JPH08301862A - Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種の抗生物質シリアノンおよびその化学誘導体並びにその製造法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物によって生産される有用な物質（特
に、抗生物質）の提供。 【解決手段】 発酵時に真菌Penicillium 種ＨＡＧ０２
５９により産生される新規抗生物質シリアノン、その製
造方法、シリアノンから誘導される化学誘導体、シリア
ノンおよびそれから誘導される誘導体の使用、医薬、
（特に、インターロイキン（ＩＬ）‐４拮抗剤）として
薬理学上活性な物質、並びに上記抗生物質を産生するPe
nicillium 種ＨＡＧ０２５９が提供される。図３はＩＬ
−４レセプターアッセイの結果を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、発酵時に真菌Penicillium 種(spec.) ＨＡＧ
０２５９により産生される新規抗生物質シリアノン、そ
の製造方法、シリアノンから誘導される化学誘導体、シ
リアノンおよびそれから誘導される誘導体の使用、医薬
として、特にインターロイキン（ＩＬ）‐４拮抗剤とし
て薬理学上活性な物質、並びに上記抗生物質を産生する
Penicillium 種ＨＡＧ０２５９に関する。

【０００２】背景技術 微生物からの二次代謝産物は感染疾患の治療に首尾よく
用いられる。二次代謝産物は、一次代謝からそれた“生
合成一方向経路”で産生され、そして特定の産生体の機
能が不明である、低分子量化合物である。現在まで、様
々な微生物（特にStreptomyces属の真菌および細菌）の
培養物から単離された約１００００の二次代謝産物が知
られている。

【０００３】これら二次代謝産物の主要使用分野は感染
疾患の治療である。しかしながら、その汎用性のために
しばしば耐性が獲得され、そのため新たな作用メカニズ
ムを有する新規抗生物質および活性物質が必要とされて
いる（Neu H.C.,Science 257,1992,pages 1064-1073
）。

【０００４】加えて、微生物活性物質の適用分野は、感
染疾患の中に含まれない疾患（例えば腫瘍治療、免疫調
節）および作物保護（除草剤および殺虫剤）にも広がっ
た。二次代謝産物はシグナル鎖のレセプターまたは酵素
のような薬理学的関心のある多数の高分子物質と相互作
用して、拮抗または阻害効果を有することも知られてい
る。しかしながら、活性物質はしばしば欠点を有し、こ
れらは満足しえないレベルの活性、高すぎる毒性および
／または望ましくない副作用で特徴付けられる。

【０００５】本発明による抗生物質と構造的に異なる抗
生物質が文献に記載されている（T.Yoshioka et al.,Bu
ll.Chem.Soc.Jpn,1982,55,3847-3851 ）。J.Casson et
al.,J.Org.Chem.,1970,35,170-186 では、^１Ｈ‐ＮＭＲ
データ、ＵＶスペクトルおよび質量スペクトル測定値が
明らかに本発明による化合物と差異を示すノルヘルクエ
イノンについて報告した。最近発行され（Jin-Zhong-Xi
ao et al.,J.Antibiotics,1993,46,1570-1574 ）、Phae
osphaeria rousseliana から単離されたルッセリアノン
は、ＮＭＲシグナルからわかるように、例えば１，２，
２‐トリメチルテトラヒドロフラン環の不在により、本
発明による化合物と異なる。

【０００６】

【発明の概要】改善された性質を有する微生物天然産物
を探索することが本発明の目的である。この目的は、本
発明によれば、シリアノンが培養ブロス中に蓄積するま
で炭素源および窒素源並びに慣用的無機塩および微量元
素を含有した栄養培地でPenicillium 種ＨＡＧ０２５９
を発酵させ、その後培養ブロスからシリアノンを単離し
て、適宜にシリアノンの化学誘導体を製造することによ
り達成される。抗生物質は薬理活性とひいては治療効力
とを有し、インターロイキン（ＩＬ）‐４拮抗剤（ＩＬ
‐４の効果を抑制する物質）として用いることができ
る。

【０００７】従って、本発明は以下に関する。 １．下記式Ｉの化合物

【化２】 （上記式中 ａ）Ｒ^１およびＲ^２は互いに独立して‐Ｃ_ｎＨ_2n‐
Ｒ^３、‐Ｏ‐Ｒ^３、‐Ｓ‐Ｒ^３またはＮＨ‐Ｒ^３であ
り、Ｒ^３は水素、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルカノイルまたは置
換もしくは非置換（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキル基であり、お
よびｎは１、２、３、４、５または６であるか、あるい
は ｂ）Ｒ^１およびＲ^２はそれらを有する炭素原子と一緒に
なって、炭素原子３〜９個の置換または非置換脂環式基
を形成している）およびその生理学上許容される塩。

【０００８】式Ｉの化合物の好ましいグループにおい
て、Ｒ^１はＯＨであり、Ｒ^２はＯＨ、ＮＨ‐Ｒ^３または
ＣＨ_２‐Ｒ^３であり、Ｒ^３は水素、ホルミル、アセチ
ル、カルボキシメチルまたはカルボキシエチルである。
式Ｉの化合物の更に好ましいグループにおいて、Ｒ^１お
よびＲ^２はヒドロキシルである。

【０００９】２．シリアノンが培養ブロス中に蓄積する
までPenicillium 種ＨＡＧ０２５９を培地で発酵させ、
その後活性物質およびその薬理学上許容される塩を単離
および精製することによってPenicillium 種ＨＡＧ０２
５９から得られる、分子式Ｃ₁₉Ｈ₁₈Ｏ_７の化合物、シリ
アノン。

【００１０】３．シリアノンが培養ブロス中に蓄積する
までPenicillium 種ＨＡＧ０２５９を培地で発酵させ、
その後活性物質を単離および精製して、化学誘導体およ
びその薬理学上許容される塩に変換することによってPe
nicillium 種ＨＡＧ０２５９から得られる、シリアノン
から誘導された化学誘導体。

【００１１】４．シリアノンが培養ブロス中に蓄積する
までPenicillium 種ＨＡＧ０２５９またはその変異体お
よび／または変種を培地で発酵させ、それを培地ブロス
から単離して、適宜にそれを化学誘導体に変換すること
からなる、１、２または３で規定された化合物の製造方
法。

【００１２】５．薬理学上活性な物質として、特にＩＬ
‐４拮抗剤としての、シリアノンまたはそれから誘導さ
れた化学誘導体の使用。 ６．Penicillium 種ＨＡＧ０２５９（ＤＳＭ９７９
１）。

【００１３】

【発明の具体的説明】本発明は、特にその好ましい態様
で、以下で詳細に記載されている。本発明は更に特許請
求の範囲の内容により規定されている。用語の定義 分子式Ｃ₁₉Ｈ₁₈Ｏ_７の本発明による化合物はシリアノン
と呼ばれる。培養ブロスとはそこで増殖した真菌の菌糸
を含有する栄養培地に関する。他で指摘されないかぎ
り、すべてのパーセンテージデータは重量に基づく。液
体の混合比は他で指摘されないかぎり容量に基づく。本
発明による方法は、実験室規模（ｍｌ／ｌ範囲）と工業
規模（立方メートル規模）の発酵に用いることができ
る。

【００１４】微生物 Penicillium 種ＨＡＧ０２５９は土壌サンプルから単離
された。土壌からの精製のために、後者は生理ＮａＣｌ
溶液（０．９％）を用いて懸濁され、連続希釈液が作成
される。次いで様々な希釈液（１０^０〜１０^６）がペニ
シリウム用の栄養培地上におかれた。培養物が３０℃で
２〜１４日間インキュベートされた後、得られたペニシ
リウムコロニーはプレートから取出されて、数回の連続
精製工程により単離された。属は当業者に知られる方法
により形態学的および分類学的基準に基づき決定され
る。Penicillium 属はその分生子柄により特徴付けられ
る。本発明による活性物質シリアノンを非常に効率的に
産生するコロニーを連続単離および精製工程によってPe
nicillium 種ＨＡＧ０２５９から単離することができ
る。

【００１５】高レベル産生のPenicillium 種ＨＡＧ０２
５９コロニーが増殖される。単離物は１９９５年３月１
６日付でブダペスト条約の規則に従い下記番号：Penici
llium 種ＤＳＭ９７９１でDeutsche Sammlung von Mikr
oorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg
1B,38124 Braunschweig,Germany に寄託された。Penici
llium 種ＤＳＭ９７９１は白色気生菌糸および緑色分生
子を有する。それはペニシリウムに特徴的な分生子柄を
形成して、綿状増殖を示す。炭素源および窒素源と慣用
的塩を含有した栄養溶液中で、Penicillium 種ＤＳＭ９
７９１は分子式Ｃ₁₉Ｈ₁₈Ｏ_７の化合物を産生する。

【００１６】ＤＳＭ９７９１株の代わりに、本発明によ
る化合物を合成するかぎり、その変異体および変種を用
いることも可能である。このような変異体は、それ自体
公知の方法で物理的手段により、例えば紫外線またはＸ
線のような照射で、あるいは例えばエチルメタンスルホ
ネート（ＥＭＳ）、２‐ヒドロキシ‐４‐メトキシベン
ゾフェノン（ＭＯＢ）またはＮ‐メチル‐Ｎ′‐ニトロ
‐Ｎ‐ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）のような化学変
異誘発物質で作ることができる。本発明によるシリアノ
ンを与える変異体および変種のスクリーニングは、培養
ブロス中に蓄積された活性物質の生物活性を調べること
により、例えば下記方法によりＩＬ‐４阻害効果を試験
することにより行える。

【００１７】微生物の培養 下記発酵条件はPenicillium 種ＨＡＧ０２５９並びにそ
の変異体および変種に適用される。好気性発酵に適切で
好ましい炭素源は、同化性炭水化物および糖アルコー
ル、例えばグルコース、ラクトースまたはＤ‐マンニト
ール、並びに炭水化物含有天然産物、例えば麦芽エキス
である。

【００１８】適切な含窒素栄養素はアミノ酸、ペプチ
ド、タンパク質およびその分解産物、例えばペプトンま
たはトリプトン、更に肉エキス、種、例えばコーン、小
麦、豆、大豆または綿植物の種、を砕いたもの、アルコ
ール、肉ミールまたは酵母エキスの製造による蒸留残
渣、並びにアンモニウム塩および硝酸塩である。栄養溶
液が含有できる無機塩は、例えばアルカリ金属またはア
ルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンの
塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩である。

【００１９】シリアノンの産生は、約０．１〜３％、好
ましくは０．２〜１％のカゼインペプトン；０．１〜３
％、好ましくは０．２〜１％の肉ペプトン；０．１〜５
％、好ましくは０．５〜２％のグルコース；および０．
１〜７％、好ましくは１〜２％のマルトースを含有した
栄養溶液中で特に良好に行える。上記各場合は完全栄養
溶液の重量に基づく。

【００２０】培養は好気的に、即ち、例えば適宜に空気
または酸素を導入して振盪フラスコまたは醗酵槽中で振
盪または撹拌しながら液内で行う。発酵は様々な容量の
広口ボトルまたは丸底フラスコ、ガラス醗酵槽またはス
テンレススチールタンクで行える。それは約１５〜３０
℃、好ましくは約２０〜３０℃、特に２３〜２８℃の温
度範囲内で行える。ｐＨは１〜７、有利には２．５〜
４．５であるべきである。微生物は通常２４〜３００時
間、好ましくは３６〜１４０時間にわたりこれらの条件
下で培養される。

【００２１】培養は有利には数段階で行われ、即ち初め
に１以上の前培養物が液体栄養培地で作られ、その後実
際の産生培地、主培養物中に例えば１：１０容量比で移
される。前培養物は、例えば胞子形成菌糸を栄養溶液中
に移して、それを約３６〜１２０時間、好ましくは４８
〜７２時間増殖させることにより得られる。胞子形成菌
糸は、例えば酵母麦芽寒天またはポテト‐デキストロー
ス寒天のような固形または液体栄養培地上で約３〜４０
日間、好ましくは４〜１０日間かけて株を増殖させるこ
とにより得られる。

【００２２】シリアノンの発酵および産生の進行は、当
業者に知られる方法により、例えばバイオアッセイで生
物活性を調べるかあるいは薄層クロマトグラフィー（Ｔ
ＬＣ）または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）のようなクロマトグラフィー方法により追跡するこ
とができる。

【００２３】シリアノンは菌糸および培養濾液の双方の
中で生じるが、通常そのほとんどはバイオマス（菌糸）
中に存在する。したがって、後者を濾液から濾過または
濃縮により分離することが好都合である。濾液は水と混
和しない溶媒、例えば１‐ブタノール、酢酸エチル、ク
ロロホルムなどで抽出される。菌糸は便宜上メタノール
またはアセトニトリルで抽出されるが、水と混和しない
上記溶媒を用いることも可能である。抽出は広いｐＨ範
囲で行えるが、好ましくはｐＨ０．５〜ｐＨ５の酸性培
地で操作することが都合よい。有機抽出液は、例えば濃
縮して、真空下で乾燥させることができる。

【００２４】単 離 シリアノンを単離する１つの方法は、それ自体公知の方
法である溶液分配である。

【００２５】もう１つの精製方法は、例えばDiaion（商
標名）ＨＰ‐２０（三菱化成社、東京）、 Amberlite
（商標名）ＸＡＤ７（Rohm and Haas,USA ）、Amberchr
om（商標名）ＣＧ（Toso Haas,Philadelphia,USA）など
のような吸着樹脂によるクロマトグラフィーである。加
えば、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）の目的のためには、一般的に知られるようになった
多数の逆相支持体、例えばＲＰ₁₈が適している。シリア
ノンを精製するもう１つの可能性は、それ自体公知の方
法で、例えばシリカゲルまたはＡｌ_２Ｏ_３その他のよう
な直接相クロマトグラフィー支持体を使用することを含
む。多くの溶液とそれらの混合液、例えば石油エーテル
／クロロホルム／氷酢酸混合液がこの目的に適してい
る。

【００２６】別の単離方法は、それ自体公知の方法で、
例えば Fractogel（商標名）ＴＳＫＭＷ‐４０、Sephad
ex（商標名）ＬＨ‐２０などのようなモレキュラーシー
ブの使用が挙げられる。加えて、シリアノンをそれに富
む物質から結晶化により得ることも可能である。例えば
無水または水を付加させた有機溶媒およびそれらの混合
物がこの目的に適している。例えばトリフルオロ酢酸、
ＨＣｌ、Ｈ_２ＳＯ_４、ギ酸その他のような酸を加えるこ
とも同様に有利であろう。

【００２７】シリアノンまたはそれから誘導される化学
誘導体は、当業者に知られる方法で対応する薬理学上許
容される塩に変換することができる。本発明による化合
物の薬理学上許容される塩とは、Remington's Pharmace
utical Sciences (17th edition,page 1418(1985))に記
載されたような無機および有機双方の塩を意味する。特
に適切な塩はアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、
生理学上許容されるアミンとの塩、例えばＨＣｌ、ＨＢ
ｒ、Ｈ_２ＳＯ_４、マレイン酸、ギ酸のような無機または
有機酸との塩である。

【００２８】Penicillium 種ＨＡＧ２５９により産生さ
れ、その後部分単離または単離されたシリアノンは、化
学的修飾に用いることができる。修飾は専門家文献に記
載された当業者に知られる方法により行う。これらの方
法としては例えば以下のものが挙げられる： ‐例えば接触還元による、炭素原子間並びに炭素および
酸素原子間の二重結合の水素付加 ‐好ましくは鎖長１〜５のアルキルエステルを製造する
ための、特に好ましくはジメチルエステルを製造するた
めの、アルコールおよび酸性基のエステル化 ‐好ましくは鎖長１〜５のアルキル基を形成するための
炭素、窒素または酸素原子のアルキル化（アルキル基は
場合により置換させることも可能である） ‐アルキルメルカプトまたはアルキルアミノ基によるア
ルコール基の置換 ‐酸エステルまたはアミドを与えるための、好ましくは
鎖長１〜５のアシル化合物によるアルコールまたはアミ
ノ基のアシル化

【００２９】Ｒ^１がＯＨでＲ^２が‐ＣＨ_２‐ＣＯ‐ＣＨ
_３‐である式Ｉの化合物は当業者に知られる方法でシリ
アノン（Ｒ^１およびＲ^２はＯＨである）をアセトンと反
応させることにより製造できる。Ｒ^１がＯＨでＲ^２が‐
ＮＨ‐ＣＨ_２‐ＣＯＯＨである式Ｉの化合物は、例えば
当業者に知られる方法でシリアノンをグリシンと反応さ
せることにより製造できる。

【００３０】シリアノンの物理化学的およびスペクトル
性質は下記のように要約することができる：表１ 外観：メタノール、アセトニトリル、クロロホルムおよ
びベンゼンに可溶性である深黄色物質。酸性媒体中で安
定、水性アルカリ中と光暴露に不安定 分子式：Ｃ₁₉Ｈ₁₈Ｏ_７ 分子量：３５８ ＥＳＩ‐ＭＳ：３５９（Ｍ＋Ｈ）^＋ ＦＡＢ‐ＭＳ、ＨＲ：実測値：３５７．０９７４、（Ｍ
‐Ｈ_２＋Ｈ）^＋としての計算値３５７．０９７４ 実測値：３４１．１０２１、（Ｍ‐Ｈ_２Ｏ＋Ｈ）^＋とし
ての計算値３４１．１０２５

【００３１】最大ＵＶ：２２０、２５９．５および３３
５ｎｍ、０．２％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル
／水（９９：１）中で測定（図１参照） 赤外線スペクトル：ＫＢｒディスクとして測定されたＦ
Ｔ‐ＩＲスペクトル（図２）¹³ Ｃ‐ＮＭＲスペクトル：１４．５、２０．６／２４．
７、２５．６、４３．２、８６．３、９２．５、１０
８．１、１０９．７、１１０．８、１１８．６、１１
９．０、１３８．６、１５１．６、１６７．９、１６
８．０、１６８．６、１９３．２、１９５．５ｐｐｍ、
重水素クロロホルム中室温１２５ＭＨｚで測定^１ ‐ＮＭＲスペクトル：１．３１、１．５０、１．５
４、２．７７、４．７２、６．７４、１３．０および１
３．９ｐｐｍ、重水素クロロホルム中室温５００ＭＨｚ
で測定

【００３２】用途／医薬組成物 本発明による化合物はインターロイキン（ＩＬ‐４）の
ＩＬ‐４レセプターへの結合を阻害して、ＩＬ‐４の効
果を抑制することがわかった。このため、本発明による
化合物はＩＬ‐４の効果の有効な阻害剤である。本発明
による化合物のＩＬ‐４阻害効果は無細胞結合アッセイ
で測定することができる。

【００３３】ドイツ特許出願ＤＥ４３ ２２ ３３０
Ａ１では、ＴＨ２タイプのＴ‐ヘルパー細胞の出現増加
で特徴付けられる疾患の診断、治療および／または処置
がＩＬ‐４の効果を抑制することにより可能であること
を開示している。多くのアレルギー、ウイルス、寄生虫
および細菌疾患の治療および予防では深刻な問題を提示
し続けている。一部の寄生虫、ウイルスおよび細菌疾患
の過程において、ある変化がリンパ球および単球細胞の
サブ集団で起きることが知られている。これは、例えば
タイプ２のいわゆるＴ‐ヘルパー細胞（以下、ＴＨ２細
胞と呼ぶ）の出現増加と関連している。Ｔ細胞は通常表
面マーカーとそれらの機能に基づいてサブ集団に分ける
ことができる。このため、例えば、Ｔ‐ヘルパーリンパ
球はＣＤ４表面分子を有し、その活性化後にサイトカイ
ンを分泌する。

【００３４】健常マウスまたは同種異系細胞で刺激され
たマウスからのクローン化Ｔ‐ヘルパー細胞のサイトカ
インパターンの分析では、これらの細胞がインターロイ
キン‐２、インターロイキン‐４、γ‐インターフェロ
ン、インターロイキン‐５、インターロイキン‐６、イ
ンターロイキン‐１０およびリンホトキシンを産生する
ことを示した（いわゆるＴＨＯタイプのＴ‐ヘルパー細
胞）。例えば細菌抗原Brucella abortusまたはMycobact
erium tuberculosisによるマウスの感染後と、Ｔ‐ヘル
パー細胞によるクローニング後に、特にみられるクロー
ンは、リンホトキシン、γ‐インターフェロンおよびイ
ンターロイキン‐２を分泌するが、インターロイキン‐
４、インターロイキン‐５、インターロイキン‐６およ
びインターロイキン‐１０をほとんどまたは全く分泌し
ない（いわゆるＴＨ１タイプのＴ‐ヘルパー細胞）。

【００３５】例えばLeishmania majorのような寄生虫病
原体による感染性マウスの感染後において、Ｔ‐ヘルパ
ー細胞のクローニングで特に生じるクローンは、多量の
インターロイキン‐４、インターロイキン‐５およびイ
ンターロイキン‐１０と、少量または検出しえない量の
インターロイキン‐２およびγ‐インターフェロンを産
生した（ＴＨ２タイプのＴ‐ヘルパー細胞）（Mosmann
et al.,ImmunologicalReview,1991,No.123,209-229 ；
S.Romagnani,Immunology Today,256-257,Vol.12,No.8,1
991 ）。

【００３６】ＴＨ‐２リンパ球の出現増加は動物および
ヒトの一部感染疾患で既に検出されており（Else and G
renic,Parasitology Today,Vol.7,No.11,1991,pp.313-3
16；Parasitology Today,Vol.7,No.10,1991,pp.261）、
二次パラメーターにも反映される。このため、Leishman
ia majorに感染したマウスは通常γ‐インターフェロン
の産生減少、血清ＩｇＥおよび好酸球の大きな上昇を示
す。

【００３７】例えばらい腫らい(lepromatous leprosy)
、リーシュマニア症および住血吸虫症並びにMycobacte
rium tuberculosis感染のヒト患者は、正常人の血清と
比較してかなり高いＩｇＥ濃度を血清中で有することが
通常わかっている。寄生虫感染の場合には、好酸球増加
が疾患の過程でしばしば観察される。

【００３８】アトピー性皮膚炎および喘息のような即時
型のＩｇＥ媒介アレルギー反応は、このような調節不全
でも特徴付けられる。例えば、抗原特異性Ｔ‐細胞クロ
ーンは特にＴＨ２タイプのアトピー性皮膚炎の患者から
の皮膚生検から単離された（Kapsenberg et al,Immunol
ogy Today,Vol.12,No.11,1991,392-395 ）。

【００３９】本発明による化合物は、アレルギー（例え
ば抗喘息剤、免疫抑制剤）および感染、特にウイルス、
細菌および寄生虫感染、並びに真菌感染；好ましくはヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはマイコバクテリ
ア、特にMycobacterium leprae、リステリア、特にLeis
hmaniaおよびPlasmodium属の原生動物、特にSchistosom
a 、Nippostrongylus およびHeligmosomoides の蠕虫、
Trichurida、Trichinella 、Taenia(Cysticercus) 、Ca
ndida およびAspergillus による感染、の治療および予
防と診断の双方に適している。しかしながら、診断、治
療または予防処置は即時型のアレルギー反応、特にＩｇ
Ｅ媒介反応にも可能である。これらには特にアトピー性
皮膚炎および喘息がある。本発明による化合物は、更に
抗炎症剤または作物保護、特に抗真菌剤としての使用に
も適している。

【００４０】投与形は通常異なる疾患毎に違っている。
このため、例えば、局所投与は一部の疾患に有利であ
る。例えば、喘息には吸入投与、結膜炎には点眼投与、
アトピー性皮膚炎には皮膚または皮内投与が有利であ
り、その理由は病原性ＴＨ２細胞が特に局所的に検出で
きるからである。本発明による化合物は、インターロイ
キン（ＩＬ‐４）のＩＬ‐４レセプターへの結合を阻害
するための科学的手段として通常用いることもできる。

【００４１】本発明は本発明による化合物の１種以上を
含有した医薬組成物にも更に関する。医薬は、例えば錠
剤、コーティング錠剤、硬質もしくは軟質ゼラチンカプ
セル、溶液、エマルジョンまたは懸濁液の形で経口投与
しうる、例えば医薬品の形で用いることができる。場合
によりタンパク質のような成分を更に含有した、リポソ
ーム中への医薬の含有も、同様に適切な投与形である。
それらは例えば坐剤の形で経直腸的に、または例えば注
射溶液の形で非経口的に投与してもよい。医薬品を製造
するために、これらの化合物は治療上不活性な有機およ
び無機賦形剤で加工処理することができる。錠剤、コー
ティング錠剤および硬質ゼラチンカプセル用のこのよう
な賦形剤の例はラクトース、コーンスターチまたはその
誘導体、タルクおよびステアリン酸またはその塩であ
る。溶液を製造する上で適した賦形剤は水、ポリオー
ル、スクロース、転化糖およびグルコースである。注射
溶液に適した賦形剤は水、アルコール、ポリオール、グ
リセロールおよび植物油である。坐剤に適した賦形剤は
植物および硬化油、ワックス、脂肪および半液体ポリオ
ールである。医薬品は保存剤、溶媒、安定剤、湿潤剤、
乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、浸透圧を変える塩、
緩衝剤、コーティング剤、酸化防止剤および適宜に他の
治療活性物質も含有することができる。

【００４２】本発明は、本発明による化合物の少くとも
１種を薬学上適切で生理学上許容される賦形剤および適
宜に他の適切な活性物質、添加剤または補助物質と共に
適切な剤形に変換することからなる、本発明による医薬
の製造方法にも関する。好ましい投与形は、経口および
局所投与、例えばカテーテルまたは注射によるような局
部投与である。

【００４３】医薬品は好ましくは投薬単位で製造および
投与され、各単位は本発明による化合物またはそこから
誘導される化学誘導体の特定量を活性成分として含有し
ている。錠剤、カプセルおよび坐剤のような固形投薬単
位の場合には、この用量が１日当たりで約２００ｍｇ以
内、好ましくは約０．１〜１００ｍｇ、アンプル中注射
溶液の場合には約２００ｍｇ以内、好ましくは約０．５
〜１００ｍｇである。

【００４４】投与される１日量は、哺乳動物の体重、年
齢、性別および状態に依存している。しかしながら、そ
れより高いまたは低い１日量でもある状況には適するか
もしれない。１日量の投与は、１回の投薬単位の形で１
回の投与により、または数回の少量投薬単位にして特定
の間隔で分割用量の多数回投与により、双方で行うこと
ができる。

【００４５】

【実施例】下記例は、発明の範囲を以下なる場合にも制
限するものではなく、発明を詳細に説明するためのもの
ある。下記省略形が用いられる： 省略形： ＢＳＡ 牛血清アルブミン ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド ＥＬＩＳＡ 酵素結合イムノソルベントアッセイ ｈｕＩＬ ヒトインターロイキン ＩＬ インターロイキン ＰＢＳ リン酸緩衝液 ＰＢＳＡ ＰＢＳ中牛血清アルブミン

【００４６】実施例１ 産生株の胞子の懸濁液の調製 ５００ｍｌ無菌エルレンマイヤーフラスコ中の栄養溶液
１００ｍｌ（水道水１リットル中麦芽エキス２０ｇ、酵
母エキス２ｇ、グルコース１０ｇ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ
_４０．５ｇ、滅菌前ｐＨ６．０）を株で接種し、ロータ
リーシェーカー上１４０ｒｐｍおよび２５℃で７２時間
インキュベートする。次いで培養液２０ｍｌを栄養培地
〔ポテトインフュージョン４．０ｇ／リットル（Ｈ_２Ｏ
１０００ｍｌ中ポテト２００ｇからのインフュージョ
ン）、Ｄ‐グルコース２０．０ｇ／リットル、滅菌前ｐ
Ｈ５．６〕含有無菌５００ｍｌエルレンマイヤーフラス
コに均一に分散させ、それに寒天１５ｇ／リットルを固
化のために更に加えてデカントした。培養物を２５℃で
１０〜１４日間インキュベートする。このとき以後フラ
スコで産生された胞子を１滴の市販ノニオン系界面活性
剤（例えばTriton X 100（商標名）Serva 製）を含有し
た脱イオン水５００ｍｌで洗い流して、直ちに用いる
か、または−２２℃で５０％グリセロール中に貯蔵す
る。

【００４７】実施例２ エルレンマイヤーフラスコ中に
おける産生株の培養物または前培養物の調製 ａ）に記載された栄養溶液１００ｍｌ含有の無菌５００
ｍｌエルレンマイヤーフラスコを斜面チューブで増殖さ
せた培養物または胞子懸濁液０．２ｍｌで接種し、暗所
でシェーカー上１４０ｒｐｍおよび２５℃でインキュベ
ートする。式Ｉの化合物の最大産生は約９６時間後に達
する。同栄養溶液からの７２時間液内培養物（約５％接
種物）であれば、１０および１００ｌリットル醗酵槽に
接種する上で十分である。

【００４８】実施例３ シリアノンの製造 １０リットル醗酵槽を下記条件下で操作する： 栄養培地： ０．５ｇ／リットル カゼインペプトン ０．５ｇ／リットル 肉ペプトン １．０ｇ／リットル グルコース １．８ｇ／リットル マルトース ｐＨ６．０ （滅菌前） インキュベート時間：９６時間 インキュベート温度：２５℃ 撹拌速度： ２００ｒｐｍ、光排除 通気： 空気５リットル／min 泡形成は数滴のエタノール性ポリオール溶液の反復添加
で抑制することができる。最大産生には約９６時間後に
達する。

【００４９】実施例４ シリアノンの単離 実施例２のように得られた培養溶液９リットルを遠心
し、バイマス（〜１．５リットル）を０．５〜０．１％
トリフルオロ酢酸が添加されたアセトニトリル３リット
ルで２回各々撹拌することにより抽出した。合わせた抽
出液を真空下で濃縮し、ｎ‐ブタノールに溶解し、遠心
し、活性物質含有の透明上澄を減圧下で再び溶媒除去し
た。残渣を純粋なヘキサンで浸漬し、＋１℃で２０時間
放置し、得られた活性物質含有沈殿物を集めた（２．３
ｇ）。

【００５０】実施例５ シリアノンの精製 実施例３のように得られた生成物２ｇを１％トリフルオ
ロ酢酸含有の３０％強度アセトニトリル／水に溶解し、
ＭＣＩゲルＣＨＰ２０Ｐ（７５〜１５０μ、三菱化成
社、東京）で充填されたキャパシティ１５０ｍｌのカラ
ムにのせた。溶出は０．０５Ｍトリフルオロ酢酸中３０
〜６０％アセトニトリルの勾配で行った。シリアノン含
有分画を集め、真空濃縮後に２５０／３２ Nucleosil
（商標名）１００‐７Ｃ₁₈ＡＢ（Macherey-Nagel,Dure
n) で精製した。１％トリフルオロ酢酸中２０〜６０％
アセトニトリルを溶出液として用いた。純粋シリアノン
含有分画を凍結乾燥した（６０ｍｇ、純度９８％）。

【００５１】質量スペクトル測定データ： ＥＳＩ‐ＭＳ：３５９（Ｍ＋Ｈ）^＋、分子式Ｃ₁₉Ｈ₁₈Ｏ
_７に相当 ＦＡＢ‐ＭＳ、ＨＲ：実測値：３５７．０９７４、（Ｍ
‐Ｈ_２＋Ｈ）^＋としての計算値３５７．０９７４、およ
び実測値：３４１．１０２１、（Ｍ‐Ｈ_２Ｏ＋Ｈ）^＋と
しての計算値３４１．１０２５

【００５２】ＮＭＲシグナル：¹³Ｃ‐ＮＭＲスペクト
ル：１４．５、２０．６／２４．７、２５．６、４３．
２、８６．３、９２．５、１０８．１、１０９．７、１
１０．８、１１８．６、１１９．０、１３８．６、１５
１．６、１６７．９、１６８．０、１６８．６、１９
３．２、１９５．５ｐｐｍ、重水素クロロホルム中１２
５ＭＨｚで測定

【００５３】^１‐ＮＭＲシグナル：１．３１、１．５
０、１．５４、２．７７、４．７２、６．７４、１３．
０および１３．９ｐｐｍ、重水素クロロホルム中５００
ＭＨｚで測定 ＵＶ：図１参照 ＩＲ：図２参照

【００５４】実施例６ 無細胞結合アッセイにおけるＩ
Ｌ‐４結合の特異的阻害 ＥＰ ４８８ １７０ Ａ１では無細胞結合アッセイに
ついて開示している。それらは、膜に通常位置する細胞
外領域のレセプターと、そのカルボキシル末端にヒン
ジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる免疫グロブリ
ン重鎖のＦｃ領域が融合された組換えキメラタンパク質
を用いて行う。いわゆるレセプター／Ｆｃ融合タンパク
質は、特異的レセプター結合活性を留めながら、例えば
Ｆｃ部分に対するモノクローナル抗体で既にコートされ
た固相に結合させることができる。この例に用いられる
固相はNunc（商標名）タイプＢ ＥＬＩＳＡプレートで
あった。１０mg/ml ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）含有ＰＢＳに溶
解されたレセプター／Ｆｃ融合タンパク質をこれらの前
処理プレートに結合させた（HulL-4R/Ｆｃ：５００ng/m
l ；mulL-4R/Ｆｃ：２５０ng/ml ；hulL-1R/Ｆｃ：１２
５ng/ml ；室温で１時間）。洗浄後、ペプチドまたは特
定の特異的未標識リガンド（hulL-4R/Ｆｃ：hulL-4；mu
lL-4R/Ｆｃ：mulL-4；hulL-1R/Ｆｃ：hulL-1ra）を様々
な濃度で加え、その後特異的リガンドを一定濃度で（１
００ng/ml ）でビオチニル化形で加えた。インキュベー
トを５％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳＡ中室温で１時間行った。
洗浄後に、ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ（Am
ersham、ＰＢＳＡ中１：２０００）と共に室温で２０分
間インキュベートした。結合ペルオキシダーゼをテトラ
メチルベンジジン基質溶液（Behringwerke）でもう１回
洗浄後に検出した。３０分間のインキュベート後、４５
０ｎｍの吸光度を測定した。それはレセプターに結合さ
れたビオチニル化リガンドの量を直接反映している。図
３では、測定された吸光シグナルは競合剤の不在下で測
定された吸光度を１００％値として用いて、競合剤の濃
度の関数としてプロットした。

【００５５】図３は、ＨｕｌＬ‐４結合アッセイで、未
標識ｈｕｌＬ‐４がヒトＩＬ‐４レセプターとの結合に
ついてビオチニル化ｈｕｌＬ‐４と競合することを示し
ている。ＩＣ₅₀＝２０μg/mlは５５．９μmol/mlに相当
する。

【図面の簡単な説明】

【図１】アセトニトリル／Ｈ_２Ｏ（９９：１）、０．２
％トリフルオロ酢酸中の本発明による化合物のＵＶスペ
クトルを示した図である。

【図２】本発明による化合物のＦＴ‐ＩＲスペクトルを
示した図である。ＫＢｒディスクとして測定した。

【図３】ＩＬ‐４レセプターアッセイの結果を示した図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/34 ＡＥＤ Ａ６１Ｋ 31/34 ＡＥＤ Ｃ１２Ｎ 1/14 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/14 Ａ 8828−4Ｂ Ｂ Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｐ 17/04 //(Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:80） (72)発明者 ビルギット、ヨルダン ドイツ連邦共和国ハッテルスハイム、イ ム、ヘールヒェン、44 (72)発明者 ヨアヒム、ウィンク ドイツ連邦共和国レーデルマルク、マクデ ブルガー、シュトラーセ、14 (72)発明者 レアンダー、ラウファー ドイツ連邦共和国グラーデンバッハ、シュ ロースアレー、25

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式Ｉの化合物およびその生理学上許容
   される塩。 【化１】 （上記式中 ａ）Ｒ^１およびＲ^２は互いに独立して‐Ｃ_ｎＨ_2n‐
   Ｒ^３、‐Ｏ‐Ｒ^３、 ‐Ｓ‐Ｒ^３またはＮＨ‐Ｒ^３であり、 Ｒ^３は水素、（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルカノイルまたは置換も
   しくは非置換（Ｃ_１‐Ｃ_６）アルキル基であり、および
   ｎは１、２、３、４、５または６であるか、あるいは ｂ）Ｒ^１およびＲ^２はそれらを有する炭素原子と一緒に
   なって、炭素原子３〜９の置換または非置換脂環式基を
   形成している）
2. 【請求項２】Ｒ^１がＯＨであり、Ｒ^２がＯＨ、ＮＨ‐Ｒ
   ^３またはＣＨ_２‐Ｒ^３であり、Ｒ^３が水素、ホルミル、
   アセチル、カルボキシメチルまたはカルボキシエチルで
   ある、請求項１に記載の式Ｉの化合物およびその薬理学
   上許容される塩。
3. 【請求項３】Ｒ^１およびＲ^２がヒドロキシルである、請
   求項１または２に記載の式Ｉの化合物およびその薬理学
   上許容される塩。
4. 【請求項４】シリアノンが培養ブロス中に蓄積するまで
   Penicillium 種ＨＡＧ０２５９を培地で発酵させ、その
   後活性物質およびその薬理学上許容される塩を単離およ
   び精製することによりPenicillium 種ＨＡＧ０２５９か
   ら得られる、分子式Ｃ₁₉Ｈ₁₈Ｏ_７（シリアノン）の化合
   物。
5. 【請求項５】シリアノンが培養ブロス中に蓄積するまで
   Penicillium 種ＨＡＧ０２５９を培地で発酵させ、その
   後活性物質を単離および精製して、化学誘導体およびそ
   の薬理学上許容される塩に変換することによってPenici
   llium 種ＨＡＧ０２５９から得られる、分子式Ｃ₁₉Ｈ₁₈
   Ｏ_７（シリアノン）の化合物から誘導される化学誘導
   体。
6. 【請求項６】シリアノンが培養ブロス中に蓄積するまで
   Penicillium 種ＨＡＧ０２５９またはその変異体および
   ／または変種を培地で発酵させ、それを培地ブロスから
   単離して、適宜にそれを化学誘導体に変換することから
   なる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物の製
   造方法。
7. 【請求項７】Penicillium 種ＨＡＧ０２５９またはその
   変異体および／または変種が好気性条件下で炭素源およ
   び窒素源と慣用的無機塩および微量元素とを含有した培
   地で発酵される、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】発酵が、０．１〜３％カゼインペプトン、
   ０．１〜３％肉ペプトン、０．１〜５％グルコースおよ
   び０．１〜７％マルトースを含有し、かつ１〜７のｐＨ
   を有する栄養培地中、１５〜３７℃で２４〜３００時間
   かけて行われる、請求項６または７に記載の方法。
9. 【請求項９】栄養培地が０．２〜１％カゼインペプト
   ン、０．２〜１％肉ペプトン、０．５〜２％グルコース
   および１〜２％マルトースを含有し、培養が１〜７のｐ
   Ｈおよび１５〜３０℃の温度で２４〜３００時間かけて
   行われる、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 【請求項１０】培養が２．５〜４．５のｐＨおよび２０
    〜３０℃の温度で３６〜１４０時間かけて行われる、請
    求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 【請求項１１】請求項１〜５のいずれか一項に記載され
    た少くとも１種の化合物および１種以上の生理学上許容
    される賦形剤と、適宜に適切な添加剤および／または補
    助物質を含有してなる医薬。
12. 【請求項１２】請求項１〜５のいずれか一項に記載され
    た少くとも１種の活性化合物を生理学上許容される賦形
    剤および適宜に適切な添加剤および／または補助物質と
    混合することからなる、請求項１１に記載の医薬の製造
    方法。
13. 【請求項１３】アレルギー、ウイルス、寄生虫および細
    菌疾患並びに真菌感染の治療および予防用医薬の製造に
    関する、請求項１〜５のいずれか一項に記載された化合
    物の使用。
14. 【請求項１４】薬理学上活性な物質としてまたはインタ
    ーロイキン（ＩＬ‐４）のＩＬ‐４レセプターへの結合
    を阻害するための科学的手段としての、請求項１〜５の
    いずれか一項に記載された化合物の使用。
15. 【請求項１５】Penicillium 種ＨＡＧ０２５９（ＤＳＭ
    ９７９１）。