JPH0829095B2 - バチルス スリンギエンシス 結晶タンパク質遺伝子毒素セグメント - Google Patents

バチルス スリンギエンシス 結晶タンパク質遺伝子毒素セグメント

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JPH0829095B2 JP60503998A JP50399885A JPH0829095B2 JP H0829095 B2 JPH0829095 B2 JP H0829095B2 JP 60503998 A JP60503998 A JP 60503998A JP 50399885 A JP50399885 A JP 50399885A JP H0829095 B2 JPH0829095 B2 JP H0829095B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は一般的には遺伝子工学的処理を受けた宿主生
物において発見できるDNA配列に関する。具体的には本
発明はバチルス スリンギエンシス（Bacillus thuringie
nsis）結晶タンパク質の毒素部分をコードする発現可能
なDNAフラグメントに関する。
〔背景技術〕
よく知られているごとく、バチルス スリンギエンシス
結晶タンパク質は多くの鱗翅類の昆虫の幼虫に有毒であ
る。そのためバチルス スリンギエンシス結晶を含む調製
試料は非常に選択的な生物的殺虫剤として商業的に使用
されている。不幸な事に、比較的高い製造コストおよび
結晶の使用に関した問題点のため、殺虫剤として他の市
販の製品と実際上競合するのは困難である。
バチルス スリンギエンシスの野生株は胞子分裂の間の
み結晶タンパク質を産生する。そのような増殖期制限
は、特に工業過程において不都合であり製造に過度の時
間が必要とされる。この点はもちろん最終的な結晶タン
パク質殺虫剤製品のコストを増大させている。
バチルス スリンギエンシス野生株の増殖期制限を克服
するため、シュネフ（Schnepf）およびホワイトレイ（W
hiteley）により1984年５月15日および1984年８月21日
に各々公開された米国特許4,448,885号および4,467,036
号には、結晶タンパク質前毒素ポリペプチドをコードす
る発現可能な異種構造DNAを含む新規組換え体プラスミ
ドの使用によるバチルス スリンギエンシス結晶タンパク
質の発現について記載されている。シュネフ／ホワイト
レイの特許はまた遺伝子工学により処理された細菌宿主
株（新規組換え体プラスミドにより形質転換された）が
バチルス スリンギエンシス結晶タンパク質前毒素ポリペ
プチドを発現する事を記載している。そのような遺伝子
工学処理をうけた細菌宿主株は増殖の全ての段階におい
てバチルス スリンギエンシス結晶タンパク質前毒素ポリ
ペプチドを発現する。
現在、鱗翅類毒素を合成するバチルス スリンギエンシ
ス亜種において、結晶タンパク質結晶はMr＝135,000か
ら160,000の一つまたはそれ以上の前毒素ポリペプチド
から構成されている事が知られている（カラブレーズ
〔Calabrese〕ら、1980;チレル〔Tyrell〕ら、1981）。
イン ビトロでの溶解および結晶のタンパク質分解およ
び多分昆虫の中腸においても、各々の前毒素分子からMr
＝55,00−72,000の毒素ペプチドが生じる（ブラ〔Bull
a〕ら、1979;リレイ〔Lilley〕ら、1980;チエスツキナ
〔Chestukhina〕ら、1982〕。
結晶タンパク質前毒素ポリペプチドは毒素フラグメン
トの約２倍の大きさであるので、もしより大きな前毒素
ポリペプチドよりむしろより小さい毒素フラグメントを
含んでいるとすれば投与量当り２倍有効な（または半分
の投与量で同程度に有効な）前毒素結晶を含む殺虫剤試
料を作製できる。さらに、もし遺伝子工学による宿主株
を前毒素ポリペプチドよりむしろ毒素フラグメントを発
現するように形質転換できれば、宿主による生成量を増
加せしめる事ができ、おそらく２倍に上昇させることも
可能であろう。その為には毒素フラグメントをコードす
るバチルス スリンギエンシス結晶タンパク質遺伝子の特
定のセグメントを同定する事が有用であろう。そのよう
なDNAセグメントが宿主生物で発現できる事および得ら
れるタンパク質生成物が鱗翅類昆虫に有毒である事を示
す事も役立つであろう。
目的 鱗翅類昆虫に有毒な結晶タンパク質の一部をコードす
るバチルス スリンギエンシス結晶タンパク質遺伝子のセ
グメント（本明細書では以後“毒素−コード”セグメン
トと称する）を同定するのが本発明の一つの目的であ
る。
バチルス スリンギエンシス結晶タンパク質遺伝子の
“毒素コード”セグメントのDNA配列を決定するのが本
発明の更なる目的である。
バチルス スリンギエンシス結晶タンパク質“毒素−コ
ード”遺伝子セグメント形質転換された組換え体宿主生
物で発現可能である事を示すのも本発明の更なる目的で
ある。
バチルス スリンギエンシス結晶タンパク質“毒素−コ
ード”遺伝子セグメントを発現するように形質転換され
た組換え体宿主により産生されるタンパク質生成物が鱗
翅類昆虫に有毒である事を示すのも本発明の更なる目的
である。
本発明の他の目的は当業者には以下の記載および図か
ら明らかになるであろう。
図 図の一般的な説明 第１図（図ＡおよびＢ）はバチルス スリンギエンシス
結晶タンパク質遺伝子の制限酵素地図および配列決定方
法を示しており； 第２図（図ＡおよびＢ）はバチルス スリンギエンシス
結晶タンパク質遺伝子のDNA配列を示しており； 第３図（図ＡおよびＢ）はpHES1の制限地図およびpHE
S16の構成を示しており； 第４図（図Ａ−Ｅ）はpHES16中の結晶タンパク質の
３′−末端欠失物の構成方法を示しており； 第５図（図Ａ−Ｃ）は結晶タンパク質遺伝子がlacプ
ロモーターに融合されたプラスミドの構成を示してお
り； 第６図（図Ａ−Ｃ）は結晶タンパク質遺伝子の３′−
末端欠失物を示しており；および 第７図（図Ａ−Ｃ）はlacＺの結晶タンパク質遺伝子
および３′および／または５′末端を修飾した結晶タン
パク質遺伝子への転写的および翻訳的融合を示してい
る。
図の詳細な説明 第1A図はpES1の制限酵素地図であり、配列決定された
プラスミドの一部（箱型のセグメント）、結晶タンパク
質転写の長さおよび方向（矢印）、およびS1ヌクレアー
ゼ地図作製プローブとして使用されたサブクローン化制
限フラグメントの一部（括弧の線）を示している。太線
はベクター（pBR322）配列を表わす。
第1B図は結晶タンパク質遺伝子の約2800bpの制限酵素
地図および配列決定方法を示している。最初の1500bpの
配列はすでに報告されており（ウオング〔Wong〕ら、19
83）矢印は示された部位からの配列決定の長さおよび方
向を示している。
第2Aおよび2B図は結晶タンパク質遺伝子のDNA配列を
示しており、５′および３′に接している配列も少し含
んでいる。バチルス スリンギエンシス（BtIおよびBtI
I）および大腸菌（Escherichia coli）（Ec）における
転写の開始部位が演繹的に推定された全アミノ酸配列と
ともに示されている。第2A図にはヌクレオチド１から22
00および対応するコドン１から558が含まれている。第2
B図にはヌクレオチド2201から4222および対応するコド
ン559から1176が含まれている。
ヌクレオチド4053から4055はコドン1176を占めこのコ
ドンはバチルス スリンギエンシス結晶タンパク質中のカ
ルボキシ末端アミノ酸をコードしている。ヌクレオチド
4140から4185はこの遺伝子の転写ターミネーターであ
る。
第3A図は単一のSalＩ部位で直線化したpES1の制限酵
素地図を示している。XmnＩに対する部分地図が示され
ており（実線）、HindIII、PvuIIおよびHdeＩに対して
は完全地図が示してある。結晶タンパク質遺伝子の位置
は点線の箱で示してあり、矢印は転写の方向を示してい
る。
第3B図はpES1の制限酵素地図であり、Tn5挿入B8（ス
テム アンド ループ構造）の位置、結晶タンパク質遺
伝子の位置（太線）、転写の方向（矢印）、およびpBR3
22ベクター配列の位置（箱型部分）が示してある。Xho
Ｉ−HindIIIフラグメントをpHES16の構成に使用してお
り（斜行平行線の陰影を付けた線）、プラスミド中にお
けるその位置を示してある。
第4A図は結晶タンパク質遺伝子（太線）および３′に
接した配列を含むpES1のセグメントの拡大制限酵素地図
である。HindIIIEフラグメント中のTn5挿入物の位置は
矢印で示してある。
第4B図は示した方向でSmaＩ部位へクローン化したpES
1のPvuIICフラグメント含有バクテリオフアージM13mp8
からのpES1のHindIIIEフラグメント中の３′−近接部分
欠失物を得るための方法を示している。
第4C図はHindIIIEフラグメント中にTn5挿入物を含むp
ES1の欠失物の構成の方法を示している。
第4D図はpHES16中の結晶タンパク質遺伝子セグメント
をpES1のHindIIIEフラグメントの欠失終点まで伸ばすた
めに使用する方法を例示している。M13フアージまたはT
n5挿入物変異体から誘導されるプラスミドはつながつた
矢印上に示してある。丸括弧に入れて示してあるpHES38
はXmnＩフラグメント５含有フアージから、示した方法
で作製され（第3A図）更なる欠失を必要としない。
第4E図はpHES35の欠失誘導体（pHES37,39,40）の作製
に使用される方法を例示している（pEHS35の構成の為の
第4D図を参照されたい）。
第5A図はlacプロモーターの結晶タンパク質遺伝子へ
の転写的融合を示している。SalＩにより直線化したpES
1の地図が提出されており、結晶タンパク質遺伝子の位
置（太線）および転写の方向（矢印）が示されている。
ベクター配列は箱型にしてある。lacプロモーターの位
置および転写の方向はＰおよび矢印で示してある。lac
アルフアー相補セグメントの位置はギリシヤ文字アルフ
アの記号で示してある。
第5B図は結晶タンパク質遺伝子の10番目および50番目
のコドンへのlac Z遺伝子の翻訳的融合を示している。
結晶タンパク質遺伝子の位置および方向を示しているpE
S1の地図が示してある。pHES44および45で使用したXmn
Ｉ（部分）／XhoＩ（完全）消化フラグメントもまた線
で示してある。これらの構成の詳細な説明は後述の材料
および方法の節に見る事ができる。
第5C図は結晶タンパク質遺伝子の先端を切つたTn5挿
入突然変異体の10番目および50番目のコドンへのlac Z
遺伝子の翻訳的融合を示している。pES1−B22およびpES
1−B22−１、そのXhoＩ欠失誘導体の各地図が示してあ
る。pHES46および47の作製に使用するXmnＩ（部分）／X
hoＩ（完全）消化フラグメントが地図の下に線で示して
ある。
第6A図は結晶タンパク質遺伝子領域の拡大地図を伴つ
たpES1の制限酵素地図である。結晶タンパク質遺伝子
（太線）、その転写方向（矢印）およびpBR322ベクター
配列（箱型にした線）が示してある。示したプラスミド
中に残存する結晶タンパク質遺伝子の部分が制限酵素地
図の下に線で表示されている。これらの線の箱型部分の
セグメントはTn5配列を示している。これらのプラスミ
ドを含む大腸菌の毒性試験の結果もまた示してある。
第6B図は、以下のプラスミドを運ぶ大腸菌の抽出液の
イムノブロツトを示している：レーン１、pES1−B8;2,p
HES19;3,pHES32;4,pHES23;5,pHES25;6,pHES33;7,pHES3
0;8,pHES16;9,pHES31（pHES32のHindIII挿入物を逆の方
向で含んでいる）;10,pHES322。レーン１は１マイクロ
リツトルの抽出液を含み；レーン２−10は20マイクロリ
ツトルの抽出液を含んでいる。
第6C図は以下のプラスミドを運ぶ大腸菌の抽出液のイ
ムノブロツトを示している：レーン1,pES1−B8;2,pHES3
4;3,pHES35;4,pHES36;5,pHES37;6,pHES38;7,pHES39;8,p
HES40。レーン１は１マイクロリツトルの抽出液を含
み；レーン２−８は20マイクロリツトルの抽出液を含ん
でいる。
第7A図は結晶タンパク質遺伝子領域の拡大地図を伴つ
たpES1の制限酵素地図である。結晶タンパク質遺伝子
（太線）、その転写の方向（矢印）およびpBR322ベクタ
ー配列（箱型の線）が示されている。表示されたプラス
ミド中に残存する結晶タンパク質遺伝子の量を示す線が
制限酵素地図の下に示されている。欠失プラスミドにお
いて、左端の箱はlacＺへの翻訳的融合を示し；右端の
箱はTn5配列を示している。右端の太い破線はlacアルフ
アーペプチド配列を示し、右端の中断のない太線は最後
の74コドンおよび結晶タンパク質遺伝子の転写ターミネ
ーターを示している。これらのプラスミドを含む大腸菌
の毒性試験の結果もまた示してある。
第7B図は以下のプラスミドを運ぶ大腸菌のイムノブロ
ツトを示している：レーン1,pHES41;2,pHES44;3,pHES4
5;4,pHES43;5,pHES46;6,pHES47。レーン１−３は５マイ
クロリツトルの抽出液を含み；レーン４−６は10マイク
ロリツトルの抽出液を含む。
図7Cは以下のプラスミドを運ぶ大腸菌のイムノブロツ
トを示している：レーン1,pHES43;2,pHES50,3,pHES48;
5,pHES49;6,pHES52;7,pBRS322。各々のレーンは20マイ
クロリツトルの抽出液を含んでいる。
参考文献 本発明は以下の報文を引用している： 1.アウエルスバルト（Auerswald）、E.−A.,ルドヴイツ
ヒ（Ludwig）、Ｇ、およびシヤラー（Schaller）、H.
（1981）コールド スプリング ハーバー シンポジウ
ム クアンテイタテイブ バイロオジー（Cold Spring
Harbor Symp Quant．Biol.）45,107−114。
2.ベルグ（Berg）、D.E.およびベルグ（Berg）、C.M.
（1983）、ハ゛イオテクノロシ゛-（Biotechnol.）、1,417−435。
3.バーンボイム（Birnboim）,H.C.およびドーリー（Dol
y）J.（1979），ヌクレイツク アシツズ リサーチ（N
ud．Acids．Res.）,7,1513−1523。
4.ボリバー（Bolivar）,F,ロドリゲス（Rodriguez）,R.
L.,グリーネ（Greene）,P.S.,ベトラツハ（Betlach）,
M.C.,ハイネツカー（Heynecker）,H.L.,ボイヤー（Boye
r）,H.W.,クロサ（Crosa）,J.H.およびフアルコー（Fal
kow）,S.（1977），ジーン,2,95−113。
5.ブツラ（Bulla）,L.A.,Jr,ダビツトソン（Davidso
n）,L.I.クレーマー（Kramer）,K.J.およびジヨーンズ
（Jones）,B.E.（1979）バイオケミカ バイオフイジカ
リサーチ コミユニケーシヨン（Biochem．Biophy．R
es．Comm．）,91,1123−1130。
6.ブツラ（Bulla）,L.A.クレーマー（Kramer）,K.J.,コ
ツクス（Cox）,D.J.,ジヨーンズ（Jones）,B.L.,ダビツ
ドソン（Davidson）,L.I.およびルツクハート（Lookhar
t）,G.L.（1981），ジヤーナル オブ バイオロジカル
ケミストリ-（J．Biol．Chem．）,256,3000−3004。
7.カラブレース（Calabrese）,D.M.,ニツカーソン（Nic
kerson）,K.W.およびレーン（Lane）,L.C.（1980）カナ
デイアン ジヤーナル オブ マイクロバイオロジー
（Can．J．Microbiol．）26,1006−1010。
8.チエスツキナ（Chestukhina）,G.G.,コスチナ（Kosti
na）,L.I.ミクハイロバ（Mikhailova）,A.L.,チウリン
（Tyurin）,S.A,クレピコード（Klepikova）,F.S.およ
びステフアノフ（Stepanov）,V.M（1982），アルキーブ
ス オブ マイクロバイオロジー（Arch．Microbiol）1
32,159−162。
9.クート（Court）,D.ハング（Huang）,T.Fおよびオツ
ペンハイム（Oppenheim）,A.B.（1983），ジヤーナル
オブ モレキユラー バイオロジー（J.Mol.Biol）,16
6,233−240。
10.ダルメージ（Dulmage）,H.T.クーペラトール（Coope
rators）（1980），マイクロバイアル コントロール
オブペスツ アンド プラント デイジージーズ（Micr
obial Control of Pests and Plant Diseases）1
970−1980（ブルゲス〔Burges〕,H.D.編集）pp.193−22
2,アカデミツクプレス，ロンドン。
11.フオウラー（Fowler）,A.V.およびザービン（Zabi
n）,I.（1983），ジヤーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー,258,14354−14358。
12.ゴールドフアーブ（Goldfarb）,D.S.ロドリゲス（Ro
driguez）,R.L.およびドイ（Doi）,R.H.（1982），プロ
シーデイング オブ ザ ナシヨナル アカデミーオブ
サイエンス（Proc．Nat．Acad．Sci）USA,79,5886−5
890。
13.グレイ（Gray）,O.およびチヤン（Chang）,S.（198
1）ジヤーナル オブ ハ゛クテリオロシ゛- （J．Bacteriol）,14
5,422−428。
14.ヘルド（Held）,G.A.,ブツラ（Bulla）,L.A.フエラ
ーリ（Ferrari）,E.,ホツホ（Hoch）,J.,アロンソン（A
ronson）,A.I.およびミニツヒ（Minnich）,S.A（1982）
プロシーデイング オブ ザ ナシヨナル アカデミー
オブ サイエンス USA,79,6065−6069。
15.ホルメス（Holmes）,W.M.,プラツト（Platt）,T.お
よびローゼンベルグ（Rosenberg）,M.（1983），セル
（Cell）,32,1029−1032。
16.ホング（Hong）,G.F.（1982），ジヤーナル オブ
モレキユラー バイオロジー,158,539−549。
17.ヒユーバー（Huber）,H.E.,およびルシー（Luthy）,
P.（1981），パソロゲネシス オブ インバーテブレー
ト マイクロバイアル デイジージーズ（Pathogenesis
of Invertebrate Microbial Diseases）（ダヴイツ
ドソン〔Davidson〕,E.W.編集）pp209−234,アランヘル
ド（Allanheld），オスマン（Osmun）会社，トトワ（To
towa）,NJ。
18.ヒユーバー（Huber）,H.E.,ルシー（Luthy）,P.,エ
ーベルソルド（Ebersold）,H.R.およびコルデエール（C
ordier）,J.−L.（1981a）アルキーブ オブ マイクロ
バイオロジー,129,14−18。
19.クリエール（Klier）,A.,フアルゲツテ（Fargett
e）,F.,リビエール（Ribier）,J.およびラポポルト（Ra
poport）,G.（1982），EMBO J,７・791−799。
20.クリエール（Klier）,A.,レカデツド（Lecadet）,M.
−M.およびラポポルト（Rapoport）,G.（1978），イン
スポアズ（In Spores）VII（チヤムブリス〔Chamblis
s〕,G,およびバリー〔Vary〕,J,C.,編集）,pp.205−212
アメリカ微生物学会，ワシントン,D.C. 21.クリエール（Klier）,L,A.,パルソツト（Parsot）,
C.およびラポポルト（Rapoport）,G.（1983），ヌクレ
イツク アシツズ リサーチ,11,3973−3987。
22.クロンスタツド（Kronstad）,J.W.シユネフ（Schnep
f）,H.E.およびホワイトレイ（Whiteley）,H.R.（198
3），ジヤーナル オブ バクテリオロジー,154,419−4
28。
23.リレイ（Lilley）,M.,ルツフエル（Ruffell）,R.W.
およびソマービール（Somerville）,H.J.（1980），ジ
ヤーナル オブ ゼネラル マイクロバイオロジー
（J．Gen．Microbiol）,118,1−11。
24.マンデル（Mandel）,M.およびハイガ（Higa）,A.（1
970）ジヤーナル オブ モレキユラー バイオロジー,
53,159−162。
25.マニアチス（Maniatis）,T.,フリツチユ（Fritsc
h）,E.F.およびサムブルツク（Sambrook）,J.（198
2），モレキユラー クローニング（Molecular Clonin
g），ラボラトリーマニアル（Laboratory Manual），コ
ールド スプリングハーバー。
26.メツシング（Messing）,J.,クレア（Crea）,R.およ
びシーブルグ（Seeburg）,P.H.（1981），ヌクレイツク
アシツズ リサーチ,9,309−321。
27.メツシング（Messing）,J.およびビエイラ（Vieir
a）,J.（1982），ジーン,19,269−276。
28.ニコル（Nicoll）,D.Ph.D.課題、ワシントン大学、
シアトル、ワシントン（1983）。
29.ペテイツト−グラトロン（Petit−Glatron）,M.−F.
およびラポポルト（Rapoport）,G.（1975）スポアズ V
I（ゲルハルト〔Gerhardt〕,P.,コスチロー〔Costilo
w〕,R.N.およびサドフ〔Sadoff〕,H.L.,編集）,pp.255
−264,アメリカ微生物学会、ワシントン、D.C. 30.ポリスキー（Polisky）,B.,グリーネ（Greene）,P.,
ガルフイン（Garfiu）,D.E.,マツカーシー（McCarth
y）,B.J.,グツドマン（Goodman）,H.M.およびボイヤー
（Boyer）,H.W.（1975）プロシーデイング オブ ザ
ナシヨナル アカデミー オブ サイエンス USA,72,3
310−3314。
31.サンガー（Sanger）,F.,ニツクレン（Nicklen）,S.
およびクールソン（Coulson）,A.R.（1977），プロシー
デイング オブ ザ ナシヨナル アカデミー オブ
サイエンス USA,74,5463−5467。
32.シエツサー（Schesser）,J.H.,クレーマー（Krame
r）,K.J.およびブツラ（Bulla）,L.A.,Jr.（1977）アプ
ライド アンド エンバイロメンタル マイクロバイオ
ロジー（Appl．Environ．Microbiol．）,33,878−880。
33.シユネフ（Schnepf）,H.E.,およびホワイトレイ（Wh
iteley）,H.R.（1981），プロシーデイング オブ ザ
ナシヨナル アカデキー オブ サイエンス USA,7
8,2893−2897。
34.サトクリフ（Sutcliff）,J.G.（1979）コールド ス
プリング ハーバー シンポジウム クオンテイタテイ
ブバイオロジー,43,77−90。
35.トラボニ（Traboni）,C.,コルテーズ（Cortese）,
R.,チリベルト（Ciliberto）,G.およびチエザレリ（Ces
areni）,G.（1983），ヌクレイツク アシツズ リサー
チ,11,4229−4239。
36.チレル（Tyrell）,D.J.,ブツラ（Bulla）,L.A.,アン
ドリユーズ（Andrews）,R.E.,クレーマー（Kramer）,K.
J.,ダビツトソン（Davidson）,L.I.およびノルデイン
（Nordin）,P.（1981），ジヤーナル オブ バクテリ
オロジー,145,1051−1062。
37.ビエイラ（Vieira）,J.およびメツシング（Messin
g）,J.（1982），ジーン,19,259−268。
38.ホン ガバイン（von Gabain）,A.,ベラスコ（Belas
co）,J.G.,シヨツテル（Schottel）,J.L.,チヤン（Chan
g）,A.C.Y.およびコーエン（Cohen）,S.N.（1983），プ
ロシーデイング オブ ザ ナシヨナル アカデミー
オブ サイエンス USA,80,653−657。
39.ホワイトレイ（Whiteley）,H.R.,クロンスタツド（K
ronstad）,J.W.,シユネフ（Schnepf）,H.E,およびデス
ロジール（DesRosier）,J.P.,モレキユラー クローニ
ング アンド ジーン レギユレーシヨン インバチリ
（Molecular Cloning and Gene Regulation in B
acilli）（A.T.ガネサン〔Ganesan〕,S.チヤン〔Chan
g〕およびJ.A.ホツホ〔Hoch〕，編集）アカデミツク
プレス、ニユーヨーク（1982）pp131−144。
40.ウオン（Wang）,H.C.,シユネフ（Schnepf）,H.E.お
よびホワイトレイ（Whiteley）,H.R.,（1983），ジヤー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー、258,1960
−1967。
定義 本明細書および請求の範囲で使用するために特別に定
義される術語および句は次のとおりである： 本明細書で使用する文字Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇは各々DNA中
のヌクレオチドのアデニン、チミン、シトシンおよびグ
アニンを意味する。
本明細書で使用するbpは塩基対を意味する。
本明細書で使用する実質的な配列相同性とは互いに実
質的に機能が等しいヌクレオチド配列を意味する。実質
的な配列相同性を持つそのような配列間のヌクレオチド
の違いは、そのような配列によりコードされる遺伝子生
成物の機能にほとんど影響しないであろう。
本明細書で使用するアミノ酸の略号は： フエニルアラニン Phe ヒスチジン His ロイシン Leu グルタミン Gln イソロイシン Ile アスパラギン Asn メチオニン Met リジン Lys バリン Val アスパラギン酸 Asp セリン Ser グルタミン酸 Glu プロリン Pro システイン Cys スレオニン Thr トリプトフアン Try アラニン Ala アルギニン Arg チロシン Tyr グリシン Gly である。
本明細書で使用する結晶タンパク質遺伝子とは、鱗翅
類昆虫に有毒なバチルス スリンギエンシス結晶タンパ
ク質ペプチドをコードするDNAセグメントを意味する。
術語“前毒素”とは約Mr＝130,000−160,000の結晶タン
パク質ポリペプチドで分解およびタンパク質分解（イン
ヒ゛トロおよび多分昆虫の中腸においても）によりそれ自
身鱗翅類昆虫に有毒な約Mr55,000−73,000のより小さい
“毒素”フラグメントを生じるものを意味する。句“バ
チルス スリンギエンシス結晶タンパク質遺伝子のアミ
ノ末端55％”とは第2A図および第2B図に示したごとき結
晶タンパク質遺伝子のアミノ末端の645コドンを意味す
る。
本明細書で使用する転写ターミネーターとは転写の停
止を促進するDNA配列を意味する。この術語を第2A図お
よび第2B図に示したようなバチルス スリンギエンシス
結晶タンパク質遺伝子のための転写ターミネーター配列
を記述するために使用した場合は、本術語は4140から41
85の塩基対からなる配列を包含する（第2B図参照）。
本明細書で使用する句“最終74コドン”とは第2A図お
よび第2B図に示したバチルス スリンギエンシス結晶タ
ンパク質遺伝子の最後の74コドンを意味する。より具体
的には、最終74コドンは第2B図に示したごとくコドン11
03から1176のコドン（または3833から4054の塩基対）か
ら成る。
本発明の方法は遺伝子工学および分子クローニングの
技術を使用する。本明細書で使用した遺伝子工学とは核
酸分子（細胞の外部で産生され誘導されたものでもよい
が）をその宿主生物への取り込みが可能になるように細
菌プラスミドまたは他のベタクー系内へ挿入する事によ
り、宿主生物内に天然には存在しないが、複製可能であ
る遺伝する物質の新しい組合せを導く技術を意味する。
これらの遺伝する物質の新しい組合せを運ぶ宿主生物を
本明細書では組換え体宿主生物と称する。遺伝子工学お
よび分子クローニングの一般的技術はマニアチスらによ
るモレキユラー クローニング：アラボラトリー マニ
ユアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー（19
82）に記載されている。
〔発明の開示〕
発明の要約 本発明は鱗翅類昆虫に有毒なバチルス スリンギエン
シス結晶タンパク質ペプチドの一部をコードするDNAフ
ラグメントに関する。本発明はまた明らかにされた毒素
をコードするDNAフラグメントのためのDNAおよびアミノ
酸配列に関する。さらに本発明は、明らかにされた毒素
コードDNAフラグメント（本明細書ではバチルス スリ
ンギエンシス結晶タンパク質遺伝子毒素セグメントと称
する）が組換え体宿主生物中で発現可能であり、形質転
換された宿主により産生される“毒素”タンパク質産生
物が鱗翅類昆虫に有毒であるを示している。
発明の詳細な説明 多くのバチルス スリンギエンシスの亜種が鱗翅類昆
虫に有毒な結晶タンパク質を産生する事は知られてい
る。これらの結晶タンパク質は結晶タンパク質遺伝子に
よりコードされており、（シユネフおよびホワイトレ
イ、1981;クロンスタツドら、1983;ヘルド、1982）それ
は亜種により、ラージプラスミドおよび／または染色体
上に位置している（クロンスタツドら、1983;ヘルド
ら、1982;クリエールら、1982;シユネフおよびホワイト
レイ、1981）。
バチルス スリンギエンシス、亜種クルスタキHD−１
−Dipelから結晶タンパク質遺伝子がクローン化され、
この株においては遺伝子はラージプラスミド上に位置し
ている事が示された。米国特許第4,467,036号を参照さ
れたい。さらに、亜種クルスタキ HD−１−Dipelから
の結晶タンパク質遺伝子は数種のバチルス スリンギエ
ンシス株の１つまたはそれ以上のプラスミド上の（およ
び一つの場合には染色体の）結晶タンパク質遺伝子と相
同である事を示した。米国特許第4,467,036号を参照；
またクロンスタツドら（1983）も参照されたい。
以前の報告においてバチルス スリンギエンシス 亜
種クルスタキ HP−１−Dipelからクローン化された遺
伝子の転写および翻訳開始部位および約1/4のヌクレオ
チド配列が報告されている（ウオンら1983）。しかしな
がらどの部分が結晶タンパク質の“毒素”部分をコード
する結晶タンパク質遺伝子であるかを決定するには上記
の部分配列以上のものが必要であり、遺伝子の残りのDN
A配列を決定した。
第１図に配列決定方法を示した；後術の材料および方
法の節も参照されたい。第2A図および第2B図にDNA配列
が示してあり、DNA配列の開放読み取り枠のみから演繹
的に推定したアミノ酸も示してある。この配列は以前化
学的方法により決定されている（ウオンら、1983）NH2
−末端配列を含んでいる。
1176のアミノ酸をコードする明らかにされたDNA配列
は、133,500の計算分子量のポリペプチドを特定する。
実施例Ｉで議論されるごとく、結晶タンパク質前毒素ペ
プチドに対するこの値は、バチルス スリンギエンシス
亜種クルスタキおよび亜種スリンギエンシスからの前
毒素に対して決定された分子量と一致する。さらに、推
定されたアミノ酸組成はバチルス スリンギエンシス亜
種クルスタキの全結晶または精製前毒素の化学的に決定
されたアミノ酸組成と非常に類似している（表１参
照）。
バチルス スリンギエンシス結晶タンパク質前毒素は
切断でき、より小さい毒素フラグメントが得られる事が
知られているので、結晶タンパク質の欠失および融合物
を持つた組換え体大腸菌株を創造し、毒素ペプチドをコ
ードする遺伝子の部分の輪郭を描くためそれらが産生す
るタンパク質を分析した。これらの“欠失および融合”
プラスミドの構成については材料および方法の節に議論
されている；また、第３〜７図も参照されたい。これら
のプラスミドにより形質転換された組換え体宿主により
産生された先端を切られたペプチドは実施例IIからＶに
議論されている。
非常に一般的には、“欠失および融合”プラスミドに
より形質転換された宿主株により産生される先端が切れ
たペプチドは、結晶タンパク質遺伝子のアミノ未端の55
％が鱗翅類毒素を産生するのに充分な情報をコードして
いる事を示した。特に“欠失および融合”の結果は、遺
伝子の５′未端から50番目のコドン、または３′未端か
ら603番目のコドンの欠失は毒性を消滅させ、一方５′
未端から10番目のコドン、または３′未端からの645番
目のコドンの欠失は消滅させない。また、結晶タンパク
質遺伝子の３′末端、645から1176のコドンは毒性には
必須ではなく、最初の10コドンは毒性を失う事なくベー
ターガラクトシダーゼのＮ−末端および合成リンカー配
列を含む２つの異つたセグメントにより置き換える事が
できる事を示している。
ここで報告される結晶タンパク質の遺伝子の最も短い
毒性セグメントは約Mr73,000のポリペプチドをコードし
ており；非毒性変異体のための一番遠い欠失終点のもの
は（コドン50から603まで）約Mr63,000のペプチドをコ
ードしている。他の研究報告によれば、結晶タンパク質
の毒性タンパク分解性フラグメントはMr30,000から80,0
00の範囲であり（ビユーバーおよびルシー、1981）、最
も新しい報告はMr55,000から72,000の大きさである事を
示している（ブツラら、1979;リレイら、1980およびチ
エスツキナら、1982）。
分子量標準品、電気泳動系およびバチルス スリンギ
エンシス株の相違で現在の結果とMr67,000から72,000の
毒素フラグメントを報告している研究者の結果の相違が
説明できるがさらに本研究で輪郭を描いたものより短い
遺伝子のセグメントからより小さい毒性フラグメントが
由来する可能性もある。本発明者らの研究および以前の
研究間の主要な相違は従来の研究においては結晶の可溶
化試料からより小さい毒性ペプチドを発生させるために
プロテアーゼを使用していたのに対し、本発明者らは、
改変した遺伝子からの毒素タンパク質の合成に、大腸菌
細胞を使用した点にある事が指摘される。本明細書に示
した結晶タンパク質遺伝子のセグメントにより、より短
い毒性ペプチドがコードされていると仮定すれば、遺伝
子のより短いセグメントが非毒性ペプチドを産生すると
いう本発明者らの発見は方法論におけるこの相違に関係
するかも知れない。遺伝子の最小毒性セグメントの欠失
により毒性コンホメーシヨンの達成に必要な、または残
りのポリペプチドセグメントの“非毒”部分によるタン
パク質の毒性コンホメーションの阻害の防止に必要とさ
れるアミノ酸セグメントが除去されたことも考えられ
る。
しかしながら、本研究の結果は毒性ポリペプチドフラ
グメント上に結晶タンパク質のＮ−末端が存在する事を
示した以前の仕事（チエスツキナら、1982）とかなり一
致している。さらに、３′末端欠失または遺伝子融合を
含む我々の実験は、残基603および645の間にタンパク質
分解に強い感受性があるセグメントが存在し、欠失株に
おいてはＮ−末端の約Mr70,000フラグメントが生成する
事を示している。645番目の残基近くにこの部位が位置
することは、連続的な３′末端欠失物より得られた結果
から推論される。具体的に言えば、結晶タンパク質配列
がコドン645で終結しているプラスミドは、切断部を超
えてポリペプチドの合成を指図しないし、もし指図して
もわずかである。残基645以前にプロセツシング部位が
存在することは、結晶タンパク質遺伝子のコドン645に
続いて同じ読み取り枠内に融合したlac アルフアーペ
プチド配列を持つプラスミドを含む大腸菌の抽出物から
lac アルフアーペプチドが明らかに除去される事より
示唆される。大腸菌JM83またはJM103中のベーターガラ
クトシダーゼ活性を補足するので、lac アルフアーペ
プチドはこのプラスミド中で機能している（データは示
されていない）。
結晶タンパク質の毒性フラグメントに対し、数人の研
究者により異つたＮ−末端アミノ酸が報告されている事
は（リレイら、1980;チエスツキナら、1982）、これら
のフラグメントに存在できるＮ−末端にある程度の柔軟
性が存在できる事を反映している。この事は、毒性をな
くす事なく２つの異つたポリペプチドをコードしている
セグメントによりこの遺伝子の最初の10コドンが置換で
きる事により示される。
本明細書に報告されている結晶タンパク質遺伝子の
５′−末端および３′末端改変物はこれらの配列の新規
配列への融合を含み、そのうちのいくつかは大腸菌中の
改変タンパク質の発現に異常な効果を示した。完全結晶
タンパク質遺伝子が存在する場合、結晶タンパク質の10
番目および50番目のコドンにおける、５′−末端のベー
ターガラクトシダーゼへの融合により、Mr134,000の結
晶タンパク質に加え約Mr110,000の抗原が産生された。
この事は改変コンホメーシヨンが分解に対しより感受性
が高い事を示しているであろう。さらに、２つの異つた
３′−末端欠失物が存在する場合、50番目のコドン融合
は約70,000の（および毒性を有しない）フラグメントを
ほとんどまたは全く生成（プロセツシング）しなかつ
た。しかしながら、この改変遺伝子がコドン645に続い
て結晶タンパク質遺伝子の最終74コドンを持つていれば
少量のMr70,000物質が検出された。この事は、プロセツ
シングおよび毒性の消失は遺伝子の５′末端の改変によ
り生じるコンホメーシヨン変化により生じる事を示唆す
る。50番目のコドン融合は結晶タンパク質の最も広範囲
な疎水性セグメントを破壊する（データは示されていな
い）。５′でのこの改変を含む細菌の毒性の欠除は、タ
ンパク質のこのセグメントは直接毒性に関与するかまた
はこのセグメントの改変がタンパク質の毒性コンホメー
シヨンの達成を妨げている事を示唆している。
10番目のコドンの融合の場合、９つのアミノ酸または
19のアミノ酸のセグメントが毒性を失う事なく置換でき
る。タイトレーシヨン実験からの予備的証拠は、９つの
アミノ酸−置換で10番目のコドン融合物を持つタンパク
質および天然のＮ−末端を含むタンパク質の毒性の差は
もし異つたとしても約３倍以下である。他のタンパク質
についてもＮ−末端置換体は、報告されており、特にベ
ーターガラクトシダーゼ（フオウラーおよびザービン、
1983）、lac アルフアーペプチド（ビエイラおよびメ
ツシング、1982;メツシングおよびビエイラ1982;トラボ
ニら、1983;上記も参照）およびクロラムフエニコール
・アセチル・トランスフエラーゼ（ゴールドフアルブ
ら、1982）である。ベーターガラクトシダーゼ（フアウ
ラーおよびザービン、1983）においては、Ｎ−末端置換
により熱または尿素による変性に対する感受性が増加し
た事が報告されている。
結晶タンパク質遺伝子の最終74コドン（第2B図のコド
ン1103−1176）、即ち分子の毒性部分のセグメント末端
のコドン645への融合は、また明らかな影響をコンホメ
ーシヨンに与える。約Mr70,000の切断生成物が産生され
るが、約Mr50,000のより目立つ切断生成物もまた検出さ
れた。しかしながら結晶タンパク質の最終74残基は、本
タンパク質のアミノ末端領域中の部位を認識して結合で
きる領域を形成する事ができると思われるのでこれは例
外的な場合であろう。もしこの結合が介在するポリペプ
チド配列なしに起こるとすれば、本タンパク質の全体の
コンホメーシヨンが変化し、タンパク質分解に対する感
受性が増加するであろう。
遺伝子発現に対する異つた３′末端の効果の評価にお
ける驚くべき結果は、等しいプロモーター−リボソーム
結合部位立体配置を与えると、結晶タンパク質遺伝子の
コドン645に続く配列源が改変結晶タンパク質合成の程
度に影響を及ぼす事が観察された点である。これらのポ
リペプチドの安定性の相違を検出する事は不可能であつ
て、この発現の相違はmRNAの安定性の相違を反映してい
るのであろうが、翻訳伸長または終結におけるいくつか
の特異な効果を排除する事はできない。遺伝子発現が転
写終結部の近くのRNA構造の改変により部分的に遺伝子
発現が制御されているバクテリオフアージ ラムダint
遺伝子の制御の研究の結果（クールトら、1983）から、
転写ターミネーターはmRNAの安定に影響を及ぼす事によ
り遺伝子発現の制御により全体的な役割を持つているの
ではないかと提案されてきた（ホルムスら、1983）。
pBR322配列で終結する改変結晶タンパク質遺伝子によ
り使用される終結部位はベーターラクタマーゼ遺伝子の
末端である可能性が強く、３つのステム−アンド−ルー
プ構造から成つている。ベーターラクタマーゼ遺伝子の
mRNAは約３分の半減期を持つている（ホン ガバイン
ら、1983）。Tn5に読み込んだ場合転写が終結する部位
は知られていないが、Tn5は転写に対し高度な極性を示
す事が知られている（ベルグおよびベルグ、1983）。本
明細書に記載した結果に基づくと、Tn5の最初の485bp中
に転写ターミネーターが存在する可能性が提案される。
結晶タンパク質遺伝子ターミネーターは非常に好まし
いステム−アンド−ループ構造を持つており、〔デルタ
Ｇ＝−30.4Kcal/mole（データは示されていない）〕、
高水準の発現をさせるように思われる。おそらく、この
構造の安定性は報告されている長い半減期の結晶タンパ
ク質mRNA（ペチツト−グラトロンおよびラポポルト、19
75）および３′−末端にターミネーターを運ぶ株中で検
出される多量の毒性ペプチドと関連している。
本発明のこれらおよび他の実施態様の詳細を以下の実
施例で概説する。そのような実施例はただ例示の目的で
示すのであり、いずれにしても請求の範囲を限定しよう
とするものではない。これらの実施例で使用される材料
および方法は以下に掲げてある。
材料および方法 細菌株、プラスミドおよびフアージ 大腸菌株HB101中のプラスミドpES1〔1984年８月21日
に発行された米国特許第4,467,036号を参照；またシュ
ネフおよびホワイトレイ、（1981）を参照されたい〕が
結晶タンパク質遺伝子DNA源である。M13バクテリオフア
ージ株mp7,mp8およびmp9を大腸菌株JM103で繁殖させる
（メツシングら、1981;メツシングおよびビエイラ、198
2）。大腸菌株CS412〔グレイおよびチヤン、1981）、JM
83およびJM103（ビエイラおよびメツシング、1982）、
プラスミドpBR322（ホリバーら、1977）、pUC8Ap（ビエ
イラおよびメツシング、1982）、pUC13Cmおよびフアー
ジM13mp8（メツシングおよびビエイラ、1982）は各々に
引用した参考文献に記載してある。プラスミドおよび二
重鎖フアージDNAはバーンボイムおよびドリイ（1979）
により記載されたごとくして調製される。フアージDNA
のトランスフエクシヨンはマンデルおよびハイガ（197
0）の方法に従つた。トランスポゾン５（Tn5）突然変異
誘発に使用した方法、およびいくつかのpES1中のTn5挿
入突然変異体の解説はウオンら（1983）により記載され
ている。pES1中のいくつかの付加的なTn5挿入物の位置
は第４図に示してあり；それはウオンら（1983）により
記載されているごとくして決定された。
酵素および放射性標識化合物 制限酵素、T4DNAリガーゼおよびS1ヌクレアーゼはニ
ユーイングランドバイオラボ（New England Biolabs）
またはベセスダリサーチラボラトリーズ（Bethesda Res
earch Laboratories）から購入した。DNAポリメラーゼ
のラージフラグメントおよびすべての32P−標識ヌクレ
オチドはニユーイングランドヌクレアー（New England
Nuclear）から購入した。すべての酵素は供給者により
すすめられたごとくして使用した。
DNA配列決定 M13−誘導フアージを鋳型として用いるサンガーらの
ジデオキシヌクレオチド鎖終結法（1977）をウオンら
（1983）により記載されたごとく、DNA配列決定に使用
した。結晶タンパク質遺伝子の内部PvuIIフラグメント
（塩基1845から3831）の配列決定のための鋳型フアージ
は、ホン（1982）のDNAseI欠失法により得た。さらに、
PvuIIフラグメント中のいくつかのSau3A1部位に隣接す
る配列決定プライマーを得るためにDNAをSauSA1で部分
消化し、BamHIで完全消化する（後者の酵素は配列決定
プライマー部位に隣接するM13mp8のポリリンカー部位の
みを切断する）。完全長以下の大きさのフアージDNAを
精製しDNAリガーゼで再環化する。
DNA配列はD.ニコル博士およびJ.シヤムプ博士（ワシ
ントン大学、微生物学および免疫学科）によりIBMパー
ソナル コンピユーターでの使用のため改良されたコン
ピユータープログラム（ニコル、1983）を使用して翻訳
および分析された。
プラスミドおよびフアージDNAの調製および取扱い プラスミドおよびフアージDNAの調製およびこれらのD
NAの消化および改変には通常の方法を使用した（マニア
チスら、1982）。フアージまたはプラスミドクローンの
欠失物を得るためMn++存在下DNAseIを使用した（ホン、
1982）。
EcoRI*活性はポリンスキーら（1975）により記載された
方法により得た。
イムノブロツテイング大腸菌の全細胞抽出物は以下の
ごとくして調製した:L−ブロスの1mlの培養液を1.5mlエ
ツペンドルフ（Eppendorff）チユーブに入れ30秒遠心分
離し、上澄み液を除去し、ペレツトを30マイクロリツト
ルの0.01Mトリス、0.005MEDTA pH7.0で再懸濁する。50
マイクロリツトルの熱２×試料緩衝液（0.1Mトリス、pH
6.8、２％ドデシル硫酸ナトリウム、２％ベーターメル
カプトエタノール、20％グリセロールおよび0.01％ブロ
モフエノールブルー）を添加し、チユーブを２分間沸騰
水浴に突つ込む。7.2M尿素、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ムおよび２％ベーターメルカプトエタノールを含有する
溶液1/10mlを添加し、試料を30秒間超音波処理し、その
後さらに２分間煮沸する。この調製試料の10から40マイ
クロリツトルを10％ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド
ゲルにのせ、電気泳動にかける（ウオンら、1983）。ゲ
ル中のタンパク質を電気泳動的にニトロセルロースに移
し、シユネフおよびホワイトレイ（1981）により記載さ
れているごとくして抗−結晶抗体および〔125I〕スタフ
イロコツカス アウレウス タンパク質Ａと反応せしめ
る。
昆虫毒性検定 J.トルーマンおよびL.リデフオード両博士（動物学
科、ワシントン大学）から孵化しているタバコすずめが
〔マンドユカ セクスタ（Manduca sexta）〕のいも虫
を得た。150mlの一夜培養液からの細胞を2mlの0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）に入れ、超音波処理する
事により細胞抽出液を調製した。20−50mlの一夜培養液
からの組換え体大腸菌株の細胞懸濁液を0.25から0.3ml
容量に調製する。抽出液（0.2ml）または懸濁液（50マ
イクロリツトル）を寒天を基本にした食物上に拡げ（２
−4ml/バイアル;4.8cm2の面積；シエツサーら、1977を
参照されたい）、放置して乾燥させる。各々のバイアル
に一匹の幼いも虫を置き、５日後の死亡率を決定した。
各々の組換え体株を５連で２ないし４回試験する。陽性
の毒性の記載はすべて５匹の幼虫が５日以内に死亡した
事を示し、陰性の記録は正常の成長および発育を示して
いる。
プラスミドの構成 結晶タンパク質DNA源はpES1（ATC
C31995）またはそのTn5挿入誘導体である。遺伝子の毒
素コード部分の輪郭をはつきりさせるために使用した方
法は、遺伝子の５′部分を含み、タバコすずめがの幼虫
に対し致死的でないベクター（pHES16）を構成する事で
ある。第２の構成においては、結晶タンパク質遺伝子の
隣接セグメント（HindIIIEフラグメント）を添加してpH
ES16を伸ばし、それにより毒性ペプチドをコードする配
列（pHES19）を作製する。Hind IIIEフラグメントのどの部分が毒性活性の３′末端
を含んでいるかを決定するため、HindIII−Ｅの副フラ
グメントを添加してpHES16を伸ばす。毒性ペプチドの
５′端を決定する為、結晶タンパク質遺伝子の10および
50番目のコドンにlacＺアルフア ペプチドを融合す
る。
pHES16−−毒素分析ベクター Bal 31ヌクレアーゼ
による消化および続いての再結合により、pBR322の2065
および2030の位置のPvuIIおよびXmuＩ部位を除去し、pB
R322の欠失物を作製する（サトクリフ、1979）。Tn5部
分および結晶タンパク質の５′部分をその転写および翻
訳開始シグナルとともに含むpES1−B8のXhoＩ−HindIII
フラグメント（第3B図のクロスハツチ線帯）をアガロー
ス ゲル電気泳動およびDE52クロマトグラフイーにより
精製する。このフラグメントを欠失pBR322のHindIIIお
よびSalＩ部位にクローン化してpHES16を得る（第3B
図）。このベクターをHindIIIおよび細菌アルカリ ホ
スフアターゼで消化し、第4D図の破線により示されるご
とく結晶タンパク質遺伝子を３方向に拡張するHindIII
フラグメントを受け入れるために使用する。
pHES19−−pES1のHindIII−Ｆフラグメントの添加に
よるpHES16結晶タンパク質遺伝子の拡張 HindIII Eフ
ラグメント（第3A図）を精製し、pHES16のHindIII部位
に結合する。pHES16中のこのフラグメントの方向は適当
な制限酵素による消化およびイムノブロツテイングによ
り検定される抗原ペプチドの分析により決定される。
pHES32、23、25、33および30−−pHES16結晶タンパク
質遺伝子のHindIII−Ｅフラグメント中のTn5挿入位置へ
の拡張 HindIII−Ｅフラグメント中にTn5を含有する挿
入突然変異体（ウオンら（1983）参照；また第4C図を参
照されたい）を第4C図に示したごとく、XhoＩ消化およ
び再結合により最初に欠失させ、結晶タンパク質遺伝子
の５′末端に最も近いTn5セグメントおよびpES1のHindI
II−Ｄフラグメント中のXhoＩ部位間のDNAを除去する。
得られるpES1のHindIII−Ｅフラグメントの５′−近接
部分を含有するHindIIIフラグメントを精製し、pHES16
のHindIII部位へクローン化する（第4D図）。クローン
化したHindIIIフラグメントの方向は、XhoI−PstI消化
により決定する；方向が正しければこれらプラスミドの
全てに共通のXhoＩ−PstＩフラグメントが得られる。pH
ES31はpHES32と同一の挿入物を含むがその方向は逆にな
つている。
pHES34,35,36および38−−pHES16結晶タンパク質遺伝
子の配列終点までの拡張 pES1のPvuIICフラグメントを
M13mp8のSmaＩ部位へ、結晶タンパク質遺伝子の３′末
端に最も近い末端がフアージのポリリンカー糸のHindII
I部位に最も近くなるような方向でクローン化する（第4
B図）。HindIIIEフラグメントの５′近接部分を含有す
る新規HindIIIフラグメントは欠失を作る事により産生
される すなわち、pHES34のための挿入物は、Mn++の存
在下DNAseIで部分消化し、続いてSalＩで消化し、DNAポ
リメラーゼでふさぎ、再結合する事により得られる。pH
ES35および36に使用する挿入物は、Sau3AIによる部分消
化、続いてBamHIにより消化し、精製および再結合して
産生する。pHES34および36に対しては、欠失の終点の位
置は配列決定により決定した。pHES35終点のSau3AI部位
は制限酵素消化および既知の配列との比較から推定し
た。pHES16内への挿入後、HindIIIフラグメントの方向
はPstＩ消化により決定された：すべての３つのプラス
ミドに共通するフラグメント（ベクター中の部位からmp
8リンカー系からの残存する部位まで拡張するフラグメ
ント）は正しい方向性を示唆する pHES38はXmnＩフラグメントNo.5（第3A図）をM13mp8
のSmaＩ部位へ、結晶タンパク質の３′末端に最も近い
末端がmp8ポリリンカー配列のHindIII部位へ最も近くな
るようにクローニングして産生される。XmnＩ部位の位
置は配列決定により決定された。得られるHindIIIフラ
グメントをpHES16のHindIII部位へ挿入し、その方向は
上に記載したごとく決定した。
pHE37,39および40−−pHES16結晶タンパク質遺伝子の
十分明確にされた終点への拡張 pHES35の構成に使用し
た欠失はmp8ポリリンカー系のBamHI部位を再生しそれは
いくつかの更なる欠失の作製に使用された（第4E図）。
pHES35をBclＩ（HindIIIEフラグメントの５′近接HindI
II部位から243塩基）およびBamHIで消化し、リガーゼ処
理により再環化してpHES37を形成せしめる。pHES39はpH
ES35をEcoRI*活性で部分消化し（ポリスキーら、1975）
続いてBamHIで完全消化し、DNAポリメラーゼＩ−触媒充
てん反応により形成せしめる。正しい大きさの精製フラ
グメントをリガーゼ処理により再環化してpHES39を形成
せしめる。pHES35をSau3AIで部分消化し、BamHIにより
完全消化し、適当な大きさのフラグメントを精製し、リ
ガーゼ処理して再環化しpHES40を産生する。終点の位置
は得られるHindIIIフラグメントの大きさを既知の配列
と比較して決定した。
pHES41、43および50−−lacプロモーター制御される
結晶タンパク質遺伝子 pES1のNdeICフラグメントを精
製（第3A図）;pUC13CmをXbaＩで消化し、挿入物および
ベクターの両方の５′拡張物をDNAポリメラーゼＩおよ
びデオキシリボヌクレオチドを用いて充てんする。リガ
ーゼ処理すると、pHES41がlacプロモーターの制御下に
あるNdeICフラグメントを含む形質転換体として得られ
る。pHES41をBclＩおよびBamHIの両方で消化した後リガ
ーゼ処理して再環化しpHES43を形成せしめる。pHES50は
SalＩおよびEcoRIで消化されたpUC13Cm、結晶タンパク
質遺伝子の５′部分を含むpHES41の精製SalＩ−BclＩフ
ラグメントおよび結晶タンパク質遺伝子の最終74コドン
および転写ターミネーターを含むM13mp8CN3のBamHI−Ec
oRIフラグメントの三方結合により構成される（第5A
図）。フアージM13mp8CN3は、結晶タンパク質遺伝子の
３′末端を含むPvuII−NdeＩフラグメントをM13mp8のSm
aＩ部位にクローニングし、続いてDNAポリメラーゼＩ−
触媒充てん反応により構成する（結晶タンパク質コード
配列がフアージのBamHI部位に最も近くなるような方向
にクローニングする）。このBamHI部位における結晶タ
ンパク質遺伝子解読わくは、コドン645のBclＩにあるも
のと同一である。M13mp8CN3はまた結晶タンパク質遺伝
子の３′末端の配列決定鋳型としても使用された。
pHES44,45,48,49,51および52−−10または50番目のコ
ドンにおける融合 pUC8中のlacＺのアルフアーペプチ
ドを同一の解読わく内で10番目（pHES44,48および51）
または50番目（pHES45,49および52）のコドンで結晶タ
ンパク質に融合する。pES1のXmnＩによる部分消化、続
いてのXhoＩによる完全消化を行ない、５−5.3Kbのフラ
グメントを精製する。pUC8をBamHIで消化し、５′伸展
物をDNAポリメラーゼＩおよびデオキシリボヌクレオチ
ドで充てんし、この試料は続いてSalＩで消化する。pUC
8およびpES1−誘導DNAを結合する（第5B図）。結晶タン
パク質遺伝子−特異性プローブ（クロンスタツドら、19
83）とハイブリダイズした数種のコロニーからのプラス
ミドDNAを制限酵素を用いてスクリーニングして、pHES4
5からpHES44を区別する。両方のプラスミドがこの結晶
タンパク質遺伝子からの580および732bpの内部EcoRIフ
ラグメントを含んでいるが、付加的な小さなフラグメン
トもまた各々pHES44およびpHES45に観察された；これら
のフラグメントは結晶タンパク質遺伝子−pUC8接合部か
らのものである。この系列の10番目コドン融合物（pHES
44,48および51）からのBamHI部位は再生されているが、
この系列の50番目のコドン融合物（pHES45,49および5
2）はBamHI部位を喪失している。pHES48および49は各々
pHES44および45の３′−末端欠失突然変異体である（第
5B図）。後者のプラスミドのSmaＩ−BclＩフラグメント
は結晶タンパク質遺伝子の５′部分を含んでおり、pUC8
のSmaＩおよびBamHI部位にクローニングされる。これら
のプラスミドからの改変結晶タンパク質ポリペプチドの
産生は、lac翻訳開始部位から始まり、結晶タンパク質
遺伝子の645番目のコドンに続く位相が異つたlacアルフ
アーペプチド配列で再び始まる。プラスミドpHES51およ
び52は、上記pHES48および49で使用したのと同一のSma
Ｉ−EcoRIフラグメントをSmaＩ−EcoRI切断pUC13Cmおよ
びpHES50の作製に使用したM13mp8CN3からのEcoRI−BamH
Iフラグメントと混合する事により作製する（第5B
図）。フラグメントを結合し、JM83内へ形質転換する；
マツコンキ−寒天上の増殖する白色形質転換体をスクリ
ーニングし、予想される制限酵素消化産生物を持つプラ
スミドを含んでいるかどうかを決定する。pHES51および
52はベーターガラクシダーゼからの19アミノ酸長のＮ−
末端コード配列および各々10番目および50番目のコドン
で結晶タンパク質遺伝子に融合したpUC8リンカー配列を
含み、位相をそろえて結晶タンパク質遺伝子の645番目
のコドンの後のlac アルフアーペプチドに３′末端で
融合している。
pHES46および47−−Tn5挿入物で終結している10および5
0番目のコドン融合物 これらのプラスミドは、XmnＩ−XhoＩ部分消化フラグ
メントがTn5挿入欠失突然変異体pES1−B22−１由来であ
る点を除いて、上記pHES44および45と類似の方法で形成
される（第5C図）。使用したTn5挿入突然変異体（B22、
第4A図）はpHES33の作製で使用したものと同一である。
実施例１ 結晶タンパク質遺伝子のDNA配列およびその遺伝子産物
の推定アミノ酸配列 バチルス スリンギエンシス結晶タンパク質遺伝子は
部分的に配列決定されている（ウオンら、1983）。しか
しながら結晶タンパク質の“毒素”部分をコードする結
晶タンパク質遺伝子の部分を決定するにはこの部分配列
以上のものが必要であるので、第１図に示した制限部位
からのクローン化制限フラグメントを一部使用して、遺
伝子の残りの部分のDNA配列を決定した。第1B図の塩基1
845から3831のPvuIIフラグメントはホン（1982）のDNAs
eI欠失法により予備的に配列決定されているが（第1B図
の番号部分参照）、部分Sau3AI消化による欠失物を得る
事によりコード鎖配列中のいくつかのみぞを埋めた（第
1B図の星印）。１つまたは他の鎖上の１つまたはいくつ
かの塩基の時折の例外を除いて、両方の鎖について完全
な配列が決定された。コード配列は塩基3831のPvuII部
位から200−400塩基離れて終了すると考えられたので
（ウオンら、1983）、大腸菌転写ターミネーター（ロー
ゼンベルグおよびクールト、1979）と似ている配列をち
ようど越した塩基4222まで拡げて決定した。後者の領域
はS1ヌクレアーゼマツピング（以下に議論する）により
転写終結の部位であると証明された。
以前に示されているごとく（ウオンら、1983）、結晶
タンパク質遺伝子は、バチルス スリンギエンシスにお
いて胞子形成の間に２つの隣接する開始部位（第2A図の
BtIおよびBtII）から転写される。クローン化遺伝子を
含む組換え体大腸菌株中では、転写はBtIおよびBtIIの
間に位置する部位（第2A図のEc）から始まり、それは成
長相に依存しない。BtIおよびBtIIの−10および−35領
域の塩基配列は、栄養体バチルス サブチリスからのRN
Aポリメラーゼおよび大腸菌RNAポリメラーゼで認められ
た一致した配列とは著しく異つている。クリエールら
（1978）はバチルス スリンギエンシスの胞子分裂培養
物からRNAポリメラーゼの２つの変形型の単離を報告し
ている；これらのポリメラーゼの１つはインビトロでバ
チルス スリンギエンシス亜種スリンギエンシスの染色
体からクローン化した結晶タンパク質遺伝子を転写する
事が観察された（クリエールら、1983）。興味ある事に
は、転写された配列は本発明者らがクローン化した遺伝
子のHindIII/EcoRIフラグメントとほとんど同一で（第2
A図および第2B図、塩基2100−2215）、BtIまたはBtII開
始部位の上流の配列に対応する−10および−35配列を含
んでいない。
バチルス スリンギエンシス結晶タンパク質遺伝子の
完全な配列が第2A図および第2B図に示されている。第2A
図および第2B図はDNA配列中の拡張開放解読わくのみか
ら推定されるアミノ酸配列も示している。開放解読わく
は1176アミノ酸をコードしており、133,500の計算分子
量のポリペプチドを特定する。この値はバチルス スリ
ンギエンシス亜種クルスタキ（ブツラら、1981）および
亜種スリンギエンシス（ヒユーバーら、1981）からの前
毒素に対し各々決定された134,000および136,000の分子
量とよく一致している。推定されるアミノ酸組成は、バ
チルス スリンギエンシス亜種クルスタキの全結晶また
は精製前毒素について化学的に決定されたアミノ酸組成
と非常に類似している（表１参照）。
実施例II 結晶タンパク質遺伝子の５′近接部分が毒性ペプチド
をコードしている。何人かの研究者はMr＝約135,000の
結晶タンパク質は前毒素であり、それはタンパク質分解
によりより小さな毒性フラグメントを与える事を報告し
ている（ヒユーバーおよびルシー、1981;ブツラら、197
9;リレイら、1980およびチエツキナら、1982）。さら
に、我々の初期のpES1のTn5挿入突然変異体のイムノブ
ロツト分析（ウオンら、1983参照）は、約Mr68,000の結
晶タンパク質抗原が結晶タンパク質遺伝子の５′−近接
セグメントと関連している事を明らかにしている。それ
故、この遺伝子セグメントが毒性ペプチドをコードして
いるかどうか決定するのが重要であり、もしそうであれ
ば、そのような毒性フラグメントを産生できる遺伝子の
最小部分の輪郭を決めることが重要である。その目的の
ため、結晶タンパク質遺伝子中に挿入物および欠失物を
含む一連のpES1−型プラスミドが構成された。これらの
プラスミドを大腸菌宿主の形質転換に使用し、次に得ら
れた“結晶タンパク質”の毒性を分析した。
結晶タンパク質遺伝子の３′末端欠失の研究に用いら
れたのは、pHES16（第3B図）である。このプラスミドは
Tn5挿入突然変異体のXhoＩ−HindIIIフラグメント〔即
ち、Tn5の485bpおよびプロモーターと最初の565コドン
を含む結晶タンパク質遺伝子の一部を含むpES1−B8（第
3B図のクロスハツチ部分）〕から成り、改変pBR322にの
つている（この事の詳細およびプラスミド構成の確認に
は第３図および材料および方法の節を参照されたい）。
このプラスミドを運ぶ大腸菌株は約Mr58,000結晶タンパ
ク質抗原を産生するが、それはいも虫に有毒ではなかつ
た（第6A図、および第6B図のレーン８）。
この結晶タンパク質遺伝子を伸長すれば毒性を回復す
るかどうかを決定する為、pHES16のHindIII部位にpES1
のHindIII−Ｅフラグメント（第3A図）を挿入した。Hin
dIII−Ｅフラグメントが適切な方向で挿入された場合、
生じるプラスミドpHES19を持つた組換え体大腸菌株は、
いも虫に対し有毒であつた（第6A図）。pHES19を運ぶ大
腸菌細胞は、結晶タンパク質に対する抗体と反応する数
種のポリペプチドを産生し、そのうち最も目立つもの
は、約Mr＝104,000および70,000である（第6B図のレー
ン２）。
この実験を通して一般的に、かなりの量の結晶タンパ
ク質抗原が検出された場合、一連の抗原性ポリペプチド
が観察され（例えば第6B図のレーン１−６）、このこと
は完全結晶タンパク質（第6B図のレーン１）が合成され
ているか先端が切れた誘導体（第6B図のレーン２−６）
が合成されているかには関係なかつた。これらのポリペ
プチドはpBR322を運ぶ大腸菌により産生されるより小さ
い交叉反応性ペプチド（第6B図のレーン10）とは異つて
いる。結晶タンパク質遺伝子由来の多数のペプチドが同
時翻訳的または大腸菌内でのタンパク質分解により後−
翻訳的に産生されるる事が推測される。
実施例III 毒素−コードセグメントの３′末端の輪郭 実施例IIで概説した実験は、結晶タンパク質遺伝子の
５′−近接部分が毒性ペプチドをコードしており、毒素
−コード部分の３′末端部分はHindIII−Ｅフラグメン
ト中にある事を示している。この領域の３′末端をより
正確に決定する為、多数の欠失プラスミドを構成した。
第6A図参照。これらのプラスミド中の結晶タンパク質コ
ード配列は、すべての解読わくがトランスポゾンの末端
の30塩基以内で閉じているTn5中か（第6A図の箱型部；
アウエルスバルドら、1981）またはすべての解読わくが
２−17コドン以内で閉じているpBR322中で（第6A図非箱
部；サツトクリフ、1979）終結している。第6A図はまた
タバコすずめがの幼虫に対し実施されたこれらの組換え
体株の抽出物の毒性試験の結果も示している。
第6A図に示したごとく、Tn5で終結した結晶タンパク
質遺伝子を持つ欠失プラスミドの４つが（pHES32,23,25
および33）大腸菌に毒性を与えたが、１つは（pHES30）
与えなかつた。pBR322で終結する結晶タンパク質遺伝子
配列を持つ９つの欠失プラスミドのうち、５つが毒性を
与え（pHES19,34,35,36および37）、４つが与えなかつ
た（pHES38,39,40および16）。プラスミドpHES38は結晶
タンパク質遺伝子の603コドンを含み（それは試験した
遺伝子の非毒性セグメントで最も長いものである）、一
方プラスミドpHES37は最も短い毒性セグメントを含有し
ている：結晶タンパク質遺伝子の645コドン、M13mp8リ
ンカー配列から５コドンおよびpBR322からの２コドン。
第６図のパネルＢおよびＣはこれらのプラスミドを含
む組換え体株により産生されるポリペプチドのイムノブ
ロツト検定を示している。第6B図のレーン２−６および
第6C図のレーン２−５に示したごとく、645コドンまた
はそれ以上の結晶タンパク質フラグメントの合成を指図
する欠失プラスミド（およびいも虫に有毒な大腸菌を作
る）は約Mr70,000の結晶タンパク質抗原およびコドン64
5を越えた結晶タンパク質遺伝子のセグメントの長さと
大まかに比例する。更に長いペプチドを合成した。上に
述べたごとくいくつかの余分なうすいバンドも観察され
る。pES1−B8によりコードされている完全長結晶タンパ
ク質が比較のため第6B図および第6C図のレーン１に示し
てある。結晶タンパク質遺伝子の645コドン末満の欠失
プラスミドを含む大腸菌株（第6B図のレーン７−９およ
び第6C図のレーン６−８）はいも虫に対し有毒でなく、
約Mr58,000−60,000の結晶タンパク質抗原を産生する。
第3B図のレーン９の抗原性ポリペプチドは、pHES32のHi
ndIII挿入物が逆向きに含まれているpHES31により産生
される；このプラスミドを運ぶ株の抽出物は有毒でな
い。多くの場合（第6B図のレーン７−９および第6C図の
レーン７および８）非毒性株により産生される約Mr58,0
00のポリペプチドは、イムノブロツテイング分析により
検出されにくい。この事はタンパク質分解に対する感受
性が増加したためか、または結晶タンパク質の主たる抗
原決定基の喪失を示しているのであろう。
実施例IV 結晶タンパク質遺伝子の５′および３′改変。
結晶タンパク質遺伝子の５′−近接部分が毒性ペプチ
ドをコードし、“毒素−コード”遺伝子セグメントの
３′末端がコドン603および645の間に位置する事がわか
つたので（第2B図参照）、毒性に対する遺伝子の５′お
よび３′末端における更なる変化の効果を評価するた
め、より多くの改変結晶タンパク質遺伝子を含むプラス
ミド（lacプロモーターまたはlacプロモーターおよびベ
ーターガラクトシダーゼ翻訳開始部の両方の制御下にあ
るもの）を構成した。これらのプラスミドは第7A図に図
示した；これらの構成は上記の材料および方法の節に記
載されている。
この研究のため結晶タンパク質遺伝子の５′末端改変
は２つの型で行い、それは遺伝子の２つの場所に位置さ
せる:1）結晶タンパク質遺伝子の最初の10コドンをベー
ターガラクトシダーゼの９コドン（pHES44,46および4
8）または19コドン（pHES51）および各々pUC8およびpUC
13のポリリンカー系と置き換え、または２）結晶タンパ
ク質遺伝子の最初の50コドンをベーターガラクトシダー
ゼの最初の９（pHES45,47および49）または19（pHES5
2）コドンおよび各々pUC8およびpUC13のポリリンカー系
と置換する。プラスミドpHES41,43および50はlacプロモ
ーターの転写制御下にあるが、結晶タンパク質リボソー
ム結合部位の翻訳制御下にあり、５′−末端改変の効果
の対照物として働く： １）結晶タンパク質コード配列、停止コドンおよび転写
ターミネーター（pHES41,44および45）、２）lacアルフ
アーペプチドの後続部分の解読わくと位相させて（pHES
43）または位相を外して（pHES48および49）融合した結
晶タンパク質遺伝子のコドン645、３）pES1中のTn5挿入
部位B22（第3B図）（pHES46および47）、４）位相させ
て結晶タンパク質遺伝子の最終74コドンおよび転写ター
ミネーターと再結合した結晶タンパク質遺伝子のコドン
645（pHES50,51および52）。
これらのプラスミドを含む大腸菌抽出物の孵化してい
るいも虫に対する毒性を試験した。結果は結晶タンパク
質遺伝子の翻訳開始部位または結晶タンパク質の10番目
にベーターガラクトシダーゼ融合物を持つプラスミド
は、コード配列の３′末端の改変とは無関係に有毒であ
る事を示している。結晶タンパク質遺伝子の50番目のコ
ドンへのベーターガラクトシダーゼ融合物は３′末端コ
ード配列とは無関係にすべて無毒であつた。
実施例Ｖ ５′−および３′−末端改変の効果 本実施例は結晶タンパク質の５′末端または両方の末
端での改変が結晶タンパク質抗原の産生に影響する事を
示す。
第7B図のレーン１−３に示したごとく、全結晶タンパ
ク質遺伝子の５′末端の改変は約Mr135,000の抗原ペプ
チドを産生させる。一方、結晶タンパク質Ｎ−末端の存
在（pHES41,レーン１）は、完全長結晶タンパク質に加
えて数種の少ないが明らかな切断生成物を産生させ、10
番目のコドン（pHES44,レーン２）および特に50番目の
コドン（pHES45,レーン３）の融合物を含む株は１つ
（またはそれ以上の）目立つた約Mr110,000の明らかな
切断生成物を産生する。第7B図のレーン４−６は、各々
pHES43,46および47を含有する細菌により産生される結
晶タンパク質抗原を示している。これらのプラスミドか
ら産生されるタンパク質は、これらのプラスミド中に存
在するコード配列の大きさに従つて各々約Mr77,000、8
5,000および80,000の大きさを持つている。さらに、レ
ーン４および５（各々、結晶タンパク質Ｎ−末端および
10番目のコドン融合物）は約Mr70,000程度のポリペプチ
ドを含んでいるが、一方レーン６（50番目のコドン融合
物）にはこの大きさのポリペプチドは観察されない。
結晶タンパク質遺伝子のコドン645に続いて付加的な
３′−末端改変物を持つプラスミドを運ぶ大腸菌の抽出
物のイムノブロツト検定の結果を第7C図に示した。前述
したごとく、天然のＮ−末端または10番目コドン融合物
はいくつかの結晶タンパク質抗原の約Mr70,000型へのプ
ロセツシングを許容する。第7C図のレーン１−４は、残
基645に続く３′配列がベーターガラクトシダーゼ ア
ルフアーペプチドであろうと〔しかも、位相がそろつて
いようと（pHES43,レーン１）または位相が乱れていよ
うと（pHES48,レーン３）〕、または結晶タンパク質遺
伝子の最終74コドンであろうと（pHES50、レーン2;pHES
51、レーン４）この事が真実である事を示している。も
し50番目のコドン融合物を含む株中で合成されるペプチ
ドが、３′−末端配列が位相の乱れたlacアルフアーペ
プチドの場合、プロセツシングされるとすると、レーン
５にはレーン３で観察された約70,000および74,000の２
つのバンドより各々約Mr4000小さい２つのバンドを示す
であろうと予測される。これらの２つの期待されるバン
ドのより大きな方のみが検出された。第7C図のレーン６
はコドン645に続いて結晶タンパク質遺伝子の最終74コ
ドンが存在する場合、50番目のコドン融合物タンパク質
が約Mr70,000ペプチドへと切断される現象が多少起こつ
た事を示している。第7C図はまたコドン645に続いて位
相をそろえて結晶タンパク質遺伝子の最終74コドンが融
合している場合、異つた５′末端を持つ株の抽出物中に
約Mr50,000の同一の目立つたペプチドが検出されるのを
（第7C図、レーン2,4および６）示しており、残基645よ
り末端の配列が改変ポリペプチドの全体のコンホメーシ
ヨンに影響できる事を示唆している。この共通の切断生
成物は非毒性プラスミドpHES52を運ぶ株の抽出物中にも
観察されるので、約50,000のペプチドは無毒であろうと
思われる。
第6B図，第6C図および第7C図のイムノブロツト分析は
約Mr70,000の結晶タンパク質フラグメントが産生された
場合、検出される抗原の量は結晶タンパク質コード配列
から遠い配列に影響される事を示している。第6B図のレ
ーン２および第6C図のレーン２−５に示したごとく結晶
タンパク質配列が３′末端でpBR322に融合したプラスミ
ドを持つ株により合成される抗原性物質の量は、結晶タ
ンパク質配列がTn5で終結している場合よりも（第6B図
のレーン３−６）多い。より長いおよびより短いpBR322
終結プラスミドの両方ともが、Tn5が３′末端に存在す
るものにより製造される量と比較してより多い抗原の合
成を促進するので、上記の相違が前毒素の特定の免疫原
性セグメントの損失によるものとは考えにくい。クロラ
ムフエニルコールの添加によりタンパク合成が阻害され
た後の種々の時間に培養液の抽出液のイムノブロツト分
析を実施する事により行なつたこれらの株中のタンパク
質分解の速度の予備的見積りでは、pBR322または結晶タ
ンパク質コード配列の末端にTn5配列を持つ株間では改
変結晶タンパク質の分解速度に著しい相違はなかつた
（データは示されていない）。第7C図に示したごとく、
結晶タンパク質遺伝子の３′未端が存在する場合（レー
ン2,4および６）は、転写がpUCベクターで終結した場合
（第7C図のレーン1,3および５）よりもより多い抗原が
産生されている。
表１ アミノ酸 結晶* 前毒素* 推定 Asx 12.45＋ 13.3112.0 Thr 6.46 5.99 6.3 Ser 7.78 6.49 7.3 Glx 12.09 11.9812.0 Pro 3.48 5.32 5.4 Gly 7.45 6.82 6.8 Ala 5.46 5.32 5.4 1/2Cys 1.66 1.66 1.5 Val 6.95 7.32 6.9 Met 0.83 0.83 0.8 Ile 5.63 5.40 6.0 Leu 7.95 7.49 8.7 Tyr 4.14 3.83 4.4 Phe 3.97 4.83 4.6 Lys 2.65 2.5 2.8 His 1.66 2.16 1.9 Arg 7.95 7.65 6.4 Trp 1.16 1.0 1.5 ＋−モル％での値 ＊−ブツラら（1981）による値 結語 本発明は組換え体宿主生物内で発現可能なバチルス
スリンギエンシス結晶タンパク質遺伝子の毒素−コード
セグメントについて記載している事がわかるであろう。
本発明は更にこれらの形質転換組換え体株により産生さ
れる“毒素”タンパク質生成物が鱗翅類昆虫に有毒であ
る事を記載している。毒素ペプチドはバチルス スリン
ギエンシス結晶タンパク質前毒素ペプチドの約半分の大
きさであるので、より大きな前毒素ポリペプチドの代わ
りにより小さな毒素フラグメントを利用する事により、
投与量当り２倍有効な（または半分の投与量で同程度に
有効な）前毒素含有標準殺虫剤調製試料を作製する事が
できる。
本明細書に示し、記載したものに加え本発明が種々に
改良できる事が上記の記述および添付の図から当事者に
は明らかになるであろう。そのような改良は付随する請
求の範囲内に含まれる。
下記表１に示す配列は、第2Aおよび2B図の配列と同じ
ものを、さらに分かり易く示すためのものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:07） (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，258〔1983〕 Ｐ．1960−1967

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列： における１〜645番目までのアミノ酸からなる配列より
    は長く、且つ１〜941番目迄のアミノ酸からなる配列よ
    りは短い配列をコードするDNAからなる、バチルス・ス
    リンギエンシス（Bacillus thuringiensis）結晶蛋白質
    の前毒素ポリペプチドの全体未満をコードする、毒素コ
    ードDNA。
  2. 【請求項２】１〜10番目のアミノ酸をコードするDNA部
    分が、置換されていてもよい、請求項１のDNA。
  3. 【請求項３】下記のアミノ酸配列： における１〜645番目までのアミノ酸からなる配列より
    は長く、且つ１〜941番目迄のアミノ酸からなる配列よ
    りは短い配列をコードするDNAからなる、バチルス・ス
    リンギエンシス結晶蛋白質の前毒素ポリペプチドの全体
    未満をコードする、毒素コードDNAにより形質転換され
    た、バチルス・スリンギエンシス結晶蛋白質の毒素部分
    の免疫学的特性を有するポリペプチドを発現する、組換
    え細菌。
  4. 【請求項４】毒素コードDNAの１〜10番目のアミノ酸を
    コードする部分が置換されていてよい、請求項３の組換
    え細菌。
  5. 【請求項５】大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Ba
    cillus subtilis）、及び緑色植物中に存在する細菌か
    らなる群から選択される、請求項３または４の組換え細
    菌。
  6. 【請求項６】下記のアミノ酸配列： における１〜645番目までのアミノ酸からなる配列より
    は長く、且つ１〜941番目迄のアミノ酸からなる配列よ
    りは短い配列をコードする毒素コードDNAからなり、バ
    チルス・スリンギエンシス結晶蛋白質の前毒素ポリペプ
    チドの全体未満であって該結晶蛋白質の毒素部分の免疫
    学的及び毒性的特性を有するポリペプチドをコードす
    る、前記毒素コードDNAを含む発現可能な異種DNAを有
    し、さらに宿主系により認識される該異種DNAのための
    発現機構をも有する、細菌宿主中で複製可能なハイブリ
    ッド組換えプラスミド。
  7. 【請求項７】毒素コードDNAの１〜10番目のアミノ酸を
    コードする部分が置換されていてよい、請求項６のプラ
    スミド。
  8. 【請求項８】細菌宿主が、大腸菌（Escherichia col
    i）、枯草菌（Bacillus subtilis）、及び緑色植物中に
    存在する細菌からなる群から選択される、請求項６また
    は７のプラスミド。
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4652628A (en) * 1984-02-22 1987-03-24 Syntro Corporation Methods and compositions for expression of BTI endotoxin
CA1301094C (en) 1984-08-31 1992-05-19 Helen Riaboff Whiteley Bacillus thuringiensis crystal protein gene toxin segment
DE3585275D1 (de) * 1984-12-10 1992-03-05 Monsanto Co Einsetzung des bacillus thuringiensis kristallproteingens in pflanzen kolonisierende mikroorganismen und deren verwendung.
JP2540484B2 (ja) * 1984-12-12 1996-10-02 サントリー株式会社 殺虫性蛋白質をコ−ドする遺伝子
US5254799A (en) * 1985-01-18 1993-10-19 Plant Genetic Systems N.V. Transformation vectors allowing expression of Bacillus thuringiensis endotoxins in plants
BR8600161A (pt) * 1985-01-18 1986-09-23 Plant Genetic Systems Nv Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio
EP0200708B1 (en) * 1985-04-30 1992-12-30 Monsanto Company Plant-colonizing microorganisms containing the toxin gene of b. thuringiensis as a chromosomal insertion
EP0206613B1 (en) * 1985-06-14 1992-08-19 Repligen Corporation Activated bacillus thuringienses delta-endotoxin produced by an engineered hybrid gene
ZA864898B (en) * 1985-07-18 1987-03-25 Lubrizol Genetics Inc Insecticidal phizobiaceae cells
KR870004140A (ko) * 1985-10-28 1987-05-07 모리 히데오 살충성 단백질 유전자의 숙주 세포내 발현에 의한 바실러스 튜린지엔시스아이자와이 ipl 아종의 살충성 단백질 제조방법
USRE35714E (en) * 1985-10-28 1998-01-13 Sumitomo Chemical Company, Limited Production of insecticidal protein of Bacillus thuringiensis subsp. aizawai by the expression of insecticidal protein gene in host cells
US5231008A (en) * 1985-10-28 1993-07-27 Sumitomo Chemical Company, Limited Production of insecticidal protein of bacillus thuringiensis subsp. aizawal IPL by the expression of insecticidal protein gene in host cells
GB2188049B (en) * 1986-03-15 1990-09-05 Ciba Geigy Ag Insecticidal proteinaceous substance
TR27832A (tr) 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
KR890701744A (ko) * 1987-06-26 1989-12-21 도날드 에이.호스 바실루스 터링기엔시스(Bacillus thuringiensis)아종 이스라엘렌시스(israelensis)의 독소-암호화 DNA 단편
US6329574B1 (en) 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US6946587B1 (en) 1990-01-22 2005-09-20 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
JP3209744B2 (ja) 1990-01-22 2001-09-17 デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション 結実能力のある遺伝子変換コーン
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
TW261517B (ja) * 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US6326527B1 (en) 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
WO1997013402A1 (en) * 1995-10-13 1997-04-17 Dow Agrosciences Llc Modified bacillus thuringiensis gene for lepidopteran control in plants

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0104920A1 (en) * 1982-09-27 1984-04-04 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing swing growth hormone-like polypeptides

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1982003872A1 (en) * 1981-04-27 1982-11-11 Washington Univ B.thuringiensis crystal protein in e.coli
FR2525630B1 (fr) * 1982-04-26 1985-07-05 Pasteur Institut Adn contenant une sequence codant pour une proteine du cristal ou un polypeptide doue de proprietes insecticides, micro-organismes transformes par de tels adn, compositions contenant lesdites proteines du cristal, polypeptide ou micro-organismes
CA1301094C (en) 1984-08-31 1992-05-19 Helen Riaboff Whiteley Bacillus thuringiensis crystal protein gene toxin segment
BR8600161A (pt) * 1985-01-18 1986-09-23 Plant Genetic Systems Nv Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio
EP0200708B1 (en) * 1985-04-30 1992-12-30 Monsanto Company Plant-colonizing microorganisms containing the toxin gene of b. thuringiensis as a chromosomal insertion
AU5954486A (en) * 1985-05-21 1986-12-24 Biotechnica International Inc. Yeast expressing gluocoamylase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0104920A1 (en) * 1982-09-27 1984-04-04 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing swing growth hormone-like polypeptides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２５８〔１９８３〕Ｐ．１９６０−１９６７

Also Published As

Publication number Publication date
JPS62500074A (ja) 1987-01-16
WO1986001536A1 (en) 1986-03-13
CA1301094C (en) 1992-05-19
AU6208390A (en) 1992-06-18
AU4804485A (en) 1986-03-24
DE3587407D1 (de) 1993-07-22
EP0192741A1 (en) 1986-09-03
AU6736294A (en) 1994-10-13
DE3587407T2 (de) 1994-01-27
EP0192741A4 (en) 1988-08-29
AU597235B2 (en) 1990-05-31
AU681400B2 (en) 1997-08-28
ATE90729T1 (de) 1993-07-15
EP0192741B1 (en) 1993-06-16
BR8506902A (pt) 1986-12-09

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