JPH0829428A

JPH0829428A - 光化学反応による、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体の担体への共有結合方法と、その担体を用いた細胞の分画定量方法、およびＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＫｉｌｌｅｒｃｅｌｌの誘導方法。

Info

Publication number: JPH0829428A
Application number: JP6191727A
Authority: JP
Inventors: Masashi Funayama; 政志船山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-07-11
Filing date: 1994-07-11
Publication date: 1996-02-02

Abstract

(57)【要約】【目的】光化学反応による、白血球分化抗原に対するモ
ノクローナル抗体の担体への共有結合方法と、その担体
を用いた細胞の分画方法および定量方法および、Ｌｙｍ
ｐｈｏｋｉｎｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＫｉｌｌｅｒ
ｃｅｌｌの誘導方法を提供する。【構成】光化学反応により、白血球分化抗原に対するモ
ノクローナル抗体を共有結合させた担体および実験器具
および測定試薬よりなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、第一に、光化学反応に
より白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を共有
結合させた不溶性担体と、それを用いた細胞および末梢
血リンパ球の分画方法および定量方法に関する。本発明
は第二に、光化学反応により白血球分化抗原に対するモ
ノクローナル抗体を共有結合させた不溶性担体を用い
た、ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＫｉ
ｌｌｅｒｃｅｌｌの誘導方法に関する。本発明は第三
に、パルプを含有する繊維製品を用いた造血幹細胞の分
画方法に関する。

【従来の技術】

【０００２】１）骨髄液中に混在する白血球の除去骨髄移植による副作用は、移植中或いは移植後短時間内
に生じる即時型と遅発型に大別される。これらの副作用
は、骨髄液中に混在する白血球が原因となる免疫学的機
序により発現する。即時型には、非溶血性発熱反応があ
り、遅発型には、骨髄移植後の移植片対宿主病（ｇｒａ
ｆｔｖｅｒｓｕｓｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅ；ＧＶ
ＨＤ）、免疫変調作用等がある。宿主にとって外来の異
物に対する反応は、抗原提示細胞を介してＴリンパ球に
よって認識される。抗原提示細胞に共通する性質は、細
胞表面に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のクラスＩお
よびクラスＩＩ分子をもっている。ヒトでは、それぞ
れ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱとして表現される。Ｍ
ＨＣクラスＩ分子は、すべての有核細胞および血小板上
に発現しており、クラスＩＩ分子は骨髄由来の一定の細
胞、特にマクロファージ、Ｂリンパ球、皮膚のランゲル
ハンス細胞、樹状細胞にのみ発現している。骨髄移植に
よる同種免疫は、通常、レシピエントの抗原提示細胞が
レシピエントのＴリンパ球に対して、ドナーのＨＬＡ抗
原を提示するのではなく、骨髄液中に含まれるドナーの
抗原提示細胞が抗原を提示し、レシピエントのＴリンパ
球によって非自己と認識される。すなわち、レシピエン
トＴリンパ球受容体は、抗原提示細胞のクラスＩＩペプ
チド複合体と結合し、更に、アクセサリーリガンドであ
るＬＦＡ−Ｉ／ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２／ＬＦＡ−３の結
合によって反応が補助される。この結果、Ｔリンパ球
（ＣＤ４細胞）は活性化され、ＩＬ−１ＩＬ−４Ｉ
Ｌ−５等、種々のサイトカインを産生し、Ｂリンパ球の
反応が起こり、抗体産生が生じ、同種免疫が成立する。
この成立の条件を考えれば、白血球および血小板を除い
た骨髄を移植することは、クラスＩＩ分子をもつドナー
抗原提示細胞が存在しない為、同種免疫は生じない。２）幹細胞の分離急性白血病や悪性リンパ腫に対する自家骨髄移植に於い
ては、採取した自家骨髄細胞中に混入した腫瘍細胞が、
自家骨髄移植後の再発の原因になることが予想される
為、抗癌剤の使用が行なわれる場合や、モノクローナル
抗体によるｉｎｖｉｔｒｏｐｕｒｇｉｎｇが行なわれ
る場合がある。−方、造血幹細胞に発現しているＣＤ３
４抗原に対するモノクローナル抗体を用いて、造血幹細
胞をｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎする方法も試
みられている。造血幹細胞を濃縮する方法には、骨髄細
胞からＣＤ３４抗原に対するモノクローナル抗体によ
り、特異的にＣＤ３４^＋細胞を吸着させ、他の細胞を除
去した後、ＣＤ３４^＋細胞をｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｌ
ｅｃｔｉｏｎする方法がある。この方法を応用した市販
の装置には、磁気ビーズ法によるＤｙｎａ−ｂｅａｄｓ
（Ｄｙｎａｌ社）、ＣＤ３４抗原に対するモノクローナ
ル抗体を非特異吸着させたフラスコを用いて選別する、
パンニング法であるＭｉｃｒｏＣＥＬＬｅｃｔｏｒ（Ａ
ＩＳ社）、ＣＤ３４抗原に対するモノクローナル抗体を
固定化したゲルを充填したカラムを用いたＣＥＰＲＡＴ
ＥＬＣ（ＣｅｌｌＰｒｏ社）の３種類がある。これら
市販の装置を用いれば、ＣＤ３４^＋細胞をおよそ１００
倍に濃縮することが可能である。濃縮後のＣＤ３４陽性
率はおよそ６５％、ＣＤ３４^＋細胞の回収率はおよそ３
５％、白血球の除去率はおよそ８０％である。以上の様
に、ＣＤ３４^＋細胞の回収率が悪いこと、白血球、血小
板および癌細胞の除去率が充分でないこと等の理由か
ら、現在は、ｉｎｖｉｔｒｏｐｕｒｇｉｎｇやｐｏ
ｓｉｔｉｖｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎの有用性が臨床試験
研究によって、広汎に容認されるには至っていない。３）モノクローナル抗体の剥離ＣＤ３４抗原に対するモノクローナル抗体を非特異吸着
させた、上記市販担体のもう一つの欠点は、リガンドで
あるモノクローナル抗体の剥離である。本発明の発明者
は、既に、前記のリガンド剥離の欠点を克服すべく、光
反応により、抗生物質を担体に共有結合させる方法を考
案し出願に及んだ。今回、本発明の発明者は、光化学反
応により白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を
共有結合させた担体が、前記のリガンド剥離の欠点を克
服することが可能であることを見い出した。４）リンパ球の活性化免疫担当細胞をＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２（ＩＬ−
２）と共に培養し、ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅＡｃｔｉｖ
ａｔｅｄＫｉｌｌｅｒ（ＬＡＫ）細胞を誘導して、こ
れらの細胞を用いる養子免疫療法がある。ＬＡＫ細胞
は、ＣｌａｓｓｉｃａｌＮＫ細胞に抵抗性を示す腫瘍
細胞のみならず、自己の新鮮腫瘍細胞に対しても細胞障
害性を示し、広いスペクトラムを持つＫｉｌｌｅｒ細胞
であることが示されている。しかしながらＬＡＫ療法に
は、高濃度のＩＬ−２による副作用や、長期間の培養に
よる感染の危険を伴うという問題がある。今回、本発明
の発明者は、光化学反応により白血球分化抗原に対する
モノクローナル抗体を共有結合させた担体を用いて、ｉ
ｎｖｉｔｒｏで免疫担当細胞をＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉ
ｎ−２（ＩＬ−２）と共に培養する方法が、リガンド剥
離の欠点および高濃度のサイトカインよる副作用の問題
を克服することが可能であることを見い出した。

【０００３】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の発明者は、
光反応により白血球分化抗原に対するモノクローナル抗
体を共有結合させた担体が、従来品および従来法と比較
して、細胞を効率良く吸着することを見い出し出願に
及んだ。しかも、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）
による測定の結果、当該担体からはリガンドの剥離は認
められなかった。すなわち本発明は、１）他家骨髄液から殆どの白血球および血小板を除去
し、他家骨髄移植時に同種免疫を回避できる担体および
方法を提供する。２）造血性幹細胞含有自家骨髄液および他家骨髄液か
ら、幹細胞を完全に純化できる担体および方法を提供す
る。３）白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体が剥離
しない末梢血リンパ球分離用担体および末梢血リンパ球
の分離方法を提供する。４）白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体が剥離
しない、リンパ球活性化用担体およびリンパ球活性化の
方法を提供する。５）パルプを含有する繊維製品を用いた造血幹細胞の分
画方法を提供する。ことに関する。

【課題を解決するための手段】

【０００５】従来の担体へのリガンドの固定化方法に
は、１）リガンドが部分的な修飾を受けることにより、リガ
ンドの高次構造や活性中心等が部分的に破壊される恐れ
がある。２）リガンドの自由な動きが制限されることにより、被
検検体との相互作用が起こりにくくなり、その結果リガ
ンドの活性の低下が起こる。３）リガンドに優れた活性と安定性を与える固定化条件
を見つけることが困難である。４）リガンドを非特異吸着により固定化した場合には、
リガンドが剥離し易い。等の欠点があった。一方、フェ
ニルアジド基は、紫外線照射により高反応性の中間体で
あるナイトレンを経由し、近傍の炭素等と共有結合する
ことが知られている（吉本薫：フォトポリマーハンドブ
ック：工業調査会１９８９）。また、人工臓器に生体適
合性を付与する方法として、材料表面の改質方法（特
願、平２−２０６５７３）が知られている。同方法は、
デバイスの表面にアジド基を介して、アルブミン等の蛋
白質を共有結合させることにより、生体適合性を付与す
る方法である。

【０００６】本発明の発明者は、このフェニルアジド基
の紫外線照射法を、白血球分化抗原に対するモノクロー
ナル抗体の強固な結合に応用することを考案した。即
ち、本発明の発明者は、リガンドの固定化について鋭意
検討した結果、ａ）不溶性担体の表面にアジド基を有する化合物を塗布
した後、被固定化白血球分化抗原に対するモノクローナ
ル抗体を塗布し、更に光を照射することからなる白血球
分化抗原に対するモノクローナル抗体の固定化方法。ｂ）不溶性担体の表面にｏ−ニトロベンジルエステル基
を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射によりカル
ボキシル基を生成させ、更に、水溶性縮合剤を用いて、
白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を化学結合
させる方法とからなる白血球分化抗原に対するモノクロ
ーナル抗体の固定化方法。ｃ）緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ
ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることにより、フェ
ニルアジド基を導入した白血球分化抗原に対するモノク
ローナル抗体を被固定化担体に塗布した後、更に光を照
射することことからなる、白血球分化抗原に対するモノ
クローナル抗体の固定化方法。によりリガンドである白
血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を担体に容易
に、強固に固定化できることを発見し、本発明を完成し
た。

【０００７】

【発明の効果】本発明は、（ａ）不溶性担体の表面にアジド基を有する化合物を塗
布した後、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体
溶液を塗布し、更に光を照射することことからなる、白
血球分化抗原に対するモノクローナル抗体の共有結合方
法。（ｂ）不溶性担体の表面にｏ−ニトロベンジルエステル
基を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射によりカ
ルボキシル基を生成させ、更に水溶性縮合剤を用いて白
血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を化学結合さ
せる方法とからなる、白血球分化抗原に対するモノクロ
ーナル抗体の共有結合方法。ｃ）緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ
ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることにより、フェ
ニルアジド基を導入した白血球分化抗原に対するモノク
ローナル抗体を被固定化担体に塗布した後、更に光を照
射することことからなる、白血球分化抗原に対するモノ
クローナル抗体の共有結合方法。（ｄ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により、
白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を共有結合
したことを特徴とする、不溶性担体および実験器具。（ｅ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により調
製した不溶性担体を用いて、細胞を分画する方法。（ｆ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により調
製した不溶性担体を用いて、細胞を分画除去する方法。（ｇ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により調
製した不溶性担体を用いて、細胞を定量する方法。（ｈ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により抗
ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を共有結合した不溶性担体と、
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２と末梢血リンパ球とをｉｎ
ｖｉｔｒｏにより培養し，ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅＡ
ｃｔｉｖａｔｅｄＫｉｌｌｅｒｃｅｌｌを誘導する方
法。ｉ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により抗Ｃ
Ｄ４抗体を共有結合した不溶性担体または、ＣＤ８抗体
を共有結合した不溶性担体を用いて、末梢血リンパ球か
らＣＤ４^＋細胞を分画した後、分画したＣＤ４^＋細胞を
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２と共に、ｉｎｖｉｔｒｏ
により培養し、ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅＡｃｔｉｖａｔ
ｅｄＫｉｌｌｅｒｃｅｌｌを誘導する方法。（ｊ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により抗
ＣＤ３４抗体を共有結合した不溶性担体、および抗ＣＤ
３８抗体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−
Ａ抗体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−Ｂ
抗体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−Ｃ抗
体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗
体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗
体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗
体を共有結合した不溶性担体および、ｓｉｎｇｌｅｃ
ｅｌｌｄｉｐｏｓｉｔｉｎｇｕｎｉｔとを用いて造
血幹細胞を分画する方法。（ｋ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により抗
ＣＤ３４抗体を共有結合した不溶性担体、および抗ＣＤ
３８抗体を共有結合した不溶性担体および、血しょう分
離器を用いて、造血幹細胞を分画する方法。（ｌ）（ｊ）または（ｋ）の方法により分画した造血幹
細胞をサイトカインと共にｉｎｖｉｔｒｏ法により増
殖する方法。（ｍ）不溶性担体が、ポリビニルアルコール、およびセ
ルロース、およびポリアクリルアミド、およびポリアク
リル酸、およびメタクリル酸、およびポリメチルメタク
リレート、およびポリイソプロピルアクリルアミド、お
よびポリエステル、およびポリアミド、およびポリエチ
レン、およびポリプロピレン、およびポリスチレンの中
から選択されたことを特徴とする（ｃ）の不溶性担体お
よび実験器具。（ｎ）１０〜９０％のパルプを含有し、その繊維径が３
〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５ｇ／ｃｍ^３で
あることを特徴とする繊維製品。（ｏ）１０〜９０％のパルプを含有し、その繊維径が３
〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５ｇ／ｃｍ^３で
あることを特徴とする繊維製品を充填したカラム。（ｐ）１０〜９０％のパルプを含有し、その繊維径が３
〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５ｇ／ｃｍ^３で
あることを特徴とする繊維製品を用いた造血幹細胞の分
画方法。（ｑ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）記載の方法によ
り調製した不溶性担体および（ｎ）記載の繊維製品を用
いて、細胞および末梢血リンパ球を分画する方法。より
なる。本発明に関わる共有結合方法により、白血球分化
抗原に対するモノクローナル抗体の活性を失うことな
く、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を容易
に、堅固に共有結合することが可能になる。また、本発
明に関わる共有結合方法により、白血球分化抗原に対す
るモノクローナル抗体を共有結合した実験器具から、白
血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を剥離させる
ことなく、幹細胞を分画することや、リンパ球を活性化
することが可能である。

【０００８】本発明では、最初に担体表面にアジド基を
有するポリマーや、低分子化合物を塗布する。使用する
ポリマーとしては、アジド基を導入したスチレン、アジ
ド基を含有するメタクリレート類等のビニルモノマー単
独重合体、アジド基含有モノマーとスチレン、アクリル
アミド等のアジド基を含有しないビニルモノマーとの共
重合体が考えられるが、安定性を考慮すると、スチレ
ン、メチルメタクリレート、ジメチルアクリルアミドと
の共重合体が特に好ましい。これらの共重合体における
アジド基の割合は、モル比で１０〜２０％存在すること
が好ましい。前記ポリマーの分子量は、数平均分子量で
１００，０００以上であることが好ましい。また、アジ
ド基を有する低分子化合物としては、ビスアジド化合物
や、イオン性基等が考えられるが、必ずしもこれらに限
定されるものではない。これらのアジド基を有する低分
子化合物では、白血球分化抗原に対するモノクローナル
抗体を安定に固定化させる為に、アジド基を２個以上含
有することが望まれる。白血球分化抗原に対するモノク
ローナル抗体を固定化する材料としては、プラスチッ
ク、ガラス、セラミック、繊維、紙、合成紙、中空糸、
金属等が考えられるが、これらに限定される訳ではな
く、また、それらの形状、表面の状態等には、何等制限
はない。

【０００９】アジド基を有する化合物は、ポリマーで
も、低分子化合物であっても、揮発性有機溶媒に溶解
し、被固定化表面に塗布、乾燥することにより実施する
ことが可能である。塗布により、形成される皮膜の厚さ
は、ポリマーの場合は、０．１〜３．０μｍであること
が好ましい。低分子の場合は、分子層が複数になる様に
塗布することが好ましい。本発明によって固定化される
白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体は、分画し
ようとする細胞および末梢血リンパ球によって、自由に
選択することが可能である。これらの白血球分化抗原に
対するモノクローナル抗体を被固定化担体に存在させる
方法には、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体
の溶液に被固定化担体を浸漬し、白血球分化抗原に対す
るモノクローナル抗体を被固定化担体に吸着させる方法
が考えられる。

【００１０】次に、白血球分化抗原に対するモノクロー
ナル抗体の存在する被固定化担体に紫外線を照射するこ
とにより、短時間で固定化が完了する。使用される光源
としては、水銀灯等が考えられる。白血球分化抗原に対
するモノクローナル抗体の水溶液または、コロイド溶液
または、懸濁液に被固定化担体を浸漬し、白血球分化抗
原に対するモノクローナル抗体を被固定化担体に吸着さ
せた後に紫外線を照射する場合には、必ずしも溶液を乾
燥させる必要はない。紫外線照射に特に限定される条件
はないが、被固定化白血球分化抗原に対するモノクロー
ナル抗体を防御する為には、３２０ｎｍよりも長波長の
光を照射することが好ましい。紫外線を照射した後、固
定化されなかった白血球分化抗原に対するモノクローナ
ル抗体は洗浄により除去する。洗浄に使用される溶媒に
も特に制限はない。

【００１１】以上の操作からなる本発明によれば、白血
球分化抗原に対するモノクローナル抗体と塗布したポリ
マー間との共有結合、更に、塗布したポリマー間とポリ
マー内との架橋が生成する為、被固定化担体が安定して
存在し続ける。被固定化担体がプラスチックの場合に
は、被固定化担体の表面と塗布した白血球分化抗原に対
するモノクローナル抗体との間に共有結合が生成する
為、被固定化担体が更に安定して存在し続ける。アジド
基を有する化合物が低分子化合物である場合にも、化学
療法剤と塗布した低分子化合物間との共有結合、更に、
塗布した低分子化合物間の架橋が生成する為、被固定化
担体が安定して存在し続ける。

【００１２】

【実施例】本発明を実施例により更に詳細に説明する。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。《実施例１．》ｉ）アジドスチレンの合成エタノール−濃塩酸混液２０ｍｌに、３−ニトロスチレ
ン５ｇを懸濁させ、更に、エタノールに溶解したＳｎＣ
ｌ_３２Ｈ_２Ｏ溶液を激しく攪拌しながら添加し、室温
で一夜、反応させた。ＮａＯＨにより中和し、固体成分
を濾別し、濾液より生成物をエーテル抽出した。エーテ
ル層をＭｇＳＯ_４で乾燥した後、濃硫酸を加え、中間体
を得た。同中間体を１０％硫酸溶液１０ｍｌに溶解し、
氷冷し１ＮのＮａＮＯ_２水溶液を添加した。２時間後
に、ＮａＮ_３水溶液を添加し、室温に戻した後、３時間
攪拌した。酢酸エチルにより抽出し、抽出液を０．１Ｎ
ＮａＨＣＯ_３水溶液と精製水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４
を添加し、乾燥した。溶媒を留去し、クロロホルム／ヘ
キサン（１／４）混合溶媒に溶解し、シリカゲルカラム
で精製した。溶媒を留去し、３−アジドスチレンを得
た。ｉｉ）アジドスチレン−スチレン共重合体の合成アジドスチレン１モルとスチレン４モルとをベンゼンで
５倍に希釈し、０．０１当量のＮ，Ｎ’−アゾビスイソ
ブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を添加、脱気、封管し、６
０℃で４時間重合した。放冷後、メタノール中に注ぎ、
沈殿したアジドスチレン−スチレン共重合体を回収し
た。得られた共重合体の数平均分子量は、１０万であっ
た。ｉｉｉ）抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴフィルムの調製前記方法により合成したアジドスチレン−スチレン共重
合体をアセトンに溶解し、１％溶液を調製した。この溶
液１００ｍｌを１ｍ^２のポリエチレンテレフタレート
（ＰＥＴ）フィルムの両面に塗布、乾燥し、アジドスチ
レン−スチレン共重合体の皮膜を形成した。リン酸緩衝
液に０．０１％の割合で溶解した抗ＣＤ３４抗体溶液
に、前記処理をしたＰＥＴフィルムを１時間浸漬し、抗
ＣＤ３４抗体を吸着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線
を１分間照射した。次に、当該ＰＥＴフィルムを精製水
で水洗、乾燥した。

【００１３】《実施例２．》抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥ
Ｔフィルム充填カラムを用いた増血幹細胞の吸着実施例
１．で調製した抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴフィルムを
１ｃｍ^２四方に切断した後、１ＮＮａＯＨで洗浄し、
更に、パイロジェンフリーの精製水で充分に洗浄、乾燥
し、パイロジェンフリーのカラムに充填した。次に、パ
イロジェンフリーの１０％ＰＢＳを含むＲＰＭＩ１６
４０培地で安定化させた。次に、Ｇ−ＣＳＦを５日間投
与後に採血した末梢血液１，０００ｍｌからＦｉｃｏｌ
ｌＰａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて分
画し、１０％ＰＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に浮
遊したリンパ球画分１０ｍｌを前記カラムにａｐｐｌｙ
し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで流下させた。流出液を１ｍｌ
づつ分画した。各画分についてコールター社製フローサ
イトメトリーを用いて、抗ＣＤ３４抗体と反応する細胞
の検出を行なった。その結果、各画分から抗ＣＤ３４抗
体と反応する細胞は検出されず、ＣＤ４およびＣＤ８抗
体と反応する細胞が検出された。従って、末梢血液中の
増血幹細胞はすべて、抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴフィ
ルム充填カラムに吸着された。また、白血球画分は抗Ｃ
Ｄ３４抗体固定化ＰＥＴフィルム充填カラムには全く吸
着されなかった。

【００１４】《実施例３．》ｉ）アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレートの合
成Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００ｍｌに
ｐ−アジド安息香酸１０ｇを溶解、氷冷し、トリエチル
アミン８．５ｍｌを添加し、更に、クロロ蟻酸イソブチ
ル８．３ｍｌを添加した。次に、ＤＭＦ３００ｍｌにヒ
ドロキシルエチルメタクリレート５．２ｍｌを溶解し、
前記溶液に添加し、６０℃で５時間攪拌した。溶媒を留
去し、酢酸エチルを添加、抽出し、１０％クエン酸水溶
液、精製水、４％ＮａＨＣＯ_３水溶液で順次洗浄し、無
水ＮａＳＯ_４を添加、乾燥した。溶媒を留去した後、ク
ロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムで精製した。溶
媒を留去し、アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレ
ートを得た。ｉｉ）アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−
メチルメタクリレート共重合体の合成前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート１ｍｏｌとメチルメタクリレート４ｍｏ
ｌとをＤＭＦで２倍に希釈し、０．０１等量のＡＩＢＮ
を添加、脱気、封管し、６０℃で３時間重合した。冷却
後、大量のエチルエーテルに注ぎ、沈殿したアジドベン
ゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレ
ート重合体を得た。得られた共重合体の数平均分子量は
１５万であった。ｉｉｉ）抗ＣＤ４抗体固定化フラスコの調製前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート−メチルメタクリレート共重合体をアセ
トンに溶解し、１％溶液を調製した。この溶液各３０μ
ｌをポリアクリルアミド製フラスコの内面に塗布、乾燥
し、アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−メ
チルメタクリレート共重合体の皮膜を形成した。前記処
理をしたポリアクリルアミド製フラスコの内面に、リン
酸緩衝液に０．０１％の割合で溶解した抗ＣＤ４抗体溶
液２００μｌを添加し、ＣＤ４抗体溶液を吸着させ、電
子線加速器（加速電圧２ＭｅＶ、電子線電流１ｍＡ）を
用いて、電子線を３０秒間照射した。次に、当該ポリア
クリルアミド製フラスコを精製水で水洗、乾燥した。

【００１５】《実施例４．》ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｌｌ
ｅｒｃｅｌｌの誘導末梢血から沈殿法に従い、末梢血リンパ球を分離した。
次に、実施例３．で調製した抗ＣＤ４抗体固定化フラス
コを用いて、ＣＤ４^＋末梢血リンパ球を分離し、ＩＬ−
２、自己血しょう、後期ｐｏｋｅｗｅｅｄｍｉｔｏｇ
ｅｎと共に２週間培養した。２週間後に前記操作により
得られた細胞（１ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）と、ラ
ジオアイソトープ（^５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウム）標
識した、ヒト子宮頚部癌由来Ｈｅｌａ細胞（Ｈｅｌａ−
Ｓ３：１ｘ１０^２ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）と、ｐｏｋｅｗ
ｅｅｄｍｉｔｏｇｅｎ（１μｇ／ｍｌ）とをｍｉｃｒ
ｏｔｅｓｔｐｌａｔｅｗｅｌｌに取り、炭酸ガス培
養器で８時間培養した。キラー活性の検量は、リンパ球
浮遊液の代りにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したもの
を０％、リンパ球浮遊液の代りに２％ＳＤＳを添加した
ものを１００％とした。キラー活性の検量の結果、８時
間後にｍｉｃｒｏｔｅｓｔｐｌａｔｅｗｅｌｌ内の
Ｈｅｌａ細胞は消滅し、ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌの誘導が確認さ
れた。

【００１６】《実施例５．》抗ＣＤ４抗体固定化不織布の調製ラジカル重合により、２−（４−アジドベンゾイルオキ
シ）エチルメタクリレート：スチレン：ｏ−ニロベンジ
ルアクリレートの三元共重合体（仕込モル比３：６：
１）（以下ＰＡＳＮ）を合成した。デュポン社製不織布
（Ｓｏｎｔａｒａ８００５）に、前記ＰＡＳＮを塗布、
薄膜を形成した後、紫外線を照射した。次に当該不織布
に０．０１％の抗ＣＤ４抗体と水溶性カルボジイミドを
含有するリン酸緩衝液に浸漬し、３７℃で１６時間反応
させた。次に当該不織布を１ＭのＮａＣｌ水溶液および
リン酸緩衝液で、洗浄乾燥した。

【００１７】《実施例６．》末梢血リンパ球の分離実施例５で調製した抗ＣＤ４抗体固定化不織布１０ｇを
カラムに充填した。次に、当該カラム３％のストレプト
マイシンを含有するリン酸緩衝液で充分に洗浄した後、
パイロジェンフリーの精製水で充分に洗浄し、無菌的に
乾燥した。続いて、当該カラムをガンマ線滅菌した。多
発性硬化症患者から採血した血液から血しょう分離器を
用いて、血しょうを分離した。当該血しょう５０ｍｌを
上記カラムにアプライし、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で流出
させた。カラム流出血しょうをプールし、コールター社
製フローサイトメトリーにより分析した。その結果、カ
ラム流出血しょうからは、ＣＤ４^＋細胞（リンパ球）は
検出されなかった。

【００１８】《実施例７．》抗ＣＤ３４抗体固定化不織布の調製デュポン社製不織布（Ｓｏｎｔａｒａ８００５）に、
ポリイソプロピルアクリルアミドを塗布、薄膜を形成し
た後電子線を照射し、ポリイソプロピルアクリルアミド
をグラフト重合した。当該不織布に、ＰＡＳＮを塗
布、薄膜を形成した後、紫外線を照射した。次に当該不
織布に１％の抗ＣＤ３４抗体と水溶性カルボジイミドを
含有するリン酸緩衝液に浸漬し、３７℃で１６時間反応
させた。次に当該不織布を１ＭのＮａＣｌ水溶液および
リン酸緩衝液で、洗浄乾燥した。

【００１９】《実施例８．》抗ＣＤ３４^＋細胞の分離実施例７で調製した抗ＣＤ３４抗体固定化不織布１０ｇ
をカラムに充填した。次に、当該カラムを３％のストレ
プトマイシンを含有するリン酸緩衝液で充分に洗浄した
後、パイロジェンフリーの精製水で充分に洗浄し、無菌
的に乾燥した。続いて、当該カラムをガンマ線滅菌し
た。Ｇ−ＣＳＦを３日間投与した健常人から採血した血
液から血しょう分離器を用いて、血しょうを分離した。
当該血しょう５０ｍｌを前記カラムにアプライし、１ｍ
ｌ／ｍｉｎの流速で流出させた。当該カラムを１００ｍ
ｌのリン酸緩衝液で充分に洗浄した後、当該カラムを３
７℃で３０分インキュベートした後、当該カラムを３７
℃に加温したリン酸緩衝液１００ｍｌで洗浄し、ＣＤ３
４^＋細胞を回収した。カラム流出血しょうをプールし、
コールター社製フローサイトメトリーにより分析した。
その結果、カラム流出血しょうからは、ＣＤ３４^＋細胞
は検出されなかった。上記健常人から採血し、カラム処
理を行なわない血しょうについて、同様にフローサイト
メトリー分析を行なった。その結果、ＣＤ３４^＋細胞が
検出された。

【００２０】《実施例９．》ＣＤ３４^＋細胞の分離規定量のＧ−ＣＳＦを５日間投与後に採血した末梢血液
１，０００ｍｌからＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製）を用いて分画し、１０％ＰＢＳを含
むＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊したリンパ球画分１０
ｍｌをデュポン社製不織布（Ｓｏｎｔａｒａ８００
５：未処理）充填カラムにアプライし、１ｍｌ／ｍｉｎ
の流速で流出させた。次に、当該カラムを１００ｍｌの
リン酸緩衝液で充分に洗浄し、白血球を流出させた後、
非流出画分を物理的に溶出させ、プールした。プールし
た画分をコールター社製フローサイトメトリーにより分
析した。その結果、プールした画分からは、アプライ画
分の９５％のＣＤ３４^＋細胞と５％の白血球画分が検出
された。

【００２１】《実施例１０．》ＣＤ３４細胞の定量実施例３の方法に準じて９６穴マイクロタイタープレー
トを調製した。当該マイクロタイタープレートに骨髄液
からＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅにより調製したリンパ球
画分１００μｌを分取し、室温で３０分インキュベート
した。次に当該マイクロタイタープレートの各穴をリン
酸緩衝液２００μｌで３回洗浄した。次に当該マイクロ
タイタープレートの各穴に酵素標識抗ＣＤ３４抗体２０
０μｌを分取し、室温で３０分インキュベートした。次
に当該マイクロタイタープレートの各穴をリン酸緩衝
液２００μｌで３回洗浄した。次に当該マイクロタイタ
ープレートの各穴に酵素基質液２００μｌを分取し、室
温で３０分イソキュベートした。３０分後に、当該マイ
クロタイタープレートの各穴に反応停止液２００μｌを
分取し反応を停止した。標準ＣＤ３４細胞を用いて同様
の操作を行ない、描いた検量線から、ＣＤ３４細胞の量
を求めた。

【００２２】《実施例１１．》抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴフィルム充填カラムを用い
た増血幹細胞の吸着実施例１．で調製した抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴフィ
ルムを１ｃｍ^２四方に切断した後、１ＮＮａＯＨで洗
浄し、更に、パイロジェンフリーの精製水で充分に洗
浄、乾燥し、パイロジェンフリーのカラムに充填した。
次に、パイロジェンフリーの１０％ＰＢＳを含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で安定化させた。次に、規定量のＧ−Ｃ
ＳＦを５日間投与した健康人末梢血液１，０００ｍｌか
らＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）を用いて分画し、１０％ＰＢＳを含むＲＰＭＩ１
６４０培地に浮遊したリンパ球画分１０ｍｌにラジオア
イソトープ（^５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウム）標識した
ヒト子宮頚部癌由来Ｈｅｌａ細胞（Ｈｅｌａ−Ｓ３：１
ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ）を混合した後、前記カラムにａｐ
ｐｌｙし、流速１ｍｌ／ｍｉｎで流下させ、流出液を１
ｍｌづつ分画した。各画分についてコールター社製フロ
ーサイトメトリーを用いて、抗ＣＤ３４抗体と反応する
細胞の検出を行なった。その結果、各画分から抗ＣＤ３
４抗体と反応する細胞およびラジオアイソトープ標識し
たヒト子宮頚部癌由来Ｈｅｌａ細胞は検出されず、ＣＤ
４およびＣＤ８抗体と反応する細胞が検出された。従っ
て、末梢血液中の増血幹細胞はすべて、抗ＣＤ３４抗体
固定化ＰＥＴフィルム充填カラムに吸着された。また、
白血球画分およびラジオアイソトープ標識したヒト子宮
頚部癌由来Ｈｅｌａ細胞は抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴ
フィルム充填カラムには全く吸着されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (54)【発明の名称】光化学反応による、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体の担体への共有結合方法と、その担体を用いた細胞の分画定量方法、およびＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＫｉｌｌｅｒｃｅｌｌの誘導方法。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】不溶性担体の表面にアジド基を有する化
合物を塗布した後、白血球分化抗原に対するモノクロー
ナル抗体溶液を塗布し、更に光を照射することことから
なる、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体の共
有結合方法。
【請求項２】不溶性担体の表面にｏ−ニトロベンジル
エステル基を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射
によりカルボキシル基を生成させ、更に水溶性縮合剤を
用いて白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を化
学結合させる方法とからなる、白血球分化抗原に対する
モノクローナル抗体の共有結合方法。
【請求項３】緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙ
ｌｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることに
より、フェニルアジド基を導入した白血球分化抗原に対
するモノクローナル抗体を被固定化担体に塗布した後、
更に光を照射することことからなる、白血球分化抗原に
対するモノクローナル抗体の共有結合方法。
【請求項４】請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により、白血球分化抗原に対するモノク
ローナル抗体を共有結合したことを特徴とする、不溶性
担体および実験器具。
【請求項５】請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により調製した不溶性担体を用いて、細
胞を分画する方法。
【請求項６】請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により調製した不溶性担体を用いて、細
胞を分画除去する方法。
【請求項７】請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により調製した不溶性担体を用いて、分
画した細胞を定量する方法。
【請求項８】請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を共有
結合した不溶性担体と、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２と
末梢血リンパ球とをｉｎｖｉｔｒｏにより培養し、Ｌ
ｙｍｐｈｏｋｉｎｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＫｉｌｌｅ
ｒｃｅｌｌを誘導する方法。
【請求項９】請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により抗ＣＤ４抗体を共有結合した不溶
性担体または、ＣＤ８抗体を共有結合した不溶性担体を
用いて、末梢血リンパ球からＣＤ４^＋細胞を分画した
後、分画したＣＤ４^＋細胞をｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−
２と共に，ｉｎｖｉｔｒｏにより培養し、Ｌｙｍｐｈ
ｏｋｉｎｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＫｉｌｌｅｒｃｅ
ｌｌを誘導する方法。
【請求項１０】請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により抗ＣＤ３４抗体を共有結合した不
溶性担体、および抗ＣＤ３８抗体を共有結合した不溶性
担体および、抗ＨＬＡ−Ａ抗体を共有結合した不溶性担
体および、抗ＨＬＡ−Ｂ抗体を共有結合した不溶性担体
および、抗ＨＬＡ−Ｃ抗体を共有結合した不溶性担体お
よび、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を共有結合した不溶性担体お
よび、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体を共有結合した不溶性担体お
よび、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体を共有結合した不溶性担体お
よび、ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｄｉｐｏｓｉｔｉｎｇ
ｕｎｉｔとを用いて造血幹細胞を分画する方法。
【請求項１１】請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により抗ＣＤ３４抗体を共有結合した不
溶性担体、および抗ＣＤ３８抗体を共有結合した不溶性
担体および、血しょう分離器、および請求項１４記載の
繊維製品を用いて造血幹細胞を分画する方法。
【請求項１２】請求項１０および請求項１１記載の方法
により分画した造血幹細胞をサイトカインと共にｉｎ
ｖｉｔｒｏ法により増殖する方法。
【請求項１３】不溶性担体が、ポリビニルアルコール、
およびセルロース、およびポリアクリルアミド、および
ポリアクリル酸、およびメタクリル酸、およびポリメチ
ルメタクリレート、およびポリイソプロピルアクリルア
ミド、およびポリエステル、およびポリアミド、および
ポリエチレン、およびポリプロピレン、およびポリスチ
レンの中から選択されたことを特徴とする請求項４記載
の不溶性担体および実験器具。
【請求項１４】１０〜９０％のパルプを含有し、その繊
維径が３〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５ｇ／
ｃｍ^３であることを特徴とする繊維製品。
【請求項１５】１０〜９０％のパルプを含有し、その繊
維径が３〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５ｇ／
ｃｍ^３であることを特徴とする繊維製品を充填したカラ
ム。
【請求項１６】１０〜９０％のパルプを含有し、その繊
維径が３〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５８／
ｃｍ^３であることを特徴とする繊維製品を用いた造血幹
細胞の分画方法。
【請求項１７】請求項１、または請求項２、または請求
項３記載の方法により調製した不溶性担体および請求項
１４記載の繊維製品を用いて、細胞を分画する方法。