JPH08298887A

JPH08298887A - ビャクダンの組織培養法及びその二次増殖法

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Publication number: JPH08298887A
Application number: JP7135908A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Kanda; 田博史神
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-05-08
Filing date: 1995-05-08
Publication date: 1996-11-19
Anticipated expiration: 2013-07-30
Also published as: JP2781964B2

Abstract

(57)【要約】【目的】ビャクダンにつき、目的とする精油成分をほぼ
同一割合で含有する原木と同一の固体を大量に得ること
ができる方法を提供するにある。【構成】ビャクダンの葉組織をショ糖を含みオーキシン
とサイトカイニンの組合わせに係るホルモンを添加した
固型培地上に植え付け、これを同じホルモン添加区の固
型培地上に継代培養することを特徴とする。【効果】カルスを経ることなく不定胚を誘導でき、この
不定胚から原木と同一の固体を安定確実に増殖、再分化
及び順化させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はビャクダンについて、カ
ルスを経由しない不定胚の誘導による大量増殖法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ビャクダンは学名Santalumで、ビャクダ
ン科に属する高さが３〜４ｍほどの半寄生常緑の喬木で
ある。このビャクダンは東インドなど熱帯の乾燥高地に
て自生、栽培され古来より現在に至るまで精油原料とし
て利用されている。この精油は調合香料の成分として、
またその香気の持続性から扇子などの装飾品への着香、
また線香、薫香さらには医薬品として用いられている。

【０００３】また、ビャクダンからの精油成分の採取
は、３０年以上の生育のものの心材部あるいは根部を細
断して粗末とし、これを水蒸気蒸留する方法によるのが
一般的で、収量は全体で４．５〜６．５％ほどである。

【０００４】また、得られる精油の主成分はα−santal
ol及びβ−santalolが約９０％である。従来、これに類
似する合成香料としてフェノール類とテルペン類を反応
させることによりボルネオール（Borneol）とフェノー
ルの縮合物としたものなど数多くのものが開発されてい
るが、その品質はビャクダンからの抽出物に劣る。

【０００５】従って、ビャクダンの精油を大量に得るに
は前記した低い収量であることを考えると、かなり多量
のビャクダンの原木が必要となる。しかし、近年その原
木の大量伐採が環境破壊につながるとして問題となって
いる。

【０００６】

【発明が解決しょうとする課題】上記した問題点との関
連から、従来、ビャクダンの大量増殖法について種々研
究されているが、今だ完成された方法は存在しない。

【０００７】また、この増殖方法として特開昭６３−２
５８５７４号公報にサフラン柱頭組織の培養方法、また
特開平１−１８１７９５号公報にクチナシ属植物の果皮
等からの培養方法が開示されているが、いずれもその対
象がビャクダンでないのみならず、果実、果皮あるいは
花芽組織を純粋培養する方法によるものである。

【０００８】しかし、植物体組織の細胞を純粋培養する
方法は、一般にその細胞の増殖に際し、変異して同一固
体を培養することが困難であり、また特に、ビャクダン
のように植物体の組織中に強い芳香性の精油成分を含む
ものである場合には、その精油成分が阻害成分となって
細胞の増殖が実質上阻止されることになる。従って、ビ
ャクダンについては上記した従来知られている、培養法
をそのまま適用することはできない。

【０００９】そこで、本発明では、上記した弊害を回避
してビャクダンについて目的とする精油成分をほぼ同一
割合で含有する原木と同一の固体を大量に得ることがで
きる培養法及びその二次増殖法を提供することを目的と
した。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
め鋭意研究を重ねた結果、本発明では先ず、次のビャク
ダンの組織培養法を開発した。即ち、ビャクダンの葉組
織をショ糖を含みオーキシンとサイカイトニンとの組合
わせに係るホルモンを添加した固型培地上に植え付け、
これを同じホルモン添加区の固型培地上に継代培養する
ことを特徴とする。

【００１１】上記した固型培地は基本培地にショ糖及び
オーキシンとサイトカイニンとの組合わせに係るホルモ
ンを添加して調製できる。この基本培地としてはＭＳ培
地、White培地、ＬＳ培地、ＷＰ（Woody plant）培地な
どによることができるが、増殖性が高いことからＷＰ培
地を用いることが好ましい。なお、培地のＰＨ値は不定
胚の増殖にとって好適な７．５〜５．８に酸あるいはア
ルカリによって調整しておくことが好ましい。

【００１２】また、上記した固型培地にポリビニルピロ
リドン（ＰＶＰ）を含有させておくことができる。この
場合、ＰＶＰの含有量は培地量に対し、０．０５〜１．
０重量％、特に葉組織の褐変を安定的に阻止し得る点か
ら、約０．１重量％であることが好ましい。

【００１３】また、前記した固型培地については継代培
養に際し、ショ糖濃度を低下させる過程を含めることが
できる。この場合、好ましくは前記植え付け用の固型培
地については、培地量に対し約３重量％とし前記継代用
の固型培地については約２重量％とすることである。そ
れぞれの過程において有効な栄養源を供給し得ると共
に、後記する作用が安定的に発揮されるからである。

【００１４】また、オーキシンとしてはＮＡＡ（a−nap
hthalen aceticacia）、ＩＡＡ（in dole acetic acid）、ＩＢＡ（imdolebutyric acid）な
どを用いることができ、またサイトカイニンとしては、
ＢＡＰ（６−benzylamino purine）、カイネチン（kine
tin）、ゼアチン（zeatin）などを用いることができ
る。これらのホルモンについては、カルスを経ない不定
胚を良好な状態で安定的に得ることができる点からＮＡ
ＡとＢＡＰとの組合わせで添加することが好ましい。

【００１５】また、これらのホルモンの添加量の範囲は
ホルモンの種類によって異なるが、例えばＮＡＡとＢＡ
Ｐとの組合わせの場合には、ＮＡＡが５×１０^-7〜１０
^-6モル、またＢＡＰが５×１０^-7〜１０^-6モルの濃度範
囲であることが好ましい。この場合、ＮＡＡとＢＡＰの
濃度が５×１０^-7モル未満であるとき、また１０^-5モル
以上となる場合には不定胚を有効に誘導することができ
なくなる場合がある。

【００１６】また、培地の固型化剤としては寒天、ゼラ
チンなど一般的なものによることができる。また、培地
の固型化も水中に溶解した固型化剤を基本培地に注加し
て、オートクレーブ内で加温、加圧下に処理する等の一
般的な方法によることができる。この固型化剤の添加量
は培地として十分な固型化状態を得るに足りる量であり
種類によって異なるが、例えば、ゼラチンの場合、約２
重量％の量が適量である。

【００１７】また、継代の時期は不定胚の増殖状態に応
じて適当に決定できるが、好ましい増殖状態を得るには
６週間ごとに行なうことである。また前記した低いショ
糖濃度の固型培地への移植時期は、最も良好な増殖状態
が得られることから、植え付け開始から１８週間後、即
ち、２回目の継代時期に行なうことが好ましい。

【００１８】なお、本発明の培養法に供するビャクダン
の葉は葉柄をつけた状態で、エチルアルコール等の各種
の殺菌剤により滅菌処理を施しておくことが好ましく、
また増殖に供する葉としては、例えば、１０×１５mmの
大きさの程度の切片としておくことができる。また、培
養条件としては２５±２℃の無菌室において、暗黒下、
静置する環境下に行なうことができる。

【００１９】次に、ビャクダンの不定胚の二次増殖法は
次の過程によることができる。即ち、上記したようにビ
ャクダンの葉組織から誘導した不定胚をショ糖を含み、
オーキシンとサイトカイニンとの組合わせに係るホルモ
ンを添加した固型培地上に植え付けて、光照射下に継代
増殖することを特徴とする。

【００２０】この二次増殖法における培地についても、
前記培養法におけると同様の材料によることができる。
なお、増殖効果が高められることから、培地中のショ糖
濃度を約２重量％とし、またホルモンとしてＩＡＡとＢ
ＡＰであって、その濃度をＩＡＡについて５×１０^-7モ
ル、ＢＡＰについて１０^-7モルとし、さらに固型化剤と
してゼラチンを適量用いることが好ましい。

【００２１】また、光照射は不定胚の苗化が可能な光量
が得られる条件で行なう必要があり、例えば、２５００
ルッスで１６時間の条件で実行することができる。な
お、この光量が低いと苗化が不十分となり、また高過ぎ
ると不定胚が乾燥化し苗化できない。

【００２２】このように苗化した不定胚については、例
えばホルモンフリー培地、又はＮＡＡ、ＩＡＡあるいは
ＢＡＰが単独の培地上で、植物体への再分化を図ること
ができる。また、このように再分化した幼植物体につい
ては、例えば、ｎｏｎ−ショ糖のＷＰ培地とバーミキュ
ライトからなる滅菌培地上への移植後、密閉状態とした
ものについて徐々に蓋を開けてゆき、さらに一定期間経
過後、バーミキュライトを土壌とする苗床上に移植して
後、常温（２０℃）下に生育させることによることがで
きる。以後、通常の環境条件下に成木にまで生育させる
ことができる。

【００２３】

【作用】本発明の方法においては、次のような作用が生
じる。先ず、ショ糖を含みオーキシンとカイトサイニン
の組合わせに係るホルモンが添加された固型培地は、ビ
ャクダンの葉組織からカルスを経ることなく不定胚を誘
導しさらにこれを増殖させる。

【００２４】また、この不定胚の培養増殖過程における
固型培地について、さらにＰＶＰが含有されているか、
あるいは前記したショ糖濃度の低下過程を経る場合に
は、その過程における葉組織の褐変化が阻止される。

【００２５】また、このような不定胚から前記した二次
増殖過程を経て原木と同一の組織を有する苗、幼木へと
再分化される。

【００２６】

【実施例】

(１)不定胚の誘導（切片の調製）…ビャクダンの葉柄をつけた状態の葉
を０．２％Tween２０に６０分間浸し、その後流水で６
０分間水洗した。次いで、７０％エチルアルコール中に
数秒間、さらに０．２％Tween２０含有のアンチオルミ
ンに１０分間、及び７０％エチルアルコールに数秒間浸
して滅菌し、その後、滅菌水で５回洗浄した。次いで、
滅菌シャーレ内でメスピンセットでこの葉の一部を切除
して１０×１５mm大の切片とした。

【００２７】（培地の作成）…ショ糖を２重量％ある
いは３重量％又はさらにこれにＰＶＰを０．１重量％含
有させたＷＰ培地にＮＡＡ及びＢＡＰをそれぞれ５×１
０^-7モル、１０^-6モル及び１０^-5モルの濃度で組合わせ
て添加した。次いで、これらを０．１Ｎ水酸化ナトリウ
ムあるいは０．１Ｎ塩酸を用いて５．７〜５．８のＰＨ
値に調整した。これらにオートクレーブ中で溶解したゼ
ラチンを０．２重量％加えて、それぞれ試験管に２０ml
ずつ分注し、これらをオートクレーブ（１２０℃、１．
２kg/cm²）で１５分間滅菌処理し固型培地を得た。

【００２８】（不定胚の誘導操作）…前記の切片を
上記の固型培地上に植え付けて、これを２５±２℃の
無菌室内にて、暗黒下に静置培養した。またこの培養過
程において６週間ごとに継代を行なった。なお、上記の
培養操作において、ショ糖濃度を３重量％に維持した固
型培地に継代した場合を条件Ａ、また同じく３重量％に
維持すると共にＰＶＰを含有させた固型培地に継代した
場合を条件Ｂ、またショ糖濃度を当初の３重量％から２
重量％に低下させた固型培地に継代した場合を条件Ｃと
した。

【００２９】上記した条件Ａの培養操作における各ホル
モン添加区では葉組織の切片がいずれも褐変化し、また
カルスの形成も認められなかった。

【００３０】上記した条件Ｂ及び条件Ｃの培養操作で
は、いずれも次のような組合わせに係るホルモン添加区
において不定胚の誘導が同等に確認された。これらの条
件Ｂ及び条件Ｃ下の結果を次表１に示した。

【表１】なお、表中、embryoは不定胚が誘導されたとき、Ｎ．
Ｅ．はそれが誘導されなかったとき、を示す。

【００３１】表１に示した結果から、ＮＡＡが５×１０
^-7モル、１０^-6モルとＢＡＰが５×１０^-7モル、１０^-6
モルとの組合わせに係る各ホルモン添加区で、それぞれ
不定胚が誘導されたことを確認できる。なお、これらの
場合その誘導は切片と培地との接面部より直接的に不定
胚が誘導された。この誘導状態を図１に示した。なお、
図中、１は葉の切片であり、２はその葉脈、また３は切
片１上に誘導された不定胚である。また４は容器、５は
培地である。

【００３２】(２)不定胚の二次増殖（培地の作成）…ＷＰ培地にショ糖を２重量％添加し
て基本培地とし、この基本培地にＮＡＡ及びＢＡＰをそ
れぞれ１０^-7モル、５×１０^-7モル、１０^-6モル及び１
０^-5モルの濃度の組合わせ並びにＩＡＡ及びＢＡＰをそ
れぞれ１０^-7モル、５×１０^-7モル、１０^-6モル及び１
０^-5モルの濃度の組合わせで添加した。次いで、これら
を０．１Ｎ水酸化ナトリウムあるいは０．１Ｎ塩酸を用
いて５．７〜５．８のＰＨ値に調整した。次いで、これ
らにオートクレーブ中で溶解したゼラチンを０．２重量
％あるいは寒天を０．９重量％加えて、それぞれマイヤ
ー（１００ml）に３３mlずつ分注し、これらをオートク
レーブ（１２０℃、１．２kg/cm²）で１５分間滅菌処理
し固型培地を得た。

【００３３】（二次増殖の操作）…前記(１)で誘導し
た不定胚を上記した固型培地に植え付けて、照度２５０
０ルックスで１６時間に亘って光照射した。なお、継代
は６週間後ごとに行なった。

【００３４】この結果、いずれの培地においても不定胚
は増殖し苗化された。これらの場合の増殖率をＮＡＡと
ＢＡＰとの組合わせに係るホルモン添加区について表２
に、またＩＡＡとＢＡＰとの組合わせに係るホルモン添
加区について表３にそれぞれ示した。

【表２】

【表３】

【００３５】なお、表２及び表３の数値は上段がゼラチ
ンを固型化剤とする培地、また下段が寒天を固型化剤と
する培地の場合である。なお、増殖率は重量の変化割合
として計算した値である。

【００３６】表２及び表３に示した結果から、寒天培地
と比較してゼラチン培地の方が全てのホルモン添加区に
おいて、より高い増殖率が得られること、またＮＡＡと
ＢＡＰとの組合わせに係るホルモン添加区よりは、ＩＡ
ＡとＢＡＰとの組合わせに係るホルモン添加区の方が、
より高い増殖率が得られることを確認できる。またゼラ
チンを固型化剤とし５×１０^-7モルのＩＡＡと１０^-7モ
ルのＢＡＰとの組合わせに係るホルモン添加区の培地に
よる場合に、最も高い増殖率が得られた。

【００３７】(３)不定胚から植物体への再分化（培地の作成）…ホルモンフリー培地、ＮＡＡ、ＩＡ
Ａ又はＢＡＰの０〜５×１０^-6モル濃度の単独のホルモ
ン添加区の培地であって、固型化剤をゼラチンあるいは
寒天としたものを前記(２)の方法に準じて固型培地と
してそれぞれ作成した。

【００３８】（再分化の操作）…ゼラチンを固型化剤
とし、１０^-7モルのＩＡＡと１０^-7モルのＢＡＰとの組
合わせに係るホルモン添加区の培地で二次増殖させ苗化
した不定胚を上記した固型培地上に植え付けて、前記増
殖の場合と同一の環境条件下に植物体への再分化を検討
した。

【００３９】この結果、いずれの培地においても不定
胚の増殖が続き４〜６週間後に子葉が展開し始め、約８
週間後に幼植物体となった。この幼植物体の状態を図２
に示した。なお、図中、６はその子葉となる苗条であ
る。また７は容器、８は培地である。

【００４０】なお、この再分化した幼植物体はホルモ
ンフリー培地で最も多く、その数は３ケ月後で５０本／
０．５ｇであった。また、ゼラチンを固型化剤とした培
地において再分化した植物体は以後黄変し落葉した。こ
のため、幼植物体の生育には寒天を固型化剤とする培地
の場合がより適していることが判る。

【００４１】(４)幼植物体の順化（順化操作）…広口マイヤー（５００ml）内にｎｏｎ
−ショ糖のＷＰ培地と支持体としてのバーミキュライト
を入れて、滅菌した培地上に前記再分化させた１３物体
を移植し蓋で閉じた。これを静置し４週間後から徐々に
蓋を開けて、その後２週間後に上記マイヤー内から植物
体を取り出して黒ポットのバーミキュライトからなる土
壌上に移植した。

【００４２】黒ポットに移植後２ケ月の時点で、健全
な植物体を生存率１００％の状態で得ることができた。
この植物体の状態を図３に示す。なお、図中、９はこの
植物体の茎で茎頂10まで及び、また11はこの茎９上の葉
である。また12はポット、13は用地としてのバーミキュ
ライトである。

【００４３】

【発明の効果】上述した各過程により本発明は構成され
ることから、次のような効果が発揮される。本発明の方
法によれば、カルスを経ることなく不定胚を誘導できる
ことから、その誘導後に原木と同一の固体を安定確実に
増殖、再分化及び順化させることができる。

【００４４】また、ビャクダンの葉組織を利用するもの
であることから、培養可能な時期が比較的に長期間に及
ぶことから大量培養に適している。

【００４５】このように大量に培養され植物体化された
幼木は、ビャクダンに適する通常の環境条件下で成木に
まで生育され、２０〜３０年の生育期間を経てビャクダ
ン油の原料として利用されることになる。

【図面の簡単な説明】

【図１】誘導された不定胚を示す図

【図２】再分化された幼植物体を示す図

【図３】生育した植物体を示す図

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビャクダンの葉組織をショ糖を含みオーキ
シンとサイトカイニンとの組合わせに係るホルモンを添
加した固型培地上に植え付け、これを同じホルモン添加
区の固型培地上に継代培養することを特徴とするビャク
ダンの組織培養法。
【請求項２】前記継代培養に係る固型培地が、ポリビニ
ルピロリドンを含有することを特徴とする請求項１のビ
ャクダンの組織培養法。
【請求項３】前記固型培地におけるショ糖濃度を継代に
際し低下させることを特徴とする請求項１のビャクダン
の組織培養法。
【請求項４】前記固型培地における高いショ糖濃度が約
３重量％で、低いショ糖濃度が約２重量％であることを
特徴とする請求項３のビャクダンの組織培養法。
【請求項５】前記した固型培地におけるホルモンが、オ
ーキシンとしてＮＡＡとサイカイトニンとしてＢＡＰと
の組合わせに係ることを特徴とする請求項１、２、３又
は４のビャクダンの組織培養法。
【請求項６】ＮＡＡが５×１０^-7〜１０^-6モル、ＢＡＰ
が５×１０^-7〜１０^-6モルの濃度であることを特徴とす
る請求項５のビャクダンの組織培養法。
【請求項７】ビャクダンの葉組織から誘導した不定胚を
ショ糖を含みオーキシンとサイトカイニンとの組合わせ
に係るホルモンを添加した固型培地上に植え付けて、光
照射下に継代増殖することを特徴とするビャクダンの不
定胚の二次増殖法。
【請求項８】オーキシンとしてＩＡＡとサイトカイニン
としてＢＡＰとの組合わせに係るホルモンであることを
特徴とする請求項７のビャクダンの不定胚の二次増殖
法。
【請求項９】ＩＡＡが５×１０^-7モル、ＢＡＰが１０^-7
モルの各濃度であることを特徴とする請求項８のビャク
ダンの不定胚の二次増殖法。