JPH0829088B2 - フルクト−ス−１，６−二燐酸の生産に使用する酵母の燐酸化活性を保持させる方法 - Google Patents

フルクト−ス−１，６−二燐酸の生産に使用する酵母の燐酸化活性を保持させる方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルタルアルデヒドにより解糖酵素群を細
胞内に固定化させ、酵母の燐酸化活性を保持させるため
の方法を提供するものである。
本発明は、デキストロースをフルクトース−1,6−二
燐酸に燐酸化することを、同一の酵母を使用して繰り返
し行えることを可能とし、更にその生産を連続的に行う
ための機構を提供するものである。
フルクトース−1,6−二燐酸は、解糖系に於ける中間
物質として、並びに、多くの代謝経路にて重要な役割を
果たしていること及び医薬分野に於いて広く応用できる
ことにより、産業上、広範に使用できることが知られて
いる。
無機燐酸によりデキストロースを酵素的に燐酸化する
ことに基づくFDPの生産方法が知られている。
このような既知の方法とは、トルエンなどの原形質分
離剤又はトリトンなどの洗浄剤によって、あるいは温度
及び浸透圧ショックとを組み合わせることによって、酵
母細胞壁の透過性を改変することであり、この方法によ
って、細胞壁の透過性を増大し、FDPを細胞質の外へ流
出させることになる。
解糖系に参入することを妨げられたFDPは、酵母細部
を含む懸濁液中に蓄積する。しかし、この工程で不都合
なことは、原形質物質に関して細胞壁の保持能力が低下
し、結果として解糖酵素群の漏出が起こり、FDPを含有
するろ過又は遠心分離された溶液中に分散することであ
る。
故に、新たな燐酸化毎に酵素成分が奪われてしまうの
で、酵母の再使用は不可能になり、従って、連続的工程
を実施することは不可能となる。
本発明は、前記の不都合を未然に防ぐために、即ち透
過性の改善した酵母細胞の細部壁を通ってこのような酵
素が漏出するのを防ぐために、グルタルアルデヒドによ
る解糖酵素群の細胞内固定化によって酵母の燐酸化活性
を保持させるための方法を提供するものである。この方
法により、酵母自身の燐酸化能が保持されるので、酵母
を繰り返し使用すること、及びデキストロースの連続的
燐酸化が可能になる。
更に詳細に言えば、本発明は酵母細胞壁の透過性を調
節すること、即ち、細胞内のフルクトース−1,6−二燐
酸を細胞外に流出させるために該透過性を増大ささせる
が、解糖酵素群の総成分（complement）は細部内に保持
させる方法に関するものである。
本発明に係る方法には、酵母としてサッカロマイセス
・カールスベルゲンシス（Saccharomycescarlsbergensi
s）あるいはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharom
yces cerevisiae）を使用することができる。
本発明に係る方法は、温度の作用と、フルクトースと
燐酸塩の濃厚溶液を添加して起こす浸透圧ショックとを
組み合わせることにより、まず、水に懸濁させた酵母の
透過性を調節し、次いでグルタルアルデヒドの作用によ
って細胞内タンパク質と交叉結合させることにより、細
胞内の原形質解糖酵素群の保持を図るものである。
以下の具体的な説明により、本発明をより十分に理解
できるであろうが、これは本発明の制限を意図したもの
でない。
本発明方法は実質的に以下の２段階からなる。
第１段階 少なくとも４日間培養した酵母培養液を遠心分離して
酵母細胞の懸濁液を調製し、水道水に再懸濁（50％w/
v）する。低価格で得ることのできるビール生産用酵母
から得られた酵母余剰物を用い、同一の結果が得られた
ことに注意するべきである。
得られた懸濁液を35℃まで加温し、静かに攪拌しなが
らその温度を１時間維持する。次いで、デキストロース
（2M）と燐酸塩（1M）との濃厚溶液を酵母懸濁液の1/5
容量に相当する割合で加える。
この混合物を加えた後、細胞の１％蒸留水溶液をメチ
レンブルー溶液（0.01％）及び酢酸ナトリウム溶液（２
％）の等量を用いて処理することからなる透過性試験を
30−45分間行う。顕微鏡下の観察にて青色または薄青色
を呈する細胞が、透過性を付与された細胞である。
このような処理に反応しない酵母の場合は（これは特
に、しばしば冬期に酵母培養液を調製し直した時に起こ
り得る）、最初の加温工程に於いて原形質分離剤（１−
５％）を加えるとよい（トリトンＸ−100またはトルエ
ンを用いて満足できる結果が得られた）。
第２段階 前工程にて得られた、透過性を付与された細胞懸濁液
にジチオトレイトール（最終濃度2mM）を加えて酵素のS
H基を酸化から保護し、要すれば、グルタルアルデヒド
の細部内酵素に与える作用を阻害するために、塩化マグ
ネシウム（最終濃度20mM）及び追加のタンパク質供給源
として崩壊酵母（10％v/v）を加えてもよい。このグル
タルアルデヒドは最終段階に結合剤として最終濃度0.25
％にて加えるべきである。
酵素懸濁液の温度は、全工程の間、28℃に保持し、ゆ
っくりと攪拌する。
崩壊酵母は、ガラス球ホモジナイザー型式の通常の細
胞粉砕機（少なくとも95％の酵母細胞を破壊する）によ
って、デキストロース（1M）及び燐酸カリウム（0.6M）
懸濁液中の遠心分離した酵母の懸濁液（50％）を使用
し、氷浴中４℃で調製する。
必要な崩壊度を達成するためには、各々３分間の操作
を少なくとも３回行うことが必要である（工程と次の工
程との間隔を１分間設ける）。
この第２段階に於いて、解糖酵素群が細胞内に保持さ
れる。
第１表は本発明方法の有効性、即ち透過性を付与され
た酵母細胞からの酵素の漏出が防止されること、及び該
漏出を防ぐことにより、デキストロースをフルクトース
−1,6−二燐酸に燐酸化することに於いて、酵母を繰り
返し再利用することのできることを示す。
ジチオトレイトールを溶液に加えるのは、グルタルア
ルデヒドによって固定された酵素をSH基の酸化から保護
するためである。
特許出願人によって実施された研究により、大変高価
なジチオトレイトールは上記の記載のように調製され
る、脱タンパク質され、遠心分離された崩壊酵母（10
％）と置き換えることができることがわかった。
以下の詳細な実施例によって、本発明は更に十分に理
解されよう。
実施例１ ポポリ（Popoli）のドレハー・エイル・ハウス（DREH
ER ale house）から調達した、遠心分離された新鮮酵母
（60g）を、６水塩塩化マグネシウム溶液（20％、2ml）
と栄養性混合物（20ml:2mデキストロース、1M二塩基性
燐酸ナトリウム及び十分量の燐酸、pH6.5に調節）と共
に水道水（40ml）に再懸濁する。この懸濁液を二重釜恒
温機にて35℃で１時間加温し、静かに攪拌して懸濁液を
均質にし、温度を一様にする。次いで、粉砕した酵母
（60ml）及びジチオトレイトール（30mg）を加え、全量
が28℃まで冷却した後、攪拌を続けながら25％グルタル
アルデヒド溶液（1ml）を加える。30分後には、繰り返
しの燐酸化工程に使用することができる。
実施例２ 実施例１に記載のように交叉結合させた、バッチパグ
リア（Battipaglia）のウーレアー・エイル・ハウス（W
HURER ale house）から調達した遠心分離された新鮮酵
母（60g）を、以下の方法に従って、10回連続燐酸化工
程に使用する。
グルタルアルデヒド処理済み最終懸濁液に栄養性混合
物を更に30ml加える。攪拌が終了した時点で、８時間、
28℃にて、この混合物をインキュベートする。この間、
大量のCO2及び泡が発生する。遠心分離し、FDPを含有す
る上清を酵母細胞から分離した後、水道水に再懸濁する
（最終容量、100ml）。次いで、20％塩化マグネシウム
（2ml）、遠心分離して脱タンパクした崩壊酵母（10m
l）、及び栄養性混合物（50ml）を加える。全体を攪拌
せずに、28℃にて10時間インキュベートし、次いで、細
胞を再び遠心分離してデカントし、再懸濁する。この工
程を同様の方法で１週間にわたり繰り返す。CO2の発生
は常に起こるものであり、このことは細胞が生き残って
いることを示している。第２表に、グルタルアルデヒド
処理済み酵母と未処理の酵母とを用いて行った10回連続
工程の比較データを示すが、これにより燐酸化活性に於
ける本発明方法の保持作用が明らかになろう。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の工程からなるフルクトース−1,6−
    二燐酸の生産に使用される酵母の燐酸化活性を保持させ
    る方法： ａ）酵母の水性懸濁液に適当な高張性溶液を加え、得ら
    れた混合物を30〜40℃の温度に加温することで、フルク
    トース−1,6−二燐酸を原形質から流出させるために細
    胞壁に透過性を付与し、 ｂ）この混合物に適当な崩壊酵母エキスを加え、燐酸化
    工程の繰り返しの間中、解糖系酵素群のSH基の酸化を防
    止し、そして ｃ）透過性を付与された酵母細胞の懸濁液にグルタルア
    ルデヒドを加え、細胞内タンパク質と交叉結合させるこ
    とにより解糖系酵素群を細胞内に固定化すること。
  2. 【請求項２】酵母が醸造用酵母である第１項に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】栄養性混合物（2Mデキストロース、1M燐酸
    ナトリウム及びpH6.5になるまで燐酸を添加）を酵母の6
    0％w/v水道水懸濁液に加え、静かに攪拌しながら35℃に
    て１時間加温することにより工程ａ）を実施する、第１
    項に記載の方法。
  4. 【請求項４】酵母細胞がサッカロマイセス・カールスベ
    ルゲンシスあるいはサッカロマイセス・セレビシエであ
    る第１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】栄養性混合物を添加する前に、１−５％量
    の原形質分離剤を酵母懸濁液に加える第３項に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】該原形質分離剤が有機溶媒または洗浄剤の
    いずれかである第５項に記載の方法。
  7. 【請求項７】10％の崩壊酵母を最終濃度が0.25−１％w/
    vとなるように、絶えず静かに攪拌しながら28℃で添加
    した第３項に記載の方法によって得られる透過性を付与
    された酵母細胞の懸濁液にグルタルアルデヒドを加える
    第１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】酵素のSH基の酸化を防ぐのに好適な酵母エ
    キスが、ボール式ホモジナイザーで粉砕して新鮮な崩壊
    酵母を得、これを1Mデキストロースと0.6M燐酸ナトリウ
    ム溶液中にて28℃で２時間インキュベートし、100℃で1
    0分間加温した後、30分間8000回転の遠心分離をかける
    ことにより得られたものである第１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】酵母エキスを５−15％v/vの容量にて燐酸
    化混合物に加える第８項に記載の方法。
JP62075750A 1986-03-25 1987-03-25 フルクト−ス−１，６−二燐酸の生産に使用する酵母の燐酸化活性を保持させる方法 Expired - Lifetime JPH0829088B2 (ja)

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