JPH0829080B2 - ヒトサイトゾルホスホリパーゼａ２ - Google Patents
ヒトサイトゾルホスホリパーゼａ２Info
- Publication number
- JPH0829080B2 JPH0829080B2 JP3211948A JP21194891A JPH0829080B2 JP H0829080 B2 JPH0829080 B2 JP H0829080B2 JP 3211948 A JP3211948 A JP 3211948A JP 21194891 A JP21194891 A JP 21194891A JP H0829080 B2 JPH0829080 B2 JP H0829080B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phospholipase
- human
- pla
- cell
- cytosolic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
- G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】本発明は、約１００，０００ダルトンのサ
イトゾル(細胞質ゾル)ホスホリパーゼＡ2酵素を単離す
るための方法に関する。より詳細には、本発明は、ヒト
単芽球誘導化セルラインから実質的に純粋な形態で単離
される新規なヒト細胞内ホスホリパーゼＡ2酵素に関す
る。
イトゾル(細胞質ゾル)ホスホリパーゼＡ2酵素を単離す
るための方法に関する。より詳細には、本発明は、ヒト
単芽球誘導化セルラインから実質的に純粋な形態で単離
される新規なヒト細胞内ホスホリパーゼＡ2酵素に関す
る。
【０００２】ホスホリパーゼは１００年前から既知であ
り研究され続けており、ホスホグリセリドを加水分解す
る多くの種類のある広在性酵素である。ホスホリパーゼ
は、開裂するその基質結合に応じて５つのグループに分
類される(Ａ1、Ａ2、Ｂ、ＣおよびＤ)。
り研究され続けており、ホスホグリセリドを加水分解す
る多くの種類のある広在性酵素である。ホスホリパーゼ
は、開裂するその基質結合に応じて５つのグループに分
類される(Ａ1、Ａ2、Ｂ、ＣおよびＤ)。
【０００３】ホスホリパーゼＡ2(ＰＬＡ2)は、等モル量
のリゾリン脂質と遊離脂肪酸とを産するホスホグリセリ
ドのｓｎ-２-アシルエステル結合の加水分解を触媒する
ホスファチド２-アシルヒドロラーゼの一般名である[デ
ニス(Dennis,E.A.)，The Enzymes，16巻，アカデミック
プレス，ニューヨーク，(1983)]。ホスホリパーゼＡ2酵
素はすべての生物種に見いだされ、種々の種類の酵素か
ら構成される。現在までに研究されているホスホリパー
ゼＡ2の中の大部分は分子量約１４kＤaであり、それら
のアミノ酸配列は相同性が高い。
のリゾリン脂質と遊離脂肪酸とを産するホスホグリセリ
ドのｓｎ-２-アシルエステル結合の加水分解を触媒する
ホスファチド２-アシルヒドロラーゼの一般名である[デ
ニス(Dennis,E.A.)，The Enzymes，16巻，アカデミック
プレス，ニューヨーク，(1983)]。ホスホリパーゼＡ2酵
素はすべての生物種に見いだされ、種々の種類の酵素か
ら構成される。現在までに研究されているホスホリパー
ゼＡ2の中の大部分は分子量約１４kＤaであり、それら
のアミノ酸配列は相同性が高い。
【０００４】最も豊富であり、かつ普通に研究されてい
るＰＬＡ2は分泌型のものである。この酵素は細胞内で
産生されて分泌ビヒクル中に蔵められ、そして後期には
生物学的マテリアルの消化を助けるために細胞外環境中
に放出される。これとは対照的に、サイトゾルＰＬＡ2
はほとんど無いといってよい程に少量でしか見いだされ
ず、細胞内に残っており、分泌型のそれとは全く相違す
るものとして役立っている。このサイトゾルＰＬＡ2の
細胞内における濃度は極めて低いことから、その酵素の
徹底的な研究活動は妨げられていた[VadasおよびPruzan
ski,Lab.Investigation,55,4:391(1986)]。
るＰＬＡ2は分泌型のものである。この酵素は細胞内で
産生されて分泌ビヒクル中に蔵められ、そして後期には
生物学的マテリアルの消化を助けるために細胞外環境中
に放出される。これとは対照的に、サイトゾルＰＬＡ2
はほとんど無いといってよい程に少量でしか見いだされ
ず、細胞内に残っており、分泌型のそれとは全く相違す
るものとして役立っている。このサイトゾルＰＬＡ2の
細胞内における濃度は極めて低いことから、その酵素の
徹底的な研究活動は妨げられていた[VadasおよびPruzan
ski,Lab.Investigation,55,4:391(1986)]。
【０００５】サイトゾルＰＬＡ2は、血小板活性化因子
(ＰＡＦ)およびエイコサノイド(eicosanoid)として知ら
れている強力なプロ-炎症メディエイターの生成を導く
生合成経路において重要な調節的役割を果している。エ
イコサノイドにはプロスタグランジン、トロンボキサ
ン、ヒドロキシエイコサテトラエン酸、ロイコトリエ
ン、およびリポキシンがある[MobilioおよびMarshall,A
nn.Reports in Med.Chem.,24:157(1989)]。遊離アラキ
ドン酸はエイコサノイド産生のための律速性前駆体であ
り、それは特定のサイトゾルＰＬＡ2の作用によってそ
の膜リン脂質貯蔵物から遊離される[Dennis,Drug Dev.R
es.,10:205,(1987)]。これと同じ酵素工程によって、Ｐ
ＡＦ型に変換することのできるリゾリン脂質をも産生さ
れる。サイトゾルＰＬＡ2は基礎レベルでは、細胞のリ
ン脂質代謝を維持するために必須である脱アシル化-再
アシル化反応に関与しているが、レセプターに介在され
る増大ＰＬＡ2活性は最大の炎症応答を引き起こす細胞
活性化と符号している。サイトゾルＰＬＡ2が炎症、過
敏症および組織損傷における強力な脂質メディエイター
の生合成経路の重要なレセプター-介在性の調節に専属
的に関与していることは周知である。
(ＰＡＦ)およびエイコサノイド(eicosanoid)として知ら
れている強力なプロ-炎症メディエイターの生成を導く
生合成経路において重要な調節的役割を果している。エ
イコサノイドにはプロスタグランジン、トロンボキサ
ン、ヒドロキシエイコサテトラエン酸、ロイコトリエ
ン、およびリポキシンがある[MobilioおよびMarshall,A
nn.Reports in Med.Chem.,24:157(1989)]。遊離アラキ
ドン酸はエイコサノイド産生のための律速性前駆体であ
り、それは特定のサイトゾルＰＬＡ2の作用によってそ
の膜リン脂質貯蔵物から遊離される[Dennis,Drug Dev.R
es.,10:205,(1987)]。これと同じ酵素工程によって、Ｐ
ＡＦ型に変換することのできるリゾリン脂質をも産生さ
れる。サイトゾルＰＬＡ2は基礎レベルでは、細胞のリ
ン脂質代謝を維持するために必須である脱アシル化-再
アシル化反応に関与しているが、レセプターに介在され
る増大ＰＬＡ2活性は最大の炎症応答を引き起こす細胞
活性化と符号している。サイトゾルＰＬＡ2が炎症、過
敏症および組織損傷における強力な脂質メディエイター
の生合成経路の重要なレセプター-介在性の調節に専属
的に関与していることは周知である。
【０００６】これまでに単離され研究されている大多数
のＰＬＡ2は細胞外型である。細胞外型ＰＬＡ2に基づく
モデルによって同定されるインヒビターは、インビボに
おける炎症の有効なインヒビターでないことが証明され
ている。ここに至り、抗-炎症特性を有するＰＬＡ2イン
ヒビターを開発するためには、比較的単離が容易な細胞
外ＰＬＡ2ではなく、炎症経路に関連する、より適切な
細胞内ＰＬＡ2をモデル酵素として使用すべきであると
考えられている[Dennis,Bio/Technology, 5:1294,(198
7)]。
のＰＬＡ2は細胞外型である。細胞外型ＰＬＡ2に基づく
モデルによって同定されるインヒビターは、インビボに
おける炎症の有効なインヒビターでないことが証明され
ている。ここに至り、抗-炎症特性を有するＰＬＡ2イン
ヒビターを開発するためには、比較的単離が容易な細胞
外ＰＬＡ2ではなく、炎症経路に関連する、より適切な
細胞内ＰＬＡ2をモデル酵素として使用すべきであると
考えられている[Dennis,Bio/Technology, 5:1294,(198
7)]。
【０００７】レセプターに媒介されるサイトゾルＰＬＡ
2活性を酵素学的なインヒビターにより調節できること
が所望の目的であり、これは、喘息、虚血、関節炎、敗
血性発作、および皮膚の炎症疾患のための新しい治療方
法を導くことができる。特定の症状に関連するサイトゾ
ルＰＬＡ2活性の不活化法または特異的な阻害法は医療
団体が非常に使用を欲しているものである。この目的を
達成するためにはまず始めに、特定の疾患の病因に関連
しているサイトゾルＰＬＡ2を同定し、単離しなければ
ならない。
2活性を酵素学的なインヒビターにより調節できること
が所望の目的であり、これは、喘息、虚血、関節炎、敗
血性発作、および皮膚の炎症疾患のための新しい治療方
法を導くことができる。特定の症状に関連するサイトゾ
ルＰＬＡ2活性の不活化法または特異的な阻害法は医療
団体が非常に使用を欲しているものである。この目的を
達成するためにはまず始めに、特定の疾患の病因に関連
しているサイトゾルＰＬＡ2を同定し、単離しなければ
ならない。
【０００８】本発明は、(a)生物学的細胞を細胞溶解
し、(b)得られた細胞溶解物を分画化して細胞残骸、オ
ルガネラおよび膜を実質的に含有しないタンパク質の溶
液を得、(c)該タンパク質溶液に含有されているホスホ
リパーゼＡ2と結合できる陰イオン交換樹脂と該タンパ
ク質溶液を接触させ、(d)該陰イオン交換樹脂からホス
ホリパーゼＡ2を溶出させ、(e)工程(d)により得られた
ホスホリパーゼＡ2を含有する溶液を、ホスホリパーゼ
Ａ2と結合できる疎水性相互作用樹脂と接触させ、(f)該
ホスホリパーゼＡ2を該疎水性相互作用樹脂から溶出さ
せ、(g)分子サイズ分画クロマトグラフィーによってホ
スホリパーゼＡ2含有溶液を同時溶出された夾雑物と分
離し、(h)ホスホリパーゼＡ2と疎水性相互作用樹脂との
間に弱い相互作用しか起こさない条件下で、工程(g)に
より得られたホスホリパーゼＡ2を含有する溶液を疎水
性相互作用樹脂と接触させること、を特徴とする、実質
的に純粋な形態にあるサイトゾルホスホリパーゼＡ2を
生物学的細胞から単離するための方法に関する。
し、(b)得られた細胞溶解物を分画化して細胞残骸、オ
ルガネラおよび膜を実質的に含有しないタンパク質の溶
液を得、(c)該タンパク質溶液に含有されているホスホ
リパーゼＡ2と結合できる陰イオン交換樹脂と該タンパ
ク質溶液を接触させ、(d)該陰イオン交換樹脂からホス
ホリパーゼＡ2を溶出させ、(e)工程(d)により得られた
ホスホリパーゼＡ2を含有する溶液を、ホスホリパーゼ
Ａ2と結合できる疎水性相互作用樹脂と接触させ、(f)該
ホスホリパーゼＡ2を該疎水性相互作用樹脂から溶出さ
せ、(g)分子サイズ分画クロマトグラフィーによってホ
スホリパーゼＡ2含有溶液を同時溶出された夾雑物と分
離し、(h)ホスホリパーゼＡ2と疎水性相互作用樹脂との
間に弱い相互作用しか起こさない条件下で、工程(g)に
より得られたホスホリパーゼＡ2を含有する溶液を疎水
性相互作用樹脂と接触させること、を特徴とする、実質
的に純粋な形態にあるサイトゾルホスホリパーゼＡ2を
生物学的細胞から単離するための方法に関する。
【０００９】本発明は、アミノ酸配列：
【化４】 を含有する、ホスホリパーゼＡ2活性を有する分子量約
１００キロダルトンのポリペプチドを包含している。ま
た、本発明はアミノ酸配列：
１００キロダルトンのポリペプチドを包含している。ま
た、本発明はアミノ酸配列：
【化５】 を含有する、ホスホリパーゼＡ2活性を有する分子量約
１００キロダルトンのポリペプチドをも包含している。
さらに本発明は、アミノ酸配列：
１００キロダルトンのポリペプチドをも包含している。
さらに本発明は、アミノ酸配列：
【化６】 を含有する、ホスホリパーゼＡ2活性を有する分子量約
１００キロダルトンのポリペプチドをも包含する。本発
明はまた、ホスホリパーゼＡ2活性を有する分子量約１
００キロダルトンである、特許請求の範囲請求項１に記
載の方法によって単離されるポリペプチドをも包含して
いる。
１００キロダルトンのポリペプチドをも包含する。本発
明はまた、ホスホリパーゼＡ2活性を有する分子量約１
００キロダルトンである、特許請求の範囲請求項１に記
載の方法によって単離されるポリペプチドをも包含して
いる。
【００１０】図１は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動の結果を示すものでる。個々のレーン(列)は本発
明方法の各工程によって得られた精製結果を示してい
る。図２は、本発明により精製されたタンパク質がＰＬ
Ａ2の最大活性に直接相関していることを示している。
図３は、本発明のＰＬＡ2がＣa2+依存性であることを示
している濃度効果グラフであり、これは最大酵素活性が
Ｃa2+濃度１μＭ 以下で達成されることを示している。
図４は、本発明のＰＬＡ2の臭化シアン開裂産物をＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示し
ている。
気泳動の結果を示すものでる。個々のレーン(列)は本発
明方法の各工程によって得られた精製結果を示してい
る。図２は、本発明により精製されたタンパク質がＰＬ
Ａ2の最大活性に直接相関していることを示している。
図３は、本発明のＰＬＡ2がＣa2+依存性であることを示
している濃度効果グラフであり、これは最大酵素活性が
Ｃa2+濃度１μＭ 以下で達成されることを示している。
図４は、本発明のＰＬＡ2の臭化シアン開裂産物をＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示し
ている。
【００１１】本発明は１つの態様として、ヒト単芽細胞
セルラインＵ９３７由来のサイトゾルＰＬＡ2を１０，
０００倍以上に精製するための方法を提供する。ＰＬＡ
2のこの新規な形態は、抗-炎症および抗-虚血特性を有
している化合物を同定するモデルに有用である。当業界
の現状は、リゾリン脂質の生成およびエイコサノイドと
ＰＡＦとの生合成経路の調節を専属的に行う特定のＰＬ
Ａ2を選択的に阻害する化合物は抗-炎症および抗-虚血
性薬物としての優れた候補物質であることを示してい
る。
セルラインＵ９３７由来のサイトゾルＰＬＡ2を１０，
０００倍以上に精製するための方法を提供する。ＰＬＡ
2のこの新規な形態は、抗-炎症および抗-虚血特性を有
している化合物を同定するモデルに有用である。当業界
の現状は、リゾリン脂質の生成およびエイコサノイドと
ＰＡＦとの生合成経路の調節を専属的に行う特定のＰＬ
Ａ2を選択的に阻害する化合物は抗-炎症および抗-虚血
性薬物としての優れた候補物質であることを示してい
る。
【００１２】本発明の方法は、サイトゾルＰＬＡ2を含
有する細胞を細胞溶解することによって開始する。すべ
ての細胞は何らかの型のＰＬＡ2を含有しており、使用
すべき細胞タイプのいずれを選択するかは生体内におけ
るその細胞の機能全体に大きく依存する。エイコサノイ
ドおよびＰＡＦ産生の調節に関与しているサイトゾルＰ
ＬＡ2に関しては、免疫系を構成している細胞が好まし
い。より好ましい細胞タイプは造血系のそれである。さ
らに好ましい細胞は、炎症応答に直接関与している骨髄
起源のそれである。より好ましい細胞には例えば、血小
板、好中球、マクロファージ、単球、およびこのような
細胞から誘導されるセルラインがある。セルラインは成
熟細胞タイプから多くが誘導されるとは限らず、むしろ
分化性幹細胞から誘起される細胞から発達するのがより
多い。この分化工程には、幹細胞から誘起される種々の
すべての細胞が包含され、この工程が完結して成熟細胞
タイプとなる。本発明の目的では、分化工程中の細胞が
前駆細胞として好ましいものである。
有する細胞を細胞溶解することによって開始する。すべ
ての細胞は何らかの型のＰＬＡ2を含有しており、使用
すべき細胞タイプのいずれを選択するかは生体内におけ
るその細胞の機能全体に大きく依存する。エイコサノイ
ドおよびＰＡＦ産生の調節に関与しているサイトゾルＰ
ＬＡ2に関しては、免疫系を構成している細胞が好まし
い。より好ましい細胞タイプは造血系のそれである。さ
らに好ましい細胞は、炎症応答に直接関与している骨髄
起源のそれである。より好ましい細胞には例えば、血小
板、好中球、マクロファージ、単球、およびこのような
細胞から誘導されるセルラインがある。セルラインは成
熟細胞タイプから多くが誘導されるとは限らず、むしろ
分化性幹細胞から誘起される細胞から発達するのがより
多い。この分化工程には、幹細胞から誘起される種々の
すべての細胞が包含され、この工程が完結して成熟細胞
タイプとなる。本発明の目的では、分化工程中の細胞が
前駆細胞として好ましいものである。
【００１３】選択する細胞タイプは、その細胞タイプ内
に含有される個々のサイトゾルＰＬＡ2の精製が行える
程に充分な量で確保されなければならない。必要となる
細胞の量は当然ながら、必要とされているＰＬＡ2の細
胞内濃度に左右される。サイトゾルＰＬＡ2は微量な細
胞内濃度中に見いだされるので、本発明の方法を始める
には、総量１０11から１０12の細胞が通常必要である。
したがって、インビトロ細胞培養は、本発明を実施する
のに必要とされる大量の細胞を獲得するための好ましい
方法である。このような方法は当業者に周知であり、種
々の態様で実験され得る。しかし、供血された血液から
血小板を単離する方法も、本発明方法を実施するために
細胞を調達するための好ましい方法である。
に含有される個々のサイトゾルＰＬＡ2の精製が行える
程に充分な量で確保されなければならない。必要となる
細胞の量は当然ながら、必要とされているＰＬＡ2の細
胞内濃度に左右される。サイトゾルＰＬＡ2は微量な細
胞内濃度中に見いだされるので、本発明の方法を始める
には、総量１０11から１０12の細胞が通常必要である。
したがって、インビトロ細胞培養は、本発明を実施する
のに必要とされる大量の細胞を獲得するための好ましい
方法である。このような方法は当業者に周知であり、種
々の態様で実験され得る。しかし、供血された血液から
血小板を単離する方法も、本発明方法を実施するために
細胞を調達するための好ましい方法である。
【００１４】選択した細胞を増殖させて収穫したなら、
例えば酵素分解、化学的細胞溶解、浸透圧ショック、機
械的破壊、音波処理および圧力ショックなどの種々の方
法によって細胞溶解すればよい(これらの方法は限定的
に列挙したものではない)。好ましい細胞溶解法は機械
的な方法であり、圧力ショックが特に好ましい。窒素キ
ャビテーションは細胞を破壊する圧力ショックのための
最も好ましい態様である。窒素キャビテーションによっ
て細胞溶解するには、細胞懸濁液を撹拌セル破壊容器(s
tirred cell disruption bomb)に入れ、そこに平方イン
チ当たり約６００ポンドになるまで窒素を２０分間圧入
する。次いで、その圧力を突然に解放し、細胞を破裂さ
せる。
例えば酵素分解、化学的細胞溶解、浸透圧ショック、機
械的破壊、音波処理および圧力ショックなどの種々の方
法によって細胞溶解すればよい(これらの方法は限定的
に列挙したものではない)。好ましい細胞溶解法は機械
的な方法であり、圧力ショックが特に好ましい。窒素キ
ャビテーションは細胞を破壊する圧力ショックのための
最も好ましい態様である。窒素キャビテーションによっ
て細胞溶解するには、細胞懸濁液を撹拌セル破壊容器(s
tirred cell disruption bomb)に入れ、そこに平方イン
チ当たり約６００ポンドになるまで窒素を２０分間圧入
する。次いで、その圧力を突然に解放し、細胞を破裂さ
せる。
【００１５】細胞溶解操作(工程(a))は、生理学的緩衝
液中、１つまたはそれ以上のプロテアーゼインヒビター
の存在下に行うのが最も都合良い。そうすれば、希少価
値あるサイトゾルＰＬＡ2が過剰に分解、変性されるこ
とが最小限に抑えられる。多くの種々のプロテアーゼイ
ンヒビターが市販されている。例えば、アンチペイン、
α1-アンチトリプシン、アプロチニン、ベスタチン、キ
モスタチン、シスタチン、ロイペプチン、ペプスタチン
Ａ、フェニルメタンスルホニルフルオライド(ＰＭＳ
Ｆ)、およびトリプシンインヒビター[ベーリンガー・マ
ンハイム，インディアナポリス，ＩＮ]があるが、これ
らに限定されない。好ましいプロテアーゼインヒビター
の組合わせは、２mＭ エチレンジアミン四酢酸が存在す
るＰＭＳＦ(１mＭ)、ロイペプチン(１００μＭ)および
ペプスタチンＡ(１００μＭ)である。
液中、１つまたはそれ以上のプロテアーゼインヒビター
の存在下に行うのが最も都合良い。そうすれば、希少価
値あるサイトゾルＰＬＡ2が過剰に分解、変性されるこ
とが最小限に抑えられる。多くの種々のプロテアーゼイ
ンヒビターが市販されている。例えば、アンチペイン、
α1-アンチトリプシン、アプロチニン、ベスタチン、キ
モスタチン、シスタチン、ロイペプチン、ペプスタチン
Ａ、フェニルメタンスルホニルフルオライド(ＰＭＳ
Ｆ)、およびトリプシンインヒビター[ベーリンガー・マ
ンハイム，インディアナポリス，ＩＮ]があるが、これ
らに限定されない。好ましいプロテアーゼインヒビター
の組合わせは、２mＭ エチレンジアミン四酢酸が存在す
るＰＭＳＦ(１mＭ)、ロイペプチン(１００μＭ)および
ペプスタチンＡ(１００μＭ)である。
【００１６】工程(b)では、以後の精製工程を容易に行
えるようにするため、細胞溶解物から可溶性かつ粒状の
画分を調製する。得られた可溶性画分から細胞残骸とオ
ルガネラを排除すれば、ＰＬＡ2を含有するサイトゾル
タンパク質の溶液が得られ、それはさらに精製すること
ができる。好ましい分画法は超遠心であるが、連続濾過
などの他の分離方法も本発明に適用することができる。
えるようにするため、細胞溶解物から可溶性かつ粒状の
画分を調製する。得られた可溶性画分から細胞残骸とオ
ルガネラを排除すれば、ＰＬＡ2を含有するサイトゾル
タンパク質の溶液が得られ、それはさらに精製すること
ができる。好ましい分画法は超遠心であるが、連続濾過
などの他の分離方法も本発明に適用することができる。
【００１７】工程(c)では、ＰＬＡ2含有溶液を陰イオン
交換樹脂と接触させることにより単離操作を続行する。
分子のイオン性電荷を利用する分離手法は当業者に周知
である。タンパク質精製の技術を説明している本発明の
理解に役立つ基礎テキストは、Scopes,R.K.のProtein P
urification, Springer-Verlag New York Inc.,1982で
ある。工程(b)は、バッチ態様でも実施することができ
る。しかし、当業者ならば、この工程はカラムクロマト
グラフィー(ＣＣ)で行うのが最も良いことは容易に理解
されよう。多くの陰イオン交換樹脂が市販されており、
本発明に適している。このような樹脂には例えば、Fast
Flow Sepharose Q(ファルマシア)、Cellfine A-800(ア
ミコン)、およびシリカＰＡＥ(アミコン)がある。最も
好ましい樹脂はFast Flow Sepharose Qである。好まし
い結合用および洗浄用緩衝液は１５０mＭ ＮaＣl、２m
Ｍ ２-メルカプトエタノール(２-ＭＥ)、１mＭ エチレ
ン-ビス(オキシ-エチレンニトリロ)四酢酸(ＥＧＴＡ)、
２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８である。
交換樹脂と接触させることにより単離操作を続行する。
分子のイオン性電荷を利用する分離手法は当業者に周知
である。タンパク質精製の技術を説明している本発明の
理解に役立つ基礎テキストは、Scopes,R.K.のProtein P
urification, Springer-Verlag New York Inc.,1982で
ある。工程(b)は、バッチ態様でも実施することができ
る。しかし、当業者ならば、この工程はカラムクロマト
グラフィー(ＣＣ)で行うのが最も良いことは容易に理解
されよう。多くの陰イオン交換樹脂が市販されており、
本発明に適している。このような樹脂には例えば、Fast
Flow Sepharose Q(ファルマシア)、Cellfine A-800(ア
ミコン)、およびシリカＰＡＥ(アミコン)がある。最も
好ましい樹脂はFast Flow Sepharose Qである。好まし
い結合用および洗浄用緩衝液は１５０mＭ ＮaＣl、２m
Ｍ ２-メルカプトエタノール(２-ＭＥ)、１mＭ エチレ
ン-ビス(オキシ-エチレンニトリロ)四酢酸(ＥＧＴＡ)、
２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８である。
【００１８】要求しているＰＬＡ2がイオン結合的に樹
脂と結合し、夾雑タンパク質が洗い流されたなら、ＰＬ
Ａ2を樹脂から溶出しなければならない。工程(d)は、緩
衝液のイオン特性を改変することにより、緩衝液のイオ
ンが樹脂由来のＰＬＡ2と置換するように行う。緩衝液
を徐々に溶出条件に変更することは本発明の方法と矛盾
するものでない。しかし、当業者には、溶出されるタン
パク質間の分解性が大きくなるので、溶出緩衝化グラジ
エントが好ましいものであることは即座に理解されよ
う。最も好ましいグラジエントでは、１００％結合用お
よび洗浄用緩衝液から始め、１００％溶出緩衝液(５０
０mＭ ＮaＣl、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、２５m
Ｍ トリス-ＨＣl pＨ８)に直線的(線状)に移行させる。
カラム溶出液は２８０nmの吸光度でモニターし、画分を
集めるのが好ましい。
脂と結合し、夾雑タンパク質が洗い流されたなら、ＰＬ
Ａ2を樹脂から溶出しなければならない。工程(d)は、緩
衝液のイオン特性を改変することにより、緩衝液のイオ
ンが樹脂由来のＰＬＡ2と置換するように行う。緩衝液
を徐々に溶出条件に変更することは本発明の方法と矛盾
するものでない。しかし、当業者には、溶出されるタン
パク質間の分解性が大きくなるので、溶出緩衝化グラジ
エントが好ましいものであることは即座に理解されよ
う。最も好ましいグラジエントでは、１００％結合用お
よび洗浄用緩衝液から始め、１００％溶出緩衝液(５０
０mＭ ＮaＣl、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、２５m
Ｍ トリス-ＨＣl pＨ８)に直線的(線状)に移行させる。
カラム溶出液は２８０nmの吸光度でモニターし、画分を
集めるのが好ましい。
【００１９】工程(d)により得られた画分はＰＬＡ2活性
について検定すべきであり、常法により濃縮すればよ
い。好ましい濃縮方法は酵素を変性しないほどに穏やか
なものであり、溶解したイオンを濃縮しないものが好ま
しい。セファデックスＧ-２５またはＧ-５０ならびにＢ
iogel Ｐ３０またはＰ６０などの分子サイズ分画および
脱塩ゲルを使用する標準的な濃縮方法が好ましい。より
好ましい濃縮方法は、限外濾過法に基づくものである。
ＹＭ３０膜(アミコン)を有する撹拌セルなどの多くの限
外濾過濃縮ユニットが市販されている。
について検定すべきであり、常法により濃縮すればよ
い。好ましい濃縮方法は酵素を変性しないほどに穏やか
なものであり、溶解したイオンを濃縮しないものが好ま
しい。セファデックスＧ-２５またはＧ-５０ならびにＢ
iogel Ｐ３０またはＰ６０などの分子サイズ分画および
脱塩ゲルを使用する標準的な濃縮方法が好ましい。より
好ましい濃縮方法は、限外濾過法に基づくものである。
ＹＭ３０膜(アミコン)を有する撹拌セルなどの多くの限
外濾過濃縮ユニットが市販されている。
【００２０】ＰＬＡ2を含有する濃縮試料は疎水性相互
作用樹脂によって工程(e)としてさらに精製する。この
ような樹脂は当業者に周知であり、目的とする分子本来
の個々の疎水性に基づいてタンパク質を精製するのに使
用される。このような樹脂の例としては、フェニル-ス
ペロース(Phenyl-Superose)[ファルマシア]、フェニル-
セファロース(ファルマシア)およびハイドロポアＨＩＵ
(HydroporeHIU)[Rainin]などが挙げられるが、これらに
限定されない。適当な緩衝条件下では、ＰＬＡ2は疎水
性相互作用樹脂に結合し、結合していないタンパク質を
洗い流した後では、有害な作用を与えることなく、カラ
ムから溶出することができる。
作用樹脂によって工程(e)としてさらに精製する。この
ような樹脂は当業者に周知であり、目的とする分子本来
の個々の疎水性に基づいてタンパク質を精製するのに使
用される。このような樹脂の例としては、フェニル-ス
ペロース(Phenyl-Superose)[ファルマシア]、フェニル-
セファロース(ファルマシア)およびハイドロポアＨＩＵ
(HydroporeHIU)[Rainin]などが挙げられるが、これらに
限定されない。適当な緩衝条件下では、ＰＬＡ2は疎水
性相互作用樹脂に結合し、結合していないタンパク質を
洗い流した後では、有害な作用を与えることなく、カラ
ムから溶出することができる。
【００２１】当業者ならば、工程(e)はＣＣ法によって
行うのが好ましいことは理解されよう。好ましい疎水性
相互作用樹脂はフェニル-スペロースであり、好ましい
結合緩衝液は５００mＭ ＮaＣl、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ
ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８である。工程
(f)では１００％結合緩衝液から始めて１００％溶出緩
衝液(水、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ ト
リス-ＨＣl pＨ８中、５０％エチレングリコール)まで
の線状グラジエントを使用してＰＬＡ2を溶出させるの
が好ましい。カラム溶出液は２８０nmの吸光度でモニタ
ーし、画分を集めるのが好ましい。得られた画分は、以
後の本発明工程を実施する前に、上記のようにしてＰＬ
Ａ2活性について検定し、濃縮すべきである。
行うのが好ましいことは理解されよう。好ましい疎水性
相互作用樹脂はフェニル-スペロースであり、好ましい
結合緩衝液は５００mＭ ＮaＣl、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ
ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８である。工程
(f)では１００％結合緩衝液から始めて１００％溶出緩
衝液(水、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ ト
リス-ＨＣl pＨ８中、５０％エチレングリコール)まで
の線状グラジエントを使用してＰＬＡ2を溶出させるの
が好ましい。カラム溶出液は２８０nmの吸光度でモニタ
ーし、画分を集めるのが好ましい。得られた画分は、以
後の本発明工程を実施する前に、上記のようにしてＰＬ
Ａ2活性について検定し、濃縮すべきである。
【００２２】本発明方法の工程(g)では、ＰＬＡ2を含有
する試料を分子サイズ分画法によりさらに精製する。こ
の工程は、最小限５mｇのタンパク質が工程(f)によって
単離された場合にのみ、続行するのが好ましい。工程
(g)の前に貯蔵が必要な場合、単離した材料は４℃にお
いて濃度２mｇ/ml 以上で３週間までは悪い作用も起こ
すことなく保存することができる。分子サイズに基づい
て酵素学的に活性なタンパク質を精製することは、濾
過、透析、密度グラジエントおよびゲル電気泳動などの
種々の方法によって実施することができるが、これらの
方法に限定されない。
する試料を分子サイズ分画法によりさらに精製する。こ
の工程は、最小限５mｇのタンパク質が工程(f)によって
単離された場合にのみ、続行するのが好ましい。工程
(g)の前に貯蔵が必要な場合、単離した材料は４℃にお
いて濃度２mｇ/ml 以上で３週間までは悪い作用も起こ
すことなく保存することができる。分子サイズに基づい
て酵素学的に活性なタンパク質を精製することは、濾
過、透析、密度グラジエントおよびゲル電気泳動などの
種々の方法によって実施することができるが、これらの
方法に限定されない。
【００２３】好ましい分子サイズ分画法はゲル濾過に基
づくものである。この目的のために多くの市販の樹脂お
よびカラムを利用でき、本発明に使用することができ
る。このような樹脂としては、スペロース１２(Ｓupero
se １２)、スペロース６、セファデックスＧ-２００[フ
ァルマシア]、およびＢio-gel Ｐ-３００[バイオラド]
などがあるが、これらに限定されない。最も好ましい樹
脂はスペロース１２である。精製する分子の特性に応じ
て、多くの種々の緩衝液がゲル濾過法に適用することが
できる。本発明のＰＬＡ2にとって好ましいゲル濾過緩
衝液は、水、１５０mＭ ＮaＣl、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ
ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８中、３０％エ
チレングリコールである。
づくものである。この目的のために多くの市販の樹脂お
よびカラムを利用でき、本発明に使用することができ
る。このような樹脂としては、スペロース１２(Ｓupero
se １２)、スペロース６、セファデックスＧ-２００[フ
ァルマシア]、およびＢio-gel Ｐ-３００[バイオラド]
などがあるが、これらに限定されない。最も好ましい樹
脂はスペロース１２である。精製する分子の特性に応じ
て、多くの種々の緩衝液がゲル濾過法に適用することが
できる。本発明のＰＬＡ2にとって好ましいゲル濾過緩
衝液は、水、１５０mＭ ＮaＣl、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ
ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８中、３０％エ
チレングリコールである。
【００２４】分子サイズ分画の前に、工程(g)により得
られたＰＬＡ2を含有する濃縮試料を、分子サイズ分画
カラムを前もって平衡化しておく緩衝液と同じもので溶
媒交換するのが好ましい。ＰＬＡ2を含有する試料は、
透析および希釈後濃縮などの種々の周知の手法によって
溶媒交換することができるが、これらの手法に限定され
ない。
られたＰＬＡ2を含有する濃縮試料を、分子サイズ分画
カラムを前もって平衡化しておく緩衝液と同じもので溶
媒交換するのが好ましい。ＰＬＡ2を含有する試料は、
透析および希釈後濃縮などの種々の周知の手法によって
溶媒交換することができるが、これらの手法に限定され
ない。
【００２５】工程(h)は本発明方法の最終工程であり、
本発明のＰＬＡ2を均一に精製する工程である。工程(g)
により得られたＰＬＡ2を含有する溶液を、ＰＬＡ2と疎
水性相互作用樹脂との間に弱い相互作用しか起こさない
条件下で疎水性相互作用樹脂に接触させる。工程(e)で
適当かつ好ましい疎水性相互作用樹脂およびカラムはこ
の工程でも使用できる。最適な緩衝化の条件を使用すれ
ば、樹脂からのＰＬＡ2の移行は遅らされるが、その
際、夾雑分子は樹脂と結合してしまうか、または妨害さ
れないで樹脂から流出する。工程(h)を行う好ましい方
法はＣＣ法であることは当業者には容易に理解されよ
う。ＰＬＡ2含有試料を工程(h)のために調製するのに好
ましく、かつカラムに適用するのに好ましい緩衝液は、
１５０mＭ ＮaＣl、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、
２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８である。ＰＬＡ2は、これ
らの緩衝液条件下では樹脂と弱く結合し、洗浄期にはカ
ラムから排出される点に留意するのが重要である。グラ
ジエント溶出工程後に洗浄操作を行うことは、本発明方
法にとって必須ではないが、カラムを調製するうえで同
じものを次に使用するためにはカラムの洗浄が必須とな
る。先の工程におけるように、カラム画分はＰＬＡ2活
性について検定すべきであり、ピーク活性が存在する画
分をプールして既述のように濃縮する。
本発明のＰＬＡ2を均一に精製する工程である。工程(g)
により得られたＰＬＡ2を含有する溶液を、ＰＬＡ2と疎
水性相互作用樹脂との間に弱い相互作用しか起こさない
条件下で疎水性相互作用樹脂に接触させる。工程(e)で
適当かつ好ましい疎水性相互作用樹脂およびカラムはこ
の工程でも使用できる。最適な緩衝化の条件を使用すれ
ば、樹脂からのＰＬＡ2の移行は遅らされるが、その
際、夾雑分子は樹脂と結合してしまうか、または妨害さ
れないで樹脂から流出する。工程(h)を行う好ましい方
法はＣＣ法であることは当業者には容易に理解されよ
う。ＰＬＡ2含有試料を工程(h)のために調製するのに好
ましく、かつカラムに適用するのに好ましい緩衝液は、
１５０mＭ ＮaＣl、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、
２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８である。ＰＬＡ2は、これ
らの緩衝液条件下では樹脂と弱く結合し、洗浄期にはカ
ラムから排出される点に留意するのが重要である。グラ
ジエント溶出工程後に洗浄操作を行うことは、本発明方
法にとって必須ではないが、カラムを調製するうえで同
じものを次に使用するためにはカラムの洗浄が必須とな
る。先の工程におけるように、カラム画分はＰＬＡ2活
性について検定すべきであり、ピーク活性が存在する画
分をプールして既述のように濃縮する。
【００２６】本発明の方法によって均一に精製された活
性サイトゾルＰＬＡ2は種々の方法で保存することがで
きる。好ましい保存方法は、精製ＰＬＡ2の酵素活性に
有害な作用を及ぼさない方法である。多くの保存方法が
当業界で知られており、それには保存緩衝液中、または
凍結乾燥粉末として、４℃、−２０℃または−７０℃で
保存する方法などがある。本発明の精製ＰＬＡ2を保存
するための最も好ましい方法は、ＰＬＡ2を含有する最
終カラム緩衝液１部を、７５％グリセリン／２５％１５
０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl
pＨ８(２部)とを混合して調製される溶液中に−２０℃
で保存することである。以下に実施例を記載して本発明
方法の理解を容易にするが、これらは本発明のＰＬＡ2
酵素の特性を例示するために示すに過ぎない。
性サイトゾルＰＬＡ2は種々の方法で保存することがで
きる。好ましい保存方法は、精製ＰＬＡ2の酵素活性に
有害な作用を及ぼさない方法である。多くの保存方法が
当業界で知られており、それには保存緩衝液中、または
凍結乾燥粉末として、４℃、−２０℃または−７０℃で
保存する方法などがある。本発明の精製ＰＬＡ2を保存
するための最も好ましい方法は、ＰＬＡ2を含有する最
終カラム緩衝液１部を、７５％グリセリン／２５％１５
０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl
pＨ８(２部)とを混合して調製される溶液中に−２０℃
で保存することである。以下に実施例を記載して本発明
方法の理解を容易にするが、これらは本発明のＰＬＡ2
酵素の特性を例示するために示すに過ぎない。
【００２７】実施例１ Ｕ９３７細胞の培養 ヒト白血病単芽様細胞セルラインＵ９３７をアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)から入
手した。このセルラインはＡＴＣＣのパーマネントコレ
クションの一部を構成しており、受託番号ＣＲＬ１５９
３のもとに入手可能である。５％子牛血清[HyClone Lab
oratories,ローガン,ユタ]、４mＭ Ｌ-グルタミン[Tana
be USA,サンジェゴ,CA]、０．０２％プルロニックＦ-６
８(Pluronic F-68)[BASF Corporation,パーシパニー,N.
J.]、１mＭ ＣaＣl2、５０μｇ/ml トブラマイシン[Eli
Lilly and Company,インディアナポリス,IN]、２０mＭ
ヘペス(Hepes)[USB,クリーブランド,オハイオ]、２．２
ｇ／Ｌ ＮaＨＣＯ3、１００μＭ エタノールアミン[Sig
ma Chemical,セントルイス,MO]を加えたＤ-ＭＥＭ／Ｆ-
１２培地[custom, GIBCO Laboratories,グランド・アイ
スランド,ニューヨーク]の培養培地にＵ９３７細胞を維
持させた。
・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)から入
手した。このセルラインはＡＴＣＣのパーマネントコレ
クションの一部を構成しており、受託番号ＣＲＬ１５９
３のもとに入手可能である。５％子牛血清[HyClone Lab
oratories,ローガン,ユタ]、４mＭ Ｌ-グルタミン[Tana
be USA,サンジェゴ,CA]、０．０２％プルロニックＦ-６
８(Pluronic F-68)[BASF Corporation,パーシパニー,N.
J.]、１mＭ ＣaＣl2、５０μｇ/ml トブラマイシン[Eli
Lilly and Company,インディアナポリス,IN]、２０mＭ
ヘペス(Hepes)[USB,クリーブランド,オハイオ]、２．２
ｇ／Ｌ ＮaＨＣＯ3、１００μＭ エタノールアミン[Sig
ma Chemical,セントルイス,MO]を加えたＤ-ＭＥＭ／Ｆ-
１２培地[custom, GIBCO Laboratories,グランド・アイ
スランド,ニューヨーク]の培養培地にＵ９３７細胞を維
持させた。
【００２８】Ａ）解凍操作 ＡＴＣＣから入手した上記細胞懸濁液１ml を含有する
アンプルをそのドライアイス容器から取り出し、３７℃
の水浴中に入れ、激しく振盪させながら氷を溶かした。
ここからのすべての操作は滅菌手法により行った。この
アンプルを開栓し、内容物を取り出して滅菌した円錐形
の１５ml 容量遠心管に入れた。培地(３７℃)９ml を加
えた後、卓上遠心機[Damon/IEC Division,ニーダム・ハ
イツ,Mass.]によりその遠心管を１０００rpmで１０分間
遠心した。培地をデカントし、得られた細胞ペレットを
培地(３７℃)５０ml に再懸濁し、５％二酸化炭素、９
５％空気で平衡化させた３７℃のインキュベーター[For
ma Scientific,マリエッタ,オハイオ]中に入れておいた
Ｔ-７５組織培養フラスコ[Corning Glass,コーニング,
ニューヨーク]に移した。
アンプルをそのドライアイス容器から取り出し、３７℃
の水浴中に入れ、激しく振盪させながら氷を溶かした。
ここからのすべての操作は滅菌手法により行った。この
アンプルを開栓し、内容物を取り出して滅菌した円錐形
の１５ml 容量遠心管に入れた。培地(３７℃)９ml を加
えた後、卓上遠心機[Damon/IEC Division,ニーダム・ハ
イツ,Mass.]によりその遠心管を１０００rpmで１０分間
遠心した。培地をデカントし、得られた細胞ペレットを
培地(３７℃)５０ml に再懸濁し、５％二酸化炭素、９
５％空気で平衡化させた３７℃のインキュベーター[For
ma Scientific,マリエッタ,オハイオ]中に入れておいた
Ｔ-７５組織培養フラスコ[Corning Glass,コーニング,
ニューヨーク]に移した。
【００２９】Ｂ）細胞の発育 コールターカウンター(Coulter Counter)[CoulterElect
ronics,Hialeah,フロリダ]によって計数して、細胞のカ
ウント数が１−１．５×１０6細胞／ml になったなら、
滅菌５００ml 容量マイクロキャリアー・スピナー・フ
ラスコ(microcarrier spinner flask)[Bellco Biotechn
ology,Vineland,ニュージャージー]中の新鮮な発育培地
(総量５００ml)４５０ml に培養物を移し、５％二酸化
炭素インキュベーター(３７℃)中、マイクロキャリアー
マグネチック撹拌子[Bellco]を使用して５０rpmで撹拌
した。細胞密度が１−１．５×１０6になったなら、細
胞懸濁液５００ml を６リットル容量マイクロキャリア
ー・スピナー[Bellco]中の培地(３７℃)５．５リットル
中に入れた。スピナーフラスコに０．２ミクロン通気フ
ィルター[Gelman Sciences,Ann Arbor,ミシガン]を備え
付け、頭隙(ヘッドスペース)を５％二酸化炭素、２５％
酸素および７０％窒素で連続的にガス処理できるように
した。３７℃において５０rpmの撹拌を行った。細胞密
度が１−１．５×１０6細胞／ml になったなら、細胞懸
濁液５リットルを滅菌した３６リットル容量Biotech Ov
erhead Drive System[Bellco]中の３７℃培地約３６リ
ットル中に入れた。７０％窒素、２５％酸素および５％
二酸化炭素を滅菌した通気フィルターから培養物に吹き
掛けた。側面の孔の１つにパスツールピペットを入れ、
ガス流を５−１０泡／秒に設定した。その培養物を６−
７rpmで撹拌し、３７℃でインキュベートした。毎日、
細胞のカウントを行い、細胞密度が約１×１０6細胞／m
l になったなら、培養物に１００％酸素を非常にゆっく
りとした速度で噴霧した。
ronics,Hialeah,フロリダ]によって計数して、細胞のカ
ウント数が１−１．５×１０6細胞／ml になったなら、
滅菌５００ml 容量マイクロキャリアー・スピナー・フ
ラスコ(microcarrier spinner flask)[Bellco Biotechn
ology,Vineland,ニュージャージー]中の新鮮な発育培地
(総量５００ml)４５０ml に培養物を移し、５％二酸化
炭素インキュベーター(３７℃)中、マイクロキャリアー
マグネチック撹拌子[Bellco]を使用して５０rpmで撹拌
した。細胞密度が１−１．５×１０6になったなら、細
胞懸濁液５００ml を６リットル容量マイクロキャリア
ー・スピナー[Bellco]中の培地(３７℃)５．５リットル
中に入れた。スピナーフラスコに０．２ミクロン通気フ
ィルター[Gelman Sciences,Ann Arbor,ミシガン]を備え
付け、頭隙(ヘッドスペース)を５％二酸化炭素、２５％
酸素および７０％窒素で連続的にガス処理できるように
した。３７℃において５０rpmの撹拌を行った。細胞密
度が１−１．５×１０6細胞／ml になったなら、細胞懸
濁液５リットルを滅菌した３６リットル容量Biotech Ov
erhead Drive System[Bellco]中の３７℃培地約３６リ
ットル中に入れた。７０％窒素、２５％酸素および５％
二酸化炭素を滅菌した通気フィルターから培養物に吹き
掛けた。側面の孔の１つにパスツールピペットを入れ、
ガス流を５−１０泡／秒に設定した。その培養物を６−
７rpmで撹拌し、３７℃でインキュベートした。毎日、
細胞のカウントを行い、細胞密度が約１×１０6細胞／m
l になったなら、培養物に１００％酸素を非常にゆっく
りとした速度で噴霧した。
【００３０】Ｃ）採取操作 培養物が２−３×１０6細胞／ml になったなら、発育容
器の内容物を滅菌した５０リットル容量ガラス瓶[Nalge
ne,ロチェスター,ニューヨーク]に移した。そのガラス
瓶に栓をし、４℃で約４８時間保存して細胞をその容器
の底に定着させた。以後のすべての工程は４℃で行い、
滅菌操作は必要でなかった。ガラス瓶の上部から殆どの
培地を吸引して廃棄し、細胞懸濁液を５−６リットルの
ままにしておいた。ガラス瓶を渦巻かせて細胞を培地中
に再懸濁し、得られた細胞懸濁液を６個の１リットル容
量遠心ボトル[Nalgene，ロチェスター，ニューヨーク]
に注いだ。それらボトルをＩＥＣ遠心機[Damon/IEC,ニ
ードハム・ハイツ,Mass.]において２５００rpmで３０分
間遠心した。上清を廃棄し、細胞を、１４０mＭ ＮaＣ
l、５mＭ ＫＣl、２mＭ エチレンジアミン四酢酸(ＥＤ
ＴＡ)、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．４(２リットル)
中で洗浄した。洗浄した細胞ペレットをまとめ、pＨ８
の１５０mＭ ＮaＣl、２mＭ ＥＤＴＡ、５０mＭ トリス
-ＨＣl、１００μＭ ロイペプチン(leupeptin)中に１０
8細胞／ml(約１０mｇ/ml タンパク質)で再懸濁し、細胞
懸濁液約５００ml または細胞タンパク質５ｇとした。
器の内容物を滅菌した５０リットル容量ガラス瓶[Nalge
ne,ロチェスター,ニューヨーク]に移した。そのガラス
瓶に栓をし、４℃で約４８時間保存して細胞をその容器
の底に定着させた。以後のすべての工程は４℃で行い、
滅菌操作は必要でなかった。ガラス瓶の上部から殆どの
培地を吸引して廃棄し、細胞懸濁液を５−６リットルの
ままにしておいた。ガラス瓶を渦巻かせて細胞を培地中
に再懸濁し、得られた細胞懸濁液を６個の１リットル容
量遠心ボトル[Nalgene，ロチェスター，ニューヨーク]
に注いだ。それらボトルをＩＥＣ遠心機[Damon/IEC,ニ
ードハム・ハイツ,Mass.]において２５００rpmで３０分
間遠心した。上清を廃棄し、細胞を、１４０mＭ ＮaＣ
l、５mＭ ＫＣl、２mＭ エチレンジアミン四酢酸(ＥＤ
ＴＡ)、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．４(２リットル)
中で洗浄した。洗浄した細胞ペレットをまとめ、pＨ８
の１５０mＭ ＮaＣl、２mＭ ＥＤＴＡ、５０mＭ トリス
-ＨＣl、１００μＭ ロイペプチン(leupeptin)中に１０
8細胞／ml(約１０mｇ/ml タンパク質)で再懸濁し、細胞
懸濁液約５００ml または細胞タンパク質５ｇとした。
【００３１】実施例２ ホスホリパーゼＡ2の精製 Ａ）Ｕ９３７サイトゾル画分の調製 ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡを１mＭ および１００μ
Ｍ (それぞれ２００mM および２０mＭ のメタノール中
の貯蔵物をまとめたものから得る)に加えた後、細胞を
前もって冷却しておいたＰarr細胞破壊容器[Parr Inst
r.Co.,モレイン,IL]に移し、６００psi窒素雰囲気下に
４℃において２０分間マクグネチック撹拌子で混合し、
圧力を解放して細胞溶解した。得られた細胞溶解物を遠
心(１５０，０００×Ｇ、６０分間、４℃)し、上清を採
取した。カラムクロマトグラフィーの前にその細胞抽出
物をまずチーズクロスで濾過し、次いで速度可変蠕動ポ
ンプを使用してＭillipak-４０フィルター[０．２２μ
m，Millipore,ベッドホールド,ＭＡ]で濾過した。
Ｍ (それぞれ２００mM および２０mＭ のメタノール中
の貯蔵物をまとめたものから得る)に加えた後、細胞を
前もって冷却しておいたＰarr細胞破壊容器[Parr Inst
r.Co.,モレイン,IL]に移し、６００psi窒素雰囲気下に
４℃において２０分間マクグネチック撹拌子で混合し、
圧力を解放して細胞溶解した。得られた細胞溶解物を遠
心(１５０，０００×Ｇ、６０分間、４℃)し、上清を採
取した。カラムクロマトグラフィーの前にその細胞抽出
物をまずチーズクロスで濾過し、次いで速度可変蠕動ポ
ンプを使用してＭillipak-４０フィルター[０．２２μ
m，Millipore,ベッドホールド,ＭＡ]で濾過した。
【００３２】Ｂ）セファロースＱ陰イオン交換クロマト
グラフィー １５０mＭ ＮaＣl、２mＭ ２−ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、
２５mＭ トリス-ＨＣlpＨ８で前もって平衡化しておい
た３．２×１４cmＦast Ｆlow Ｓepharose Ｑ[ファルマ
シア]に速度５ml／分でサイトゾル画分(２−３ｇタンパ
ク質)を適用した。このカラムを同じ緩衝液５００ml で
洗浄し、２mＭ ２−ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ ト
リス-ＨＣl pＨ８中、１５０mＭ から５００mＭ ＮaＣl
の線状塩グラジエント１５００ml で展開させて溶出
し、画分１２ml づつをを採取した。そのカラム溶出液
を吸光度２８０nm(ＡＵＦ２．０)でモニターし、各画分
の２μl をＰＬＡ2活性について検定した。ＰＬＡ2は、
画分４７−５６(１２０ml)に約３８０mＭ ＮaＣlで溶出
された。これらの画分をまとめ、ＹＭ３０膜を有するア
ミコン限外濾過撹拌セルを使用して２５ml に濃縮し
た。
グラフィー １５０mＭ ＮaＣl、２mＭ ２−ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、
２５mＭ トリス-ＨＣlpＨ８で前もって平衡化しておい
た３．２×１４cmＦast Ｆlow Ｓepharose Ｑ[ファルマ
シア]に速度５ml／分でサイトゾル画分(２−３ｇタンパ
ク質)を適用した。このカラムを同じ緩衝液５００ml で
洗浄し、２mＭ ２−ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ ト
リス-ＨＣl pＨ８中、１５０mＭ から５００mＭ ＮaＣl
の線状塩グラジエント１５００ml で展開させて溶出
し、画分１２ml づつをを採取した。そのカラム溶出液
を吸光度２８０nm(ＡＵＦ２．０)でモニターし、各画分
の２μl をＰＬＡ2活性について検定した。ＰＬＡ2は、
画分４７−５６(１２０ml)に約３８０mＭ ＮaＣlで溶出
された。これらの画分をまとめ、ＹＭ３０膜を有するア
ミコン限外濾過撹拌セルを使用して２５ml に濃縮し
た。
【００３３】Ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー 陰イオン交換カラムから得られた濃縮ピーク画分(タン
パク質１５０mｇ)を、５００mＭ ＮaＣl、２mＭ ２−Ｍ
Ｅ、１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８で前
もって平衡化しておいたフェニル-スペロースＨＲ１０
／１０カラム(ファルマシア)に流速１ml／分で適用し、
画分４ml づつをを採取した。そのカラムを同じ緩衝液
１２０ml で洗浄した後、カラム緩衝液１部および溶出
緩衝液(５０％エチレングリコール、２mＭ ２−ＭＥ、
１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８)１部を
使用して線状グラジエント１２０ml を流速０．７５ml
／分で適用した。そのカラム溶出液を吸光度２８０nmで
モニターし、各画分の２μl をＰＬＡ2活性について検
定した。ＰＬＡ2は、画分３２−５２(４０ml)に１５−
４５％エチレングリコール由来の広範なピークとして溶
出された。これらの画分をまとめ、まずＹＭ３０膜を有
するアミコン撹拌セルで、次いでセントリコン-３０微
小濃縮器(Centricon-30 microconcentrator)[アミコン
(Amicon)]で濃縮し、３０％エチレングリコール、２mＭ
２-ＭＥ、１５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＥＧＴＡ、２５m
Ｍ トリス-ＨＣl pＨ８(１５容量)中に再懸濁し、次い
で２ml に再濃縮した。
パク質１５０mｇ)を、５００mＭ ＮaＣl、２mＭ ２−Ｍ
Ｅ、１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８で前
もって平衡化しておいたフェニル-スペロースＨＲ１０
／１０カラム(ファルマシア)に流速１ml／分で適用し、
画分４ml づつをを採取した。そのカラムを同じ緩衝液
１２０ml で洗浄した後、カラム緩衝液１部および溶出
緩衝液(５０％エチレングリコール、２mＭ ２−ＭＥ、
１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８)１部を
使用して線状グラジエント１２０ml を流速０．７５ml
／分で適用した。そのカラム溶出液を吸光度２８０nmで
モニターし、各画分の２μl をＰＬＡ2活性について検
定した。ＰＬＡ2は、画分３２−５２(４０ml)に１５−
４５％エチレングリコール由来の広範なピークとして溶
出された。これらの画分をまとめ、まずＹＭ３０膜を有
するアミコン撹拌セルで、次いでセントリコン-３０微
小濃縮器(Centricon-30 microconcentrator)[アミコン
(Amicon)]で濃縮し、３０％エチレングリコール、２mＭ
２-ＭＥ、１５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＥＧＴＡ、２５m
Ｍ トリス-ＨＣl pＨ８(１５容量)中に再懸濁し、次い
で２ml に再濃縮した。
【００３４】Ｄ）スペロース１２ゲル濾過 疎水性相互作用カラムから得られた濃縮したピーク画分
をまとめ(タンパク質約５mｇ)、３０％エチレングリコ
ール、２mＭ ２-ＭＥ、１５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＥＧ
ＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８で前もって平衡化し
ておいた直列スペロース１２カラム(各１．６×５０cm)
に流速０．１５ml／分でクロマトグラフィーし、画分
１．５ml づつを採取した。そのカラム溶出液を吸光度
２８０nmでモニターし、各画分の２μl をＰＬＡ2活性
について検定した。その酵素活性は、画分３８−４７
(１５ml)に溶出された。これらの画分をまとめ、微小濃
縮器[アミコン]で濃縮した。得られた濃縮試料(各濃縮
器毎に約８０μl)をそれぞれ１５０mＭ ＮaＣl、２mＭ
２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ
８(２．５ml)中に再懸濁し(これによりエチレングリコ
ールの最終濃度は＜１％になる)、約８０μl に再濃縮
し、次いでまとめて最終容量＜６５０μl とした。
をまとめ(タンパク質約５mｇ)、３０％エチレングリコ
ール、２mＭ ２-ＭＥ、１５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＥＧ
ＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８で前もって平衡化し
ておいた直列スペロース１２カラム(各１．６×５０cm)
に流速０．１５ml／分でクロマトグラフィーし、画分
１．５ml づつを採取した。そのカラム溶出液を吸光度
２８０nmでモニターし、各画分の２μl をＰＬＡ2活性
について検定した。その酵素活性は、画分３８−４７
(１５ml)に溶出された。これらの画分をまとめ、微小濃
縮器[アミコン]で濃縮した。得られた濃縮試料(各濃縮
器毎に約８０μl)をそれぞれ１５０mＭ ＮaＣl、２mＭ
２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ
８(２．５ml)中に再懸濁し(これによりエチレングリコ
ールの最終濃度は＜１％になる)、約８０μl に再濃縮
し、次いでまとめて最終容量＜６５０μl とした。
【００３５】Ｅ）疎水性相互作用クロマトグラフィー ゲル濾過カラムから得られた濃縮試料(タンパク質約１m
ｇ)を１５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴ
Ａ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８を使用して１ml に希
釈した。その試料を、希釈用に使用した緩衝液と同じも
ので平衡化しておいたフェニル-スペロースＨＲ ５／５
(ファルマシア)カラムに流速０．２５ml／分で入れ、画
分０．５ml づつを採取した。そのカラムを同じ緩衝液
８ml で洗浄した後、カラム緩衝液１部および溶出緩衝
液(５０％エチレングリコール、２mＭ ２−ＭＥ、１mＭ
ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８)１部を使用し
て線状グラジエント１０ml を流速０．２５ml／分で適
用した。上述のように、溶出は以後の使用のためのカラ
ムの再条件化にとって必要となるだけである。そのカラ
ム溶出液を吸光度２８０nmでモニターし、各画分の２μ
l をＰＬＡ2活性について検定した。ＰＬＡ2活性は画分
７−２０(７ml)に現れた。これらの画分をまとめ、まず
セントリコン-３０微小濃縮器[アミコン]で、次いでウ
ルトラフリーＭＣ １０，０００ＮＭＷＬフィルターユ
ニット[ミリポア(Millipore),ベッドホールド,MA]を使
用して６０μl にまで濃縮した。回収されたタンパク質
は約１００μgであった。
ｇ)を１５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴ
Ａ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８を使用して１ml に希
釈した。その試料を、希釈用に使用した緩衝液と同じも
ので平衡化しておいたフェニル-スペロースＨＲ ５／５
(ファルマシア)カラムに流速０．２５ml／分で入れ、画
分０．５ml づつを採取した。そのカラムを同じ緩衝液
８ml で洗浄した後、カラム緩衝液１部および溶出緩衝
液(５０％エチレングリコール、２mＭ ２−ＭＥ、１mＭ
ＥＧＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８)１部を使用し
て線状グラジエント１０ml を流速０．２５ml／分で適
用した。上述のように、溶出は以後の使用のためのカラ
ムの再条件化にとって必要となるだけである。そのカラ
ム溶出液を吸光度２８０nmでモニターし、各画分の２μ
l をＰＬＡ2活性について検定した。ＰＬＡ2活性は画分
７−２０(７ml)に現れた。これらの画分をまとめ、まず
セントリコン-３０微小濃縮器[アミコン]で、次いでウ
ルトラフリーＭＣ １０，０００ＮＭＷＬフィルターユ
ニット[ミリポア(Millipore),ベッドホールド,MA]を使
用して６０μl にまで濃縮した。回収されたタンパク質
は約１００μgであった。
【００３６】Ｆ）結果 以下の表１は、実施例１および２で例示した本発明方法
の結果をまとめたものである。データの作成は、２つの
精製工程をまとめ、工程(f)における調製物４０リット
ルを工程(g)および(h)のために一緒にした。
の結果をまとめたものである。データの作成は、２つの
精製工程をまとめ、工程(f)における調製物４０リット
ルを工程(g)および(h)のために一緒にした。
【００３７】
【表１】 タンパク質 比ＰＬＡ2 全ＰＬＡ2 収率 純度 工 程 (mｇ tot) (mU/mｇ) (mU) (%) (倍) (a）窒素キャビテーション 15621 0.05 748 - - (b）UC150,000×G 6066 0.31 1882 100 3 (c)&(d）Q-セファロース 293 3.74 1095 58 31 (e)&(f）フェニル-スペロース 6.3 76.0 529 29 630 (g）スペロース12 0.5 517 265 14 4289 (h）フェニル-スペロース <0.1 >1722 172 9 >14278
【００３８】図１は、Laemmli[Laemmli,Nature,227:680
(1970)]に従って還元条件下で行った１２％ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)を再現
したものである。ゲルの各レーンは、本発明の各精製工
程の結果として単離されたタンパク質のパターンを示し
ている。レーン７は、本発明の方法によって単離された
ＰＬＡ2が実質的に純粋であること、およびその分子量
が約１００kＤaであることを示している。
(1970)]に従って還元条件下で行った１２％ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)を再現
したものである。ゲルの各レーンは、本発明の各精製工
程の結果として単離されたタンパク質のパターンを示し
ている。レーン７は、本発明の方法によって単離された
ＰＬＡ2が実質的に純粋であること、およびその分子量
が約１００kＤaであることを示している。
【００３９】図２は、本発明の精製ＰＬＡ2の非-変性ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を示している。染色され
ていない同様のＰＬＡ2レーンを２０切片に切断し、２m
ｇ/ml ウシ血清アルブミンを加えた１％ＣＨＡＰＳ、１
５０mＭ ＮaＣl、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、２
５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８を使用して４℃一晩で各切片
の内容物をゲルから溶出させた。得られた溶出液をＰＬ
Ａ2活性検定に供し、本発明の方法によって精製された
タンパク質が実際にＰＬＡ2酵素であることが証明され
た。図２は、ゲル上の最初のタンパク質バンドがＰＬＡ
2活性と一致していることを示している。
リアクリルアミドゲル電気泳動を示している。染色され
ていない同様のＰＬＡ2レーンを２０切片に切断し、２m
ｇ/ml ウシ血清アルブミンを加えた１％ＣＨＡＰＳ、１
５０mＭ ＮaＣl、２mＭ ２-ＭＥ、１mＭ ＥＧＴＡ、２
５mＭ トリス-ＨＣl pＨ８を使用して４℃一晩で各切片
の内容物をゲルから溶出させた。得られた溶出液をＰＬ
Ａ2活性検定に供し、本発明の方法によって精製された
タンパク質が実際にＰＬＡ2酵素であることが証明され
た。図２は、ゲル上の最初のタンパク質バンドがＰＬＡ
2活性と一致していることを示している。
【００４０】図３は、単離した産物のＣa2+要求性を調
査するためのＰＬＡ2活性検定の結果を示している。プ
ロットした曲線は、本発明のＰＬＡ2がその活性のため
にＣa2+が必要であり、また最大の酵素活性は約８００n
Ｍ Ｃa2+濃度で達成されることを明らかに示す２つの別
の検定法のものである。十分に特性化されている他のす
べての低分子量ＰＬＡ2は現在まではＣa2+濃度１mＭ 以
上において最大活性を示すと報告されていることから、
この知見は本発明ＰＬＡ2に独特のものである。
査するためのＰＬＡ2活性検定の結果を示している。プ
ロットした曲線は、本発明のＰＬＡ2がその活性のため
にＣa2+が必要であり、また最大の酵素活性は約８００n
Ｍ Ｃa2+濃度で達成されることを明らかに示す２つの別
の検定法のものである。十分に特性化されている他のす
べての低分子量ＰＬＡ2は現在まではＣa2+濃度１mＭ 以
上において最大活性を示すと報告されていることから、
この知見は本発明ＰＬＡ2に独特のものである。
【００４１】実施例３ アミノ酸配列決定 予備実験によって、単離したＰＬＡ2はアミノ末端がブ
ロックされているためにそのＮ末端アミノ酸の配列決定
が行えないことが判明した。このタイプの分析において
は細胞質タンパク質はブロックされていることが多いこ
とは周知であるので、この実験結果は予想外のものでは
なかった。この酵素を臭化シアン(ＣＮＢr)で開裂して
ＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけることで、部分的アミノ酸配列
が得られた。次いで、この開裂ＰＬＡ2をＳＤＳ-ＰＡＧ
Ｅに戻し、タンパク質結合膜にエレクトロブロット(電
気ブロット)し、次いでアミノ酸配列分析に供した。
ロックされているためにそのＮ末端アミノ酸の配列決定
が行えないことが判明した。このタイプの分析において
は細胞質タンパク質はブロックされていることが多いこ
とは周知であるので、この実験結果は予想外のものでは
なかった。この酵素を臭化シアン(ＣＮＢr)で開裂して
ＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけることで、部分的アミノ酸配列
が得られた。次いで、この開裂ＰＬＡ2をＳＤＳ-ＰＡＧ
Ｅに戻し、タンパク質結合膜にエレクトロブロット(電
気ブロット)し、次いでアミノ酸配列分析に供した。
【００４２】Ａ）ＳＤＳ-ＰＡＧＥ 濃縮した(４倍)試料緩衝液(８％ＳＤＳ、４０％グリセ
リン、２０％２-ＭＥおよび４００mＭ トリス-ＨＣl p
Ｈ６．８)２０μl をフェニル-スペロース５／５カラム
から得られた濃縮画分６０μl と混合し、６０℃で２０
分間インキュベートすることにより、試料をＬaemmliに
従ってＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけた。その２０μl (タンパ
ク質約２５μg)を、９％ＳＤＳポリアクリルアミド分離
ゲルおよび５％重層ゲルを含有するミニゲル(５×７cm)
に適用し、２０mＡの一定電流で９０分間電気泳動し
た。電気泳動した後、１工程の低バックグランドクーマ
シー染色法によってＰＬＡ2バンドを視覚化し[B.D.Zeh
r,T.J.Savin およびR.E.Hall,Anal.Biochem.,182:157,
(1989)]、ゲルから切除した。各ゲル切片を１０％酢
酸、５％メタノール１ml で２回洗浄し、−２０℃にお
いてエッペンドルフ試験管中に保存した。
リン、２０％２-ＭＥおよび４００mＭ トリス-ＨＣl p
Ｈ６．８)２０μl をフェニル-スペロース５／５カラム
から得られた濃縮画分６０μl と混合し、６０℃で２０
分間インキュベートすることにより、試料をＬaemmliに
従ってＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけた。その２０μl (タンパ
ク質約２５μg)を、９％ＳＤＳポリアクリルアミド分離
ゲルおよび５％重層ゲルを含有するミニゲル(５×７cm)
に適用し、２０mＡの一定電流で９０分間電気泳動し
た。電気泳動した後、１工程の低バックグランドクーマ
シー染色法によってＰＬＡ2バンドを視覚化し[B.D.Zeh
r,T.J.Savin およびR.E.Hall,Anal.Biochem.,182:157,
(1989)]、ゲルから切除した。各ゲル切片を１０％酢
酸、５％メタノール１ml で２回洗浄し、−２０℃にお
いてエッペンドルフ試験管中に保存した。
【００４３】Ｂ）臭化シアン開裂 本発明のＰＬＡ2を含有する各ポリアクリルアミドゲル
切片を水１ml で１０分間洗浄し、次いで２０％ギ酸を
含有する０．１Ｎ 塩酸１ml 中のＣＮＢr(１００mｇ/m
l)にさらした。このＣＮＢrは、９０％ギ酸中、５００m
ｇ/ml の新たに調製した貯蔵液から希釈した。未反応の
ＣＮＢrは膨大な連続洗浄によって除去した。水１ml と
共に５分間インキュベートを１回行い、１００mＭ トリ
ス-ＨＣlpＨ８．８(１ml)と共に５分間インキュベート
を２回行い、そして３７℃で試料緩衝液(０．００２％
ブロムフェノールブルーを含有する２％ＳＤＳ、１０％
グリセリン、５％２-ＭＥおよび１００mＭ トリス-ＨＣ
l pＨ６．８)４００μl と共に１０分間インキュベート
を１回行うことにより、ゲル切片からＣＮＢrを除去し
た。得られた切片は電気泳動を行うことができるまで、
−７０℃で保存した。
切片を水１ml で１０分間洗浄し、次いで２０％ギ酸を
含有する０．１Ｎ 塩酸１ml 中のＣＮＢr(１００mｇ/m
l)にさらした。このＣＮＢrは、９０％ギ酸中、５００m
ｇ/ml の新たに調製した貯蔵液から希釈した。未反応の
ＣＮＢrは膨大な連続洗浄によって除去した。水１ml と
共に５分間インキュベートを１回行い、１００mＭ トリ
ス-ＨＣlpＨ８．８(１ml)と共に５分間インキュベート
を２回行い、そして３７℃で試料緩衝液(０．００２％
ブロムフェノールブルーを含有する２％ＳＤＳ、１０％
グリセリン、５％２-ＭＥおよび１００mＭ トリス-ＨＣ
l pＨ６．８)４００μl と共に１０分間インキュベート
を１回行うことにより、ゲル切片からＣＮＢrを除去し
た。得られた切片は電気泳動を行うことができるまで、
−７０℃で保存した。
【００４４】Ｃ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動およびタンパク質移動 ゲル切片から得たタンパク質を、５％重層ゲルおよび１
４％分離ゲルを含有するＳＤＳポリアクリルアミドゲル
にて電気泳動した。電気泳動した後、ゲルを移動緩衝液
[１０mＭ ３-[シクロヘキシルアミノ]-１-プロパンスル
ホン酸、１０％メタノール、pＨ１１]に５分間浸し、４
℃において２５０mＡで２時間ポリビニリデンジフルオ
ライド(ＰＶＤＦ)膜[Immobilon；４５μm孔サイズ，Ｍi
llipore,ベッドフォード,MA]にエレクトロブロットした
[P.Matudaira,J.Biol.Chem.,262:10035(1987)]。得られ
たＰＶＤＦ膜をクーマシーブルーＲ-２５０で染色し
て、ＣＮＢr処理ペプチドを視覚化した。その膜を脱イ
オン水で膨大にすすぎ、乾燥させて−２０℃で保存し
た。図４は、移動された開裂産物および分子量標品を示
すものである。７つの異なるバンドがＰＬＡ2レーンに
観察されたが、このことは、本発明のＰＬＡ2がＣＮＢr
処理によっては部分的にしか開裂されないことを示して
いる。
動およびタンパク質移動 ゲル切片から得たタンパク質を、５％重層ゲルおよび１
４％分離ゲルを含有するＳＤＳポリアクリルアミドゲル
にて電気泳動した。電気泳動した後、ゲルを移動緩衝液
[１０mＭ ３-[シクロヘキシルアミノ]-１-プロパンスル
ホン酸、１０％メタノール、pＨ１１]に５分間浸し、４
℃において２５０mＡで２時間ポリビニリデンジフルオ
ライド(ＰＶＤＦ)膜[Immobilon；４５μm孔サイズ，Ｍi
llipore,ベッドフォード,MA]にエレクトロブロットした
[P.Matudaira,J.Biol.Chem.,262:10035(1987)]。得られ
たＰＶＤＦ膜をクーマシーブルーＲ-２５０で染色し
て、ＣＮＢr処理ペプチドを視覚化した。その膜を脱イ
オン水で膨大にすすぎ、乾燥させて−２０℃で保存し
た。図４は、移動された開裂産物および分子量標品を示
すものである。７つの異なるバンドがＰＬＡ2レーンに
観察されたが、このことは、本発明のＰＬＡ2がＣＮＢr
処理によっては部分的にしか開裂されないことを示して
いる。
【００４５】Ｃ）アミノ酸配列分析 電気泳動およびエレクトロブロット後におけるＰＶＤＦ
膜上に観察される３つの主要なバンド(ペプチド２、３
および４)を切除し、９００Ａ型データシステムを備え
たApplied Biosystems 477A Pulsed Liquid Sequencer
を使用して自動エドマン分解法に供した[R.M.Hewick ら
のJ.Biol.Chem.,256:7990(1981)]。そのタンパク質分析
装置の製造元の教示に従って、ブロットしたＣＮＢr処
理ペプチド(全ＰＬＡ2調製物から誘導したもの)を含有
するＰＶＤＦ膜をポリブレン条件化フィルターの上端に
置いた。ＰＴＨ-Ｃ１８カラム(２．１×２２０mm)を備
えたApplied Biosystems 120A PTH アミノ酸分析装置を
使用し、得られたフェニルチオヒダントインアミノ酸を
オンラインで分析した。ペプチド４の２６アミノ末端ア
ミノ酸は、以下のとおりであった：
膜上に観察される３つの主要なバンド(ペプチド２、３
および４)を切除し、９００Ａ型データシステムを備え
たApplied Biosystems 477A Pulsed Liquid Sequencer
を使用して自動エドマン分解法に供した[R.M.Hewick ら
のJ.Biol.Chem.,256:7990(1981)]。そのタンパク質分析
装置の製造元の教示に従って、ブロットしたＣＮＢr処
理ペプチド(全ＰＬＡ2調製物から誘導したもの)を含有
するＰＶＤＦ膜をポリブレン条件化フィルターの上端に
置いた。ＰＴＨ-Ｃ１８カラム(２．１×２２０mm)を備
えたApplied Biosystems 120A PTH アミノ酸分析装置を
使用し、得られたフェニルチオヒダントインアミノ酸を
オンラインで分析した。ペプチド４の２６アミノ末端ア
ミノ酸は、以下のとおりであった：
【化７】 仮の配列は以下のペプチド３と帰属された：
【化８】 ペプチド２はペプチド４と同じ配列を与えるようであっ
た。
た。
【００４６】実施例４ ＰＬＡ2活性検定 １-パルミトイル-２-[１４Ｃ]アラキドノイル-ｓｎ-グ
リセロ-３-ホスホコリン([１４Ｃ]ＰＣ)[ＮＥＮ Ｒesea
rch Ｐroductsから入手。５５mＣi／mmol]およびｓｎ-
１，２-ジオレオイルグリセロール(ＤＧ)[Avanti Polar
Lipids,バーミンガム,AL]をモル比２：１で含有する基
質である音波処理リポソームを以下のようにして調製し
た。[１４Ｃ]ＰＣ(２０nmol、１×１０6dpm、トルエン
／エタノール中、１００mＣi／ml)およびＤＧ(１０nmo
l、クロロホルム中、１００μg／ml)を窒素雰囲気下に
乾燥した。Ｍicroson probe-音波処理装置[Heat-system
s,Ultrasonics]を４５秒間隔で４×１５秒間使用し、音
波処理を行うことで、１５０mＭ ＮaＣl、５０mＭ Ｈep
es,pＨ７．５(検定緩衝液)１ml 中に脂質を分散させ
た。ウシ血清アルブミン(実質的に脂肪酸を含まない。
水中１００mｇ/ml ストックから入手、シグマ)を終濃度
４mｇ/ml になるまで加えた。ＰＬＡ2活性について検定
する試料を、１mＭ ＣaＣl2および１mＭ ２-ＭＥを含有
する検定緩衝液０．２ml 総量中、リポソーム[ＤＧ０．
２５nmolを含有する０．５nmol[１４Ｃ]ＰＣ、５０，０
００cpm]５０μl と共にインキュベートした。インキュ
ベートは３７℃で１５分間行い、ドール試薬[１０μｇ/
ml ステアリン酸を含有する２-プロパノール／ヘプタン
／０．５Ｍ 硫酸、４０：１０：１]２ml を添加して終
了した。混合した後、ヘプタン１．２ml および水１ml
を加えた。得られた混合物を手短に旋回し、得られた上
部層を、ヘプタン２ml および使用前に１３０℃におい
て活性化したBio-Sil[Bio-Rad Laboratories]１５０mｇ
を含有するチューブに移した。そのチューブを完全に旋
回させ、遠心した(１０００×Ｇ、５分間)。上清をシン
チレーション用バイアルにデカンテーションした。液体
シンチレーション混液[Ready Protein+,Beckman]１０ml
を添加した後、Packard 液体シンチレーションカウン
ター１５００型を使用して放射活性をカウントした。高
い放射活性のカウント数は酵素活性と相関する。
リセロ-３-ホスホコリン([１４Ｃ]ＰＣ)[ＮＥＮ Ｒesea
rch Ｐroductsから入手。５５mＣi／mmol]およびｓｎ-
１，２-ジオレオイルグリセロール(ＤＧ)[Avanti Polar
Lipids,バーミンガム,AL]をモル比２：１で含有する基
質である音波処理リポソームを以下のようにして調製し
た。[１４Ｃ]ＰＣ(２０nmol、１×１０6dpm、トルエン
／エタノール中、１００mＣi／ml)およびＤＧ(１０nmo
l、クロロホルム中、１００μg／ml)を窒素雰囲気下に
乾燥した。Ｍicroson probe-音波処理装置[Heat-system
s,Ultrasonics]を４５秒間隔で４×１５秒間使用し、音
波処理を行うことで、１５０mＭ ＮaＣl、５０mＭ Ｈep
es,pＨ７．５(検定緩衝液)１ml 中に脂質を分散させ
た。ウシ血清アルブミン(実質的に脂肪酸を含まない。
水中１００mｇ/ml ストックから入手、シグマ)を終濃度
４mｇ/ml になるまで加えた。ＰＬＡ2活性について検定
する試料を、１mＭ ＣaＣl2および１mＭ ２-ＭＥを含有
する検定緩衝液０．２ml 総量中、リポソーム[ＤＧ０．
２５nmolを含有する０．５nmol[１４Ｃ]ＰＣ、５０，０
００cpm]５０μl と共にインキュベートした。インキュ
ベートは３７℃で１５分間行い、ドール試薬[１０μｇ/
ml ステアリン酸を含有する２-プロパノール／ヘプタン
／０．５Ｍ 硫酸、４０：１０：１]２ml を添加して終
了した。混合した後、ヘプタン１．２ml および水１ml
を加えた。得られた混合物を手短に旋回し、得られた上
部層を、ヘプタン２ml および使用前に１３０℃におい
て活性化したBio-Sil[Bio-Rad Laboratories]１５０mｇ
を含有するチューブに移した。そのチューブを完全に旋
回させ、遠心した(１０００×Ｇ、５分間)。上清をシン
チレーション用バイアルにデカンテーションした。液体
シンチレーション混液[Ready Protein+,Beckman]１０ml
を添加した後、Packard 液体シンチレーションカウン
ター１５００型を使用して放射活性をカウントした。高
い放射活性のカウント数は酵素活性と相関する。
【図１】 本発明方法の各工程により得られる産物のＳ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面
に代わる写真である。
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面
に代わる写真である。
【図２】 本発明の精製タンパク質が最大ＰＬＡ2活性
と相関することを示すグラフ、及びクロマトグラフの結
果を撮影した図面に代わる写真である。
と相関することを示すグラフ、及びクロマトグラフの結
果を撮影した図面に代わる写真である。
【図３】 本発明のＰＬＡ2のＣa2+依存性を示すグラフ
である。
である。
【図４】 本発明のＰＬＡ2の臭化シアン開裂後におけ
るＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す
図面に代わる写真である。
るＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す
図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−43193（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．，170（２）（1990）, ＰＰ．484−90
Claims (6)
- 【請求項１】 (a)ヒトの生物学的細胞を細胞溶解し、 (b)得られた細胞溶解物を分画化して細胞残骸、オルガ
ネラおよび膜を実質的に含有しないタンパク質の溶液を
得、 (c)該タンパク質溶液をその中に含有されているヒトの
ホスホリパーゼＡ2と結合できる陰イオン交換樹脂と接
触させ、 (d)該陰イオン交換樹脂からヒトのホスホリパーゼＡ2を
溶出させ、 (e)工程(d)により得られたヒトのホスホリパーゼＡ2を
含有する溶液を、ヒトのホスホリパーゼＡ2と結合でき
る疎水性相互作用樹脂と接触させ、 (f)該ホスホリパーゼＡ2を該疎水性相互作用樹脂から溶
出させ、 (g)分子サイズ分画クロマトグラフィーによってヒトの
ホスホリパーゼＡ2含有溶液を同時に溶出された夾雑物
と分離し、 (h)ヒトのホスホリパーゼＡ2と疎水性相互作用樹脂との
間に弱い相互作用しか起こさない条件下で、工程(g)に
より得られたヒトのホスホリパーゼＡ2含有溶液を疎水
性相互作用樹脂と接触させること、 を特徴とする、実質的に純粋な形態にあるヒトのサイト
ゾルホスホリパーゼＡ2をヒトの生物学的細胞から単離
するための方法。 - 【請求項２】 生物学的細胞がＵ９３７ヒト白血病単芽
球様細胞である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 (a)サイトゾルホスホリパーゼＡ2インヒ
ビターと思われるものを標識したサイトゾルホスホリパ
ーゼＡ2リポソーム基質中に入れ、 (b)標識したサイトゾルホスホリパーゼＡ2リポソーム基
質を水層から分離し、 (c)標識物の存在または不存在について検定すること、 を特徴とするサイトゾルホスホリパーゼＡ2インヒビタ
ーをスクリーニングするための方法。 - 【請求項４】 アミノ酸配列： 【化１】 を含有している、ホスホリパーゼＡ2活性を有し、分子
量約１００キロダルトンであり、約８００ｎＭのカルシ
ウム濃度で最大の酵素活性を示すヒトポリペプチド。 - 【請求項５】 アミノ酸配列： 【化２】 を含有している、ホスホリパーゼＡ2活性を有し、分子
量約１００キロダルトンであり、約８００ｎＭのカルシ
ウム濃度で最大の酵素活性を示すヒトポリペプチド。 - 【請求項６】 アミノ酸配列： 【化３】 を含有している、ホスホリパーゼＡ2活性を有し、分子
量約１００キロダルトンであり、約８００ｎＭのカルシ
ウム濃度で最大の酵素活性を示すヒトポリペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US57351390A | 1990-08-24 | 1990-08-24 | |
| US573513 | 1990-08-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0591874A JPH0591874A (ja) | 1993-04-16 |
| JPH0829080B2 true JPH0829080B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
ID=24292288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3211948A Expired - Fee Related JPH0829080B2 (ja) | 1990-08-24 | 1991-08-23 | ヒトサイトゾルホスホリパーゼａ２ |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0476849B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0829080B2 (ja) |
| AT (1) | ATE149567T1 (ja) |
| AU (1) | AU643061B2 (ja) |
| CA (1) | CA2049482A1 (ja) |
| DE (1) | DE69124893T2 (ja) |
| DK (1) | DK0476849T3 (ja) |
| ES (1) | ES2098326T3 (ja) |
| GR (1) | GR3023061T3 (ja) |
| HU (1) | HUT61588A (ja) |
| IE (1) | IE912994A1 (ja) |
| IL (1) | IL99227A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5453443A (en) * | 1994-07-20 | 1995-09-26 | Merck Frosst Canada, Inc. | Bis(aryloxy)alkanes as inhibitors of phospholipase A2 enzymes |
| CA2365973A1 (en) | 1999-03-09 | 2000-09-14 | Laxdale Limited | Diagnostic test |
| KR20040001144A (ko) * | 2002-06-27 | 2004-01-07 | 김대경 | 신규한 적혈구 세포질형 포스포리파아제 에이 투 효소,그에 대한 항체, 이들의 용도 및 제조 방법 |
| WO2004081230A1 (ja) * | 2003-03-13 | 2004-09-23 | Nippon Soda Co. Ltd. | 生理的な活性型構造機能を反映する機能因子の活性評価方法およびその使用 |
| CN103338636A (zh) * | 2010-12-07 | 2013-10-02 | 好时公司 | 影响脂肪酸摄取和代谢及炎性介质产生的化合物和从可可产品中分离所述化合物的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6443193A (en) * | 1987-08-11 | 1989-02-15 | Tanpaku Kogaku Kenkyusho Kk | Production of phospholipase a2 |
| JPH03503843A (ja) * | 1988-04-15 | 1991-08-29 | バイオジェン インコーポレイテッド | ホスホリパーゼａ２の精製方法およびホスホリパーゼａ２様ポリペプチドの製造方法 |
| IL101507A0 (en) * | 1991-04-17 | 1992-12-30 | Lilly Co Eli | Compounds,vectors and methods for expressing human,cytosolic phospholipase a2 |
-
1991
- 1991-08-19 CA CA002049482A patent/CA2049482A1/en not_active Abandoned
- 1991-08-19 IL IL9922791A patent/IL99227A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-08-22 AT AT91307746T patent/ATE149567T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-08-22 DK DK91307746.7T patent/DK0476849T3/da active
- 1991-08-22 AU AU82698/91A patent/AU643061B2/en not_active Ceased
- 1991-08-22 DE DE69124893T patent/DE69124893T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-08-22 ES ES91307746T patent/ES2098326T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-08-22 EP EP91307746A patent/EP0476849B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-08-23 IE IE299491A patent/IE912994A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-08-23 HU HU912779A patent/HUT61588A/hu unknown
- 1991-08-23 JP JP3211948A patent/JPH0829080B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-04-08 GR GR970400729T patent/GR3023061T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．，１７０（２）（１９９０），ＰＰ．４８４−９０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0476849B1 (en) | 1997-03-05 |
| IE912994A1 (en) | 1992-02-26 |
| IL99227A (en) | 1996-10-16 |
| AU8269891A (en) | 1993-04-08 |
| JPH0591874A (ja) | 1993-04-16 |
| DK0476849T3 (da) | 1997-07-28 |
| DE69124893D1 (de) | 1997-04-10 |
| HU912779D0 (en) | 1992-01-28 |
| CA2049482A1 (en) | 1992-02-25 |
| DE69124893T2 (de) | 1997-09-11 |
| EP0476849A2 (en) | 1992-03-25 |
| HUT61588A (en) | 1993-01-28 |
| ES2098326T3 (es) | 1997-05-01 |
| AU643061B2 (en) | 1993-11-04 |
| EP0476849A3 (en) | 1992-06-17 |
| ATE149567T1 (de) | 1997-03-15 |
| IL99227A0 (en) | 1992-07-15 |
| GR3023061T3 (en) | 1997-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rothe | Electrophoresis of enzymes: Laboratory methods | |
| O'Brien et al. | Saposin proteins: structure, function, and role in human lysosomal storage disorders | |
| Podack et al. | Cytolytic T cell granules. Isolation, structural, biochemical, and functional characterization. | |
| Pentchev et al. | The isolation and characterization of sphingomyelinase from human placental tissue | |
| Knudsen | Acyl-CoA-binding protein (ACBP) and its relation to fatty acid-binding protein (FABP): an overview | |
| KR0159275B1 (ko) | 안넥신의 정제 방법 | |
| CA2188159A1 (en) | Chondroitinases i and ii, methods of preparation, and use thereof | |
| US6261803B1 (en) | Process for preparing functional recombinant tissue factor | |
| Bode et al. | Analysis of the pinocytic process in rat kidney: I. Isolation of pinocytic vesicles from rat kidney cortex | |
| Völkl et al. | Isolation of rat hepatic peroxisomes by means of immune free flow electrophoresis | |
| JPH0591874A (ja) | ヒトサイトゾルホスホリパーゼａ２ | |
| Volwerk et al. | Phosphatidylinositol‐specific phospholipase C From Bacillus cereus: Improved purification, amino acid composition, and amino‐terminal sequence | |
| Wagner et al. | [14] Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity | |
| Rindler-Ludwig et al. | Characterization and partial purification of acid lipase from human leucocytes | |
| Wieslander et al. | Fractionation of membranes from Acholeplasma laidlawii A on the basis of their surface properties by partition in two-polymer aqueous phase systems | |
| US20020169294A1 (en) | Method of purifying calcium ion-binding protein | |
| CA2002446A1 (en) | Method for the isolation of purification of cu/zn superoxide dismutase | |
| Ajmar et al. | Expression of erythroid acetylcholinesterase in the K-562 leukemia cell line | |
| Deshmukh et al. | Studies on the submicrosomal fractions of bovine oligodendroglia: lipid composition and glycolipid biosynthesis | |
| Elce | Expression of m-calpain in Escherichia coli | |
| US12606593B2 (en) | Process for producing a membrane protein | |
| Bauer et al. | Changes of the electrophoretic mobility of human monocytes are regulated by lymphocytes | |
| RU2337966C2 (ru) | Препарат рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина и способ его получения | |
| US5100798A (en) | Method for the extraction of a vitamin-k-dependent carboxylase complex and the use thereof | |
| RU2109748C1 (ru) | Способ выделения ангиогенина |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19961210 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |