JPH0829090B2 - ポリヌクレオチドの製造方法 - Google Patents

ポリヌクレオチドの製造方法

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JPH0829090B2
JPH0829090B2 JP61067385A JP6738586A JPH0829090B2 JP H0829090 B2 JPH0829090 B2 JP H0829090B2 JP 61067385 A JP61067385 A JP 61067385A JP 6738586 A JP6738586 A JP 6738586A JP H0829090 B2 JPH0829090 B2 JP H0829090B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 発明の分野 ハイブリドDNA技術が出現しかつ広範な種類の天然生
産物、例えばポリペプチド、および核酸の両者を単離
し、精製し、そして検定する可能性が急激に増加し、ア
ミノ酸および核酸のオリゴマーを製造する迅速かつ効率
よい方法の必要性が増加している。
核酸では、リンカー（linker）、アダプター、合成遺
伝子および合成制御配列、ならびにプローブ、プライマ
ーなどとして使用するため配列を合成することが必要と
される。これらの配列はクローニングできるので、初期
の用途においてほんの少量の物質のみを必要とするが、
誤りを含む配列は望ましくない産生物または結果を生ず
る構造を形成しうるので、このような配列を実質的に含
有しないことが非常に重要である。
ポリ（アミノ酸）またはポリペプチドについて、天然
ポリペプチドをその生理学的性質の研究のために、ポリ
ペプチドの断片および天然の産生物の製造のために、合
成できることに実質的に関心がもたれており、ここでこ
のような断片はその生理学的性質について研究すること
ができ、問題の決定因子の部位に対して特異的な抗体の
産生のためのハプテン、薬物アゴニスト又は拮抗物質等
として使用できる。
ヌクレオチド、アミノ酸または他の天然モノマーのオ
リゴマーを製造するための多くの手順が開発された。こ
れらの手順は多くの場合、選択的に切離し可能な結合に
より第１モノマーを固体の支持体へ取付けることに頼
る。次いで各モノマー単位を順次に付加（add）し、各
付加はある数の化学反応を含む。
オリゴマーの合成の間各段階において、ある数の鎖が
伸長されないというある程度の可能性が存在する。した
がって、オリゴメリゼーションの間、多数の誤まりが導
入されることがあり、ここで単一または複数のモノマー
が省略された配列が生成する。配列が完結しかつ支持体
が分離されたとき、所望の配列はそれに密接に類似する
配列で汚染されるであろう。次いでこれらの誤りは種々
の態様で現われ、その態様はポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドのいずれが生産されているかによって異る。
ポリヌクレオチドでは、配列が種々の構成でクローニン
グされかつ使用されるとき、誤まりが導入されることが
ありこの場合選択されるクローンが誤まった配列を含
む。造成物を配列する場合に前もってオリゴマーを精製
しないと、誤まりが保持されて望ましくない生成物、最
適でない性能などに導く。ポリペプチドでは、誤まった
配列は意図する配列とは異る生理学的活性、注目の配列
以外の配列に結合する抗体の形成を導くことがあり、そ
して変化する結合の応答の結果、誤りの結果を与える可
能性がある。
したがって、誤まった生成物または観察に導くであろ
う、所望の配列に近似する配列の汚染が実質的に存在し
ないことを保証する配列を調製できることの重要性が増
加してきた。製造の間失敗した（failure）配列を除去
することによって、材料を損失しうる引き続く精製、例
えば、電気泳動を実施する必要性を排除することができ
る。クローニングまたは研究用ポリペプチドを用いる初
期の段階において非常に少量の合成される材料を取り扱
うとき、材料の損失は重大な問題となることがある。
〔先行技術の説明〕
マチウシ（Matteucci）およびカルサーズ（Caruther
s）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イアティ（J.Am.Chem.Soc.）（1981）103:3185−3191
は、オリゴヌクレオチドの製造におけるホスホルクロリ
ダイトの使用を記載している。ビーウケイジ（Beaucag
e）およびカルーサーズ（Caruthers），テトラヘドロン
・レターズ（Tetra.Lett．）（1981）22:1859−1862お
よび米国特許第4,415,732号は、オリゴヌクレオチドの
製造におけるホスホルアミダイトの使用を記載してい
る。スミス（Smith）、ABL（1983年12月）15−24は、自
動化された固相オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成
を記載している。また、その中に引用されている参考文
献を参照のこと。また、ワーナー（Warner）ら、DNA（1
984）3:401−411参照その開示を引用によってここに加
える。
アデノシンのアミジン保護は、マクブライド（McBrid
e）およびカルーサーズ（Caruthers）、テトラヘドロン
・レターズ（Tetra.Lett.）（1983）24:245およびフレ
ーラー（Froehler）およびマッテウシ（Matteucci）、
ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nul.Acids Res.）
（1983）11:8031に記載されている。他のブロッキング
（blocking）基は後述する。
〔発明の要約〕
ポリヌクレオチド（本明細書において、単に「ポリマ
ー」又は「オリゴマー」という場合がある）の製造を包
含する新規な方法および組成物が提供され、ここで個々
のヌクレオチド（本明細書において「モノマー」という
場合がある）は前もって決定した群の構成員であり、そ
して順次に付加されて個々の構成員の前もって決定した
配列を形成する。成長する鎖が不溶性支持体に結合して
いる間に、オルゴメリゼーションが起こる。各段階の後
に、失敗の配列（failure sequence）をキャッピング
（capping）し、そして配列が完結するまで次のモノマ
ーを付加（add）する。個々のモノマー上の保護基、末
端ブロッキング基（blocking group）、キャッピング
基、および支持体への結合は選択可能な切離しを可能と
するように選択される。ブロッキング基は末端ブロッキ
ングを欠く配列の酵素的分解を妨害しないように選択さ
れるか、あるいはキャッピングの除去時に選択的に除去
することができる。完結のとき、キャッピング基を除去
し、酵素的分解を妨害するブロッキング基を除去し、そ
して末端ブロッキング基を欠く不完全配列を酵素的に分
解する。不完全配列の酵素的分解前に、オリゴマーは支
持体上に保持するかあるいは除去することができる。次
いで、誤まり（error）を有する配列を実質的に含まな
い完成された正しい配列を単離する。
〔特定の実施態様の説明〕
本発明は、共通の官能基を有するが側鎖が異なるモノ
マーのオリゴリメリゼーションに関する。モノマーは縮
合型オリゴメリゼーションを行い、ここで鎖は支持体へ
結合している間伸長される。オリゴリメリゼーションは
モノマーを段階的に付加して少なくとも約10の構成員、
通常少なくとも12の構成員の所望の配列を生成すること
を含み、そして構成員の数は100以上であることができ
る。種々の官能基が種々の機能のために用いられ、それ
らは選択的に除去することができる。官能基は側鎖の保
護基、末端ブロッキング基、キャッピング基および、オ
リゴマーを支持体へ結合させて維持するための結合基を
包含する。これらの官能基はオリゴマーの製造の間およ
び／または配列の完結後に選択的に除去または切離され
ることができ、同時にオリゴメリゼーションの間および
必要に応じて不完全配列の酵素的分解の間に配列を支持
体へ結合させて保持するように、これらの官能性は選択
される。
さらに、誤まりまたは不完全配列のエキソヒドラーゼ
分解を妨害しないか、あるいは酵素的加水分解前に選択
的除去することができる保護基を用いる。誤まりまたは
不完全の配列の分解の前または後の支持体からの完成さ
れた配列の切離しが実施され、そして支持体からの分離
および不完全配列の分解後、配列の調製に関連する物質
を実質的に含まない完成された配列を次いで単離するこ
とができる。
本発明の方法は、誤まりを含有するかあるいは不完全
な配列を選択的に除去する。エキソヒドロラーゼはブロ
ッキングされない不完全配列を加水分することができる
が、エキソヒドロラーゼの完全配列への作用を阻止する
末端ブロッキング官能基を用いることによって、上の選
択的除去が達成される。この方法は、また、順次的付加
（sequential addition）において次の段階を行ってお
らず、かつキャッピング前に、反応性の遊離末端官能基
を保持する配列を停止するキャッピング官能基の使用を
必要とする。こうして、失敗の配列は失敗の時に停止
し、そして連続しない。
ブロッキング基および結合基の選択的使用を可能とす
る縮合オリゴメリゼーションを用いる本発明は、多くの
場合、核酸、すなわち、DNAおよびRNA、およびポリ（ア
ミノ酸）に関するが、同一の手段を多糖類、炭水化物お
よびアミノ単糖類の調製に有効であろう。各ポリマーま
たはオリゴマーは個々の縮合モノマーの間の結合のため
に同一の官能基を用い、核酸のためにはホスフェートエ
ステルを用い、アミノ酸のためにはペプチドまたはアミ
ド結合を用い、糖類についてはヘミアセタールまたはヘ
ミケタールのエーテル結合を用いる。
次の式は本発明において使用するモノマーの一般化さ
れた表示である： 式中、 Ｍはオリゴマーの結合の形成に関与せずかつまたブロ
ッキングまたは保護に関与しない分子の部分のすべてを
含む、分子の中央の残基であり、例えば、グリシンの場
合において、それはメチレンであり、アデノシンの場合
において、それはリンに結合した基及びホスフェートエ
ステル結合の形成に関与するブロックされたオキシ基を
除外した分子のすべてを含み、 αはオリゴマーの末端官能基と反応するために活性化
可能な形態または活性な形態の官能基であり、 βはブロックされていないときαと反応する末端官能
基であり、 γはβのブロッキング基であり、 δは保護を必要とする官能基、通常アミノ、ヒドロキ
シまたはメルカプトであり、そして存在することあるい
は存在しないことができ、 εは保護であり、 μはαのブロッキング基であり、そして ａは保護しなくてはならない官能基の数であり、一般
に０〜２、より通常０〜１である。
化合物がプリンであるとき、本発明において用いるプ
リンヌクレオチドは多くの場合次式を有する： 式中、 ＭΔ１は、それぞれ、グアニンおよびアデニンについ
ては２または６位置に環の外のアミノ基をもつアデニン
またはグアニンの残基であり、 ＺはＯ−ブロッキング基であり、 B1またはG1の一方は水素であり、そして他方の保護基
であることができ、あるいは２つは窒素に二重結合した
保護基を形成することができ、 Ｗは１対の電子または酸素であり、Ｙが二置換アミノ
基であるとき１対の電子であり、そしてＹがオキシであ
るとき、酸素であり、 Ｙはオキシまたは二置換アミノ基であり、ここで置換
基は反応過程を妨害しない有機基であり、そして二置換
アミノ基はホスフェートエステルの形成のための離脱基
（leaving group）としてはたらき、 オキシは通常はアンモニウム塩であり、便利には３〜
12個の炭素原子のトリアルキルアンモニウム塩であり、 Ｙが二置換アミノ基であるとき、それは式-NT1T2をも
ち、式中T1およびT2は同一であるか異なり、そして有機
であり、 Ｄは選択的除去可能な有機基であり、そして Ｅは水素または保護基である。
ヌクレオチドがピリミジンであるとき、ピリミジンは
次式を有するであろう： 式中、記号のすべては前に定義した通りであるが、ただ
し M2はシトシンまたはチミンの残基であり、 M2がシトシン残基であるとき、ｂは１であり、M2がチ
ミン残基であるとき、ｂは０であり、 B2は水素であり、そしてG2は保護基、通常アシルであ
る。
Ｄのために用いる基は脂肪族基、とくに飽和脂肪族
基；β−ヘテロ置換脂肪族基（ここで、β−置換基はβ
−排除において、離脱基またはプロトン活性化基とし
て、容易に関与することができる電子吸引基である）；
α−置換メチレン（ここでα−置換基は広く変化するこ
とができ、そして誘導作用または共鳴作用を介してメチ
レン上に陰性電荷を支持する）；アリール；およびアラ
ルキルであろう。リンの官能性の性質に依存して、１つ
の基を他の基の代わりに選択することができる。こうし
て、ホスホルクロリダイト、ホスホルアミダイト、ホス
フェート、チオホスフェート、ホスファイトなどを用い
るかどうかに依存して、特定のホスホロエステル基が好
ましいであろう。
ホスホルクロリダイトおよびホスホルアミダイトにつ
いて、アルキルおよびβ−置換ジメチレンが好ましく、
一方ホスフェートおよびホスフィンについて、アリール
およびアラルキルの官能性が好ましいであろう。
多くの場合、Ｄは次式により示すことができる： Q(CH2)C-C1(J2)- 式中、 １は第１炭素原子であり、 Ｊは同一であるかあるいは異なり、Ｈまたは１〜３
個、通常１〜２個の炭素原子のアルキル基、好ましくは
メチルであり、 ｃは０または１であり、通常、Ｑが炭素原子を介して
結合しているとき、０または１であり、そしてＱが異種
原子を介して結合しているとき１であり、 ＱはＨ、１〜９個の炭素原子のアルキル、ニトラト、
メチルスルホニル、シアノ、フェニル、ベンジル、フェ
ニル−、ベンジル−、置換フェニル−、置換ベンジルチ
オまたは−スルホキシ（ここでアリール置換基の数は０
〜２であり、そしてシアノ、ハロ、ニトロなど、トリハ
ロメチル、とくにフルオロおよびクロロにより例示され
る）、β−ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラ
キノリルなどあることができ、あるいは Ｄはフェニルまたは置換フェニルであることができ、
ここで置換基は上に示したものと同一であることがで
き、さらにフェニルへ直接にあるいは酵素または炭素を
介して結合したトリチルを含むことができる。
Ｄとして使用に報告されている特定の基は、次の通り
である： アルキル ビーウケイジ（Beaucage）およびカルスサー
ズ（Caruthers）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahe
dron Lett.）（1981）22:1859 NCCH2C(Me)0-2(H2-0)- コスター（Koster）、ニュクレ
イック・アシズリサーチ（Nucleic Acids Res.）（198
4）12:4539;マルッグ（Marugg）ら、Rec.tray.Chim.Pay
-Bays（1984）103:97−8;バン・ブーム（Van Boom）
ら、ニュークレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Ac
ids Res.）（1984）12:8639 p-O2NCH2CH2- シュワルツ（Schwarz）およびプフレ
イデレル（Pfleiderer）、テトラヘドロン・レターズ
（Tetrahedron Lett.）（1984）25:5513 MeSO2CH2CH2- クラエセン（Claesen）ら、ibid（198
4）25:1307 （ハロ）3CC(Me)0-2(H)0-2- タカク（Takakn）ら、ケ
ミストリー・レターズ（Chemistry Letters）1984:126
7;レトシンガー（Letsinger）ら、テトラヘドロン（Tet
rahedron）（1984）40:137 (CH2)0-1S(O)0-2(CH2)2バルゴビン（Balgobin）ら、
テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron.Lett.）（198
1）22:1915;アガルワル（Agarwal）ら、ジャーナル・オ
ブ・ケミカル・ソサイアティ（J.Am.Chem.Soc.）（197
6）98:1065;フェルダー（Felder）ら、テトラヘドロン
・レターズ（Tetrahedron Lett.）（1984）25:3967 (X)0-2CH2−,2−ナフチル−CH2−９−フルオレニル−
CH2−アンスラキノニル カルサーズ（Caruthers）ら、
核酸の研究（Nucleic Acids Res.）Sym.Ser．（1980）
7:215;クリストドンロン（Christodonlon）およびリー
ズ（Reese）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron
Lett.）（1983）24:1951;クウィアトコウスキー（Kwia
tkowski）ら、アストラクツ、コンフェレンス・オン・
シンセチック・オリゴヌクレオチド・イン・モレキュラ
ー・バイオロジー（Abstract,Conf.on Syn.Oligonucleo
tides in Molecular Biology）、ウップサラ（Uppsa
l）、スウェーデン・コンフェレンス（Sweden Conf.）1
6−20（1982）＃64;バルゴビン（Balgobin），ibid （Ｘ）CH2CH2- ウルマン（Uhlmann）ら、テトラヘド
ロン・レターズ（1980）21:1181;シュルツ（Sehulz）お
よびプフレイデレル（Pfleiderer）、ibid（1983）24:3
582;ベイテ（Beite）およびプフレイデレル（Pfleidere
r）、ibid（1984）25:1975 MeCOCH（Me）− バミレズ（Bamirez）ら、テトラヘド
ロン（1983）39:2157３ Ｃ（Cl）− バッセウル（Vasseur）ら、テトラ
ヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）（1983）24:
2573 Ｘは水素あるいは中性または極性の電子供与性または
電子吸引性の、一般に１〜10個、通常１〜６個、一般に
０〜７個の炭素原子の非妨害性の安定な置換基であるこ
とができ、そして脂肪族、脂環族、芳香族または複素環
族の基、一般に脂肪族性飽和のハロ炭化水素、例えば、
トリフルオロメチル、ハロ、チオエーテル、オキシエー
テル、エステル、アミド、ニトロ、シアノ、スルホン、
アミノ、アゾなどであることができる。種々のXX（ここ
でｘは数である）の各々について、それらはＸの定義の
範囲内に入るが、当業者はこの発明の開示に照して適当
な基を選択することができるであろう。ある場合におい
て、好ましいＸは示されるか、あるいはXXは再定義する
ことができる。
Ｄとして用いる基は、末端ブロッキング基を除去しな
いかあるいは、適当ならば、オリゴマーを支持体から切
り離す試薬、例えば、フェニル−メルカプチドまたは置
換フェニル−メルカプチドおよびtert−アミン、アンモ
ニア、アルドキシド、モノアミンまたはポリアミンを包
含する有機アミン溶媒により除去できるであろう。
Ｚのために用いる基は、アラルキル基、とくに置換お
よび非置換のピクシルまたはトリアリールメチルであ
り、ここでアリールはフェニル、ナフチル、フラニル、
ビフェニルなどであることができ、そして置換基は０〜
３、通常０〜２であり、そしてＸの定義の範囲内に入る
であろう。
Ｚとして用いる基は保護基およびキャッピング基の除
去に用いられる試薬に対して安定であり、主として塩基
に対して安定であり、そして酸に対して感受性である。
こうして、ベンジル、とくにα−置換されたもの、例え
ば、トリチル基は末端ブロッキング基として使用され
る。
ある場合において、オリゴマーの合成の完結後、Ｚを
異なる基で置換することが望ましいであろう。ブロッキ
ング基（とくにトリチル基を用いる場合）および不完全
オリゴマーを分解するために用いる酵素の性質に依存し
て、加水分解条件は有意な比率でＺ基を除去することが
ある。これらの条件下では、完全オリゴマーもまた分解
してオリゴマーの収率を実質的に減少させるであろう。
エキソヌクレアーゼによる完成オリゴマーの分解を避
けるために、Ｚ基はエキソヌクレオリティック（exnucl
eolytic）条件の条件下で安定である異なるブロッキン
グ基で置換することができる。このような基はキャッピ
ング基の除去の間保持されること、エキソヌクレオリテ
ィック条件の間保持されること、およびそれ自体である
いは支持体からの切離と関連して、オリゴマーを分解せ
ずに除去されうることによって特徴づけられるであろ
う。
ブロッキング基を除去しかつ別の基で置換するかわり
に、代わりのブロッキング基、例えば、カルボン酸エス
テル、ホスフェートなどに依存して、空極のヌクレオチ
ドは代わりの保護基を存在させて調製することができ
る。こうして、置換ブロッキング基を含有するヌクレオ
チドを予備調製することにより、これらを最後の工程に
おいて付加することができ、ここで手動手順または自動
化手順は異なるヌクレオチドの使用を可能とする。
多くの場合、Ｚの代わりに使用する基は安定なエステ
ルを与えるアシル基であろう。アシル基は有機または無
機であることができ、例えば、カルボキシル、ホスホリ
ル、ピロホスホリルなどある。とくに興味あるものは、
アルカン酸、とくにアリール置換アルカン酸であり、こ
こでこの酸は少なくとも４個の炭素原子であり、そして
約12個以下、通常約10個以下の炭素原子をもち、通常８
〜12個の炭素原子をもつアリール、通常フェニル置換ア
ルカン酸である。種々の異種原子、例えば、酵素（オキ
シ）、ハロゲン、窒素、例えば、シアノなどが存在する
ことができる。大部分について、カルボン酸エステルは
塩基安定性であるが、とくに約50℃以下、さらにとくに
約35℃以下の温度において、および約２より大きく、と
くに約４より大きいpHにおいて適度な酸に対して安定で
ある。
ある場合において、所望の保護を与える特殊な試薬を
用いることができる。例えば、Ｏ−ジブロモメチルベン
ゾエートを用いてエステルを形成し、次いでこれを後述
するように特定の試薬で切離すことができる。
次の表は、ある数の使用できる基およびブロッキング
剤として使用する基およびこれらの基を除去する条件お
よび試薬を記載する参考文献を示す。
ベンゾエート基は酵素α−キモトリプシンで容易に除
去することができる。ホスフェートはアルカリ性ホスフ
ァターゼで除去できる。使用できる他の酵素は、カルボ
キシペタチダーゼＡ、ロイシンアミノペプチダーゼ、酸
性ホスファターゼ、ピロホスファターゼなどを包含す
る。あるいは、酵素の加水分解を用いる代わりに、カル
ボキシレートエステル基は水酸化アンモニウム、水酸化
ナトリウム、モルホリンなどで除去することができる。
とくに興味あるものは、ヌクレオシドのヒドロキシ
ル、例えば、完成した配列の末端５′−ヒドロキシルを
ホスホリル化するために使用できる特定のホスホリル化
剤である。新規なO,O′−ジ（シアノエチル）ホスホル
アミダイトの使用は本発明においてとくに有利であり、
ここで窒素は置換されている（１〜２個の基）かあるい
は置換されていないことができ、とくに二置換されてお
り、さらにとくに、ジアルキル置換されており、アルキ
ル基は１〜６個、通常２〜４個、とくに３個の炭素原子
をもち、例えば、イソプロピルである。（下の-NT1T2の
説明を参照。） この試薬は、酸化可能なホスファイトエステルを与え
る置換ブロッキング基（ZS）、およびモノマーとして使
用するヌクレオシジルホスホルアミダイトと同じ方法で
除去されるＯ−置換基として使用できる。主題の試薬は
オリゴマーの末端ヒドロキシルの容易な官能化を可能と
し、完成された鎖の保護を提供し、そして自動化された
核酸の配列の合成に容易に適合する。
Ｙに用いる基はオリゴメリゼーションに使用するリン
誘導体の性質に依存する。ホスホルアミダイトを用いる
とき、Ｙは式-NT1T2を有し、式中T1およびT2は同一であ
るかあるいは異なることができ、そして炭化水素である
ことができ、あるいは０〜５個、通常０〜４個の異種原
子、主としてオキシとして酸素原子、チオとしてイオ
ウ、またはアミノ、とくにtert−アミノ、NO2またはシ
アノとして窒素を有することができる。２つのＴは一緒
になって合計１〜３、通常１〜２のヘテロ環構成員およ
び１〜３の環を有するモノ−またはポリ複素環式環を形
成することができる。通常、２つのＴは合計２〜20、よ
り通常２〜16個の炭素原子を有し、ここでＴは脂肪族
（脂肪族を含む）、とくに飽和脂肪族の１価の基、ある
いは、一緒になったとき、２価の基であることができ、
置換または非置換の複素環式環を形成する。アミンは、
広範な種類の飽和第二アミン、例えば、ジメチルアミ
ン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチル
アミン、メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミ
ン、メチルシクロプロピルアミン、エチルシクロヘキシ
ルアミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシ
ルメチルアミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホ
リン、チオモルホリン、ピロリジン、ピペリジン、2,6
−ジメチルピペリジン、ピペラジンおよび同様に飽和さ
れた単環式窒素複素環族を包含する。（米国特許第4,41
5,732号） -NT1T2として使用するために報告されている特定の基
は、次の通りである： 基の例は、次の通りである:N−ピロリジノ、Ｎ−ピペ
リジノ、１−メチル−Ｎ−ピペラジノ、Ｎ−ヘキサヒド
ロアジピノ、Ｎ−オクタヒドロアゾニノ、Ｎ−アザシク
ロトリデカノ、Ｎ−３−アザビシクロ（3.2.2）ノナ
ノ、チオモルホリノ、N,N−ジエチルアミノ、N,N−ジメ
チルアミノ、N,N−ジイソプロピルアミノ、ピペリジ
ノ、2,2,6,6−テトラメチル−Ｎ−ピペリジノ。
Ｙは、また、ハロ、例えば、クロロであることができ
〔レトシンガー（Letsinger）およびルンスフォード（L
unsford）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル
・ソサイアティ（J.Am.Chem.Soc.）（1976）98:3655;マ
テウシ（Matteucci）およびカルサーズ（Caruthers）、
supra〕あるいはアンモニウムオキシ塩、とくに３〜12
個の炭素原子のトリアルキルアンモニウムであることが
できる。
RNAまたは混合RNA−DNAオリゴマーを調製するとき、
とくにトリエステル法を用いる場合、Ｅとして使用する
基は次の通りである： 使用できる他の基は、三置換シリル、例えば、３〜12
個の炭素原子のトリアルキルシリル、２−テトラヒドロ
フラニル、tert−ブチルジメチルシリル、あるいは塩基
性条件および縮合条件に対して安定な他の保護基を包含
する。
環外（excyclic）アミン保護基は、縮合条件に対して
安定でありかつ、末端ブロッキング基を除去しないであ
るいは、適当ならば、支持体への結合基を切離さない
で、配列の完結時に除去されうるようにあるいは、誤ま
りの配列の分解を妨害しないように選択されるであろ
う。ＢおよびＧは同一であるかあるいは異なることがで
き、そして一緒になって２価の基を形成できる。
Ｂが水素であるとき、Ｇは通常２〜16個、通常２〜14
個の炭素原子および０〜６個（オキソ酸素を除外す
る）、通常０〜４個のカルコゲン（酸素およびイオウ）
または窒素である異種原子のアシルであり（ここで窒素
は通常水素以外に結合している）そして脂肪族、脂環
族、芳香族、複素環族、またはそれらの組み合わせであ
ることができ、そして置換または非置換であることがで
き、通常脂肪族不飽和を含まず、ここで置換基は１〜６
個の炭素原子のアルキルまたはアルコキシ、ハロ、ニト
ロ、フェニル、２〜６個の炭素原子のジアルキルアミ
ノ、オキソなどを包含し、そしてギ酸および炭酸の誘導
体を包含する。
多くの場合、ＢがＨであるとき、Ｇは次式をもつであ
ろう： (X2)C−Δ−CO 式中、 Δは１〜10個、通常１〜６個の炭素原子の、通常飽和
された脂肪族または脂環族の基、またはアリール基（カ
ルコゲンまたは窒素である異種原子の１〜２個を有する
複素環族を包含し、そして環は５〜６の環構成員、１〜
２の環および５〜12個の炭素原子を有する）、またはア
ラルキル基（ここでアリールは上に定義した通りであ
り、そしてアルキルは１〜３個の炭素原子をもつ）であ
り、 ｃはΔが脂肪族であるとき０であり、そしてΔがアリ
ールまたはアラルキルであるとき０〜３、通常０〜２で
あり、 X2は１〜６個、通常１〜４個の炭素原子のアルキルま
たはアルコキシ、ハロ、とくにクロロ、フェニル、ニト
ロ、シアノなどある。
ＢおよびＧが一緒になって２価の基を形成するとき、
２価の基は３〜12個の炭素原子およびジオイルのオキソ
原子以外の０〜４個の異種原子のアルキリデンまたはジ
オイルであり、そして脂肪族、脂環族、芳香族または複
素環族、あるいはそれらの組み合わせてあることがで
き、アルキリデンはイミンまたはアミジンを形成し、ジ
オイルは環式イミドを形成し、ここでアルキリデンは通
常１〜３個の炭素原子のアルキリデンであり、二置換ア
ミノ、とくに２〜10個の炭素原子のジアルキルアミノ基
でα−置換されており、一方ジオイルは４〜12個の炭素
原子をもつであろう。
ＢおよびＧとして使用するために報告された特定の基
は、次の通りである： 上の成分の中にはある種の好ましい基が存在する。末
端ブロッキング基について、トリアリールメチル基、と
くにジメトキシトリチルは合成の間のモノマーのために
好ましい。環外アミノ保護基について、アルキリデン、
とくにジブチルアミノメチレンは好ましい。
次に重要な官能性はオリゴマーの支持体への結合であ
る。この結合はオリゴメリゼーションの種種の段階、キ
ャッピング基および保護基、および通常ブロッキング基
の除去、および、適当ならば、誤まりの配列の加水分解
的分解の間に安定であるべきである。完成されたオリゴ
マーを解放するための官能性を包含する結合単位の選択
は、支持体、ブロッキング基およびリンの基のモノマー
および性質、キャッピング基およびオリゴメリゼーショ
ンのために用いる試薬により影響を受けるであろう。
広範な種類の支持体を用いることができ、それらの例
は次の通りである：シリカ、ポラシル（Porasil）Ｃ、
ポリスチレン、調節された孔のガラス（Controlled por
e glass）（CPG）、ケイ藻土、ポリ（ジメチルアクリル
アミド）、ポリ（アクリルモルホリド）、ポリ（テトラ
フルオロエチレン）上にグラフトしたポリスチレン、セ
ルロース、セファデックス（Sephadex）LH−20、フラク
トシル（Fractosil）500など。興味ある参考文献は、次
の通りである：マテウシ（Matteucci）およびカルーサ
ーズ（Caruthers）、supra；チオウ（Chow）ら、ヌクレ
イック・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）（19
81）９:2807;フェルダー（Felder）ら、テトラヘドロン
・レターズ（Tetrahedron Lett.）（1984）25:3967;ゴ
ー（Gough）ら、ibid（1981）22:4177;ガイト（Gait）
ら、ニュークレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Ac
ilds Res.）（1982）10:6243;ベラガジェ（Belagje）お
よびブラッシ（Brush）、前記（1982）10:6295;ガイト
（Gait）およびシェパード（Sheppard）、前掲（1977）
4:4391;ミヨシ（Miyoshi）およびイタクラ（Itakur
a）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）
（1978）38:3635;ポタポフ（Potapov）ら、ヌクレイッ
ク・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）（1979）
6:2041;シュイザー（Schwyzer）ら、ヘルベチカ・ヒミ
カ・アクタ（Helv.Chim.Acta）（1984）57:1316;チョレ
ット（Chollet）ら、前掲（1984）67:1356;イトー（It
o）ら、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Aci
ds Res.）（1982）10:1755;エフィモフ（Efimov）ら、
前掲（1983）11;8369;クレア（Crea）およびホーン（Ho
rn）、前掲（1980）8:2331;ホーン（Horn）ら、Nucleic
Acids Res.Sym.Ser.（1980）7:225;トラゲイン（Tragl
in）ら、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Let
t.）（1983）24:1691;コスター（Koster）ら、テトラヘ
ドロン（Tetrahedron）（1984）40:103;ゴー（Gough）
ら、テトラヘドロン・レターズ（1983）24:5321;コスタ
ー（Koster）ら、前掲（1972）16:1527;コスター（Kost
er）およびヘインス（Heyns）、前掲（1972）16:1531;
デンベク（Dembek）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサイアティ（J.Am.Chem.Soc.）（1981）
103:706;カルサーズ（Caruthers）ら、ゼネティック・
エンジニアリング：プリンシプルス・アンド・メンズ
（Genetie Engineering:Principles and Methods）、セ
トロウ（Setlow）およびホレンダー（Hollaender）編、
Vol.4、1982、１−12ページ、プレナム・プレス（Plenu
m Press）ニューヨーク。
支持体の性質に依存して、異なる官能基がアンカー
（anclror）としてはたらくであろう。ケイ素含有支持
体、例えば、シリカおよびガラスについて、置換アルキ
ルおよびアリールシリル化合物を用いてシロキサンまた
はシロキシイミンの結合を形成する。有機ポリマーで
は、エーテル、エステル、アミド、サルファイド、スル
ホン、ホスフェートを使用できる。アリール基、例え
ば、ポリスチレンについて、ハロメチル化を官能化に使
用することができ、ここでハロ基を次いでオキシ、チオ
（これは酸化してスルホンにすることができる）、アミ
ノ、ホスホ（ホスフィン、ホスファイトまたはホスフェ
ートとして）、シリルなどで置換することができる。ケ
イ藻土、例えば、多孔質ケイ藻土では、ケイ藻土をポリ
アクリル酸誘導体により活性化し、そして活性化された
官能性をアミノ基と反応させてアミン結合を形成でき
る。多糖類を無機エステル、例えば、ホスフェートで官
能化することができ、ここで他の酸素は鎖を結合するは
たらきをする。ポリアクリル酸誘導体では、カルボキシ
ルおよび側鎖の官能性、例えば、Ｎ−ヒドロキシエチル
アクリルアミドは普通の方法で使用して結合基を接合す
ることができる。
結合の基および鎖は、第１ヌクレオチドを結合する長
さ、官能性および方法に関して広く変化するであろう。
鎖を延長するため、官能性はシリル基、エーテル基、ア
ミノ基、アミド官能性などを含むことができ、ここで試
薬、例えば、ジアミンおよび二塩基酸、アミノ酸、単
糖、シランなどを用いる。
文献に報告されてきているある数の支持体および結合
基を、下表に示す。
ポリヌクレオチドを製造する種々の技術が文献に記載
されている。例えば、ホスホルアミダイトのその場の製
造、ベアウケイジ（Beaucage）、テトラヘドロン・レタ
ーズ（Tetrahedron Lott.）（1984）25:375;ホスフェー
トトリエステルの紙のディスク法、フランク（Frank）
ら、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（1983）11;4365
およびメイセス（Mathes）ら、EMBO（1984）800;ホスフ
ェートトリエステル−１−ヒドロキシベントリアゾール
法、ファン・デル・マレル（Van der Marel）ら、ヌク
レイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）
（1982）7:2337;前掲（1984）12:8639;ホスフェートト
リエステル−アリールスルホニルテトラゾール結合法、
スタウンスキ（Stawinski）ら、前掲（1977）5:353;ポ
スフェートトリエステルバリウム塩法、ゴー（Gough）
ら、前掲（1979）7:1955;ホスフェートトリエステル
過法、チャウトフリ（Chaudhuri）ら、テトラヘドロン
・レターズ（Tetrahedron Lett.）（1984）25:4037;逆
ホスフィチル化、ジャラマン（Jayaraman）およびマク
クラウハーティ（McClaugherty）、バイオテクニークス
（Biotechniques）、1984、94;逆方向ホスフェートトリ
エステル（５′−３′）法、ベラガジェ（Belagaje）お
よびブラチ（Brush）、ヌクレイック・アシズ・リサー
チ（Nucleic Acids Res.）（1982）10:6295;ホスホルア
ミダイト法、ベアウケイジ（Beaucage）およびカルサー
ズ（Caruthers）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahe
dron Lett.）（1981）22:1859;ホスホクロリダイト法、
マテウシ（Matteucci）およびカルサーズ（Caruther
s）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イアティ（J.Am.Chem.Soc.）（1981）103:3185;ホスフ
ァイト“シリンジ”法、タナカ（Tanaka）およびレトシ
ンガー（Letsinger）、ヌクレイック・アシズ・リサー
チ（Nucleic Acids Res.）（1982）10:3249;メチルホス
ロジテトラゾリド（MPDT）−ホスファイト法、カオ（Ca
o）ら、テトラヘドロン・レターズ（1983）24:1019;シ
アノエチルホスホルアミダイト、シンハ（Sinha）ら、
ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids Re
s.）（1984）12:4539;およびニトロフェネチルホスホル
アミダイト、ベイツェル（Beitzer）およびプフレィデ
レル（Pfleiderer）、テトラヘドロン・レターズ（198
4）25:1975。
残りの試薬はキャッピング剤であり、これは遊離ヒド
ロキシル基を有する失敗の配列をキャッピングするはた
らきをする。大部分について、キャッピング基は、カル
ボン酸アシル基であり、とくに２〜８個、通常２〜６個
の炭素原子および０〜２個のヘテロ置換基を有するアシ
ル基であり、ヘテロ置換基は酸素、イオウおよび窒素、
とくにオキシまたはオキソとして酸素、チオエーテルま
たはスルホンとしてイオウ、およびアミノ窒素として窒
素を含み、それに共有結合した水素原子を含有しない。
キャッピング基の例は、アセチル、レブリニル、アリー
ルチオウタニル、とくにフェニル、およびジメトキシト
リアゾリルホスフィンである。キャッピング試薬および
その使用法は、前に引用した参考文献、マテウシ（Matt
eucci）およびカルサーズ（Caruthers）、およびチョウ
（Chow）ら、ならびにマガルワル（Agarwal）およびコ
ラナ（Khorana）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケ
ミカルソサイアティ（J.Am.Chem.Soci.）（1972）94:35
78に記載されており、これらの参考文献を引用によって
ここに加える。
種々の組み合わせが好ましいであろう。例えば、３′
−５′方向の核酸の調製において、好ましい末端ブロッ
キング基は通常トリチル基であり、ここでアリール基な
らびに置換基を変更することができ、ジメトキシトリチ
ルは好ましい。環外アミン保護基として、好ましい基は
メチレン基、とくにジアルキルアミノメチレン、アルカ
ノイル、とくに分枝鎖状アルカノイル、およびアロイ
ル、とくにベンゾイルおよび置換ベンゾイルである。結
合官能基として、カルボン酸エステル、グリコール、お
よびトリチルエーテルが使用されるであろう。キャッピ
ング官能基として、カルボン酸のキャッピング基、とく
にアセチルおよびレブリニルはとくに興味がある。
保護官能基、ブロッキング官能基、キャッピング官能
基および結合官能基の種々の組み合わせを、関連する官
能基を除去または切離すための種々の試薬と組み合わせ
て使用できる。次の組み合わせは例示である。
上に示したように、環外アミノ基のための保護基の除
去のため、水性アンモニアおよびヒドラジンを用いるこ
とができ、これらはキャッピング基を除去するはたらき
をする。
酵素的加水分解妨害保護官能基あるいは所望の生成物
上の末端５′または３′部分を除外したすべてのブロッ
キング基を除去した後、先端を切つた失敗配列（trunca
ted failure sequences）の酵素的加水分解を実施す
る。加水分解のための酵素は、速度、５′−３′または
３′−５′の加水分解（合成の方向に依存する）、末端
ブロッキング基による阻止、エンドヌクレアーゼ活性の
欠除および配列または二次構造依存性の欠除に基づいて
選択されるであろう。３′−５′合成のルートについて
次の酵素を使用できる：脾ホスホジエステラーゼ〔ベル
ナルディ8Bernardi）およびベルナルディ（Bernard
i）、1971、ザ・エンチム（The Enzymes）、P.D.ボイア
ー（Boyer）編、第３版、V.4、271ポージ、アカデミッ
ク・プレス、ニューヨーク〕、バシルス・スブチリス
（Bacillus subtilis）細胞外エキソヌクレアーゼ〔ケ
ル（Kerr）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.）（1967）242:2700、カナモ
レ（Kanamore）ら、バイオヒミカ・エト・バイフィジカ
・アクタ（Biochim Biophys.Acta）、（1974）335:173;
カナモレ（Kanamore）ら、バイオヒミカ・エト・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）、（1974）
335:155〕、サケ・テステス（Salmon testes）エキソヌ
クレアーゼ〔メノン（Menon）およびスミス（Smith）、
バイオケミストリー（Bichem.）9:1584〕、およびラク
トバシルス・アミドフィルス（Lactobacillus acidophi
lus）ホスホジエステラーゼ〔ファイアーズ（Fires）お
よびコラナ（Khorana）、ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー）、（1983）238:2798〕。５′−３′合成ル
ートのために、次の酵素を使用できる：スネイク・ベノ
ム（Snake venom）ホスホジエステラーゼ〔ラスコウス
キー（Lawkowshi）、1971、ザ・エスチムス（The Enzym
es）、P.D.ボイアー（Boyer）編、第３版、V.4、313ペ
ージ、アカデミック・プレス・ニューヨーク〕、マウス
の腎のホスホジエステラーゼ（ラゼル（Razzell）、W.
E.、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol Chem.）、（1961）236:3031〕、ニンジンのエキソヌ
クレアーゼ〔ハーベイ（Hervey）ら、バイオケミストリ
ー（Biochemistry）、（1967）6:3689;ハーベイ（Harve
y）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）（1970）
9:921〕およびアベナ・リーク（avena leak）ホスホジ
エステラーゼ〔ウドバルディ（Udvardy）、バイオヒミ
カ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.
Acta.）（1970）206:392〕。検定のために適当な条件
は、引用した参考文献に記載されている。
核酸と多くの類似性を共有するポリペプチドを本発明
において使用することもできる。ポリペプチドについ
て、末端ブロッキング基は通常α−アミノ基に結合した
基であるが、合成は末端基としてカルボキシルを用いて
逆方向であることもできる。保護基は側鎖のアミノ、ヒ
ドロキシル、メルカプトおよびカルボキシ基に結合した
基であり、これらの基はリジン、アルギニン、ヒスチジ
ン、チロシン、セリン、スレオニン、システイン、アス
パラギン酸およびグルタミン酸中に存在する。さらに、
種々の樹脂を用い、ここで完成された鎖は樹脂から切離
さなくてはならず、そして付加が起こらなかった鎖をキ
ャッピングすることが望ましく、これは核酸の鎖の場合
とまったく同じである。
多くの場合、鎖がＣ−Ｎ方向またはＮ−Ｃ方向のいず
れに構成されるか、すなわち、鎖上の末端官能基がカル
ボキシであるかアミノであるかに依存して、鎖の構成に
用いるアミノ酸は次の式の１つを有するであろう。
式中、 ＪおよびJ1はＤ−またはＬ−アミノ酸のいずれかのア
ミノ酸の残部であり、そして20の天然アミノ酸または天
然以外のアミノ酸、例えば、ホモセリン、ノルロイシ
ン、サルコシンなどのノルマル側鎖のいずれかを含み、 ＫおよびK1は官能基保護基であり、官能基がアミノ
（これはアミノがアミノ基、グアニジンまたはイミダゾ
ールであるかどうかによりさらに区別されうる）、ヒド
ロキシ、メルカプトまたはカルボキシのいずれであるか
依存して、それらの性質が異なり；アミノについて、保
護基は４〜12個の炭素原子のα，β−不飽和ケトン、２
〜12個、通常４〜10個の炭素原子のオキシカルボニル
（とくに脂肪族、芳香族およびアラルキルは酸不安定性
である）、β−ジケトン、アリールスルフェニル、アリ
ールスルホニル、アラルキル、ニトロ、およびポリニト
ロフェニルを包含することができ、 ヒドロキシについて、７〜12個の炭素原子のアラルキ
ルおよびアリールオキシカルボニル（両者は置換および
非置換である）を包含することができ、 メルカプトについて、１〜10個の炭素原子のアルキル
およびアラルキル（これはジサルファイドを形成するイ
オウ、例えば、メチルジチオを形成するメチルチオを含
有できる）を包含することができ、 カルボキシについて、７〜12個の炭素原子のアラルキ
ル（置換および非置換）または２〜７個の炭素原子のア
ルキルを包含することができ、 末端ブロッキングＱについて、アミノ末端基につい
て、２〜12個の炭素原子、通常５〜10個の炭素原子のオ
キシカルボニル（これらは脂肪族、脂環族、芳香族、ま
たはそれらの組み合わせである）；ジアシル（これは５
〜６の環構成員の環式イミドを形成できる）；アラルキ
ル、とくにトリチル（置換および非置換）、および２〜
４個の炭素原子のポリフルオロカルボン酸、とくにパー
フルオロを包含することができ、 Q1は水素であろうが、ここで末端基はカルボキシであ
り、 末端基がアミノであるとき、Ｕはヒドロキシまたは水
性媒質中でアミノ酸へのアミド結合を形成できるエステ
ル基であることができ、そしてＮ−オキシスクシンイミ
ド、ｏ−ニトロフェニル、ペンタクロロフェニル、４−
オキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸、または、とく
にカルボン酸誘導体との、混合無水物のような基を包含
するであろう、 U1は、末端基としてはたらき、１〜10個の炭素原子の
アルキルまたはアラルキルであることができる。
窒素上の残りの原子価は、他の方法で置換されていな
い場合、水素であろう。
種々のブロッキング基および保護基について一般化さ
れた参考文献は、次のものである：バラニー（Barany）
およびメリフィールド（Merrifield）、ペプチドズ：ア
ナリシス・シスセシス・バイオロジー（Peptides:Analy
sis.Synthesis.Biology）、Vo1.2、スペシャルメソズ
（Special Methods）、〔グロス（Gross）およびメイエ
ンホファー（Meienhofer）編〕、1979。
文献に記載されている保護基の例示的列挙は、次の通
りである。
特定のブロッキング基および保護基に加えて、支持体
への結合および支持体の性質に関連する官能基がまた存
在する。広範な種類の支持体がポリペプチド合成に関連
して使用されてきている。支持体は架橋したポリスチレ
ン、セルロース、ポリビニルアルコール、ガラス、ポリ
エチレンイミンなどのような種々の物質を包含する。こ
のような支持体を用いるとき、広範な種類の結合がこの
支持体へ最初のアミノ酸を結合するために使用されてき
ている。結合は、ポリペプチド末端がアミノまたはカル
ボキルであるかに依存して、エステル、アミドおよび置
換アミンを包含する。
文献に記載される支持体および結合官能基の例は、次
の通りである： キャッピング基として、アミンのための側鎖の保護基
として用いたのと同一の形であるが、末端ブロッキング
基と異なる基を使用できる。この方法において、キャッ
ピング基および側鎖の保護基は誤まりの配列の酵素的分
解の前に同時に除去することができる。
アミノ末端のためのキャッピング基の例は、トリチ
ル、ポリフルオロアシル、フルオロメトキシカルボニ
ル、ジチアスクシニノイル、ｏ−ニトロフェニルスルフ
ェニルおよび2,4−ジニトロヘェニルである。
オリゴマーのポリペプチドが完成したとき、保護基、
キャッピング基およびブロッキング基とともに含まれる
種々の官能基を切離し、基を除去し、次いで支持体から
切離す。次の表は、官能基および試薬の種々の組み合わ
せを例示する。
Ｐ−Ｏ側鎖の酸素上の保護基 S 〃 イオウ上の保護基 N 〃 窒素上の保護基 COO 〃 カルボキシレート上の保護基 Ｂ 末端ブロッキング基 Ｃ キャッピング基 Ｌ 支持体への結合 実施例１において上に示したように、ポリペプチドの
調製において、保護基およびキャッピング基としてチオ
分解性基を用いることにより、末端アミノ酸が付加され
たとき、保護基およびキャッピング基はカルボニル末端
ブロッキング基の存在下に優先的に除去することができ
る。塩基性条件下でのチオフェノールのような条件を用
いると、α−アミノ末端ブロッキングを保持している
間、保護基およびキャッピング基を除去できる。次い
で、誤まりの配列をアミノペプチダーゼ、例えば、アミ
ノペプチダーゼＭを用いて分解できる〔ロイアー（Roye
r）およびアンドリュー（Andrew）、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio.Chem.）（197
3）248:1807−1812〕。分解後、末端保護基および支持
体への結合は、特定の基に依存して、同時にあるいは順
次に切離すことができる。例えば、オキソ−カルボニル
およびβ−排除を可能とする基、例えば、スルホニルエ
チルを用いると、アミノ酸の鎖は同時に支持体から解放
しかつ脱ブロッキングすることができるであろう。
カルボキシル基が末端であるとき、末端ブロッキング
基は第三アルキルまたはアラルキル基を含むことがで
き、これらの基は酸不安定性であるが、塩基不安定性側
鎖保護基、例えば、ポリフルオロアセチルまたはチオ分
解性側鎖保護基（上を参照）を用いることができる。次
いで、誤まりの配列をカルボキシペプチダーゼA,Bまた
はＣあるいはそれらの組み合わせで分解することができ
る。配列の例は、次の通りである。光不安定性であるｏ
−ニトロベンジル結合官能基に対して第１アミノ酸を用
いて、エステルを形成する。末端ブロッキング基はtert
−ブトキシオキシカルボニル（tBOC）であることができ
るであろう。チオ分解性側鎖保護基、例えば、Ｓ−アル
キルメルカプト、ジチアスクシノイル、ジニトロフェニ
ル、フェナシルなどを用いる。こうして、側鎖保護基は
除去できるが、末端ブロッキング基は保持される。
カルボキシが末端基であるとき、異なる試薬をブロッ
キング基、保護基およびキャッピング基として使用でき
る。例えば、アミノ基を支持体へ酸および塩基安定性の
結合により固定し、この結合は水素化分解、例えば、ス
ルフェニル、まは光分解切離しにより切離すことができ
る。末端ブロッキング基は酸不安定性tert−アルキル基
であることができ、この基は二塩化メチレン中でトリフ
ルオロ酢酸で除去することができる。あるいは、tBOCヒ
ドラジニルを末端ブロッキング基として使用することが
でき、この基は4NのHCl/ジオキサンのような試薬で除去
できる。側鎖の保護基は塩基不安定性基、例えば、フル
オレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）およびチオ分
解性基（上を参照）であり、一方キャッピング基は低級
アルキル、例えば、メチルである。誤まりの配列を分解
した後、末端ブロッキング基を除去し、完成したポリペ
プチドを支持体から切り離し、単離し、そして必要に応
じて精製する。
通常不必要であるが、存在しうる他の物質を除去する
ために、さらに精製を行うとき、種々の技術、例えば、
透析、ゲル透過クロマトグラフィー、HPLC、逆相HPLC、
親和クロマトグラフィーなどを用いることができる。
使用する支持体は、種々の配列の調製に手動法または
自動化法のいずれを用いるかに依存して変化するであろ
う。一般に、自動化手順について、粒子サイズは約50〜
300ミクロン、より通常約100〜200ミクロンであり、こ
れに対して手動合成を用いるとき粒子の大きさは前記範
囲の下であり、一般に約100〜150ミクロンであることが
できる。
ポリヌクレオチドの合成を例示するために、次の例を
提供する。
便利には、支持体への結合基のカルボン酸を適当なカ
ーボジイミドまたは活性化カルボニル、例えば、カルボ
ニルジイミダゾールで活性化し、カルボン酸無水物また
は混合無水物との反応によりあるいは他の慣用の技術に
より、第１ヌクレオシドへのエステル結合を形成でき
る。
いったん支持体へ接合したヌクレオシジルエステルが
調製されると、それをポリヌクレオチド鎖の伸長の開始
に使用することができる。一連の段階の各々はヌクレオ
チドの付加を含む各配列について反復されるので、第１
工程は支持体へ結合した末端ヌクレオチドからのブロッ
キング基の除去であろう。すでに示したように、多くの
場合、ブロッキング基はトリチル基であろう。便利に
は、この基は不活性有機媒質、例えば、ジクロロメタン
中で、ルイス酸、金属ハロゲン化物、例えば、臭化亜
鉛、またはプロトン酸、とくに強いカルボン酸（pKa＜
４）例えばジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸などにより除
去される。ルイス酸の濃度は一般に約0.1〜1.0モルであ
る。反応時間は一般に約１〜５分であり、そしてこの時
間は反応を完結させ、同時に副反応を最小とするように
選択される。この工程はホスホルアミダイトまたはホス
フェートを含むいずれの手順に対しても共通である。
次いで粒子を適当な不活性溶媒または溶媒混合物ある
いは溶媒の系列、とくに有機極性溶媒で洗浄し、最後に
不活性無水極性溶媒、例えば、アセトニトリル、ジクロ
ロメタンなどで洗浄して湿気が確実に存在しないように
する。適当ならば、これらの工程は不活性の無水の環
境、例えば、アルゴン、水素、ヘリウム、窒素などの存
在下に実施する。通常、各段階における最後の洗浄は次
の工程の溶媒系を用いる。
よく洗浄して微量の酸を除去した後、接合粒子（conj
ugated particles）は次のヌクレオチドを付加できる状
態にある。使用する特定のリン酸誘導体に依存して、プ
ロトコール（protocols）はここで変化するであろう。
ホスホルアミダイトを使用するとき、ホスホルアミダイ
トは活性化剤、例えば、テトラゾールと組み合わせて添
加される。この反応の条件は不活性無水極性溶媒、例え
ば、アセトニトリルを短時間に使用することであり、一
般に５分以内、通常約１〜３分は十分である。トリエス
テルのルートにおいて、ホスフェートのトリアルキルア
ンモニウム塩の添加は活性化剤、例えば、メシチレンス
ルホニル−３−ニトロ−1,2,3−トリアゾールまたは塩
化スルホニルおよびＮ−メチルイミダゾール、すなわ
ち、活性化アリールスルホン酸化合物の存在下に実施す
る。
リン化合物の縮合の後、不活性無水極性有機溶媒、例
えば、アセトニトリルを用いる完全な洗浄を実施する。
ホスホルアミダイトでは、次の段階を変化させること
ができ、キャッピングは酸化と交互するであろう。すな
わち、ホスファイトは酸化してホスフェートにしなくて
はならない。
キャッピングのため、アミノ保護基とともにアミン保
護基を効率よく除去できるカルボン酸誘導体を使用す
る。好ましいカルボン酸は脂肪族カルボン酸であり、と
くにヒドラジンと反応して、通常５〜６環構成員の、環
式化合物の形成を可能とする間隔を置いて位置するカル
ボニル基を有することができる。２〜８個、通常２〜５
個の炭素原子のオキソ−置換脂肪族カルボン酸である。
とくに興味あるものは酢酸またはレブリン酸であり、こ
れらは便利には無水物で用い、エステルの形成に使用で
きる。
キャッピング反応は、４〜６個の炭素原子の極性エー
テル、例えば、テトラヒドロフラン中の約５〜20容量
％、通常約10容量％のジアルキル化ピリジンの溶液中
に、約0.1〜１モル、通常0.4〜0.6モルの濃度で複素環
式芳香族アミンまたはアミンの混合物、とくにジアルキ
ルアミノピリジン、さらにとくに４−ジメチルアミノピ
リジン（DMAP）を含有する塩基性溶液を最初に添加する
ことによって実施する。上のアミン溶液の添加後、脂肪
族カルボン酸無水物を極性エーテル溶媒中の約１〜３モ
ル、好ましくは２モルの濃度で加える。こうして、複素
環式芳香族塩基は、カルボン酸誘導体との反応のためヒ
ドロキシル基を活性化してエステルを生成し、失敗配列
をキャッピングする。
酸化のため、酸化は便利には温和な酸化剤、例えば、
塩基性溶液中のヨウ素を少量の、例えば各各約５〜15容
量％のジアルキルピリジン、例えば、2,6−ルチジン、
および水を含有する極性脂肪族エーテル中で約0.1〜0.4
モル、好ましくは約0.2モルの濃度で用いて普通に実施
される。あるいは、有機ヒドロパーオキシド、例えば、
ｔ−ブチルヒドロパーオキシドまたはベンジルパーオキ
シドを用いることができる。
キャッピング工程と酸化工程との間に、洗浄を実施
し、これには次の工程の溶媒系を使用する。水を酸化工
程において使用し、そして無水系はキャッピングのため
に好ましいので、この系列においては、キャッピングは
通常最初に実施されるであろう。トリエステル系列のた
めには、酸化は不必要であり、それゆえキャッピングは
縮合後直ちに実施する。
好ましくは不活性の無水有機溶媒、例えば、アセトニ
トリルおよびジクロロメタンである逐次的溶媒を用い
て、よく洗浄した後、この手順は反復することができ
る。ポリヌクレオチド鎖がいったんその所望長さに伸長
されると、保護基の除去、失敗配列の分解および所望配
列の単離をここで開始できる。
次の工程はアルキルまたは置換アルキルである酸素上
の置換基の除去のために普通に実施される。通常、チオ
フェノキシドを三置換アミンの存在下に用いる。便利に
は、不活性エーテル性有機溶媒、例えば、ジオキサンを
使用する。時間はこの系の性質に依存して広く変化する
であろう。この時間は約５分程度に短かく、そして約１
時間程度に長くあることができる。便利には、溶媒、メ
ルカプチドおよびアミンの比は容量で2:1:1の比であ
る。脂肪族ホスフェートエステル基の除去に引き続い
て、極性有機ヒドロキシル化合物、とくにアルコール、
例えば、メタノールを用いる洗浄を実施する。酸素上の
置換基がクロロフェニルであるとき、オキシメート、曲
型的には２−ピリジニルアルドキシメート、および1,1,
3,3−テトラメチルグアニジンの無水塩基性溶液を普通
の条件下に用いることができる。
次に工程において、キャッピング基、例えば、ルブリ
ン酸、およびアミノ保護基を同時に除去する。この試薬
は高度に塩基性の有機溶媒中のヒドラジンであり、この
溶媒は少量の有機アンモニウム塩、例えば、２〜４個の
炭素原子の脂肪族カルボン酸、例えば、酢酸と、溶媒と
しても作用する複素環式アミンとの塩を含有する。溶媒
は複素環式芳香族塩基、例えば、ピリジンまたは５〜８
個の炭素原子の置換ピリジンであり、ここでカルボン酸
の量は一般に約10〜30容量％、好ましくは約15〜25容量
％であろう。ヒドラジンは、水和物として、一般に約0.
2〜１モル、好ましくは約0.5モルであろう。反応時間は
少なくとも１時間、より通常少なくとも６時間であり、
そして約48時間以下、好ましくは約24時間以下であり、
温度はほぼ周囲温度ないし50℃である。この反応に引き
続いて、極性有機溶媒、とくにメタノールによる洗浄を
実施し、次いで乾燥する。乾燥の方法は臨界的ではな
く、便利には、室温における高い真空で十分であろう。
この時点において、失敗した配列は遊離のヒドロキシ
ル基を有するであろうが、成功した配列はトリチルブロ
ッキング基で終るであろう。トリチル基を異なる基で置
換すべきとき、トリチル基は温和な酸を下に記載するよ
うにして用いて除去することができる。通常、脱トリチ
ルおよび再ブロッキングはキャッピング基および保護基
の除去前に実施される。こうして、ヌクレオチド保護官
能基は存在してそれらの部位における反応を阻止するで
あろう。次いで、末端ヒドロキシルをアシル無水物、例
えば、安息香酸無水物を第三アミン、例えば、テトラヒ
ドロフラン中のN,N−ジメチルアミノピリジン（DMAP）
および2,6−ルチジンの組み合わせ、と一緒に用いて再
ブロッキングすることができ、ここで2,6−ルチジンは
約1:10（v/v）であり、無水物は約0.2〜２モルであり、
そしてDMAPは約３〜10％（w/v）である。時間は通常周
囲条件において約５〜30分で変化するであろう。
失敗した配列をここで酵素的分解、とくにホスホジエ
ステラーゼを使用して分解する。用いる媒質は酵素の活
性を再適化し、通常緩衝化水性媒質を用いる。酵素は緩
衝化媒質、1:1水：ポリオール、とくにグリセロール中
に加えることができる。この反応は約40℃を越えず、一
般に約25℃〜40℃、好ましくは約35℃〜40℃の温度にお
いて実施することができ、通常約１時間より長くかつ約
24時間以下の範囲の時間を通常必要とする。反応の完結
時に、媒質を冷却することができ、次いで支持体をpH約
６〜７、好ましくは約6.4〜6.5の水性緩衝化媒質で洗浄
する。緩衝剤の濃度は一般に約0.05〜0.2モルである。
ポリヌクレオチドの配列は、前に除去されていない場
合、ここで支持体から除去し、そして末端ヒドロキシル
基を脱ブロッキングすることができる。支持体からの除
去は反応性アミン、例えば、アンモニア、とくに濃水性
水酸化アンモニウムを用いて容易に達成される。除去を
脱ブロッキングの前に実施するとき、除去は保護基の除
去と関連させて、よりきびしい除去の条件を用いして実
施して保護基を同時に除去することができる。この反応
は周囲温度で比較的急速に進行し、通常約0.5〜６時
間、好ましくは約１〜３時間実施する。反応の完結時
に、粒子はポリヌクレオチド配列から、便利には遠心、
および引き続くヌクレオチド配列の単離により、便利に
は溶媒の蒸発により、除去される。
先端が切られた失敗の断片の酵素的加水分解を５′−
保護ターゲット断片の存在下に実施できる別の手段は、
失敗の断片およびターゲット断片を支持体から酵素の添
加前に除去することである。これは支持体からのDNAの
除去の間に５′−保護基が安定であることを必要とす
る。水酸化アンモニウム感受性の結合では、５′−ジメ
トキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリチル、ホ
スホリル、ピロホスホリルおよび他の基を使用できる。
別の結合は他の５′−保護基の使用を可能とするであろ
う。
酵素的分解は、酵素を溶液中で使用し、次いで活性を
除去する（例えば、フェノール抽出）か、あるいは固体
に支持された酵素〔例えば、脾ホスホジエステラーゼ；
セリゲット（Seliget）ら、バイオテクノロジー・アン
ド・バイオエンジニアリング（Biotechnlogy and Bioen
gineering）、vol.XXII、ジョン・ウイリー・アンド・
サンズ（John Wiley and Sons）、1980〕を用いて実施
できる。
末端トリチルヒドロキシルブロッキング基の除去は慣
用法により、便利には酸性媒体好ましくは水中の約75％
〜85％の酢酸の中にポリヌクレオチド配列をまず懸濁す
ることによって達成することができる。反応が起こるた
めに十分な時間を経過させた後、一般に約２時間以内の
後、DNA、RNAまたはそれらの組み合わせを少量の沈殿
剤、例えば、エタノールまたはエーテルの添加に沈殿さ
せることができる。次いでポリヌクレオチドは、便利に
は遠心および引き続く少量の塩基、例えば、濃水酸化ア
ンモニウムの添加による少なくとも部分的中和により単
離し、そして混合物を蒸発乾固することができる。
アロイル末端ブロッキング基の除去のため、濃水性水
酸化アンモニウムを40℃〜70℃の高温において２〜６時
間実施することができる。
得られる配列プローブとして使用することができ、DN
Aポリメラーゼとともに使用して日本鎖（ds）DNAを形成
することができ、あるいは複数の断片を重なりを可能と
する部分的相補性をもたせて使用して、複数の断片から
大きく伸長した配列を生成することができる。断片をア
ニーリングして、複数のニックを有する二本鎖を形成
し、そして結合する。
二本鎖配列を得る場合、配列を種々の方法で操作する
ことができる。配列はベクターまたはウイルスの中に直
接挿入することができ、あるいはアダプター（adapto
r）、リンカー（linker）などの付加により修飾するこ
とができ、ここで得られるdsDNAはベクターの中に挿入
してクローニングし、引き続いて制限マッピング（mapp
ing）または配列決定して所望配列の存在を確保するこ
とができ、あるいは適当ならば、発現させることができ
る。
ポリヌクレオチドの調製は図面に示すような装置を用
いて自動化することができる。脱ブロッキングおよび精
製のための自動化装置10を構成し、この装置は温度が制
御された反応塔12および共通のヘリウム源14を有する。
種々の弁がNC（常態で閉じている）、NO（常態で開いて
いる）およびＣ（共通の弁または口）として示されてい
る。
反応塔12は両端が多孔質バリヤーで囲まれている。バ
リヤー中の孔は十分に微細であって分散した固相支持体
を反応器内に保持するが、実質的な差圧を用いないで混
合を可能とする。パッキング16は密に詰められている。
反応塔12は試薬マニホールド18から単離弁20よりおよび
ヘリウムマニホールドから単離弁22により分離されてい
る。弁20および22の各々は、それぞれ、廃物ライン24お
よび26に接続されている。廃物弁28は、また、三方、２
位置の自動弁であり、そして試薬マニホールドに接続さ
れた共通の常態で開いた口を有する。
試薬マニホールド18はある数の試薬および洗浄溶液の
供給容器を接続する:30A、アセトニトリル−洗浄;30B、
水;30C、水酸化アンモニウム;30D、水;30E、80％の酢
酸;30F、緩衝剤;30G、ホスホジエステル塩基;30H、メタ
ノール；および30K、チオフェノール−トリエチルアミ
ン−ジオキサン。
試薬／洗浄溶液の対の各々は単一の入口点で試薬マニ
ホールド18に接続されている。弁の対を直列に接続する
ことが好ましい。洗浄溶液または希釈溶液を試薬溶液と
結合させ、こうしてそれらを混合しそして反応器へ移送
することができる。ポリヌクレオチドを調製する種々の
方法の前の説明および米国特許第4,483,964号中の詳細
な説明、ならびに実験の部分に記載する手順に基づい
て、種々の弁を操作して脱ブロッキングおよび精製を実
施する方法は明らかとなるであろう。
実験 実施例１−ホルムアミジン置換グアニジンの調製 反応フラスコに6.7gのデオキシグアノシンを導入し、
これをジメチルホルムアミド（DMF）とともに共蒸発さ
せる。このデオキシグアノシンに、8.75mlのジ−Ｎ−ブ
チルホルムアミドジメチルアセタール〔メールウエイン
（Meerwein）ら、リービグス・アンナーレン・デル・ヘ
ミー（LiebigsAnn.）（1961）641:1に記載されるように
して調製〕および200mlのDMFを加える。又クレオシドは
急速に溶解するが、３時間以内に完全には溶解しない。
透明な黄色がかった溶液を蒸発させると油が得られ、こ
れをジクロロメタン／水性重炭酸ナトリウム中に分配
し、有機層を蒸発により乾燥し、次いで100mlのジクロ
ロメタン中に溶解し、次いで900mlの石油エーテルで沈
殿させる。上澄み液をデカンテーションし、沈殿をジク
ロロメタン中に再溶解し、そしてジクロロメタンを蒸発
させると、12gが得られ、これをピリジンと共蒸発させ
る。次いでこの混合物に200mlのピリジンおよび8.5gの
ジメトキシトリチルクロライドを加え、そして反応を室
温において18時間進行させる。
この反応混合物に10mlのメタノールを加え、揮発性物
質をジクロロメタンと水性重炭酸ナトリウムとの間に分
配させ、蒸発により乾燥し、次でトルエン中で共蒸発さ
せる。得られる発泡体にジクロロメタンを加えて生成物
を溶解し、そしてこの生成物をシリカで精製する。ジト
リチル化生成物を１％のメタノールおよびジクロロメタ
ンで溶離し、一方所望生成物は２％〜３％のメタノール
溶離で得られる。生成物を含有する分画を合わせ、蒸発
により濃縮し、そして90mlのジクロロメタン中に溶解
し、次いで石油エーテル（900ml）で沈殿させ、そして
単離すると、7.9gの所望生成物が得られる。
実施例２−ホルムアミジン置換アデノシンの調製 フレーラー（Froehler）およびマテウシ（Matteucc
i）、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids
Res.）（1983）11:8031−8036に記載されているよう
にして調製する。
実施例３−レブリン酸キャッピング剤の調製 ジエチルエーテル（325ml）中のレブリン酸（100ミリ
モル）および50ミリモルのジシクロヘキシルカーボジイ
ミドを60時間攪拌した。過後、溶液を蒸留により除去
すると、12gの黄色がかった油が得られる。この油を50m
lの無水テトラヒドロフラン中に溶解して、最終濃度１
モルのレブリン酸無水物を得た。
実施例４−ホルムアミダイトの調製 トリチルブロックドヌクレオシド（環外アミンはジブ
チルアミノホルムアジニル官能性またはベンゾイル可能
性により保護されている）を注意して乾燥し、そして次
のようにして反応させた。15ミリモルのヌクレオシドに
21mlのジイソプロピルエチルアミジンおよび30mlのクロ
ロホルムを加え、そしてこの混合物を窒素の雰囲気のも
とに攪拌する。次いで上の混合物に、N,N−ジイソプロ
ピルアミノメトキシホスホロクロリダイト（4.3ml）を
約１分かけてゆっくり加える。この添加を反復し、そし
て攪拌を20分間続ける。次いでこの混合物に240mlの酢
酸エチルを加え、この混合物を分液漏斗に移し、窒素で
フラッシユし、そして250mlの脱気した飽和水性NaCl溶
液を加える。両方の相を激しく振とうしながら混合し、
相を分離させ、水相を除去し、そして抽出を３回反復す
る。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで蒸発乾固
する。この残留物に、50mlのトルエンを加え、蒸発を反
復する。この残留物を50mlのトルエン中に溶解し、そし
てこの溶液を600mlのヘキサンに−70℃において攪拌し
ながら窒素のもとに滴々加える。ホルホルアミダイトは
沈殿し、これを過し、そして使用するまでデシケータ
ー中に真空下に維持する。
実施例５−固体の支持体の調製 95％のエタノール（250ml）中に懸濁させた調節され
た孔のガラス（CPG）（25g、500Åの孔）〔エレクトロ
ヌクレオニクス（Electro Nucleonics）、米国マサチュ
セッツ州〕を、３−アミノプロピルトリメトキシシラン
（7.5ml）で48時間処理した。過および洗浄後、CPGを
120℃で２時間硬化させてCPG−PrNH2を得た。10gのこの
物質を、コハク酸無水物（3.7g）および４−（N,N−ジ
メチルアミノ）ピリジン（0.5g）を添加して含有するTH
F中に懸濁させた。48時間反応を停止し、この時CPGはア
ミノ官能について陽性の試験（エタノール中のニンヒン
ドリン）をもはや与えなかった。末端カルボキシル基の
活性化を、DMF中のカルボニルジイミダゾール（4g）で1
8時間真空中で実施した。CPGを過し、ヘキサンジアミ
ン（4g）を含有するDMF中に直ちに懸濁させた。48時間
後、CPGを過し、メタノール、ジクロロメタン、エー
テルでよく洗浄し、次いで60℃で18時間乾燥した。
実施例６−固体支持DNA合成。
固体支持オリゴヌクレオチドの脱保護および酵素的精
製 チョウ（Chow）ら、ヌクレイック・アシズ・リサチ
（Nucleic Acids Res.）（1981）９:2807−2811の手順
に従い、脱保護したデオキシヌクレオシド３′−Ｏ−コ
ハク酸誘導体を官能化アミノ末端−CPGに結合させるこ
とによって、ヌクレオシドを支持体へ接合させた。
次はポリヌクレオチドの調製に用いたサイクルであ
り、ここでCPGと第１ヌクレオチドとの間の結合基は次
の式を有する： CPG500-(CH2)3NHCO(CH2)2CONH(CH2)6NHCO(CH2)2CO−
３′−Ｏ− 第１ヌクレオシドは５′−ジメトキシトリメチルでブ
ロッキングされたチミジンであった。モノマーの単位は
ヌクレオシジル置換N,N−ジイソプロピル−Ｏ−メチル
ホスホルアミダイトであった。アデノシンおよびグアノ
シンはN,N−ジブチルアミノメチレンでブロッキングさ
れた環外窒素を有して、環外アミン窒素をもつアミジン
を形成し、一方シトシンはベンゾイルでブロッキングさ
れた環外アミン窒素を有した。
下表１は、ほぼ３μモルのチミジンを有する支持体の
70mgを用いる、用いたサイクルを示す。
１〜９のサイクルを14回反復した。第14ヌクレオチド
を付加後、試料を３つの部分に分割し、そして３サイク
ルを、それぞれ、A,CおよびＧを用いて異なるように実
施し、第15ヌクレオチドおよび第16および第17ヌクレオ
チドについて、チミジンであった。試料を第15ヌクレオ
シドの後に合成を続ける前に採取し、ここでオリゴヌク
レオチドはそれらの最後の残基としてDMT−Ａ、DMT−Ｃ
およびDMT−Ｇを有する。これらを酵素分解のための対
照として使用し、ここで最後のオリゴヌクレオチドで
は、組成物を半分に分割し、１つは完全に脱ブロッキン
グしかつ脱トリチル化し、そして第２は脱ブロッキング
するが、DMT基を最後のチミジン上に保持させた。双方
の種を酵素反応に使用した。
次の配列を調製した： ３′−TTTTTTTTTTTTTTXTT Ｘ＝A,CまたはＧ 断片を脱保護、酵素による消化および固体の支持体か
らの除去は次のようにして実施した。支持体に200μｌ
のジオキサン／チオフェノール／トリエチルアミン（2:
1:1）を加え、そして反応を室温で１時間実施して、ホ
スフェートエステルのメチル基を完全に除去した。次い
で支持体をメタノールでよく洗浄し、次いで200μｌの
ビリジン／酢酸（4:1v/v）中の0.5モルのヒドラジン・H
2Oを加え、そして反応を室温で24時間実施し、次いでメ
タノールで洗浄し、そして高真中で乾燥した。この処理
は環外アミノ保護基のすべて、ならびにルブリンキャッ
ピング基を除去する。
50μｌの0.1モルの酢酸ナトリウム、pH6.45の中に懸
濁させた１〜2ngの上からの支持体に、36μｌのグリセ
ロール/0.1モルのコハク酸ナトリウム（1:1v/v）、pH6.
5中の３単位の脾ホスホジエステラーゼ〔シグマ（Sigm
a）Ｐ−0770〕を加え、この混合物を37℃に18時間維持
した。この時、混合物を冷却し、そして支持体を0.1モ
ルの酢酸ナトリウム、pH6.45（100μｌ）でよく洗浄し
た。
この洗浄した支持体に200μｌの濃水性水酸化アンモ
ニウムを加え、そしてこの混合物を室温で２時間放置し
た。次いでこの混合物を遠心し、上澄み液を単離し、そ
してスピード−バク（Speed−vac）内で蒸発乾固させ
た。
乾燥した残留物を100μｌの80％の水性酢酸中に再懸
濁させ、そして反応を室温で１時間進行させた。次いで
DNAを1mlのエーテルの添加により沈殿させ、分散物を遠
心し、そして残留物を単離した。１滴の濃水性水酸化ア
ンモニウムを沈殿物に加え、次いで沈殿をスピード−バ
ク内で蒸発乾固させた。容器（エッペンドルフ管）を25
μｌの蒸留水で洗浄し、そして沈殿を蒸発乾固した。
生成物をゲル電気泳動により分析し、ここで試料を90
％のホルムアミド/1％のフィコール（Ficoll）/0.005％
ブロモフェノールブルー（10μl/mg支持体）中で可溶化
し、そして20％のアクリルアミドゲル上へ装入した。
ゲル電気泳動に基づき、ここで調製は本発明に従い実
施されており、鋭い帯がヘプタデカヌクレオチドについ
て観測され、ここでわずかに弱く観測可能な中間の帯が
存在し、一方酵素処理前にブロッキング基を除去した調
製物は低分子量の数本の帯の存在を示し、これらは本発
明に従って調製した生成物で得られた帯ほど暗色ではな
かった。
脱保護および精製プロトコール（protocol）について
の別のプロトコールは、次の通りである。
1.完成された合成物の脱トリチル化およびCH2Cl2を用い
る洗浄。
2.2,6−ルチジン/THF（1:10v/v）中における6.5％のN,N
−ジメチルアミノピリジン（w/v）中の２モルの安息香
酸無水物による10分のベンジル化、引き続くCH3CNによ
る洗浄。
3.チオフェノール−トリエチルアミン／ジオキサン（1:
1:2v/v）を用いる１時間のホスフェートの脱メチル化、
およびメタノールによる洗浄。
4.ピリジン／氷酢酸（4:1v/v）中の0.5モルのヒドラジ
ン水和物による環外窒素および５′−Ｏキャッピング基
の脱保護、および引続くメタノールおよび0.1モルのリ
ン酸ナトリウム、pH6.0による洗浄。
5.0.1モルのリン酸ナトリウム、pH6.0中の１単位（支持
体1mgにつき）の脾ホスホジエステラーゼによる18時間
の消化、引き続く0.1モリのリン酸ナトリウム、pH6.0お
よび水による洗浄。
6.NH4OHで２時間処理することによる支持体からの断片
の除去。
7.上澄み液のガラスバイアル中への移しおよび60℃で４
時間の脱ベンゾイル化のための密閉。
8.スピード−バク内の乾燥および水中の再懸濁。
実施例７−ホスホリル化試薬の調製およびオリゴヌクレ
オチドの５′−ホスホリル化 試薬ビス（β−シアノエトキシ）−N,N−ジイソプロ
ピルアミノホスフィンを次のようにして調製した。クロ
ロ−N,N−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシ
ホスフィン〔N.D.シンハ（Sinha）ら、ヌクレイック・
アシズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）（1984）12:453
9;アメリカン・バイオネチクス（American Bionetic
s）、米国カリフォルニア州エメリービレから入手可
能〕をアルゴンのもとに、10mlの塩化メチレン中の３−
ヒドロキシプロピオニトリル（4.6ミリモル）およびN,N
−ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA;4.9ミリモル）
の攪拌した溶液に０℃において急速に添加した。この溶
液を室温に加温し、酢酸エチル（50ml）で希釈し、そし
て80％の飽和水性NaCl（２×20ml）で洗浄した。有機相
を無水Na2SO4で乾燥し、そして減圧濃縮した。この油を
酢酸エチル中に溶解し、次いで各々200μモルの前記試
薬を含有する15mlの隔膜密閉式バイアルにアリコートを
入れた。溶媒を排気により除去し、そして生成物を−20
℃でアルゴンのもとに貯蔵した。この粗生成物はそれ以
上精製せずに使用した。
乾燥した物質をアセトニトリル中のテトラゾールで活
性化し、そして固体に支持されたオリゴヌクレオチドに
結合した。引き続いて合成DNAを水性I2で標準条件下に
酸化し、そして60℃においてNH4OHで脱保護した。この
方法は定量的収率で５′−ホスホリル化ターゲット断片
を与える。
実施例８−溶液中のオリゴヌクレオチドの溶解酵素的精
製 断片５′−TATCAATTCCAATAAACTTTACTCCAAACC−３′お
よび５′−AAGGATCCAGTTGGCAGTACAGCCTAGCAGCCATGGAAAC
−３′を、実施例６〔ワーナー（Warner）ら、DNA3、40
1（1984）〕に記載するようにしてCPG支持体上で合成し
た。次いで断片を実施例７に記載するようにして５′−
ホスホリル化した。オリゴマーを室温においてNH4OHで
支持体から除去し、次いで60℃で一夜脱保護した。溶液
をスピードーバク内で蒸発乾固した。
2mgの支持体から得られる粗生成物を20μｌのH2O中に
懸濁させ、これに0.3単位の脾ホスホジエステターゼを
含有する50μｌのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0を加
えた。かきまぜた後、溶液を37℃に１時間保持した。
ポリアクリルアミドゲルによると、先端が切られた失
販配列（truncated failure sequences）は引き続いて
分解されたが、これに対してホスホリル化ターゲット断
片は加水分解から保護されたことが立証された。
本発明は、問題の配列に密接に類似するが、１または
２以上の単位の欠如において有意に異なる配列を含まな
いかあるいは実質的に含まない生成物を提供することに
おいて、多くの利点を有する。本発明の変法において、
オリゴマーまたはポリマーが製造され、ここで個々のモ
ノマーは単一のモノマーよりはむしろモノマーの群の構
成員であり、そしてオリゴマーまたはポリマーはこれら
のモノマーの特定の配列を有することを必要とする。本
発明によれば、オリゴマーの順次の形成の間に特定のモ
ノマーの付加の失販から生ずる、誤まりの配列である配
列を含まないかあるいは実質的に含まないオリゴマーま
たはポリマーを製造できる。本発明を用いることによ
り、所望の配列の使用を妨害し、誤まった結果を与え、
そして所望の配列を使用するときの効率を減少させるこ
とのある密接に類似する配列で汚染されずに、生成物は
合成から純粋な形態で得られ、そして直接使用すること
ができる。さらに、この方法はブロッキング基および保
護基を広範な種類の官能性を官能化するための現在存在
する広範な技術を使用し、前記ブロッキング基および保
護基はこのような官能性の順次および／または連続の除
去を可能とすると同時に、オリゴマーまたはポリマーを
支持体に結合させて維持する。次いで誤まりの配列を酵
素的加水分解により破壊して、所望の配列のみを支持体
に結合させて残すことができる。次いで残るブロッキン
グ基を支持体からの切離しに関連させて除去することが
できる。このようにして、誤まりの配列で汚染されてい
ない、プローブとして直接使用できるポリヌクレオチド
を得ることができ、そしてポリペプチドの性質の評価、
免疫原としてのその使用などを妨害しうる種々の他のア
ミノ酸配列を含まないポリペプチドを得ることができ
る。
【図面の簡単な説明】
図面は、オリゴヌクレオチドを製造するこの発明の方法
において使用する装置の略図である。 10……脱ブロッキングおよび精製のための自動化装置、
12……温度制御された反応塔、14……ヘリウム原、16…
…パッキング、18……試薬マニホールド、20,22……分
離弁、24,26……廃物ライン、28……廃物弁、30A,30B,3
0C,30D,30E,30F,30G,30Hおよび30K……供給容器。

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】縮合のための共通の官能基を有する複数の
    ヌクレオチドからポリヌクレオチドを製造する方法であ
    って、（１）該ポリヌクレオチドを末端がブロックされ
    たヌクレオチドの順次的付加により製造し、前記ヌクレ
    オチドは保護基に結合した１または２以上の官能基を有
    し、その間伸長するポリヌクレオチド鎖は支持体に結合
    されており、（２）次いで末端ブロッキング基を除去し
    かつ次のヌクレオチドを付加し、（３）最後のヌクレオ
    チドの付加後、末端ブロッキング基および存在する場合
    保護基を除去し、そしてポリヌクレオチドを支持体から
    除去することを含む方法において、 各順次的付加の前に、ブロッキングされていない末端基
    を選択的に除去可能なキャッピング基でキャッピング
    し、 最後のヌクレオチドの付加後、キャッピング基および酵
    素加水分解妨害性保護基を除去し、そして 末端ブロッキング基の除去前に、末端ブロッキング基を
    欠くポリヌクレオチドを酵素的に加水分解する、ことを
    特徴とする方法。
  2. 【請求項２】前記除去の間、前記支持体に対して結合を
    保持する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】前記ヌクレオチドがホスホルアミダイトで
    ある特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】前記ヌクレオチドがホスフェートエステル
    である特許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】末端ヒドロキシがブロックされたホスホル
    アミダイトまたはホスフェートを使用し、末端がブロッ
    クされたＯ−およびＮ−保護ヌクレオチドの順次的付加
    によりポリヌクレオチドを製造し、ここで伸長するポリ
    ヌクレオチドは選択的に切離し可能な結合を介して支持
    体に結合されており、そして最後のヌクレオチドの付加
    後、末端ブロッキング基および保護基を除去し、そして
    ポリヌクレオチドを支持体から切離すことを含んでなる
    ポリヌクレオチドを製造する方法において、 末端ブロッキング基を保持している間に選択的に除去可
    能な基を保護基として使用し、 各順次的付加の前に、末端ブロッキング基を保持してい
    る間に、選択的に除去可能なキャッピング基でブロック
    されていない末端基をキャッピングし、 最後のヌクレオチドの付加後、末端ブロッキング基を保
    持しながら、キャッピング基および酵素加水分解妨害性
    保護基を除去し、そして 末端ブロッキング基の除去前に、末端ブロッキング基を
    欠くポリヌクレオチドを酵素的に加水分解する、ことを
    特徴とする方法。
  6. 【請求項６】前記除去の間、前記支持体に対して結合を
    保持する特許請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】前記Ｏ−保護基がアルキルまたは置換アル
    キルであり、そしてＮ−保護基がアミノメチレンである
    特許請求の範囲第５項記載の方法。
  8. 【請求項８】前記キャッピング基がレブニリルである特
    許請求の範囲第５項記載の方法。
  9. 【請求項９】前記末端ブロッキング基がトリチル基であ
    る特許請求の範囲第５項記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記Ｎ−保護基をヒドラジンで除去する
    特許請求の範囲第７項記載の方法。
  11. 【請求項１１】アデノシンおよびグアノシンがジイソブ
    チルアミノメチレンであるＮ−保護基を有する特許請求
    の範囲第５項記載の方法。
  12. 【請求項１２】シトシンが保護ベンゾイルまたは置換ベ
    ンゾイル基を有する特許請求の範囲第５項記載の方法。
  13. 【請求項１３】最後のヌクレオチドの付加後であるが、
    存在する場合キャッピング基の除去の前に、前記末端ブ
    ロッキング基を酸安定性、塩基不安定性ブロッキング基
    で置換する追加の工程を含む特許請求の範囲第５項記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】酸安定性、塩基不安定性基がカルボキシ
    レートである特許請求の範囲第13項記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記酸安定性、塩基不安定性基がホスフ
    ェートである特許請求の範囲第13項記載の方法。
  16. 【請求項１６】次の工程： 前もって決定した配列において、（１）カルボン酸エス
    テル結合を介して支持体へ接合しかつ（２）遊離末端ヒ
    ドロキシル基を有する伸長するヌクレオチドに、Ｏ−ブ
    ロックされたヌクレオシジルホスホルアミダイトを順次
    に付加してホスファイトトリエステルを形成し、前記ホ
    スファイトトリエステルをホスフェートエステルに酸化
    し、そして遊離ヒドロキシル基を活性化カルボン酸と反
    応させてカルボキシレートエステルを形成することによ
    り、目的とするヌクレオチドが導入されなかったポリヌ
    クレオチド配列をキャッピングし、 Ｏ−ブロッキング基を除去し、そして末端ヌクレオシジ
    ルホスホルアミダイトの付加まで、上の工程を反復し、 ホスフェートエステル保護基を除去し、 アミン保護基およびキャッピング基を除去し、そして ポリヌクレオチド鎖を支持体から除去することを含んで
    なるポリヌクレオチドを製造する方法において、 ヌクオシジルホスホルアミダイトとして、保護されたア
    デノシンおよびグアノシン（ここで環の外にあるアミン
    はN,N−二置換アミノメチレン置換されてホルムアミジ
    ンを形成する）、並びに保護されたシトシン（ここで前
    記環の外にあるアミンはアロイル基で置換されてアミド
    を形成する）を使用し、 ヒドラジンと共に５員ないし６員環の環を形成すること
    ができるオキソ置換脂肪族カルボン酸でキャッピング
    し、 アミン保護基およびキャッピング基をヒドラジンで除去
    し、そして 末端Ｏ−ブロッキング基の除去前に、目的とするヌクレ
    オチドが導入されなかったポリヌクレオチド配列をホス
    ホジエステラーゼで消化する、 ことを特徴とする方法。
  17. 【請求項１７】前記N,N−二置換アミノメチレンがN,N−
    ジアルキルである特許請求の範囲第16項記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記アロイル基がベンゾイルである特許
    請求の範囲第16項記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記キャッピング基がレブリネートであ
    る特許請求の範囲第16項記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記ヒドラジンをピリジニウム塩を含有
    するピリジン溶媒中で使用する特許請求の範囲第16項記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】次の工程： ホスフェートエステルの除去前であってかつ末端ヌクレ
    オシジルホスホルアミダイトの付加前に（ここでＯ−ブ
    ロッキング基はトリチル基である） 前記トリチル基をおだやかな酸性条件下に除去し、そし
    て ブロッキングされないヒドロキシルを第三アミンまたは
    ホスホリル化剤の存在下に無水アロイルと反応させるこ
    とにより再ブロッキングする、 ことを含む特許請求の範囲第16項記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記ホスホリル化剤がO,O′−ジシアノ
    エチルホスホルアミダイトであり、次いでホスフェート
    への酸化を実施する特許請求の範囲第16項記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記末端ヌクレオシジルホスホルアミダ
    イトがベンゾエートまたはホスフェートでブロッキング
    されたヌクレオシジルホスホルアミダイトである特許請
    求の範囲第16項記載の方法。
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