JPH082906B2 - 新規な免疫抑制剤化合物 - Google Patents

新規な免疫抑制剤化合物

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JPH082906B2
JPH082906B2 JP1165522A JP16552289A JPH082906B2 JP H082906 B2 JPH082906 B2 JP H082906B2 JP 1165522 A JP1165522 A JP 1165522A JP 16552289 A JP16552289 A JP 16552289A JP H082906 B2 JPH082906 B2 JP H082906B2
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テー．チエン シイー―シユング
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メルク エンド カムパニー インコーポレーテツド
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な免疫抑制剤“デメトマイシン”（L-68
2,933、31−デスメトキシ−31−ヒドロキシ−L-679,934
とも言われる）、その産生に微生物アクチノプラナセテ
種（MA6559、Actinoplanacetesp.）を用いる新規な発酵
方法に関する。この方法はL-679,934のC31メトキシ基を
脱メチル化する条件下でL-679,934と微生物を培養する
ことを含む。更にヒト宿主の自己免疫疾患、感染症の治
療及び／又は器官移植片拒否反応を防止するための使用
方法を開する。
1983年に米国FDAは器官移植片手術の分野に大改革を
起こした非常に有効な抗拒絶剤、シクロスポリンを認可
した。この薬剤は移植片の異種タンパク質を拒絶するた
めに体の免疫系が自然保護因子の莫大な貯蔵を可動させ
ることを阻止することにより作用する。
この薬剤は移植拒絶反応に抵抗するには有効である
が、多くの場合かなり重篤になり得る腎不全、肝損傷及
び潰瘍を引き起こす欠点を持っている。
フジサワによる欧州特許庁公告第0184162号にはシク
ロスポリンより100倍以上有効であると見なされる新規
なマクロライド免疫抑制剤FK-506が記述されておりこの
引例を本明細書中に引用する。このマクロライドは特定
菌株ストレプトマイセスツクバエンシス（Streptomyces
tsukubaensis）の発酵によって製造される。またS.ヒ
グロスコピカス（S.hygroscopicus）亜種ヤクシマエン
シス（yakushimaensis）により産生される密接に関連し
たマクロライド免疫抑制剤FK-520も述べられている。
T.アライによる米国特許第3,244,592号には抗真菌剤
“アスコマイシン”を産生するためにストレプトマイセ
スヒグロスコピカスの変異株アスコマイセチカス（asco
myceticus）の培養が記述されている。
しかしながらいずれの免疫抑制剤の製造の文献にもシ
クロスポリンの副作用が実質的に存在しないという記載
はない。
この分野では副作用の少ない安全な新しい薬剤が絶え
ず探索されている。
窒素栄養源を含む水性炭水化物培地中、深部好気性条
件下微生物アクチノプラナセテ種ATCC No.53771をマク
ロライド免疫抑制剤L-679,934と発酵させ、該条件がL-6
79,934をC-31位で選択的に十分脱メチル化させるpH約７
で行なわれることにより新規な免疫抑制剤“デメトマイ
シン”を得ることができることを見い出した。
この結果得られた“デメトマイシン”は本明細書中で
“Ｔ細胞増殖検定”と呼ばれるカルシウムイノフォア
（イオノマイシン）とホルボールミリステートアセテー
ト（PMA）誘発Ｔ細胞刺激検定で証明される通り免疫抑
制活性即ちＴ細胞活性化の陽性阻止を示す。
この検定の原理はイノマイシンとPMAの組合わせで刺
激されたマウスＴリンパ球の増殖を測定するものであ
る。この検定で陽性の試料はトリチウム標識チミジンの
消費が減少を示す通りＴ細胞増殖を阻止する。
本発明は、構造式（Ｉ） を有する新規化合物である。
更に本発明は、化合物（Ｉ）の治療上有効な量と医薬
的に許容しうる実質的に無毒性の担体又は賦形剤とを含
んで成る免疫抑制剤である。
更に本発明は、窒素栄養源を含む水性炭水化物培地
中、深部好気性発酵の条件下で、アクチノプラナセテ種
の菌株を構造式 を有する化合物と共に培養する段階を含んで成る、化合
物（Ｉ）の製造方法である。
更に本発明は、移植拒絶反応を防止するべくヒト宿主
を処置するのに有用な又は自己免疫疾患若しくは感染症
を治療するのに有用な免疫抑制剤を調製するために、化
合物（Ｉ）を使用する方法である。
更に本発明は、化合物（Ｉ）を含む、上記製造方法に
よって調製されたブイヨンである。
更に本発明は、上記製造方法によって製造された化合
物（Ｉ）である。
更に本発明は、Ｔ細胞増殖検定によるＴ細胞活性化の
陽性阻害（IC50約0.6〜1.2×10-9モル）を示し、且つ添
付の第１図に示されるプロトン核磁気共鳴スペクトルを
示す化合物である。
本発明によれば窒素栄養源を含む水性炭水化物培地
中、深部好気性発酵条件下でアクチノプラナセテ種の菌
株MA6559をL-679,934と共に産生物“デメトマイシン”
を十分産生する時間培養する段階を包含している。“デ
メトマイシン”として同定される免疫抑制剤の製造方法
が提供される。
更にＴ細胞増殖検定によりＴ細胞活性化の陽性阻止を
示し第１図により確認されるプロトン核磁気共鳴スペク
トルを示す上記方法によって産生された新規な免疫抑制
剤“デメトマイシン”が提供される。
また医薬的に許容し得る実質的に無毒性の担体又は賦
形剤と併用して“デメトマイシン”の治療上有効な量を
含む医薬組成物が提供される。
更にヒト宿主に“デメトマイシン”の治療上有効な量
を投与することを特徴とする移植拒否反応を妨止するた
めに該宿主を処置するか又は自己免疫疾患又は感染症を
治療する使用方法が提供される。
本発明はアクチノプラセテ種MA6559をL-679,934と共
に発酵させて“デメトマイシン”を産生することを含
む。微生物は現在アメリカン タイプ カルチュア コ
レクション12301 パークラウン ドライブ、ロックビ
ル マリーランドによりATCC No.53771としてメルク
カルチュア コレクション ラーウェイ、ニュージャー
ジイにMA6559として限定寄託している。形態学的培養
上、生物学的及び生理学的特徴を含む物理的特徴及び分
類は以下で簡単に延べられる。
これまで行われていた分類学的解析に基づいて培養株
はアクチノマイセターレス目及びアクチノプラナセア系
に暫定的に割り当てられていた。更に分類的特徴は、こ
の微生物を属及び種に決定的に入れるために検討される
ものである。
この培養株はトリプチケース大豆寒天（28及び37
℃）、酵母麦芽エキス寒天、グリセロールアスパラギン
寒天、無機塩デンプン寒天、オートミール寒天、ツァベ
ックドックス溶液とペプトン寒天及びベンネット寒天を
含む通常の培地で全て28℃で良好に増殖する。
形態−この培養株は直系0.2〜0.4μを有する分岐され
た線状菌糸として増殖する。コロニー組織は酵母麦芽エ
キス寒天でゴム状であるが菌糸の著しいフラグメンテー
ションが観察される他の培地ではブチル状である傾向が
ある。コロニーの表面は外観上粉状である傾向がある。
可溶性色素は観察されなかった。
胞子嚢−は主として球状であり直径４〜25μの大きさ
である。胞子嚢は一般に21日で目に見え、グリセロール
アスパラギン寒天で融合する傾向がある。胞子はブラン
ト末端（0.76×1.98μ）を有する桿状の形をし、非運動
性であり、150μの長さまでの分岐されない長い連鎖に
現われる。
MA6559の培養上の特徴 酵母エキス−麦芽エキス寒天（ISP培地２） 栄養菌糸は透明〜黄色であり、気中菌糸は24〜72時間
で発育し淡黄色〜ローズピンク色で外観上粉末である。
裏面は黄褐色〜帯赤褐色である。
オートミール寒天（ISP培地３） 栄養菌糸は透明〜黄色であり裏面は透明〜黄褐色であ
る。気中増殖は白色〜薄いローズベージュ色であり外観
上粉末である。
無機塩−デンプン寒天（ISP培地４） 光増殖、わずかな気中菌糸。栄養増殖は透明であり、
非常に分裂する。デンプンの透明化は7dで認められるコ
ロニーの周囲で起こる。
グリセロールアスパラギン寒天（ISP培地５） 栄養増殖は透明〜黄色であり、裏面は透明〜肉桂褐色
である。気中菌糸は粉末で白色〜ローズピンク色であ
る。
ペプチド−鉄−酵母エキス寒天（ISP培地６） 栄養増殖は黄褐色である。気中増殖は観察されずメラ
ニン色素は生じない。
チロシン寒天（ISP培地７） 栄養増殖は黄褐色であり培養年齢に応じて深紅色にな
る。気中菌糸はビロード〜灰色がかったローズベージュ
色である。
ツァペック−ドックス寒天 栄養増殖は黄褐色であり培養年齢に応じてピンク色に
なる。気中菌糸は短く湿った状況でつや消しである。
本発明の方法はアクチノプラナセテ種のいかなる“デ
メトマイシン産生”菌株でも実施することができ、特に
ATCC No.53771菌株が好ましい。
一般に“デメトマイシン”は同化される炭素及び窒素
源を含む水性栄養培地中好ましくは深部好気性条件（例
えば振盪培養深部培養等）下デメトマイシン物質産生菌
をL-679,934と培養（発酵）することによって生産する
ことができる。水性培地は、好ましくは発酵過程の開始
及び終結（回収）に於てpH約７に維持される。これより
pHが高いと生成物の本質的及び／又は全体の損失をもた
らす。所望のpHは緩衝液、例えばモルフォリノエタンス
ルホン酸（MES）の使用によって又は、本質的に緩衝特
性を有する栄養物質例えば以下で述べられる産生培地の
選択によって維持することができる。
栄養培地中の好ましい炭素源は炭水化物例えばグルコ
ース、キシロース、ガラクトース、グリセリン、デンプ
ン、デキストリン等である。マルトース、ラムノース、
ラフィノース、アラビノース、マンノース、サリシンコ
ハク酸ナトリウムといった他の炭素源を含むことができ
る。
好ましい窒素源は酵母エキス、肉エキス、ペプトン、
グルテンミール、綿実ミール、大豆ミール及び他の植物
ミール（一部又は全部脱脂された）、カゼイン加水分解
物、大豆加水分解物及び酵母加水分解物、コーンスティ
ープリカー、乾燥酵母、麦芽、羽毛粉、落花生粉、醸造
可溶成分等並びに無機及び有機窒素化合物例えばアンモ
ニウム塩（即ち硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ酸等である。
炭素及び窒素源は組合わせて有利に使用されるが、発
育因子の痕跡とかなりの量の鉱物栄養源を含む純度の劣
る物質も使用に適しているため、これらを純粋な形で使
用する必要はない。所望するときに培地に鉱酸塩例えば
炭酸ナトリウム又はカリウム、リン酸ナトリウム又はカ
リウム、塩化ナトリウム又はカリウム、ヨウ化ナトリウ
ム又はカリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等
を加えることができる。必要があれば特に培地がひどく
あわ立つときあわ消し剤、例えば流動パラフィン、脂肪
油、植物油、鉱油又はシリコーンを加えることができ
る。
L-679,934出発物質は、フジサワによる欧州特許庁公
告第0184162号（この特定の目的に対して本明細書中に
引用する）に記載される、L-679,934と同一であるとこ
ろのFR-900506若しくは“FK-506"を製造するためのS.ts
ukubaensisの発酵によって、若しくは欧州特許庁公告第
0184162号に記載されたFR-900506を調製するための同様
の条件下でのメリーランド州ロックビルのアメリカンタ
イプカルチュアコレクションによって限定寄託されてい
るActinoplanacete sp.（メルクカルチュアコレクショ
ンMA6548）ATCC No.53770の発酵によって得ることが出
来る。
上記で培養株MA6548と呼ばれる簡単な分類上の説明は
次の通りである。
この培養株はトリプチケース大豆寒天（28及び27
℃）、酵母麦芽エキス寒天、無機塩デンプン寒天、グリ
セロールアスパラギン寒天、オートミール寒天、ツァペ
ックドックス寒天、ツァペック溶液寒天、ペプトンツァ
ペック溶液寒天及びベンネット寒天を含む多くの通常の
培地で全て28℃に於て良好に増殖する。
形態−この培養株は、直径0.2〜0.4μを有する分岐さ
れた線状菌糸として増殖する。この培養菌のコロニーは
試験される全ての培地で不透明で隆起し、不斉歯状縁の
あるゴム状の組織である。コロニーの表面は、特に大量
の空気中の発育面では粉状である傾向がある。増殖は48
〜72時間で目に見える。可溶性色素は試験された培地の
いずれにも観察されなかった。
胞子嚢−胞子嚢は主として球状であり、直径10〜40μ
である。大量の増殖面では胞子嚢は不規則な形をした塊
に融合する。胞子はブラント末端（0.8×0.8μ）を有す
る桿状の形をし、非運動性であり分岐されない長い連鎖
で配列している。
酵母麦芽エキス寒天−黄色〜黄色がかった緑色の栄養
増殖は接種48時間以内で目に見える。気中菌糸の白色ふ
さ状分岐は72〜96時間で発育する。裏面は黄色がかった
褐色の色である。
グリセロールアスパラギン寒天−黄色〜オリーブ緑色
の栄養増殖は白色〜黄色の空気増殖のわずかな面を有す
る。裏面は透明〜黄褐色である。
無機塩デンプン寒天−黄色〜黄色がかった緑色の栄養
及び空気増殖。裏側は透明〜黄褐色である。
オートミール寒天−黄色〜黄緑色の栄養増殖。表面は
制限空気増殖により粗粒である。裏側は透明〜薄茶色で
ある。
大量にデメトマイシンを生産する条件については深部
好気性培養条件が好ましい。少量の生産に対してはフラ
スコ又はビンで振盪又は表面培養が使用される。更に増
殖が大きなタンクで行なわれるときデメトマイシンの生
産の過程で増殖遅延を避けるために産生タンクの接種に
増殖形の微生物を使用することが好ましい。従ってまず
比較的少量の培地に“斜面”で生産した微生物の胞子又
は菌糸を接種し、“種子培地とも言われる該接種培地を
培養することによって微生物の栄養接種物を産生した
後、培養した栄養接種物を大きなタンクに無菌的に移す
ことが望ましい。接種物を生産する発酵培地はデメトマ
イシンの生産に使用される培地と実質的に同じか又は異
なり、一般に接種前に培地を滅菌するためにオートクレ
ーブにかけられる。培地のpHは、一般に酸は又は塩基を
好ましくは緩衝液の形で適当に添加してオートクレーブ
前にpH約7.0に調節される。
培養混合物の撹拌及び通気は種々の方法で行なうこと
ができる。撹拌は、プロペラ又は類似の機械的撹拌装置
によって又は発酵槽を回転又は振盪することによって、
種々のポンプ装置によって又は無菌空気を培地に通過さ
せることによって与えることができる。通気は無菌空気
を発酵混合物に通過させることによって行なうことがで
きる。
発酵は通常約20〜40℃好ましくは25〜35℃の温度で約
10〜20時間行なわれるが、発酵条件及び規模によって異
なってよい。産生培養は220rpmで操作する回転振盪機で
27℃に於て約17時間インキュベートしてこの間発酵培地
はpH7.0に維持され、回収されることが好ましい。
発酵を実施する好ましい培養／産生培地は次の培地を
含む。
種子培地Ａ g/l デキストロース 1.0 デキストリン 10.0 牛肉エキス 3.0 アルダミンpH 5.0 NZ アミンタイプＥ 5.0 MgSO4・7H2O 0.05 K2HPO4 0.37 pH7に調整する CaCO3 0.5g/lを加える。
転換培地Ｂ g/l グルコース 10 ハイケースSF ２ 牛肉エキス １ コーンスティープリカー ３ pH7.0に調整する 転換培地Ｃ g/l マンニトール ５ グリセロール ５ ハイケースSF ２ 牛肉エキス １ コーンスティープリカー ３ pH7.0に調整する 生産されたデメトマイシンは他の公知の生物学的に有
効な物質の回収に一般に使用される常法によって培地か
ら回収することができる。デメトマイシン物質は、培養
菌糸及び液中に見い出され、従って菌糸及び液から
分離、精製することができ、これらは、培養ブイヨンを
常法例えば減圧下濃縮、凍結乾燥、通常溶媒例えばメタ
ノール等で抽出、pH調整、通常の樹脂（例えばアニオン
又はカチオン交換樹脂、非イオン吸着樹脂等）で処理、
通常の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、
セルロース、アルミナ等）で処理、結晶、再結晶等で
過又は遠心分離して得られる。溶媒抽出、特にメタノー
ルを使用する方法が好ましい。
発酵からの生産物デメトマイシンは“Ｔ細胞増殖検
定”により陽性の免疫抑制活性を示し、これに基づいて
有用性を有する。
この生産物“デメトマイシン”は次の物理特性を示
す。
1.白色無定形粉末 2.メタノール溶解性 3.FAB質量分光法で測定した分子量789は第３図の認定さ
れた構造及び実験式C43H67NO12（Ｍ＋Li＝796から誘
導）と一致する。
認定されたデメトマイシン構造（第３図）の図解NMR
の特徴は3.1ppm付近の特徴的ケミカルシフトにH-31が共
鳴せずに結合した第１図〜第２図のメトキシシグナルの
喪失である。結合したOHを持ったCHは一般にCH-OCH3に
比べて下位領域の0.1〜0.3ppmであるために、31メチル
が喪失し、H-31がH-13,H-21,H-33と残存しているメトキ
シルを含む3.3〜3.5ppm多重線に置き換わると結論する
ことは穏当である。更に消失メトキシルをC-13又はC-15
よりむしろC-31に認定する証拠は、第１図のH-14とH-15
のケミカルシフトが第２図の親分子のものと同一である
という事実である。また新しい共鳴が見られずH-2〜H-2
8の確認し得る全てのプロトンシグナルがL-679,934のも
のと本質的に重なるためにC-31脱メチル化が唯一の構造
変化であることを推定することは穏当である。
上記で説明した発酵方法に従って得られたデメトマイ
シンは常法、例えば抽出、沈降、分別結晶、再結晶、ク
ロマトグラフィー等で分離、精製することができる。
この物質の適当な塩は、医薬的に許容し得る塩例えば
塩基性塩即ちアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カ
リウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム
塩、マグネシウム塩等）、アンモニウム塩、アミン塩
（例えばトリエチルアミン塩、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチ
ルアミン塩等）及び他の通常の有機塩を包含することが
できる。
前述の発酵反応及び発酵混合物の後処理に於てデメト
マイシンの配座異性体及び／又は立体異性体は不斉炭素
原子又は二重結合のため他の配座異性体及び／又は立体
異性体にしばしば変換することができ、かかる場合もま
た本発明の範囲内に包含される。
本発明のデメトマイシンは薬理作用例えば免疫抑制作
用、抗菌作用等を有し、従って器官又は組織例えば心
臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚等の移植拒否反応、骨髄移
植による対宿主移植片疾患、自己免疫疾患例えばリウマ
チ様関節炎、全身系紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、多発性
硬化症、重症筋無力症、工型糖尿病、葡萄膜炎等の治療
及び予防に有用である。
本発明の医薬組成物は、医薬製剤の形で例えば固体、
半固体又は液体形態で使用することができ、有効成分と
して本発明のデメトマイシンを外用、経腸用又は非経口
用に適当な有機又は無機担体又は賦形剤と混和して含
む。有効成分は具体的には錠剤、小丸薬、カプセル剤、
坐薬、液剤、乳剤、懸濁液剤及び使用に適した他のいか
なる形に対しても、通常の無毒性の医薬的に許容し得る
担体と配合することができる。使用することができる担
体は水、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラ
チン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグ
ネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイ
ダルシリカ、ジャガイモデンプン、尿素及び固体、半固
体又は液体形態の製剤の製造に於いて使用に適した他の
担体であり、更に、補助薬、安定剤、濃厚化剤、着色剤
及び香料を使用することができる。活性な目的化合物は
医薬組成物中に疾患の過程又は症状に対して所望の効果
を充分生じる量で含まれる。
この組成物をヒトに適用するためには非経口又は経腸
投与によって適用することが望ましい。デメトマイシン
の治療上有効な量は治療される各々の患者の年令及び症
状により異なり、またこれに依存するが、有効成分約0.
01〜1000mg、好ましくは0.1〜500mg、更に好ましくは0.
5〜100mgの日用量（70kgの人を基準として計算した）が
疾患の治療に一般に投与され１回の平均服用量約0.5mg,
1mg,5mg,10mg,50mg,100mg,250mg,500mgが一般に投与さ
れる。
次の実施例は本発明を具体的に説明することを目的と
して示され、本発明の範囲又は精神を限定するものとし
て解釈するべきではない。
実施例１ 微生物及び培養条件 凍結乾燥培養株ATCC No.53771をデキストリン10.0
％、デキストロース1.0％、牛肉エキス3.0％、アルダミ
ンPH（イースト プロダクツ社）5.0％、N-ZアミンＥ型
5.0％、MgSO4・7H2O0.05％、KH2PO40.37％及びCaCO30.5
％からなる（単位g/lで）オートクレープにかけた（滅
菌した）種子培地50mlを含む250mlのバッフル付き振盪
フラスコに接種するために使用した。オートクレープに
かける前に種子培地をpH7.1に調整した。種子培地中の
種子を220rpmに回転振盪機を操作して27℃で48時間温置
した。一方、凍結栄養菌糸又は斜面源を用いる場合は、
種子培地中の培養株は220rpmに於て27℃で24時間温置す
る。得られた種子培地の2.5mlアリコートを次の２種の
異なった予めオートクレープにかけた（滅菌した）産生
培地の各々50mlを含む250mlのバッフルのない振盪フラ
スコに接種するために使用した。L-679,934はジメチル
スルホキシド中の溶液として加え最終濃度0.1mg/ml濃度
を得た。次に振盪フラスコ内容物を220rpmに回転振盪機
を操作して27℃で16時間温置した。
1.転換培地Ｂは（g/lで）グルコース10.0、ハイケースS
F2.0、牛肉エキス1.0、コーンスティープリカー3.0から
なり、オートクレープにかける前にpH7.0に調整した。
2.転換培地Ｃは（g/lで）マンニトール5.0、グリセロー
ル5.0、ハイケースSF2.0、牛肉エキス1.0、コーンステ
ィープリカー3.0からなり、オートクレープにかける前
にpH7.0に調整した。
各ブイヨンに対する分離、精製方法 転換培地Ｂの全ブイヨン（100ml）を塩化メチレンで
３回抽出した（３×100ml）。塩化メチレン抽出液を合
わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で油状残留物に
濃縮した。残留物をアセトニトリルに溶解し、高性能液
体クロマトグラフィー（HPLC）精製にかけた。
HPLCはホワットマンパーチシル（Whatman Partisil）
10 ODS-34.6mm×25cmカラムで行ない、60℃で205nm及び
225nmを監視した。このカラムを0.1％水性H3PO4-CH3CN
45:55〜0.1％水性H3PO4-CH3CN 20:80の直線勾配で30分
間展開させた。上述の抽出液を繰り返し注入している間
この化合物を集めた。保持時間14分の分画をプールし、
pH6.5に調整し蒸発させてアセトニトリルを除去した。
更に化合物をC18Sep-PaK（ウオーターズ アソシエイテ
ス（Waters Associates））及びアセトニトリル−水溶
離溶剤を用いて精製して1mgを生成した。この化合物をL
-682,993“デメトマイシン”と称した。同様の結果が転
換培地Ｃの使用で得られた。
確認 デメトマイシンをNMR分析により確認して第１図のNMR
スペクトルを得た。認定された分子構造を第３図に示
す。
実施例２ Ｔ細胞増殖検定 1.試料調製 上記HPLCで調製した精製デメトマイシンを無水エタノ
ールに1mg/mlで溶解した。
2.検定 C57B1/6マウスの脾臓を無菌条件下で用い、10％熱失
活胎仔ウシ血清（GIBCO）で補足した氷冷RPMI1640培地
（ギブコ（GIBCO）、グランドアイランド、ニューヨー
ク）に緩やかに解離させた。1500rpmで８分間遠心分離
して細胞を沈殿させた。この沈殿物を塩化アンモニウム
溶離緩衝液（ギブコ）で４℃に於て２分間処理して汚染
している赤血球を取り除いた。冷培地を加え、細胞を15
00rpmで８分間再び遠心分離した。次いで細胞懸濁液を
次の通りのナイロンウールカラムにより分離してＴリン
パ球を単離した。ナイロンウールカラムは洗浄乾燥した
ナイロンウール約4gを20mlのプラスチック注射器に充填
して調製した。このカラムを250゜Fで30分間オートクレ
ープにかけて滅菌した。ナイロンウールカラムを温暖
（37℃）培地で湿らせ、この同じ培地ですすいだ。温暖
培地に再懸濁した洗浄脾細胞をナイロンウールにゆっく
りと適用した。次いでこのカラムを垂直に37℃で１時間
インキュベートした。非付着Ｔリンパ球を温暖培地と共
にカラムから溶離し、細胞懸濁液を上記の通り撹拌し
た。
精製Ｔリンパ球を10％熱失活胎仔ウシ血清、100mMグ
ルタミン、1mM焦性ブドウ酸ナトリウム、２×10-5M2−
メルカプトエタノール及び50μg/mlゲンタマイシンを有
するRPMI1640培地からなる完全培地に2.5×105細胞/ml
で再懸濁した。イオノマイシンを250ng/mlで、PMAを10n
g/mlで加えた。この細胞懸濁液を直ちに96ウェル平底の
ミクロ培養プレート（コスター）に200μｌで分配し
た。次いで試験薬剤のない培地である対照と試験される
試料（上述の精製デメトマイシン）の以下に示される種
々の希釈液を３回の実験のウェルに20μl/ウェルで加え
た。標準としてL-679,934を使用した。次に培養プレー
トを５％CO2-95％空気の湿らせた雰囲気中37℃で44時間
インキュベートした。Ｔリンパ球の増殖をトリチウム標
識チミジンの取り込みを測定して算定した。44時間の培
養後、細胞をトリチウム標識チミジン（NEN、ケンブリ
ッジ、マサチュセッツ）２μCi/ウェルでパルス標識し
た。更に４時間インキュベートした後、複数試料回収器
を用いてガラス繊維フィルターにより回収した。個々の
ウェルに対応するフィルターディスクの放射能を標準液
体シンチレーション計数法（βカウンター）で測定し
た。繰り返しのウェルの１分当りの平均計数を計算し、
この結果を次の通りトリチウム標識チミジン消費（増
殖）の阻害％として表した。
デメトマイシンの種々の濃度に於ける阻害％の結果を
次の表に示す。
注1.マウスＴ細胞培養株に回収の48時間前に3H−チミジ
ンを４時間パルスした。
2.標準L-679,934（10ng/ml）は99％阻害を示した。
3.デメトマイシン（L-682,993）に対するIC50＝0.86ng/
ml＝1.09nM.一般に0.6〜1.2×10-9M 4.デメトマイシンによるＴ細胞増殖阻害は培養開始に於
てIL-2（組換え体IL-2）50μ/mlを加えることによって
復帰した。
【図面の簡単な説明】
第１図はCDCl3中“デメトマイシン”の400MHzに於ける1
H核磁気共鳴（NMR）スペクトルを示す図面である。 第２図はCDCl3中L-679,934の400MHzに於ける1H NMRスペ
クトルを示す図面である。 第３図は“デメトマイシン”の認定された分子構造を示
す図面である。
フロントページの続き (72)発明者 シイー―シユング テー．チエン アメリカ合衆国，07751 ニユージヤーシ イ，モーガンヴイル，スコツト ドライブ 12 (72)発明者 リンダ エス．ウイカー アメリカ合衆国，07090 ニユージヤーシ イ，ウエストフイールド，アロウウツド ドライヴ 2096

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】窒素栄養源を含む水性炭水化物培地中深部
    好気性発酵の条件下でアクチノプラナセテ種の菌株を構
    造式： を有する化合物と共に、構造式： を有する化合物を充分生産する時間培養する段階を包含
    している構造式： を有する化合物の製造方法。
  2. 【請求項２】該微生物がATCC No.53771である請求項１
    記載の方法。
  3. 【請求項３】該培地がグルコース、ハイケースSF、牛肉
    エキス及びコーンスティープリカーを包含する“培地B"
    発酵培地である請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】該培地がマンニトール、グリセロール、ハ
    イケースSF、牛肉エキス及びコーンスティープリカーを
    包含する“培地C"発酵培地である請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】構造式： を有する化合物を含む、請求項１記載の方法によって産
    生されたブイヨン。
  6. 【請求項６】請求項１記載の方法によって産生された構
    造式： を有する化合物。
  7. 【請求項７】Ｔ細胞増殖検定によるＴ細胞活性化の陽性
    阻害（IC50約0.6〜1.2×10-9モル）及び第１図に示され
    るプロトン核磁気共鳴スペクトルを示し、構造式： によって示される分子構造を有する化合物。
  8. 【請求項８】構造式： によって示される分子構造を有する化合物。
  9. 【請求項９】医薬的に許容しうる実質的に無毒性の担体
    又は賦形剤と併用して構造式： を有する化合物の治療上有効な量を含んで成る免疫抑制
    剤。
  10. 【請求項１０】移植拒絶反応を防止するべくヒト宿主を
    処置するのに有用な又は自己免疫疾患若しくは感染症を
    治療するのに有用な免疫抑制剤を調整するために構造
    式： を有する化合物を使用する方法。
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