これらの改良は、抗体フラグメント−酵素融
合分子、とくに細胞質性哺乳動物もしくは大腸菌酵素た
とえば大腸菌β−グルクロニダーゼを含有する融合蛋白
質にも適用可能でなければならない。
【０００４】大腸菌のβ−グルクロニダーゼは生化学的
にも遺伝学的にもよく検討されている。その遺伝子（ｕ
ｉｄＡ）はJeffersonら（PNAS 83巻, 8447〜8451頁, 19
86）によってクローン化され、異種コントロール領域の
レポーター遺伝子として使用されている。
【０００５】β−グルクロニダーゼ（β−Ｄ−グルクロ
ノシドグルクロノソヒドロラーゼ、Ｅ.Ｃ.３.２.１.３
１）は、β−グルクロニドの切断を触媒する酸ヒドロラ
ーゼである。哺乳動物グルクロニダーゼについての徹底
的な研究の結果、組織学的、分光光学的および蛍光光学
的分析には様々な物質が利用されている。この酵素に
は、標的化腫瘍療法用の融合蛋白質としての用途で、さ
らに新たな重要性が付与されたのである。このことと関
連して、ヒトグルクロニダーゼが、抗体／抗体フラグメ
ントまたは抗原結合領域を含有する融合蛋白質の型で使
用される（Bossletら, Br．J．Cancer, 65, 234〜238,
1992）。ヒト酵素に代えて対応する大腸菌のβ−グルク
ロニダーゼを使用することも可能である。大腸菌のβ−
グルクロニダーゼを用いる利点の一つは生理的pHにおけ
るその触媒活性がヒトβ−グルクロニダーゼの場合に比
べて有意に高いことである。
【０００６】これまで抗体フラグメント−酵素融合分子
は、大腸菌ではペリプラズムで発現させることしかでき
なかった。したがって、この場合に使用される酵素残基
は常にたとえばβ−ラクタマーゼのような大腸菌のペリ
プラズム酵素から構成されている（Goshornら, Canc．R
es. 53, 2123〜2117, 1993）。
【０００７】これまで大腸菌では、細胞質大腸菌酵素た
とえばβ−グルクロニダーゼを用いては、抗体フラグメ
ント−酵素融合蛋白質を、機能的に活性な状態で、すな
わちその酵素活性また抗体残基の抗原結合活性を維持し
たままで発現させることはできなかった。一般的に、大
部分の抗体または抗体フラグメント分子の機能的に活性
な発現には、小胞体を介して発現分子を培養培地中に
（動物細胞または酵母）またはペリプラズム中に（大腸
菌）排出するために特定のシグナル配列を必要とする。
機能的活性に重要なジスルフィド橋の形成に必要な酸化
条件に適しているのは小胞体またはペリプラズム内のみ
である。しかも、発現した蛋白質の正しい三次元折りた
たみには分泌性合成経路が決定的な問題であることが多
い。
【０００８】チオレドキシンリダクターゼを欠損した大
腸菌株、たとえばＡＤ ４９４は、細胞質内でジスルフ
ィド橋を形成することが可能であり、したがって、自然
に分泌される酵素、たとえばアルカリホスファターゼを
細胞内で発現させることができる（Dermanら, Science,
262巻, 1744〜1747, 1993）。
【０００９】
【課題を解決するための手段】今回、Ｆａｂ分子、たと
えばＭａｂ ＢＷ ４３１／２６が、チオレドキシンリダ
クターゼを欠損した大腸菌株においては、機能的に活性
な状態で、すなわちその抗原結合性が完全な抗体と全く
同様に維持されて、細胞質内において発現できることが
見出された。
【００１０】さらに、驚くべきことに、たとえば細胞質
性の非ジスルフィド橋大腸菌酵素のβ−グルクロニダー
ゼと、たとえばこちらは正しい折りたたみのための分子
内シスチン橋を必要とするＦａｂ ＢＷ ４３１／２６と
から構成される抗体フラグメント−酵素融合分子（Ｆａ
ｂ ＢＷ ４３１／２６−大腸菌β−グルクロニダーゼ）
を細胞質内で発現させて、そこから機能的な形態で単離
することが可能になった。同時に、発現された分子は可
溶性で、再折りたたみ実験は不必要であった。これは治
療および診断用の抗体、抗体フラグメントおよび抗体フ
ラグメント−酵素融合分子の経済的な製造のための新し
い機会を開くものである。
【００１１】発明の実施の形態 したがって、本発明は、抗体、抗体フラグメント、また
は哺乳動物または大腸菌細胞質酵素を融合パートナーと
して含有する抗体フラグメント融合分子のチオレドキシ
ンリダクターゼ欠損大腸菌株を用いる組換え発現および
細胞質からのその発現産物の単離方法に関する。このこ
とに関連して、抗体フラグメントは好ましくはＦａｂも
しくは他の抗原結合領域（sFv, Plueckthun & Skerra,
Meth. Enzymol. 178, 497〜515 頁, 1991）である。最
終的に、抗体フラグメント−酵素融合蛋白質は、融合パ
ートナーとして細胞質大腸菌酵素を含むもの、とくに融
合パートナーとして大腸菌β−グルクロニダーゼを含む
ものが好ましい。
【００１２】以下の実施例は本発明を例示するものであ
る。
【００１３】
【実施例】
シグナル配列のないジシストロン発現ベクターの構築 例１ Ａ） 大腸菌ＲＲ１からの大腸菌β−グルクロニダーゼ
のクローニング：大腸菌β−グルクロニダーゼをコード
するＤＮＡ配列を、大腸菌ＲＲ１からプライマーE.c.β
Gluc．forおよびE.c.β Gluc．backを用いてＰＣＲに
より増幅し、Ｘｂａ ＩおよびＨｉｎｄ III部位でベク
ターＫＳにクローニングした（図１）。
【００１４】Ｂ） 大腸菌β−グルクロニダーゼの前部
へのＶＨ／ＣＨ１およびリンカーＭａｂ ＢＷ ４３１／
２６のクローニング：可変ドメインＶＨおよび定常ドメ
インＣＨ１を入手可能なＨＣ−ｈｕｍ−β−グルクロニ
ダーゼｃＤＮＡ構築体からプライマーＦａｂ ＨＣ ｆｏ
ｒおよびＦａｂ ＨＣ ｂａｃｋを用いてＰＣＲにより増
幅し、Ｘｂａ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉ部位でベクターＫＳ
にクローニングした（図２）。ＤＮＡ配列を確証したの
ち、Ｘｂａ ＩおよびＮｃｏ Ｉで消化して単離したＤＮ
Ａフラグメントを、Ｘｂａ IおよびＮｃｏ Ｉで予め消
化したクローニング工程Ａからのベクター中にライゲー
トした（図３）。
【００１５】Ｃ） Ｆａｂ ＢＷ ４３１／２６−大腸菌
β−グルクロニダーゼのｐＴｒｃ９９へのクローニン
グ：大腸菌β−グルクロニダーゼに融合した相当する重
鎖を含有するＸｂａ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを
発現ベクターｐＴｒｃ ９９中に存在するＭａｂ ＢＷ
４３１／２６の軽鎖にライゲートした（Amannら、 Gene
69、 301、 1988）（図４）。得られた構築体は構造：
プロモーター（ｔｒｃ）−シャインダルガノ配列（Ｓ
Ｄ）−ＶＫ／ＣＫ Ｍａｂ ＢＷ ４３１／２６−ＳＤ−
ＶＨ／ＣＨ１ Ｍａｂ ４３１／２６−大腸菌β−グルク
ロニダーゼ−転写終結シグナルを有する（図５〜７）。
【００１６】例２ ＡＤ ４９４の発現 例１に記載のpTrc dicistr. Ｆａｂ−大腸菌β−グルク
ロニダーゼを繋留するＡＤ ４９４の一夜培養液を１：
１０に希釈し、ＯＤ600が０.７に達するまで２５℃でイ
ンキュベートした。１mMのＩＰＴＧで１９〜２２時間誘
導したのち、細胞を氷上にて１〜１.５時間インキュベ
ートした。細胞をペレット化したの、培養体容量１リッ
トルあたり１０mlのＰＢＳ、pH７.２に再懸濁したの
ち、細胞をフレンチプレスによって１０００〜１５００
Psiで破壊した。破壊された細胞の懸濁液をＳＳ−３４
ローター中２０,０００rpmで澄明にし、上清を以下の検
討に使用した。
【００１７】例３ 融合分子のアフィニティークロマトグラフィーによる精
製 破壊された細胞の懸濁液上清を２μmのフィルターを通
して澄明化したのち、融合蛋白質をアフィニティークロ
マトグラフィーにより、抗イディオタイプモノクローナ
ル抗体（ＢＷ ２０６４／３４, Ｍａｂ ６mg／ml Ｃｎ
Ｂｒ−活性化Sepharose ４Ｂ）に結合させて精製した。
アフィニティーカラムに結合した融合蛋白質をpH移動
（pH７.２−pH５.０）により溶出させた。溶出液をつい
で限外ろ過によって濃縮した（Filtron Macrosep. Omeg
a NMWL:30 KD）。破壊細胞懸濁液上清、空隙容量、濃縮
溶出液および限外ろ過からのろ液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析した。約９７ ＫＤに出現するバンドが、その
分子量からみて抗体の重鎖残基および大腸菌β−グルク
ロニダーゼからなる期待の融合蛋白質に相当する。約７
０ ＫＤに出現するバンドは、発現した重鎖／β−グル
クロニダーゼと内因性のβ−グルクロニダーゼの間での
ヘテロテトラマー（下記参照）の形成によりアフィニテ
ィークロマトグラフィー時に同時に精製された内因性β
−グルクロニダーゼを示す。
【００１８】例４ ＴＳＫ ３０００ゲルクロマトグラフィー ネイティブな分子をＴＳＫ ３０００ゲルクロマトグラ
フィーによって調べ、その分子量は４５０ ＫＤである
ことを見出した。グルクロニダーゼはネイティブな状態
でテトラマーを形成するので、観察された分子量は理論
的に期待される分子量に相当する。この工程は以下に詳
述する。
【００１９】抗イジオタイプアフィニティーで精製した
融合蛋白質４００ngを、２５μl中で、ＴＳＫゲルＧ３
０００ ＳＷ ＸＬカラム（ＴＯＳＯ ＨＡＡＳ、カタロ
グ番号３.５ＷｘＮ３２１１、７.８mm×３００mm）上適
当な移動相（ＰＢＳ、pH７.２、５ｇ／リットル マルト
ース、４.２ｇ／リットル アルギニン）中、流速０.５m
l／分においてクロマトグラフィーに付した。Merck Hit
achi ＨＰＬＣユニット（Ｌ−４００ ＵＶ検出器、Ｌ−
６２１０知能ポンプ、Ｄ−２５００クロマト積分計）を
約２０barで操作して溶出液の光学密度を２８０nmで測
定し、ＬＫＢ２１１１ Mutisacフラクションコレクター
を用いて０.５mlの分画を集め、続いて酵素活性特異性
試験で分析した（例５）。実験は図８に記述する。矢印
で示した検量蛋白質の分子量位置に基づき、機能的に活
性なＦａｂ−大腸菌β−グルクロニダーゼ融合蛋白質は
約４５０ ＫＤの分子量をもつと結論することができ
る。
【００２０】例５ 抗原結合性および酵素活性の証明 Ｆａｂ−大腸菌β−グルクロニダーゼ融合蛋白質が、Ｃ
ＥＡ（癌胎児性抗原）上のＭａｂ ４３１／２６−特定
エピトープに特異的に結合し、同時にβ−グルクロニダ
ーゼの酵素活性を発揮する能力は酵素活性特異性試験で
証明された（ＥＰ−Ａ−０ ５０１ ２１５Ａ２、 例
Ｊ）。試験は、融合蛋白質がそのＦａｂ残基によって抗
原に結合したのちに、融合蛋白質のβ−グルクロニダー
ゼ残基による４−メチルウンベリフェリル−β−グルク
ロニドからの４−メチルウンベリフェロンの遊離によっ
て測定した。測定された蛍光値は相対的蛍光単位（Ｆ
Ｕ）として与えられる（表１）。この試験により、融合
蛋白質はＣＥＡコートプレート中にメチルウンベリフェ
ロンの有意な遊離を起こさせることが証明される。
【００２１】ＰＥＭ（多型上皮性ムチン）コートプレー
トを対照として用いた。これらのプレートでは蛍光シグ
ナルは常に３０ ＦＵ未満である。
【００２２】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌β−グルクロニダーゼをコードするＤＮ
Ａ配列の、大腸菌ＲＲ１からのＰＣＲ増幅に使用したプ
ライマーE．c．β Gluc．for およびE．c．β Gluc．ba
ck、大腸菌β−グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ配
列、ならびにそれをＸｂａＩおよびＨｉｎｄ III部位で
ベクターＫＳにクローニングして得られた構築体KS＋
E．c．β Gluc．の制限酵素地図。
【図２】可変ドメインＶＨおよび定常ドメインＣＨ１を
入手可能なＨＣ−ｈｕｍ−β−グルクロニダーゼｃＤＮ
Ａ構築体pAB Stop c-DNA HC/hu β-Gluc、そのＰＣＲ増
幅に用いたプライマーFab HCforおよびFab HCbackなら
びにｃＤＮＡ構築体をＸｂａＩおよびＥｃｏＲ Ｉ部位
でベクターＫＳにクローニングして得られた構築体ＫＳ
＋Ｆａｂ ＨＣの制限酵素地図。
【図３】図２のＫＳ＋Ｆａｂ ＨＣをＸｂａ ＩおよびＮ
ｃｏ Ｉで消化して単離したＤＮＡフラグメントを、Ｘ
ｂａ ＩおよびＮｃｏ Ｉで予め消化した図１のベクター
KS＋E.c.β Gluc．中にライゲートして得られた構築体K
S＋Fab HC/E.c.β Gluc．の制限酵素地図。
【図４】大腸菌β−グルクロニダーゼに融合した重鎖を
含有するFab HC/E.c.β Gluc.のＸｂａ Ｉ／Ｈｉｎｄ I
IIフラグメント、Ｍａｂ ＢＷ ４３１／２６の相当する
軽鎖を含有する発現ベクターｐＴｒｃ９９、および前者
を後者にライゲートして得られたpTrc99＋dicistr.Fab/
E.c.β Gluc．の制限酵素地図。
【図５】ｐＴｒｃ９９中４３１／２６ hum dicistr. Fa
b/E.c.β Glucronidaseの制限酵素地図ならびにその遺
伝子配列およびアミノ酸配列。
【図６】図５における、ｐＴｒｃ９９中４３１／２６ h
um dicistr. Fab/E.c.β Glucronidaseの制限酵素地図
ならびにその遺伝子配列およびアミノ酸配列の続きであ
る。
【図７】図６における、ｐＴｒｃ９９中４３１／２６ h
um dicistr. Fab/E.c.β Glucronidaseの制限酵素地図
ならびにその遺伝子配列およびアミノ酸配列の続きであ
る。
【図８】抗イジオタイプアフィニティーで精製した融合
蛋白質のＴＳＫ−３０００ゲルクロマトグラフィー。融
合蛋白質の保持時間：１３.４分。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 クラウス・ボスレツト ドイツ連邦共和国35037マルブルク．アン デアハウシユタト64 (72)発明者 イエルク・チエツク ドイツ連邦共和国35041マルブルク．クロ イツアカー２アー

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 チオレドキシンリダクターゼ欠損大腸菌
    株を用い、発現産物をその細胞質から単離することを特
    徴とする抗体、抗体フラグメント、または哺乳動物もし
    くは大腸菌細胞質酵素を融合パートナーとして含有する
    抗体フラグメント−酵素融合分子の組換え発現方法。
  2. 【請求項２】 Ｆａｂフラグメントまたは抗原結合領域
    （sFv）が発現される請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 抗体フラグメント−酵素融合分子の抗体
    残基は腫瘍細胞に向けられた抗体であり、酵素残基は非
    毒性プロドラッグを切断して毒性薬剤を与えることがで
    きる請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 抗体残基はヒト化されていて、酵素残基
    はヒト細胞質酵素である請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 大腸菌β−グルクロニダーゼが融合パー
    トナーである抗体フラグメント−酵素融合蛋白質。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の融合蛋白質をコードす
    る遺伝子。
JP8087788A 1995-04-11 1996-04-10 大腸菌における抗体、抗体フラグメントおよび抗体フラグメント融合分子の細胞質発現 Pending JPH08289794A (ja)

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