JPH08308576A - ターゲット遺伝子を捕捉するための新規ベクター及びその使用 - Google Patents
ターゲット遺伝子を捕捉するための新規ベクター及びその使用Info
- Publication number
- JPH08308576A JPH08308576A JP8029792A JP2979296A JPH08308576A JP H08308576 A JPH08308576 A JP H08308576A JP 8029792 A JP8029792 A JP 8029792A JP 2979296 A JP2979296 A JP 2979296A JP H08308576 A JPH08308576 A JP H08308576A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- vector
- gene
- cell
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1051—Gene trapping, e.g. exon-, intron-, IRES-, signal sequence-trap cloning, trap vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/033—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the internal surface of the plasma membrane, e.g. containing a myristoylation motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞外たんぱく質を単離して突然変異分泌遺
伝子を有する細胞および微生物を作るための分泌遺伝子
捕捉ベクターおよびこのようなベクターを使う方法を提
供するものである。 【解決手段】 ベクターはII型トランスメンブラン領域
および腔- 感受性指示標識物および場合により選択可能
な標識物とエキソンスプライス受容体部位をコードす
る。遺伝子単離方法は、分泌捕捉ベクターを内因性遺伝
子へ安定的に導入し、これにより得られた融合たんぱく
質の発現が内因性遺伝子がN-末端シグナル配列を提供す
るかどうかにしたがって指示標識物の異なった発現をも
たらす。
伝子を有する細胞および微生物を作るための分泌遺伝子
捕捉ベクターおよびこのようなベクターを使う方法を提
供するものである。 【解決手段】 ベクターはII型トランスメンブラン領域
および腔- 感受性指示標識物および場合により選択可能
な標識物とエキソンスプライス受容体部位をコードす
る。遺伝子単離方法は、分泌捕捉ベクターを内因性遺伝
子へ安定的に導入し、これにより得られた融合たんぱく
質の発現が内因性遺伝子がN-末端シグナル配列を提供す
るかどうかにしたがって指示標識物の異なった発現をも
たらす。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、膜および分泌たん
ぱく質をコードする標的遺伝子を補足するための新規ベ
クターおよびその使用に関する。
ぱく質をコードする標的遺伝子を補足するための新規ベ
クターおよびその使用に関する。
【従来の技術】分泌たんぱく質は、絶対ではないが一般
に、おおよそ18-25 個の疎水性アミノ酸のN-末端延長部
( または" シグナル配列" ）を有することが特徴的であ
る。このシグナル配列は翻訳生成物を分泌経路へ向かわ
せるものであり、これによりポリペプチドが細胞外へ出
るために細胞膜を通り抜けるようになる。通常、シグナ
ル配列は分泌過程の間にたんぱく質加水分解によりポリ
ペプチドから分解され、これにより最終分泌生成物には
この配列がない。このクラスの分泌たんぱく質には、た
とえばポリペプチドホルモンおよびサイトキンが含まれ
る。
に、おおよそ18-25 個の疎水性アミノ酸のN-末端延長部
( または" シグナル配列" ）を有することが特徴的であ
る。このシグナル配列は翻訳生成物を分泌経路へ向かわ
せるものであり、これによりポリペプチドが細胞外へ出
るために細胞膜を通り抜けるようになる。通常、シグナ
ル配列は分泌過程の間にたんぱく質加水分解によりポリ
ペプチドから分解され、これにより最終分泌生成物には
この配列がない。このクラスの分泌たんぱく質には、た
とえばポリペプチドホルモンおよびサイトキンが含まれ
る。
【０００２】膜の間にまたがるたんぱく質( membrane-s
panning proteins)は、一般に、シグナル配列のほか
に、シグナル配列の下流に、しばしば同じサイズの一つ
以上の疎水性配列を含む。トランスメンブラン領域はポ
リペプチドのこれ以上の移動を妨害し、この結果、膜の
間にまたがるたんぱく質が製造される。このクラスのト
ランスメンブランたんぱく質は全てI 型配向を指し、こ
こではたんぱく質のN-末端が細胞の外側に向けられ、そ
してたとえばポリペプチドホルモンのレセプターおよび
サイトキンのレセプターを含む。また、N-末端シグナル
配列のない膜間たんぱく質の少数のクラスがあり、これ
らのたんぱく質はI 型またはII型配向のいずれかで存在
するであろう( ハイ、1992) 。II型膜たんぱく質は、N-
末端が細胞質ゾルに残るように膜に挿入される。これら
のたんぱく質が選ぶ配向は主に内部トランスメンブラン
領域を横切る電位差により決定される( ハートマン、ラ
ッパポルトおよびロディッシュ、1989) 。
panning proteins)は、一般に、シグナル配列のほか
に、シグナル配列の下流に、しばしば同じサイズの一つ
以上の疎水性配列を含む。トランスメンブラン領域はポ
リペプチドのこれ以上の移動を妨害し、この結果、膜の
間にまたがるたんぱく質が製造される。このクラスのト
ランスメンブランたんぱく質は全てI 型配向を指し、こ
こではたんぱく質のN-末端が細胞の外側に向けられ、そ
してたとえばポリペプチドホルモンのレセプターおよび
サイトキンのレセプターを含む。また、N-末端シグナル
配列のない膜間たんぱく質の少数のクラスがあり、これ
らのたんぱく質はI 型またはII型配向のいずれかで存在
するであろう( ハイ、1992) 。II型膜たんぱく質は、N-
末端が細胞質ゾルに残るように膜に挿入される。これら
のたんぱく質が選ぶ配向は主に内部トランスメンブラン
領域を横切る電位差により決定される( ハートマン、ラ
ッパポルトおよびロディッシュ、1989) 。
【０００３】様々な発現クローニング方法が長年にわた
って分泌たんぱく質および膜間たんぱく質を同定するた
めに展開されてきた( シモンズ、1993) 。これらの方法
はランダムにcDNAを発現ベクターへクローニングし、そ
してトランスフェクトした細胞を細胞表面の抗原決定基
の出現に関しスクリーニングすることに基づく。この技
術の最近の実施態様、" シグナル配列捕捉" ( タシロ
ら、1993) 、において、N-末端シグナル配列をコードす
るcDNAフラグメントは、一時的にトランスフェクトした
細胞の表面における特異的抗原決定基の出現について分
析することにより同定された。新規分泌または膜間たん
ぱく質を同定するための発現クローニングシステムは、
技術的な要求が多過ぎそして一般には量の多いmRNA種の
検出の方に都合が良い。さらに、これらの方法で単離さ
れた遺伝子の機能および発現プロフィールは、かなり努
力しないと確認できない。
って分泌たんぱく質および膜間たんぱく質を同定するた
めに展開されてきた( シモンズ、1993) 。これらの方法
はランダムにcDNAを発現ベクターへクローニングし、そ
してトランスフェクトした細胞を細胞表面の抗原決定基
の出現に関しスクリーニングすることに基づく。この技
術の最近の実施態様、" シグナル配列捕捉" ( タシロ
ら、1993) 、において、N-末端シグナル配列をコードす
るcDNAフラグメントは、一時的にトランスフェクトした
細胞の表面における特異的抗原決定基の出現について分
析することにより同定された。新規分泌または膜間たん
ぱく質を同定するための発現クローニングシステムは、
技術的な要求が多過ぎそして一般には量の多いmRNA種の
検出の方に都合が良い。さらに、これらの方法で単離さ
れた遺伝子の機能および発現プロフィールは、かなり努
力しないと確認できない。
【０００４】" 遺伝子捕捉( gene trapping)" は、真核
細胞の遺伝子におけるランダムな挿入変異を発生させる
ために発展してきた( コズラーら、1989; ブレナーら、
1989; ケールら、1989；およびフリードリッヒおよびソ
リアノ、1991) 。一般には、このようなベクターは、組
み換え配列を形成するするために転写単位を挿入された
ベクター配列の単離を促進する構造成分および得られた
組み換え配列を同定および／または特性決定させる他の
要素を有する。したがってたとえば、公知ベクターは、
真核構造遺伝子、たとえば全てのエキソンの5'末端に生
じるスプライス受容体部位および最終エキソンの後に通
常は続くポリアデニル化部位と普通は結合する配列を含
む。ベクターが正しい向きでイントロンへ挿入した場
合、スプライス受容体およびポリアデニル化部位を利用
してベクターのレポーター遺伝子配列へスプライスされ
た標的遺伝子の一部分を含む融合RNA 転写物が生じる。
同様な機能を有する他のベクターは、スプライシングに
頼らず単に標的遺伝子のコード配列内での組み換えの結
果としてランダムな組み換えが起こる。
細胞の遺伝子におけるランダムな挿入変異を発生させる
ために発展してきた( コズラーら、1989; ブレナーら、
1989; ケールら、1989；およびフリードリッヒおよびソ
リアノ、1991) 。一般には、このようなベクターは、組
み換え配列を形成するするために転写単位を挿入された
ベクター配列の単離を促進する構造成分および得られた
組み換え配列を同定および／または特性決定させる他の
要素を有する。したがってたとえば、公知ベクターは、
真核構造遺伝子、たとえば全てのエキソンの5'末端に生
じるスプライス受容体部位および最終エキソンの後に通
常は続くポリアデニル化部位と普通は結合する配列を含
む。ベクターが正しい向きでイントロンへ挿入した場
合、スプライス受容体およびポリアデニル化部位を利用
してベクターのレポーター遺伝子配列へスプライスされ
た標的遺伝子の一部分を含む融合RNA 転写物が生じる。
同様な機能を有する他のベクターは、スプライシングに
頼らず単に標的遺伝子のコード配列内での組み換えの結
果としてランダムな組み換えが起こる。
【０００５】レポーター遺伝子の発現を活性化する各々
の挿入は、理論的には標的遺伝子の正常なコード配列を
中断して突然変異を起こす挿入を表す。さらに、レポー
ター遺伝子の発現は、標的遺伝子の調節管理下にあり、
したがってレポーター遺伝子の発現は標的遺伝子の発現
パターンを反映すべきものである( スカルネスら、199
2) 。最後に、RNA 融合転写物に含まれる標的遺伝子の
一部は融合転写物からまたは挿入部位の下流のゲノムDN
A から直接クローン化されうる( スカルネスら、1992；
フォンメルヒナーら、1992；チェンら、1994；デグレゴ
リーら、1994) 。マウス胚幹(ES)細胞の遺伝子捕捉はこ
れまで、マウスが成長する間に発現した遺伝子を同定し
そして同時に突然変異化するための迅速であるがしかし
実質的にランダムな方法を提供してきた( スカルネス
ら、1990) 。しかしながら、様々な選択基準に基づいて
標的真核遺伝子を同定および／または単離する必要があ
る。興味のある特定クラスの遺伝子は、分泌および膜間
たんぱく質をコードするものである。
の挿入は、理論的には標的遺伝子の正常なコード配列を
中断して突然変異を起こす挿入を表す。さらに、レポー
ター遺伝子の発現は、標的遺伝子の調節管理下にあり、
したがってレポーター遺伝子の発現は標的遺伝子の発現
パターンを反映すべきものである( スカルネスら、199
2) 。最後に、RNA 融合転写物に含まれる標的遺伝子の
一部は融合転写物からまたは挿入部位の下流のゲノムDN
A から直接クローン化されうる( スカルネスら、1992；
フォンメルヒナーら、1992；チェンら、1994；デグレゴ
リーら、1994) 。マウス胚幹(ES)細胞の遺伝子捕捉はこ
れまで、マウスが成長する間に発現した遺伝子を同定し
そして同時に突然変異化するための迅速であるがしかし
実質的にランダムな方法を提供してきた( スカルネス
ら、1990) 。しかしながら、様々な選択基準に基づいて
標的真核遺伝子を同定および／または単離する必要があ
る。興味のある特定クラスの遺伝子は、分泌および膜間
たんぱく質をコードするものである。
【０００６】遺伝子捕捉ベクターは、一般に、β- ガラ
クトシダーゼレポーター遺伝子を含む。β- ガラクトシ
ダーゼ( β- gal)はシグナル配列およびトランスメンブ
ラン領域のない細胞質ゾル酵素である。このレポーター
は、β- gal がその酵素活性に影響を及ぼすことなく大
きなN-末端融合体に順応できるという事実のために細菌
において遺伝子融合体を発現するための特に有用な道具
であった( カサダバン、チョウおよびコーヘン、1980)
。分泌された分子の全てまたは一部を含む融合体を使
用して分泌を開始するN-末端シグナル配列に対する要求
を決めていた( ベンソン、ホールおよびシルハビィ、19
85; シルハビィおよびベックウィズ、1985) 。しかしな
がら、これらの融合体は細胞外に出ず、β- gal が細菌
膜を通過することができないことを示唆する。同様に、
β- gal レポーターは真核細胞において分泌経路と不適
合であることがわかっている。酵母において、インベル
ターゼ酵素のシグナル配列を含むβ- gal 融合体はERの
膜フラクションと結合するがしかしさらに分泌経路に沿
って通ることはできない( エルムら、1984) 。これらの
例では、β- gal 活性は保存される。対照的に、カエノ
ルハビディテス エレガンス( Caenorhabditis elegan
s）では、β- gal 活性は分泌したラミニンのN-末端シ
グナル配列を含む融合体において失われる( ファイア
ー、ハリソンおよびディクソン、1990）。シグナル配列
およびβ- gal の間に予測したI 型( ハートマンら、19
89) トランスメンブラン領域を含むと、多分細胞質ゾル
にβ- gal を維持することにより、融合体たんぱく質に
対する酵素活性が回復した。
クトシダーゼレポーター遺伝子を含む。β- ガラクトシ
ダーゼ( β- gal)はシグナル配列およびトランスメンブ
ラン領域のない細胞質ゾル酵素である。このレポーター
は、β- gal がその酵素活性に影響を及ぼすことなく大
きなN-末端融合体に順応できるという事実のために細菌
において遺伝子融合体を発現するための特に有用な道具
であった( カサダバン、チョウおよびコーヘン、1980)
。分泌された分子の全てまたは一部を含む融合体を使
用して分泌を開始するN-末端シグナル配列に対する要求
を決めていた( ベンソン、ホールおよびシルハビィ、19
85; シルハビィおよびベックウィズ、1985) 。しかしな
がら、これらの融合体は細胞外に出ず、β- gal が細菌
膜を通過することができないことを示唆する。同様に、
β- gal レポーターは真核細胞において分泌経路と不適
合であることがわかっている。酵母において、インベル
ターゼ酵素のシグナル配列を含むβ- gal 融合体はERの
膜フラクションと結合するがしかしさらに分泌経路に沿
って通ることはできない( エルムら、1984) 。これらの
例では、β- gal 活性は保存される。対照的に、カエノ
ルハビディテス エレガンス( Caenorhabditis elegan
s）では、β- gal 活性は分泌したラミニンのN-末端シ
グナル配列を含む融合体において失われる( ファイア
ー、ハリソンおよびディクソン、1990）。シグナル配列
およびβ- gal の間に予測したI 型( ハートマンら、19
89) トランスメンブラン領域を含むと、多分細胞質ゾル
にβ- gal を維持することにより、融合体たんぱく質に
対する酵素活性が回復した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ここにおいて、上記で
概略した問題を解決しそして遺伝子捕捉のプロトコール
に基づいたより一層明確な形の方法を見出した。修飾さ
れた遺伝子捕捉ベクター、分泌捕捉は、β- gal レポー
ター遺伝子の活性がベクター挿入の部位で内因性遺伝子
からのシグナル配列の獲得に依存するように計画され
た。シグナル配列を含まずレポーターを活性化すること
ができない融合体は、かなりの努力をすることなしには
確認することができない。
概略した問題を解決しそして遺伝子捕捉のプロトコール
に基づいたより一層明確な形の方法を見出した。修飾さ
れた遺伝子捕捉ベクター、分泌捕捉は、β- gal レポー
ター遺伝子の活性がベクター挿入の部位で内因性遺伝子
からのシグナル配列の獲得に依存するように計画され
た。シグナル配列を含まずレポーターを活性化すること
ができない融合体は、かなりの努力をすることなしには
確認することができない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】標的遺伝子を検出および
／または単離するための方法および組成物が提供され
る。本発明の第一の見地によれば、標的真核遺伝子へ挿
入すると、発現時に真核遺伝子の核酸配列によりコード
されるそのアミノ酸配列の第一の部分およびベクターの
核酸配列によりコードされるそのアミノ酸配列の第二の
部分を有するポリペプチドをコードする修飾された遺伝
子を産生する成分を含むベクターであって、該ベクター
が、その結果前記ポリペプチドが宿主細胞の構造成分と
予め決められた空間的関係で位置するようになるアミノ
酸配列をコードする核酸配列の真核遺伝子における存在
と示差的（differentially）に結合し特性をポリペプチ
ドに付与する配列を含むことを特徴とするものである。
／または単離するための方法および組成物が提供され
る。本発明の第一の見地によれば、標的真核遺伝子へ挿
入すると、発現時に真核遺伝子の核酸配列によりコード
されるそのアミノ酸配列の第一の部分およびベクターの
核酸配列によりコードされるそのアミノ酸配列の第二の
部分を有するポリペプチドをコードする修飾された遺伝
子を産生する成分を含むベクターであって、該ベクター
が、その結果前記ポリペプチドが宿主細胞の構造成分と
予め決められた空間的関係で位置するようになるアミノ
酸配列をコードする核酸配列の真核遺伝子における存在
と示差的（differentially）に結合し特性をポリペプチ
ドに付与する配列を含むことを特徴とするものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明による特に有用なベクター
群は、ポリペプチドに分泌または膜間たんぱく質と結合
するシグナル配列の真核遺伝子における存在と示差的に
結合する特性を付与する一つ以上の配列を含むベクター
である。アミノ酸配列をコードする核酸配列の標的真核
遺伝子における存在と" 示差的に結合" しその結果キメ
ラポリペプチドが宿主細胞の構造成分と予め決められた
空間的関係に位置することにより、示差的に結合する特
性の存在または不存在は、本発明のベクターが、(1) そ
の結果キメラポリペプチドが宿主細胞の構造成分と予め
決められた空間的関係に位置することになるアミノ酸配
列をコードする核酸配列を有する標的真核遺伝子と、
(2) その結果キメラポリペプチドが宿主細胞の構造成分
と予め決められた空間的関係に位置することになるアミ
ノ酸配列をコードする核酸配列が欠けている標的真核遺
伝子との間の区別をすることができる。本発明の好まし
い実施態様において、本発明のベクターは、(1) シグナ
ル配列を有するたんぱく質たとえば分泌たんぱく質をコ
ードする標的真核遺伝子と(2) シグナル配列を有さない
たんぱく質たとえば非- 分泌たんぱく質をコードする標
的真核遺伝子との間を区別することができる。
群は、ポリペプチドに分泌または膜間たんぱく質と結合
するシグナル配列の真核遺伝子における存在と示差的に
結合する特性を付与する一つ以上の配列を含むベクター
である。アミノ酸配列をコードする核酸配列の標的真核
遺伝子における存在と" 示差的に結合" しその結果キメ
ラポリペプチドが宿主細胞の構造成分と予め決められた
空間的関係に位置することにより、示差的に結合する特
性の存在または不存在は、本発明のベクターが、(1) そ
の結果キメラポリペプチドが宿主細胞の構造成分と予め
決められた空間的関係に位置することになるアミノ酸配
列をコードする核酸配列を有する標的真核遺伝子と、
(2) その結果キメラポリペプチドが宿主細胞の構造成分
と予め決められた空間的関係に位置することになるアミ
ノ酸配列をコードする核酸配列が欠けている標的真核遺
伝子との間の区別をすることができる。本発明の好まし
い実施態様において、本発明のベクターは、(1) シグナ
ル配列を有するたんぱく質たとえば分泌たんぱく質をコ
ードする標的真核遺伝子と(2) シグナル配列を有さない
たんぱく質たとえば非- 分泌たんぱく質をコードする標
的真核遺伝子との間を区別することができる。
【００１０】前記" 付与する(conferring)" 配列はたと
えば膜結合たんぱく質の少なくとも一部分を含むことが
できる。この実施態様において、ベクターのレポーター
遺伝子要素によりコードされるたんぱく質生成物は、標
的遺伝子へ組み込まれた時、遺伝子が分泌または膜間た
んぱく質と結合するシグナル配列を含むかどうかにした
がって、二つの立体配置のうちの一つを強制的にとるこ
とができる。すなわちたとえば、遺伝子が分泌または膜
間たんぱく質をコードする場合、ベクター配列の膜結合
たんぱく質要素によりレポーター遺伝子生成物が活性化
されそして検出可能な信号を作るように細胞成分と関係
する立体配置をとる。これに代わり、ベクターを分泌ま
たは膜間たんぱく質をコードしない標的遺伝子へ組み込
んだ場合、ベクター配列の膜結合たんぱく質要素によ
り、レポーター遺伝子生成物が活性化されずしたがって
検出可能なシグナルを生成しないように細胞成分と関係
する立体配置をとるであろう。
えば膜結合たんぱく質の少なくとも一部分を含むことが
できる。この実施態様において、ベクターのレポーター
遺伝子要素によりコードされるたんぱく質生成物は、標
的遺伝子へ組み込まれた時、遺伝子が分泌または膜間た
んぱく質と結合するシグナル配列を含むかどうかにした
がって、二つの立体配置のうちの一つを強制的にとるこ
とができる。すなわちたとえば、遺伝子が分泌または膜
間たんぱく質をコードする場合、ベクター配列の膜結合
たんぱく質要素によりレポーター遺伝子生成物が活性化
されそして検出可能な信号を作るように細胞成分と関係
する立体配置をとる。これに代わり、ベクターを分泌ま
たは膜間たんぱく質をコードしない標的遺伝子へ組み込
んだ場合、ベクター配列の膜結合たんぱく質要素によ
り、レポーター遺伝子生成物が活性化されずしたがって
検出可能なシグナルを生成しないように細胞成分と関係
する立体配置をとるであろう。
【００１１】ベクター配列の膜たんぱく質結合たんぱく
質要素は好ましくはII型トランスメンブラン領域すなわ
ち膜間配列および必要ならばぶらさがり配列(flanking
sequence) を含む領域である( 以下参照）。すなわち、
好ましいベクターはレポーター遺伝子およびII型トラン
スメンブラン領域であって好ましくはレポーターのN-末
端に位置するものを含み、それぞれが修飾遺伝子の発現
時にレポーターポリペプチドの検出がシグナル配列を有
する分泌たんぱく質をコードする真核遺伝子に依存し、
そしてレポーターは真核遺伝子が非- 分泌たんぱく質を
コードする場合実質的に検出することができないように
配置している。レポーターは一般に特徴的表現型、たと
えば酵素活性たとえばβ- ガラクトシダーゼ活性を提供
する。本発明のベクターは、好ましくは真核遺伝子への
前記成分の挿入を促進する核酸配列を含む。これらの配
列は、たとえば（a)m RNA からのイントロン配列の排除
に関連する配列たとえばスプライス受容体配列、または
（b)ポリアデニル化シグナル配列である。これに代わ
り、ベクターはスプライス受容体配列がなく、したがっ
て遺伝子のコード配列へ直接挿入されてもよい。
質要素は好ましくはII型トランスメンブラン領域すなわ
ち膜間配列および必要ならばぶらさがり配列(flanking
sequence) を含む領域である( 以下参照）。すなわち、
好ましいベクターはレポーター遺伝子およびII型トラン
スメンブラン領域であって好ましくはレポーターのN-末
端に位置するものを含み、それぞれが修飾遺伝子の発現
時にレポーターポリペプチドの検出がシグナル配列を有
する分泌たんぱく質をコードする真核遺伝子に依存し、
そしてレポーターは真核遺伝子が非- 分泌たんぱく質を
コードする場合実質的に検出することができないように
配置している。レポーターは一般に特徴的表現型、たと
えば酵素活性たとえばβ- ガラクトシダーゼ活性を提供
する。本発明のベクターは、好ましくは真核遺伝子への
前記成分の挿入を促進する核酸配列を含む。これらの配
列は、たとえば（a)m RNA からのイントロン配列の排除
に関連する配列たとえばスプライス受容体配列、または
（b)ポリアデニル化シグナル配列である。これに代わ
り、ベクターはスプライス受容体配列がなく、したがっ
て遺伝子のコード配列へ直接挿入されてもよい。
【００１２】問題のベクターはまた、ベクター成分が標
的真核遺伝子へ挿入される結果、形質転換された細胞の
選択および／または同定を可能にする要素を含んでもよ
い。このような選択可能の要素は、示差的に結合する特
性とは別に、形質転換細胞における第二の特性を伝え
る：たとえば、ベクターの成分を標的真核遺伝子へ挿入
してその結果抗生物質耐性または限定した培地において
生き残りおよび／または増幅することができる能力を付
与することからなる細胞の選択ができる特性である。こ
のようなマーカー配列の例は、その結果形質転換された
細胞が抗生物質たとえばG418に対し耐性であるか、また
は様々な程度の増殖因子または栄養依存性を有するよう
になるものである。その結果キメラポリペプチドが示差
的結合特性および顕著な選択可能特性の両方を有するこ
とになる配列を有するベクターが、二つの特性が同じ要
素から得られうるとしても、特に好ましい( たとえば細
胞の構造成分と予め決められた空間的関係にしたがって
示差的に活性である選択可能なマーカー）。前者のベク
ターの例としては、キメラたんぱく質においてβ- ガラ
クトシダーゼ( β- gal)とネオマイシン(neo) ホスホト
ランスフェラーゼ活性の両方を付与する配列を有するも
のである。一つの構築物においてβ- ガラクトシダーゼ
( β- gal)とネオマイシン(neo) ホスホトランスフェラ
ーゼ活性の両方を付与する構築されたβgeo 組合せ配列
が特に好ましい。
的真核遺伝子へ挿入される結果、形質転換された細胞の
選択および／または同定を可能にする要素を含んでもよ
い。このような選択可能の要素は、示差的に結合する特
性とは別に、形質転換細胞における第二の特性を伝え
る：たとえば、ベクターの成分を標的真核遺伝子へ挿入
してその結果抗生物質耐性または限定した培地において
生き残りおよび／または増幅することができる能力を付
与することからなる細胞の選択ができる特性である。こ
のようなマーカー配列の例は、その結果形質転換された
細胞が抗生物質たとえばG418に対し耐性であるか、また
は様々な程度の増殖因子または栄養依存性を有するよう
になるものである。その結果キメラポリペプチドが示差
的結合特性および顕著な選択可能特性の両方を有するこ
とになる配列を有するベクターが、二つの特性が同じ要
素から得られうるとしても、特に好ましい( たとえば細
胞の構造成分と予め決められた空間的関係にしたがって
示差的に活性である選択可能なマーカー）。前者のベク
ターの例としては、キメラたんぱく質においてβ- ガラ
クトシダーゼ( β- gal)とネオマイシン(neo) ホスホト
ランスフェラーゼ活性の両方を付与する配列を有するも
のである。一つの構築物においてβ- ガラクトシダーゼ
( β- gal)とネオマイシン(neo) ホスホトランスフェラ
ーゼ活性の両方を付与する構築されたβgeo 組合せ配列
が特に好ましい。
【００１３】検討したように、内因性遺伝子のシグナル
配列を獲得しないキメラポリペプチドにおける示差的結
合特性を選択的に不活性化することは、キメラポリペプ
チドをERの膜にII型配向に挿入することによる。好適な
II型トランスメンブラン領域は、好ましくは以下に記載
のように、経験的に特定される。さらに、内部トランス
メンブラン領域( シグナルアンカー配列）を含むがシグ
ナル配列を含まないたんぱく質の配向は、しばしばトラ
ンスメンブラン領域のいずれかの側の15個のアミノ酸に
おいて陽性に帯電したアミノ酸の数から予測される( ハ
ートマン、ラッパポートおよびローディッシュ、1989)
。しかしながら、予測されたI 型配向のたんぱく質
は、N-末端が多くの陽性に帯電したアミノ酸を含む場
合、強制的にII型に配向させられるかもしれない。この
ような配向の陽性を失ったぶらさがり配列は、以下のCD
4 で示すように、直ちに同定される。これらの場合にお
いて、陽性を失ったぶらさがり配列を保持して領域のII
型特性を保つことが必要である。これらの指標を用い
て、公知II型たんぱく質のいずれかからトランスメンブ
ラン領域を新規分泌捕捉ベクターを設計するために選択
してもよい；好適なトランスメンブラン領域はハートマ
ン、ラッパポルトおよびローディッシュ(1989)によりリ
ストされたII型たんぱく質からのもの、たとえばヒトP-
糖たんぱく質、ヒトトランスフェリンレセプターまたは
ラットゴルジ体のシアリルトランスフェラーゼのトラン
スメンブラン領域である。これに代わり、合成またはハ
イブリッドII型トランスメンブラン領域を使用してもよ
い。
配列を獲得しないキメラポリペプチドにおける示差的結
合特性を選択的に不活性化することは、キメラポリペプ
チドをERの膜にII型配向に挿入することによる。好適な
II型トランスメンブラン領域は、好ましくは以下に記載
のように、経験的に特定される。さらに、内部トランス
メンブラン領域( シグナルアンカー配列）を含むがシグ
ナル配列を含まないたんぱく質の配向は、しばしばトラ
ンスメンブラン領域のいずれかの側の15個のアミノ酸に
おいて陽性に帯電したアミノ酸の数から予測される( ハ
ートマン、ラッパポートおよびローディッシュ、1989)
。しかしながら、予測されたI 型配向のたんぱく質
は、N-末端が多くの陽性に帯電したアミノ酸を含む場
合、強制的にII型に配向させられるかもしれない。この
ような配向の陽性を失ったぶらさがり配列は、以下のCD
4 で示すように、直ちに同定される。これらの場合にお
いて、陽性を失ったぶらさがり配列を保持して領域のII
型特性を保つことが必要である。これらの指標を用い
て、公知II型たんぱく質のいずれかからトランスメンブ
ラン領域を新規分泌捕捉ベクターを設計するために選択
してもよい；好適なトランスメンブラン領域はハートマ
ン、ラッパポルトおよびローディッシュ(1989)によりリ
ストされたII型たんぱく質からのもの、たとえばヒトP-
糖たんぱく質、ヒトトランスフェリンレセプターまたは
ラットゴルジ体のシアリルトランスフェラーゼのトラン
スメンブラン領域である。これに代わり、合成またはハ
イブリッドII型トランスメンブラン領域を使用してもよ
い。
【００１４】さらに本発明は、前記で定義したベクター
を利用して細胞を形質転換し、その結果前記ポリペプチ
ドが宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関係で
位置するようになるアミノ酸配列をコードする核酸配列
の標的真核遺伝子における存在と示差的に結合する特性
を分析することにより形質転換細胞を検出することを含
む宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関係で位
置するたんぱく質をコードする標的真核遺伝子を検出お
よび／または単離する方法を提供するものである。好ま
しい実施態様において、方法は、以下の工程からなる細
胞外たんぱく質をコードする標的真核遺伝子を単離する
方法である；(1) 複数の細胞へII型トランスメンブラン
領域および腔- 感受性指示標識物をコードするベクター
を導入し、その際前記指示標識物は前記II型トランスメ
ンブラン領域に対し3'に配向し、これにより前記ベクタ
ーは前記複数の細胞のゲノムへ安定的に組み込まれて複
数の通過性(transgenic)細胞を形成し、ここで前記多数
の細胞の少なくともひとつの細胞で前記ベクターがN-末
端シグナル配列を有する細胞外たんぱく質をコードする
遺伝子へ安定的に組み込まれ；(2) 前記複数の細胞を、
前記指示標識物が前記細胞または前記細胞の派生物にお
いて前記細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合たんぱ
く質として優先的活性形で発現し、そしてN-末端シグナ
ル配列を有する細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合
たんぱく質として前記指示標識物を発現しない前記複数
の細胞において発現しないかもしくは優先的に不活性形
で発現する条件下でインキュベートし；(3) 前記細胞ま
たは前記細胞の派生物での活性指示標識物の発現を検出
し；(4) 前記細胞外たんぱく質の少なくともN-末端領域
をコードする核酸を前記細胞または前記細胞の派生物か
ら単離する。
を利用して細胞を形質転換し、その結果前記ポリペプチ
ドが宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関係で
位置するようになるアミノ酸配列をコードする核酸配列
の標的真核遺伝子における存在と示差的に結合する特性
を分析することにより形質転換細胞を検出することを含
む宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関係で位
置するたんぱく質をコードする標的真核遺伝子を検出お
よび／または単離する方法を提供するものである。好ま
しい実施態様において、方法は、以下の工程からなる細
胞外たんぱく質をコードする標的真核遺伝子を単離する
方法である；(1) 複数の細胞へII型トランスメンブラン
領域および腔- 感受性指示標識物をコードするベクター
を導入し、その際前記指示標識物は前記II型トランスメ
ンブラン領域に対し3'に配向し、これにより前記ベクタ
ーは前記複数の細胞のゲノムへ安定的に組み込まれて複
数の通過性(transgenic)細胞を形成し、ここで前記多数
の細胞の少なくともひとつの細胞で前記ベクターがN-末
端シグナル配列を有する細胞外たんぱく質をコードする
遺伝子へ安定的に組み込まれ；(2) 前記複数の細胞を、
前記指示標識物が前記細胞または前記細胞の派生物にお
いて前記細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合たんぱ
く質として優先的活性形で発現し、そしてN-末端シグナ
ル配列を有する細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合
たんぱく質として前記指示標識物を発現しない前記複数
の細胞において発現しないかもしくは優先的に不活性形
で発現する条件下でインキュベートし；(3) 前記細胞ま
たは前記細胞の派生物での活性指示標識物の発現を検出
し；(4) 前記細胞外たんぱく質の少なくともN-末端領域
をコードする核酸を前記細胞または前記細胞の派生物か
ら単離する。
【００１５】これらの方法のベクターは、腔- 感受性標
識物、すなわち細胞の分泌腔たとえばER、ゴルジ体、分
泌小胞などに存在しない場合優先的に検出可能である標
識物を含む。たとえば、標識物は、腔において優先的に
不活化されるガラクトシダーゼのような酵素である。本
発明を実施する同様な方法は、腔に存在する場合優先的
に検出可能である標識物を使うことである。重要な特徴
は、標識物が腔の中または外にあるかどうかにしたがっ
て示差的な検出ができることである。標識物が腔の外で
優先的に検出可能である場合、ベクターはまた前記のよ
うにII型トランスメンブラン領域を含む。さらに、ベク
ターは前記のように腔- 感受性標識物と同じまたは異な
った選択可能な標識物を含でもよい。ベクターは常法に
より細胞へ導入される。たとえば、培養物における細胞
では、常法たとえばトランスフェクション( リポフェク
ション、沈降、エレクトロポーション、等）、マイクロ
注入法等が使用される。微生物における細胞に対して
は、導入はウィルス、リポソーム、または他の通常の方
法により仲介される。
識物、すなわち細胞の分泌腔たとえばER、ゴルジ体、分
泌小胞などに存在しない場合優先的に検出可能である標
識物を含む。たとえば、標識物は、腔において優先的に
不活化されるガラクトシダーゼのような酵素である。本
発明を実施する同様な方法は、腔に存在する場合優先的
に検出可能である標識物を使うことである。重要な特徴
は、標識物が腔の中または外にあるかどうかにしたがっ
て示差的な検出ができることである。標識物が腔の外で
優先的に検出可能である場合、ベクターはまた前記のよ
うにII型トランスメンブラン領域を含む。さらに、ベク
ターは前記のように腔- 感受性標識物と同じまたは異な
った選択可能な標識物を含でもよい。ベクターは常法に
より細胞へ導入される。たとえば、培養物における細胞
では、常法たとえばトランスフェクション( リポフェク
ション、沈降、エレクトロポーション、等）、マイクロ
注入法等が使用される。微生物における細胞に対して
は、導入はウィルス、リポソーム、または他の通常の方
法により仲介される。
【００１６】広範囲の様々な細胞が対象分泌捕捉ベクタ
ーの標的になることができ、これらは幹細胞、分化可能
の細胞たとえば接合体、胚、ES細胞、他の幹細胞たとえ
ばリンパ様および骨髄幹細胞、神経幹細胞、形質転換細
胞たとえば腫瘍細胞、感染細胞、分化細胞等が含まれ
る。細胞は培養物中またはインビボで標的にされうる。
ベクターは、標的細胞のゲノム( すなわちクロマチン）
へ安定的に組み込まれる。一般には、ベクターは少なく
とも一つの細胞ではなく、多数の細胞のゲノムへランダ
ムに組み込まれ、ベクターは、シグナル配列がベクター
/ 挿入物に対し5'に配向するようにN-末端シグナル配列
を有する内因性細胞外たんぱく質( すなわち、分泌型ま
たはトランスメンブランたんぱく質）をコードする遺伝
子へ組み込まれる。このような細胞は腔- 感受性標識物
およびII型トランスメンブラン領域をコードする対象ベ
クターの少なくとも一部を含む細胞外遺伝子の突然変異
された対立遺伝子を獲得する。
ーの標的になることができ、これらは幹細胞、分化可能
の細胞たとえば接合体、胚、ES細胞、他の幹細胞たとえ
ばリンパ様および骨髄幹細胞、神経幹細胞、形質転換細
胞たとえば腫瘍細胞、感染細胞、分化細胞等が含まれ
る。細胞は培養物中またはインビボで標的にされうる。
ベクターは、標的細胞のゲノム( すなわちクロマチン）
へ安定的に組み込まれる。一般には、ベクターは少なく
とも一つの細胞ではなく、多数の細胞のゲノムへランダ
ムに組み込まれ、ベクターは、シグナル配列がベクター
/ 挿入物に対し5'に配向するようにN-末端シグナル配列
を有する内因性細胞外たんぱく質( すなわち、分泌型ま
たはトランスメンブランたんぱく質）をコードする遺伝
子へ組み込まれる。このような細胞は腔- 感受性標識物
およびII型トランスメンブラン領域をコードする対象ベ
クターの少なくとも一部を含む細胞外遺伝子の突然変異
された対立遺伝子を獲得する。
【００１７】安定的に導入されたベクターを含む細胞
は、細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合たんぱく質
として優先的に検出可能な形で発現される、すなわち融
合たんぱく質が、内因性たんぱく質部分が機能的シグナ
ル配列を含む場合標識物を介して優先的に検出可能であ
る条件下でインキュベートされる。インキュベーション
条件は主に細胞の型により決定され、そして最初のトラ
ンフェクトされた細胞の有糸分裂増殖および分化も含
む。優先的に検出可能な形の標識物は常法により検出さ
れうる。しばしば、優先的検出可能性は標識物における
シグナル型の変化または色彩の変化もしくは光学密度の
変化としてもたらされる。シグナルを優先的に発現する
細胞は、内因性シグナル配列を含む融合たんぱく質を含
むことが予測される。このような内因性シグナル配列を
コードする核酸を次いで常法により、代表的には突然変
異ゲノム対立遺伝子またはその転写物をクローニングす
ることにより細胞から単離する。この方法において、公
知および新規細胞外たんぱく質をコードする遺伝子が得
られる。さらに、対象方法を修正して通過性動物、細胞
列、組み換え分泌たんぱく質等のような生成物を得るよ
うにしてもよく、これらの幾つかを以下に記載する。
は、細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合たんぱく質
として優先的に検出可能な形で発現される、すなわち融
合たんぱく質が、内因性たんぱく質部分が機能的シグナ
ル配列を含む場合標識物を介して優先的に検出可能であ
る条件下でインキュベートされる。インキュベーション
条件は主に細胞の型により決定され、そして最初のトラ
ンフェクトされた細胞の有糸分裂増殖および分化も含
む。優先的に検出可能な形の標識物は常法により検出さ
れうる。しばしば、優先的検出可能性は標識物における
シグナル型の変化または色彩の変化もしくは光学密度の
変化としてもたらされる。シグナルを優先的に発現する
細胞は、内因性シグナル配列を含む融合たんぱく質を含
むことが予測される。このような内因性シグナル配列を
コードする核酸を次いで常法により、代表的には突然変
異ゲノム対立遺伝子またはその転写物をクローニングす
ることにより細胞から単離する。この方法において、公
知および新規細胞外たんぱく質をコードする遺伝子が得
られる。さらに、対象方法を修正して通過性動物、細胞
列、組み換え分泌たんぱく質等のような生成物を得るよ
うにしてもよく、これらの幾つかを以下に記載する。
【００１８】
【実施例】以下の実験および実施例を説明のために示す
が、本発明はこれらに限定されるものではない。内因性
遺伝子のN-末端シグナル配列を捕獲して活性β- ガラク
トシダーゼ融合たんぱく質を生成することができる修飾
した遺伝子捕捉ベクター( ここでは" 分泌捕捉" とい
う）を見出した。プロトタイプベクターpGT1.8TM( 図2)
を用いると挿入部が新規カドヘリン(cadherin)、unc-6
関連ラミニン、sek レセプターチロシンキナーゼおよび
二つのレセプター結合たんぱく質チロシンホスファター
ゼ、LAR およびPTPkの細胞外領域において見出され、し
たがってトランスメンブランおよび分泌たんぱく質生成
物をコードする遺伝子における挿入変異を検出する分泌
捕捉ベクターの選択的特性を確認した。分泌捕捉計画
は、lacZをベースとする遺伝子捕捉ベクターから出発し
て発展した( ゴスラーら、1989; ブレナーら、1989；ケ
ールら、1989; フリードリッヒおよびソリアノ、1991；
スカルネス、アウァーバッハおよびジョイナー、1992)
。これらのベクターは、細胞の別々の室へ集まるN-末
端β- ガラクトシダーゼ( βgal)融合生成物を作り出す
ことができ、これは多分シグナルを分類する働きをする
内因性たんぱく質配列の獲得の反映である( スカルネス
ら、1992；ブルンスら、1994) 。ここで、我々はN-末端
シグナル配列をコードする遺伝子、すなわち細胞表面に
発現しそうな遺伝子を捕獲するための手段としてβ- ga
l 融合たんぱく質を示差的に分類することを説明する。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。内因性
遺伝子のN-末端シグナル配列を捕獲して活性β- ガラク
トシダーゼ融合たんぱく質を生成することができる修飾
した遺伝子捕捉ベクター( ここでは" 分泌捕捉" とい
う）を見出した。プロトタイプベクターpGT1.8TM( 図2)
を用いると挿入部が新規カドヘリン(cadherin)、unc-6
関連ラミニン、sek レセプターチロシンキナーゼおよび
二つのレセプター結合たんぱく質チロシンホスファター
ゼ、LAR およびPTPkの細胞外領域において見出され、し
たがってトランスメンブランおよび分泌たんぱく質生成
物をコードする遺伝子における挿入変異を検出する分泌
捕捉ベクターの選択的特性を確認した。分泌捕捉計画
は、lacZをベースとする遺伝子捕捉ベクターから出発し
て発展した( ゴスラーら、1989; ブレナーら、1989；ケ
ールら、1989; フリードリッヒおよびソリアノ、1991；
スカルネス、アウァーバッハおよびジョイナー、1992)
。これらのベクターは、細胞の別々の室へ集まるN-末
端β- ガラクトシダーゼ( βgal)融合生成物を作り出す
ことができ、これは多分シグナルを分類する働きをする
内因性たんぱく質配列の獲得の反映である( スカルネス
ら、1992；ブルンスら、1994) 。ここで、我々はN-末端
シグナル配列をコードする遺伝子、すなわち細胞表面に
発現しそうな遺伝子を捕獲するための手段としてβ- ga
l 融合たんぱく質を示差的に分類することを説明する。
【００１９】材料および方法 ベクター。 βgeo レポーターは、pSA βgeo のClaI/S
phI フラグメントで遺伝子捕捉ベクターpGT1.8のClaI(l
acZ で唯一)/SphI(neoで唯一) フラグメントを置換する
ことにより得られた( フリードリッヒおよびソリアノ、
1991) 。pGT1.8はpGT4.5( コスラーら、1989) の派生物
であり、3'En2 配列が0.2kbBclI/BamHI SV40ポリA シグ
ナルで置換されている。親ベクターpActβgeo はβgeo/
SV40ポリAカセットと連結した0.5kb ヒトβ- アクチン
プロモーター( ジョイナー、スカルネスおよびロッサ
ン、1989) を含む。βgeo 翻訳の開始点は、次の融合体
発生のためにいずれかの側において唯一のSalIおよびNr
uI部位とともにコザック(Kozak）コンセンサス配列を含
むように処理した。SalI部位をラットCD4cDNA の完全コ
ード領域を含む BalI フラグメントの各末端に位置させ
た( クラークら、1987)。CD4 のN-末端を含む0.45kb Sa
lI/KpnIフラグメントまたは完全CD4 コード領域を含む
1.4kb SalI/NdeI フラグメントを、pActβgeo を消化し
たSalI/ NruIへクローン化し、それぞれpActSSβgeo お
よび pActSSTM βgeo を発生させた。分泌捕捉ベクター
pGT1.8TMは、pGT1.8geo においてβgeo をフレームに挿
入したトランスメンブラン領域(TM)を含むCD4 の0.7kbP
stI/NdeIフラグメントを含む。
phI フラグメントで遺伝子捕捉ベクターpGT1.8のClaI(l
acZ で唯一)/SphI(neoで唯一) フラグメントを置換する
ことにより得られた( フリードリッヒおよびソリアノ、
1991) 。pGT1.8はpGT4.5( コスラーら、1989) の派生物
であり、3'En2 配列が0.2kbBclI/BamHI SV40ポリA シグ
ナルで置換されている。親ベクターpActβgeo はβgeo/
SV40ポリAカセットと連結した0.5kb ヒトβ- アクチン
プロモーター( ジョイナー、スカルネスおよびロッサ
ン、1989) を含む。βgeo 翻訳の開始点は、次の融合体
発生のためにいずれかの側において唯一のSalIおよびNr
uI部位とともにコザック(Kozak）コンセンサス配列を含
むように処理した。SalI部位をラットCD4cDNA の完全コ
ード領域を含む BalI フラグメントの各末端に位置させ
た( クラークら、1987)。CD4 のN-末端を含む0.45kb Sa
lI/KpnIフラグメントまたは完全CD4 コード領域を含む
1.4kb SalI/NdeI フラグメントを、pActβgeo を消化し
たSalI/ NruIへクローン化し、それぞれpActSSβgeo お
よび pActSSTM βgeo を発生させた。分泌捕捉ベクター
pGT1.8TMは、pGT1.8geo においてβgeo をフレームに挿
入したトランスメンブラン領域(TM)を含むCD4 の0.7kbP
stI/NdeIフラグメントを含む。
【００２０】ES細胞培養物 CGR8 ES細胞( ジェイ ニコラス(J.Nicholas)によるマ
ウス129/Ola 系に由来する飼料独立型細胞列( マウント
フォードら、1994))を、0.23% 重炭酸ナトリウム、1X M
EM必須アミノ酸、2mM グルタミン、1mM ピルビン酸塩、
50μM β- メルカプトエタノール、10% 子牛胎児血清(
グローベファーム(Globepharm)）および100 単位/ml DI
A/LIF を含むグラスゴウ( Glasgow ）MEM/BHK12 培地に
維持した。250 μF/250Vにセットしたバイオラッド遺伝
子パルサー(BioRAd Gene Pulser)を用いてPBS0.8ml容量
中プラスミドDNA100μg を用いて107 個のES細胞をエレ
クトロポレート(electroporating）することにより短期
間でトランスフェクトした細胞を得、これをゼラチン処
理したカバーガラス上で36時間培養した後に分析した。
安定な細胞列を得るために、5 ×107 〜108 個のCGR8 E
S 細胞を直線化プラスミドDNA150μg を用いてエレクト
ロポレート(3μF/80V)し、5 ×106 個の細胞を10cm皿上
に塗布し、コロニーを200 μg/mlゲネチシン(Genetici
n)(ジブコ(GibCo) ）において選択した。βgal 酵素活
性およびたんぱく質を分析するために、ES細胞をゼラチ
ン化カバーガラス上で増殖し、X-gal またはポリクロー
ナルウサギα- βgal 抗血清およびFITC- 結合したロバ
α- ウサギIgG(ジャクソン イムノリサーチ(Jackson I
mmunoResearch)) を用いて染色した。膜を通過させるた
めに、細胞を0.5%NP-40 で処理し、その後で抗体染色し
た。
ウス129/Ola 系に由来する飼料独立型細胞列( マウント
フォードら、1994))を、0.23% 重炭酸ナトリウム、1X M
EM必須アミノ酸、2mM グルタミン、1mM ピルビン酸塩、
50μM β- メルカプトエタノール、10% 子牛胎児血清(
グローベファーム(Globepharm)）および100 単位/ml DI
A/LIF を含むグラスゴウ( Glasgow ）MEM/BHK12 培地に
維持した。250 μF/250Vにセットしたバイオラッド遺伝
子パルサー(BioRAd Gene Pulser)を用いてPBS0.8ml容量
中プラスミドDNA100μg を用いて107 個のES細胞をエレ
クトロポレート(electroporating）することにより短期
間でトランスフェクトした細胞を得、これをゼラチン処
理したカバーガラス上で36時間培養した後に分析した。
安定な細胞列を得るために、5 ×107 〜108 個のCGR8 E
S 細胞を直線化プラスミドDNA150μg を用いてエレクト
ロポレート(3μF/80V)し、5 ×106 個の細胞を10cm皿上
に塗布し、コロニーを200 μg/mlゲネチシン(Genetici
n)(ジブコ(GibCo) ）において選択した。βgal 酵素活
性およびたんぱく質を分析するために、ES細胞をゼラチ
ン化カバーガラス上で増殖し、X-gal またはポリクロー
ナルウサギα- βgal 抗血清およびFITC- 結合したロバ
α- ウサギIgG(ジャクソン イムノリサーチ(Jackson I
mmunoResearch)) を用いて染色した。膜を通過させるた
めに、細胞を0.5%NP-40 で処理し、その後で抗体染色し
た。
【００２１】RNA 分析およびRACEクローニング ノザン法およびRACEを既に記載( スカルネスら、1992)
したように行った。すでに使用した5'RACE法( スカルネ
ス、アウァーバッハおよびジョイナー、1992)へ幾つか
の修正を加えた：(1) マイクロダイアリシス(0.025ミク
ロンフィルター、ミリポア）をエタノール沈降に代えて
使用し、(2) 重複PCR(各々30回）をアンカープライマー
およびCD4 に特異的なプライマーを用いて実施し、続い
てアガロースゲルにおいてサイズ選択し、アンカーおよ
びEn-2 256プライマーを用いて二回目のPCR を行い、
(3) クロモスピン400 カラム( クロンテック(Clontec
h)）を用いてXbaI/Kpn消化PCR 生成物をサイズ選択し次
いでクローニングした。
したように行った。すでに使用した5'RACE法( スカルネ
ス、アウァーバッハおよびジョイナー、1992)へ幾つか
の修正を加えた：(1) マイクロダイアリシス(0.025ミク
ロンフィルター、ミリポア）をエタノール沈降に代えて
使用し、(2) 重複PCR(各々30回）をアンカープライマー
およびCD4 に特異的なプライマーを用いて実施し、続い
てアガロースゲルにおいてサイズ選択し、アンカーおよ
びEn-2 256プライマーを用いて二回目のPCR を行い、
(3) クロモスピン400 カラム( クロンテック(Clontec
h)）を用いてXbaI/Kpn消化PCR 生成物をサイズ選択し次
いでクローニングした。
【００２２】結果 N-末端シグナル配列を含むβgal 融合体がこれらの細胞
下分布により同定されるかどうかを試験するために、ベ
クターを、βgeo 、βgal とネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼ活性の両方を有するキメラたんぱく質( フ
リードリッヒおよびソリアノ、1991) と融合したCD4 I
型膜たんぱく質( クラークら、1987) の一部を発現する
ように構築した( 図1)。CD4 のシグナル配列と融合した
βgeo(pActSSβgeo)は、小胞体(ER)に蓄積し、しかしβ
gal 活性はなかった。したがって、ERの腔へのβgeo の
輸送はβgal 酵素機能を停止するようであった。βgal
活性は、たぶん細胞質ゾルにβgal を維持することによ
り、CD4(pActSSTMβgeo)のトランスメンブラン領域を含
むことにより回復した。活性たんぱく質はERと結合し、
複数の細胞質含有物において、ESコロニーではほとんど
観察されないパターンが通常の遺伝子捕捉ベクターで得
られ、これはたぶん膜間たんぱく質をコードする遺伝子
のシグナル配列およびトランスメンブラン領域の両方の
下流の挿入がめったにないからであろう。したがって、
分泌およびI 型膜たんぱく質の両方における挿入部を同
定するために、我々の遺伝子捕捉ベクターpGT1.8geo を
修飾してβgeo の上流にCD4 のトランスメンブラン領域
を含ませた( 図2)。ベクターは、直線化された後、pSA
βgeo のプラスミド骨格( 線で表す）におけるScaI(Sc)
部位またはEn-2イントロンの5'末端におけるHindIII(H)
部位のいずれかでエレクトロポレートされた。G418- 耐
性コロニーの数が二つのエレクトロポレート実験( 実験
1: 5x107個の細胞；実験 2: 108 個の細胞) で得られ、
検出可能なβgal活性を発現する割合を右側に示す。分
泌捕捉ベクターpGT1.8TMでは、βgal 酵素活性はシグナ
ル配列の上流に生じる挿入部のいずれかで回復される。
下分布により同定されるかどうかを試験するために、ベ
クターを、βgeo 、βgal とネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼ活性の両方を有するキメラたんぱく質( フ
リードリッヒおよびソリアノ、1991) と融合したCD4 I
型膜たんぱく質( クラークら、1987) の一部を発現する
ように構築した( 図1)。CD4 のシグナル配列と融合した
βgeo(pActSSβgeo)は、小胞体(ER)に蓄積し、しかしβ
gal 活性はなかった。したがって、ERの腔へのβgeo の
輸送はβgal 酵素機能を停止するようであった。βgal
活性は、たぶん細胞質ゾルにβgal を維持することによ
り、CD4(pActSSTMβgeo)のトランスメンブラン領域を含
むことにより回復した。活性たんぱく質はERと結合し、
複数の細胞質含有物において、ESコロニーではほとんど
観察されないパターンが通常の遺伝子捕捉ベクターで得
られ、これはたぶん膜間たんぱく質をコードする遺伝子
のシグナル配列およびトランスメンブラン領域の両方の
下流の挿入がめったにないからであろう。したがって、
分泌およびI 型膜たんぱく質の両方における挿入部を同
定するために、我々の遺伝子捕捉ベクターpGT1.8geo を
修飾してβgeo の上流にCD4 のトランスメンブラン領域
を含ませた( 図2)。ベクターは、直線化された後、pSA
βgeo のプラスミド骨格( 線で表す）におけるScaI(Sc)
部位またはEn-2イントロンの5'末端におけるHindIII(H)
部位のいずれかでエレクトロポレートされた。G418- 耐
性コロニーの数が二つのエレクトロポレート実験( 実験
1: 5x107個の細胞；実験 2: 108 個の細胞) で得られ、
検出可能なβgal活性を発現する割合を右側に示す。分
泌捕捉ベクターpGT1.8TMでは、βgal 酵素活性はシグナ
ル配列の上流に生じる挿入部のいずれかで回復される。
【００２３】パイロット試験において、我々の遺伝子捕
捉ベクターの相対的効率を、ES細胞へエレクトロポレー
ト後の最初のpSA βgeo と比較した。pSA βgeo は我々
のベクターにはない翻訳の開始点を含んでいるが、pGT
1.8geo と比べてより少数のG418- 耐性コロニーがpSA
βgeo で得られた。さらに重要なことに、pSA βgeo か
ら派生されたほとんどすべてのコロニーで高レベルのβ
gal 活性を示し、一方我々のベクターは広い範囲の染色
強度を示しβgal 陰性コロニーの割合が多い。pSA βge
o ベクターの配列分析はその酵素活性を低めることが知
られているneo で点突然変異を示した( イエノフスキ
ー、フィンおよびペロウ、1991) 。したがって、pSA β
geo ベクターは高レベルで発現された遺伝子に対し予備
選択性であり、我々のベクターにおいてneo 突然変異の
修正により低レベルで発現した遺伝子を入手できる( 以
下参照）。
捉ベクターの相対的効率を、ES細胞へエレクトロポレー
ト後の最初のpSA βgeo と比較した。pSA βgeo は我々
のベクターにはない翻訳の開始点を含んでいるが、pGT
1.8geo と比べてより少数のG418- 耐性コロニーがpSA
βgeo で得られた。さらに重要なことに、pSA βgeo か
ら派生されたほとんどすべてのコロニーで高レベルのβ
gal 活性を示し、一方我々のベクターは広い範囲の染色
強度を示しβgal 陰性コロニーの割合が多い。pSA βge
o ベクターの配列分析はその酵素活性を低めることが知
られているneo で点突然変異を示した( イエノフスキ
ー、フィンおよびペロウ、1991) 。したがって、pSA β
geo ベクターは高レベルで発現された遺伝子に対し予備
選択性であり、我々のベクターにおいてneo 突然変異の
修正により低レベルで発現した遺伝子を入手できる( 以
下参照）。
【００２４】pGT1.8geo コロニーのほぼ半分が検出可能
なβgal 活性を発現しそしてすでに観察されたβgal 染
色の様々な細胞下パターンを示す。これと対照的に、pG
T1.8TMコロニーはわずか20% だけがβgal 活性を発現
し、すべてがpActSSTMβgeo 融合体のβgeo 活性特性の
" 分泌" パターンを示す。pGT1.8TMでトランスフェクト
した安定な細胞列はほとんどの場合分化していないES細
胞において検出可能なβgal 活性を示すが、しかしなが
ら我々は場合により一連の分化した細胞型においてのみ
検出可能なβgal 活性を示すES細胞を見出した。分泌捕
捉ベクターで観察されたβgal 陽性コロニーの割合の低
下およびβgal 染色の珍しいパターンは、βgal 活性が
N-末端シグナル配列を含む融合体でのみ保持され、そし
てneo 活性ではなくβgal 活性がシグナル配列を持たな
いたんぱく質との融合体で失われるということを示して
いる。
なβgal 活性を発現しそしてすでに観察されたβgal 染
色の様々な細胞下パターンを示す。これと対照的に、pG
T1.8TMコロニーはわずか20% だけがβgal 活性を発現
し、すべてがpActSSTMβgeo 融合体のβgeo 活性特性の
" 分泌" パターンを示す。pGT1.8TMでトランスフェクト
した安定な細胞列はほとんどの場合分化していないES細
胞において検出可能なβgal 活性を示すが、しかしなが
ら我々は場合により一連の分化した細胞型においてのみ
検出可能なβgal 活性を示すES細胞を見出した。分泌捕
捉ベクターで観察されたβgal 陽性コロニーの割合の低
下およびβgal 染色の珍しいパターンは、βgal 活性が
N-末端シグナル配列を含む融合体でのみ保持され、そし
てneo 活性ではなくβgal 活性がシグナル配列を持たな
いたんぱく質との融合体で失われるということを示して
いる。
【００２５】我々のデータによれば、分解可能なN-末端
シグナル配列の不存在下で、融合たんぱく質はII型膜た
んぱく質としての性質を示し、βgeo がER腔に入り、こ
こでβgal 酵素が不活性になる( ハイ、1992)(図3)。こ
れを確認するために、幾つかのβgal - 陰性細胞列を単
離し、免疫蛍光法で分析した。βgal 陰性細胞列はa-β
gal 抗体およびECL 検出システム( アマーシャム）を用
いて全細胞溶菌液のイムノドットブロットから同定され
た。48個のコロニーのスクリーンから、3 個のβgal 陰
性細胞列を回収し、免疫蛍光法で分析した。これらの列
において、融合たんぱく質は、溶剤通過性の不存在下に
細胞の表面において検出され、βgeo 融合たんぱく質の
II型配向を示した。これと対照的に、溶剤通過性は、I
型膜たんぱく質について予期されるように、βgal 陽性
細胞列において融合たんぱく質を検出するのに必須であ
った。
シグナル配列の不存在下で、融合たんぱく質はII型膜た
んぱく質としての性質を示し、βgeo がER腔に入り、こ
こでβgal 酵素が不活性になる( ハイ、1992)(図3)。こ
れを確認するために、幾つかのβgal - 陰性細胞列を単
離し、免疫蛍光法で分析した。βgal 陰性細胞列はa-β
gal 抗体およびECL 検出システム( アマーシャム）を用
いて全細胞溶菌液のイムノドットブロットから同定され
た。48個のコロニーのスクリーンから、3 個のβgal 陰
性細胞列を回収し、免疫蛍光法で分析した。これらの列
において、融合たんぱく質は、溶剤通過性の不存在下に
細胞の表面において検出され、βgeo 融合たんぱく質の
II型配向を示した。これと対照的に、溶剤通過性は、I
型膜たんぱく質について予期されるように、βgal 陽性
細胞列において融合たんぱく質を検出するのに必須であ
った。
【００２６】分泌捕捉ベクターにおけるβgal の観察さ
れた選択活性のモデルを、図3 に示す。シグナル配列を
含む遺伝子におけるpGT1.8TM( 斜線の入った四角形）の
挿入はI 型配置で小胞体の膜に挿入される融合たんぱく
質を作る。ベクターのトランスメンブラン領域は細胞ゾ
ルにおいてβgal を保持し、ここで活性のままである。
シグナル配列のない遺伝子におけるベクターの挿入は、
内部TM領域との融合たんぱく質を作る。これらの融合体
において、トランスメンブラン領域はシグナルアンカー
配列として作用し( ハイ、1992) 、II型配向にβgeo を
置き、ERの腔へβgeo を晒し、ここでβgal 活性が失わ
れる。内因性シグナル配列の獲得における酵素活性のこ
の依存性は、N-末端シグナル配列をコードする遺伝子へ
挿入することについての簡単なスクリーンを提供する。
さらにこのモデルの証拠は幾つかの分泌捕捉挿入部と結
合した幾つかの遺伝子をクローニングすることからもた
らされる。
れた選択活性のモデルを、図3 に示す。シグナル配列を
含む遺伝子におけるpGT1.8TM( 斜線の入った四角形）の
挿入はI 型配置で小胞体の膜に挿入される融合たんぱく
質を作る。ベクターのトランスメンブラン領域は細胞ゾ
ルにおいてβgal を保持し、ここで活性のままである。
シグナル配列のない遺伝子におけるベクターの挿入は、
内部TM領域との融合たんぱく質を作る。これらの融合体
において、トランスメンブラン領域はシグナルアンカー
配列として作用し( ハイ、1992) 、II型配向にβgeo を
置き、ERの腔へβgeo を晒し、ここでβgal 活性が失わ
れる。内因性シグナル配列の獲得における酵素活性のこ
の依存性は、N-末端シグナル配列をコードする遺伝子へ
挿入することについての簡単なスクリーンを提供する。
さらにこのモデルの証拠は幾つかの分泌捕捉挿入部と結
合した幾つかの遺伝子をクローニングすることからもた
らされる。
【００２７】5'RACE(cDNA 末端の迅速増幅）を用いて検
出可能なβgal 活性を発現する分泌捕捉挿入部と結合す
る内因性遺伝子の一部をクローニングした( 表1)。ノザ
ンおよびRNA ドットブロット分析は、G418- 耐性細胞列
のほぼ1/2(この研究において分析された11のうち5)がス
プライス受容体を正しく利用しておらず、ベクターのイ
ントロン配列とハイブリッド化する融合転写物を生産し
ていることを示した。これらの挿入部は多分正しい遺伝
子捕捉の結果を表さず、したがってこれ以上分析されな
かった。6 個の正しくスプライスした列のノザン法分析
は、各細胞列において独特なサイズのβgal 融合転写物
を検出した。これらの実験において、15μg のES細胞RN
A のノザン法は、lacZ遺伝子とハイブリッド化され、そ
してST534(LAR)挿入部からクローン化されたRACE cDNA
フラグメントで再調査された。少なくとも二つの独立し
たRACE cDNA を各細胞列からクローン化した。ST514 を
除く全ての細胞列から得られたcDNAは、ST534 調査で示
したように全ての細胞列に対し普遍的な融合体転写物お
よび内因性転写物の両方を検出した。ST514 挿入はES細
胞において非常に低いレベルで発現した遺伝子が捕捉さ
れうることを示す。ST514 培養物において、βgal 活性
はわずかに異なった細胞において観察されただけで、し
たがって融合体も内因性転写物のいずれもノザン法では
検出されなかった。
出可能なβgal 活性を発現する分泌捕捉挿入部と結合す
る内因性遺伝子の一部をクローニングした( 表1)。ノザ
ンおよびRNA ドットブロット分析は、G418- 耐性細胞列
のほぼ1/2(この研究において分析された11のうち5)がス
プライス受容体を正しく利用しておらず、ベクターのイ
ントロン配列とハイブリッド化する融合転写物を生産し
ていることを示した。これらの挿入部は多分正しい遺伝
子捕捉の結果を表さず、したがってこれ以上分析されな
かった。6 個の正しくスプライスした列のノザン法分析
は、各細胞列において独特なサイズのβgal 融合転写物
を検出した。これらの実験において、15μg のES細胞RN
A のノザン法は、lacZ遺伝子とハイブリッド化され、そ
してST534(LAR)挿入部からクローン化されたRACE cDNA
フラグメントで再調査された。少なくとも二つの独立し
たRACE cDNA を各細胞列からクローン化した。ST514 を
除く全ての細胞列から得られたcDNAは、ST534 調査で示
したように全ての細胞列に対し普遍的な融合体転写物お
よび内因性転写物の両方を検出した。ST514 挿入はES細
胞において非常に低いレベルで発現した遺伝子が捕捉さ
れうることを示す。ST514 培養物において、βgal 活性
はわずかに異なった細胞において観察されただけで、し
たがって融合体も内因性転写物のいずれもノザン法では
検出されなかった。
【００２８】すべての場合において、RACE cDNA の配列
分析により、スプライス受容体の正しい使用およびβge
o とのフレームに一箇所開放したリーディングフレーム
が示された。1 個の挿入部をネトリンに入れ、これはカ
エノルハビディティス エレガンス( イシイら、1992)
のunc-6 遺伝子と類似の分泌ラミニンをニワトリで最近
クローン化したものである( セラフィニら、1994) 。残
りの5 個の挿入部が膜間たんぱく質の細胞外領域を中断
した：ドュロソフィラ(Drosophila)のfat 腫瘍サプレッ
サー遺伝子に非常に近似した新規カドヘリン( マホネイ
ら、1991) 、sek レセプターチロシンキナーゼ( ギラル
ディ- ヘベンストレイトら、1992) 、レセプター結合た
んぱく質チロシンホスファターゼPTPk( ジャングら、19
93) 、および第二のレセプター結合チロシンホスファタ
ーゼLAR における二つの別々の挿入部( ストロウリら、
1988) 。これらの結果により、βgal 活性が挿入部位に
おける内因性遺伝子からのN-末端シグナル配列を獲得す
ることに依存するという予想が支持される。
分析により、スプライス受容体の正しい使用およびβge
o とのフレームに一箇所開放したリーディングフレーム
が示された。1 個の挿入部をネトリンに入れ、これはカ
エノルハビディティス エレガンス( イシイら、1992)
のunc-6 遺伝子と類似の分泌ラミニンをニワトリで最近
クローン化したものである( セラフィニら、1994) 。残
りの5 個の挿入部が膜間たんぱく質の細胞外領域を中断
した：ドュロソフィラ(Drosophila)のfat 腫瘍サプレッ
サー遺伝子に非常に近似した新規カドヘリン( マホネイ
ら、1991) 、sek レセプターチロシンキナーゼ( ギラル
ディ- ヘベンストレイトら、1992) 、レセプター結合た
んぱく質チロシンホスファターゼPTPk( ジャングら、19
93) 、および第二のレセプター結合チロシンホスファタ
ーゼLAR における二つの別々の挿入部( ストロウリら、
1988) 。これらの結果により、βgal 活性が挿入部位に
おける内因性遺伝子からのN-末端シグナル配列を獲得す
ることに依存するという予想が支持される。
【００２９】sek(ST497) およびネトリン- 1(ST514)遺
伝子における挿入部から導かれる胚におけるβgal 発現
のパターンは、マウスsek(ニエトら、1992) およびニワ
トリネトリン( ケネディら、1994) 遺伝子に対し公開さ
れたRNA 自体の結果と非常に類似しており、遺伝子捕捉
ベクターが内因性遺伝子発現のパターンを正確に報告す
るというさらに別の証拠を提供した( スカルネス、アウ
ァーバッハおよびジョイナー、1992) 。これらの実験に
対し、キメラ胚および生殖系列マウスがC57B1/6胚磐胞
の注入により発生した( スカルネス、アウァーバッハお
よびジョイナー、1989) 。適当な段階の胚を切り開き、
固定し、記載のようにX -gal で染色した( ベディント
ンら、1989) 。LAR における両方の挿入物(ST448,534)
は、8.5d胚において弱く拡散した発現を示した。PTPkに
おける挿入物(ST531) は、内胚葉および近軸中胚葉にお
いてβgal 発現を示し、新しく圧縮した体節において最
も高い。LAR およびPTPkにおける成人マウスの有する挿
入物の組織におけるβgal 発現は、mRAN発現の公知位置
と非常に関係する( ジャングら、1993; ロンゴら、199
3) 。βgal 活性の最も高いレベルは、ST534(LAR)マウ
スの肺、乳腺および脳に見られ、そしてST531(PTPk) マ
ウスの脳と肝臓にみられた。
伝子における挿入部から導かれる胚におけるβgal 発現
のパターンは、マウスsek(ニエトら、1992) およびニワ
トリネトリン( ケネディら、1994) 遺伝子に対し公開さ
れたRNA 自体の結果と非常に類似しており、遺伝子捕捉
ベクターが内因性遺伝子発現のパターンを正確に報告す
るというさらに別の証拠を提供した( スカルネス、アウ
ァーバッハおよびジョイナー、1992) 。これらの実験に
対し、キメラ胚および生殖系列マウスがC57B1/6胚磐胞
の注入により発生した( スカルネス、アウァーバッハお
よびジョイナー、1989) 。適当な段階の胚を切り開き、
固定し、記載のようにX -gal で染色した( ベディント
ンら、1989) 。LAR における両方の挿入物(ST448,534)
は、8.5d胚において弱く拡散した発現を示した。PTPkに
おける挿入物(ST531) は、内胚葉および近軸中胚葉にお
いてβgal 発現を示し、新しく圧縮した体節において最
も高い。LAR およびPTPkにおける成人マウスの有する挿
入物の組織におけるβgal 発現は、mRAN発現の公知位置
と非常に関係する( ジャングら、1993; ロンゴら、199
3) 。βgal 活性の最も高いレベルは、ST534(LAR)マウ
スの肺、乳腺および脳に見られ、そしてST531(PTPk) マ
ウスの脳と肝臓にみられた。
【００３０】LAR、PTPkおよびsek 遺伝子に挿入部を有
するES細胞列は、マウスの生殖系列へ伝達された。PTPk
およびLAR 挿入部の生殖系列伝達に続いて、繁殖分析に
より、挿入部のいずれかに対するマウス同型接合体が成
熟しそして繁殖能力があることがわかった。LAR および
PTPk遺伝子が効果的に分断されたことを確認するため
に、野性型および同型接合型成人組織からのRNA のノザ
ン法は、各挿入位置の下流領域からのcDNAを用いて証明
された。野性型(+/+) 、異型接合型(+/-) および同型接
合型(-/-)TからのRNA 10μg のノザン法において、成人
マウスST534(LAR)の肺およびST531(PTPk) の腎臓は、挿
入部に対してLAR およびPTPk cDNA 配列3'とともにハイ
ブリッド化され、そして荷重コントロールとしてリボソ
ームS12 遺伝子を用いて再調査された。両方の突然変異
に対し、正常の完全長さの転写物は同型接合型動物では
検出されなかった。
するES細胞列は、マウスの生殖系列へ伝達された。PTPk
およびLAR 挿入部の生殖系列伝達に続いて、繁殖分析に
より、挿入部のいずれかに対するマウス同型接合体が成
熟しそして繁殖能力があることがわかった。LAR および
PTPk遺伝子が効果的に分断されたことを確認するため
に、野性型および同型接合型成人組織からのRNA のノザ
ン法は、各挿入位置の下流領域からのcDNAを用いて証明
された。野性型(+/+) 、異型接合型(+/-) および同型接
合型(-/-)TからのRNA 10μg のノザン法において、成人
マウスST534(LAR)の肺およびST531(PTPk) の腎臓は、挿
入部に対してLAR およびPTPk cDNA 配列3'とともにハイ
ブリッド化され、そして荷重コントロールとしてリボソ
ームS12 遺伝子を用いて再調査された。両方の突然変異
に対し、正常の完全長さの転写物は同型接合型動物では
検出されなかった。
【００３１】分泌捕捉挿入部がある場合、標的遺伝子の
細胞外領域の大部分を含むであろう融合体を発生させる
ので、機能の損失および機能の獲得( すなわち、優勢-
劣性）の両方の突然変異を作ることが可能である。しか
しながら、LAR およびPTPkとのβgeo 融合体はこれらの
たんぱく質の細胞外領域の300 未満のアミノ酸を含むの
で、これらの挿入部は無価値の突然変異を表す。LAR お
よびPTPkは、レセプターPTP 遺伝子のこれまで増加した
一群のメンバーである( サイトー、1993) 。LAR および
PTPk突然変異マウスに明白な表現型が存在しなかったこ
とは、筋原性およびScr-群遺伝子の複数の構成員におけ
る標的突然変異で観察されたように、遺伝子群のメンバ
ー間の機能の重なりのためであろう( ラドニッキら、19
93; スタイン、ボーゲルおよびソリアノ、1994; ロゥエ
ル、ソリアノおよびマルマス、1994) 。
細胞外領域の大部分を含むであろう融合体を発生させる
ので、機能の損失および機能の獲得( すなわち、優勢-
劣性）の両方の突然変異を作ることが可能である。しか
しながら、LAR およびPTPkとのβgeo 融合体はこれらの
たんぱく質の細胞外領域の300 未満のアミノ酸を含むの
で、これらの挿入部は無価値の突然変異を表す。LAR お
よびPTPkは、レセプターPTP 遺伝子のこれまで増加した
一群のメンバーである( サイトー、1993) 。LAR および
PTPk突然変異マウスに明白な表現型が存在しなかったこ
とは、筋原性およびScr-群遺伝子の複数の構成員におけ
る標的突然変異で観察されたように、遺伝子群のメンバ
ー間の機能の重なりのためであろう( ラドニッキら、19
93; スタイン、ボーゲルおよびソリアノ、1994; ロゥエ
ル、ソリアノおよびマルマス、1994) 。
【００３２】同定された最初の6 個の遺伝子に基づい
て、分泌捕捉は大きな膜間レセプターを優先させること
を示す。LAR における二つの別々の挿入部の回収は、現
在のベクターの設計が遺伝子の制限されたクラスに近づ
くであろうことを示唆している。遺伝子のイントロンに
おける挿入のための遺伝子捕捉ベクターの必要性は、大
きなイントロン領域からなる遺伝子を検出するのに賛成
する本来的な性質を有し、したがってこのやり方で入手
可能な遺伝子の数が限定されることが予測される。より
大きな遺伝子のプールを入手するために、我々は三つの
可能性のあるリーディングフレームの各々にベクターを
構築した。さらに、僅かのまたは全くイントロンの無い
より小さい転写単位において挿入部を回収するために、
スプライス受容体を欠いたベクターの" エキソン捕捉"
版を見出した。三つのリーディングフレームで処理され
た分泌捕捉ベクターおよびエキソン捕捉ベクターの相対
的効果を図4 に示す。CGR8 ES 細胞のエレクトロポレー
トは前記のように実施された( 実験1: 2X107個の細胞;
実験2: 108個の細胞) 。各ベクターはG418- 耐性コロニ
ーの同程度の数が得られ、同じ割合のβgal 活性の分泌
パターンを示す。ベクターを組合せると、膜レセプター
および分泌リガンドの両方を含むゲノムの代表的サンプ
リングが得られる。
て、分泌捕捉は大きな膜間レセプターを優先させること
を示す。LAR における二つの別々の挿入部の回収は、現
在のベクターの設計が遺伝子の制限されたクラスに近づ
くであろうことを示唆している。遺伝子のイントロンに
おける挿入のための遺伝子捕捉ベクターの必要性は、大
きなイントロン領域からなる遺伝子を検出するのに賛成
する本来的な性質を有し、したがってこのやり方で入手
可能な遺伝子の数が限定されることが予測される。より
大きな遺伝子のプールを入手するために、我々は三つの
可能性のあるリーディングフレームの各々にベクターを
構築した。さらに、僅かのまたは全くイントロンの無い
より小さい転写単位において挿入部を回収するために、
スプライス受容体を欠いたベクターの" エキソン捕捉"
版を見出した。三つのリーディングフレームで処理され
た分泌捕捉ベクターおよびエキソン捕捉ベクターの相対
的効果を図4 に示す。CGR8 ES 細胞のエレクトロポレー
トは前記のように実施された( 実験1: 2X107個の細胞;
実験2: 108個の細胞) 。各ベクターはG418- 耐性コロニ
ーの同程度の数が得られ、同じ割合のβgal 活性の分泌
パターンを示す。ベクターを組合せると、膜レセプター
および分泌リガンドの両方を含むゲノムの代表的サンプ
リングが得られる。
【００３３】本発明において、我々は、βgeo レポータ
ー遺伝子をN-末端トランスメンブラン領域を有するよう
に修飾することができることを示したことが明らかであ
ろう。N-末端シグナル配列をコードする内因性遺伝子へ
組み込むと、細胞質ゾルにβgal を維持し、ここで機能
的酵素活性を保持するI 型配置を想定する融合たんぱく
質が作られる( 図3(i)参照) 。逆に、修飾したレポータ
ーがシグナル配列をコードしない遺伝子へ組み込まれる
と、疎水性トランスメンブラン領域自体が細胞によりシ
グナルアンカー配列として認識され、II型配向に融合た
んぱく質を置き、その際βgal 酵素が不活化する( 図3
(ii) 参照) 。したがって、βgal またはβgeo が予めN
-末端II型トランスメンブラン領域で固定されている構
築物は特別な性質を有する。構築物がシグナル配列をコ
ードする分泌遺伝子へ組み込まれるならば、βgal は活
性のままである。これが非- 分泌遺伝子へ組み込まれて
いる場合、βgal 活性は遮断される。これにより、分泌
遺伝子への組み込がレポーター遺伝子活性ついての簡単
な検定( たとえば、色彩の変化）により同定されること
ができるようになる。
ー遺伝子をN-末端トランスメンブラン領域を有するよう
に修飾することができることを示したことが明らかであ
ろう。N-末端シグナル配列をコードする内因性遺伝子へ
組み込むと、細胞質ゾルにβgal を維持し、ここで機能
的酵素活性を保持するI 型配置を想定する融合たんぱく
質が作られる( 図3(i)参照) 。逆に、修飾したレポータ
ーがシグナル配列をコードしない遺伝子へ組み込まれる
と、疎水性トランスメンブラン領域自体が細胞によりシ
グナルアンカー配列として認識され、II型配向に融合た
んぱく質を置き、その際βgal 酵素が不活化する( 図3
(ii) 参照) 。したがって、βgal またはβgeo が予めN
-末端II型トランスメンブラン領域で固定されている構
築物は特別な性質を有する。構築物がシグナル配列をコ
ードする分泌遺伝子へ組み込まれるならば、βgal は活
性のままである。これが非- 分泌遺伝子へ組み込まれて
いる場合、βgal 活性は遮断される。これにより、分泌
遺伝子への組み込がレポーター遺伝子活性ついての簡単
な検定( たとえば、色彩の変化）により同定されること
ができるようになる。
【００３４】
【表１】 表１ 6 個の分泌捕捉挿入部と関係する内因
性遺伝子の同定 βgal 発現 1 転写サイズ(kb) 2 フェノ 細胞列 ES diff 融合 内因性 遺伝子3 タイプ4 ( 重量:het:hom) ──────────────────────────────────── 484 + + 7.5 7.5 LAR(604) NA 497 + +/- 6.5 7 sek(439) ? 514 - +/- ND ND ネクトリン ? (404) 519 - +/- >12 >12 新規カドヘリン NA 531 - +/- 6.1 5.3 PTPk(288) 可変 (36:57:27) 534 + + 6.0 7.5 LAR(228) 可変 (36:79:25) ────────────────────────────────────
性遺伝子の同定 βgal 発現 1 転写サイズ(kb) 2 フェノ 細胞列 ES diff 融合 内因性 遺伝子3 タイプ4 ( 重量:het:hom) ──────────────────────────────────── 484 + + 7.5 7.5 LAR(604) NA 497 + +/- 6.5 7 sek(439) ? 514 - +/- ND ND ネクトリン ? (404) 519 - +/- >12 >12 新規カドヘリン NA 531 - +/- 6.1 5.3 PTPk(288) 可変 (36:57:27) 534 + + 6.0 7.5 LAR(228) 可変 (36:79:25) ────────────────────────────────────
【００３５】1 自然差示(diff)細胞型の亜群を含むES細
胞培養物のX-gal 染色に基づく。(+/-) は差示細胞型の
亜群における発現を示す。2 転写サイズがノザン法から測定された( 図4 およびデ
ータを示さず）。N.D.は検出せず。3 括弧内の数は、ラットLAR(AC L11586)、マウスsek(AC
S51422)、ニワトリネトリンI(AC L34549)およびマウス
PTPk(AC L10106) のアミノ酸配列に基づく内因性の挿入
位置を示す。新規カドヘリンの種子バンク入手番号は、
受け入れられるべきである。4 異型接合型異種交配からの離乳年齢期の同種接合型動
物の回収に基づく。(?)は未知の表現型、成長における
繁殖。NA、適用されず、生殖ではまだ挿入されず。
胞培養物のX-gal 染色に基づく。(+/-) は差示細胞型の
亜群における発現を示す。2 転写サイズがノザン法から測定された( 図4 およびデ
ータを示さず）。N.D.は検出せず。3 括弧内の数は、ラットLAR(AC L11586)、マウスsek(AC
S51422)、ニワトリネトリンI(AC L34549)およびマウス
PTPk(AC L10106) のアミノ酸配列に基づく内因性の挿入
位置を示す。新規カドヘリンの種子バンク入手番号は、
受け入れられるべきである。4 異型接合型異種交配からの離乳年齢期の同種接合型動
物の回収に基づく。(?)は未知の表現型、成長における
繁殖。NA、適用されず、生殖ではまだ挿入されず。
【００３６】文献 ベディントン、アール. エス .ピィ. ら( Beddington,
R.S.P.et al.)、Development 106,37-46(1989);ベンソ
ンら( Benson et al.）、Ann.Rev.Biochem.54,101-134
(1985) ブルナー、ディ. ジィ. 、 リン- チャオ、エス. およ
びコーエン、エス. エヌ.( Brenner,D.G.,Lin-Chao,S.
& Cohen,S.N.）、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86,5517-5521
(1989).ブルンス、エヌ. ら( Burns,N.et al.）、Gene
Dev.8,1087-1105(1994).カサダバンら( Casadaban et a
l.）、J Bacteriol.143,971-980(1980) カール、エス. ジェイ. ら( Clarl,S.J et al.）、Pro
c.Nat.Acad.Sci.USA 84,1649-1653(1987).エムルら( Em
r et al.）、Mol Cell Biol.4,2347-2355(1984) ファイアーら( Fire et al. ）、Gene 93,189-198(199
0) フリードリッヒ、ジィ. およびソリアノ、ピィ.( Fried
rich,G.&Soriano P.）、Genes Dev.5,1513-1523(1991) フロハム、エム. エー. 、ダッシュ、エム. ケィ. およ
びマーチン、ジィ.( Frohman,M.A.,Dush,M.K.&Martin
G. ）、 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85,8998-9002(1988).
ギラルディ- ヘベンストライト、ピィ. ら( Gilardi-He
benstreit,P.et al.）、Oncogene 7,2499-2506(1992) ゴスラー、エー. 、ジョイナー エー. エル. 、ロサン
ト、ジェイ. およびスカルネス、ダブリュ. シィ.( Gos
sler,A.,Joyner,A.L.,Rossant,J.&Skarnes,W.C.）、Sci
ence 244,463-465(1989) ハートマンら( Hartman et al.）、PNAS 86,5786-5790
(1989) ハイ エス.( High,S.）Bioessays 14,535-540(1992) ハートレイ、エス. エム.( Hurtley,S.M. ）J.Cell Sc
i.106,649-655(1993) イシイ、エヌ. ら( Ishii,N.et al.）、,Neuron 9,873-
881(1992) ジャシンら( Jasin et al.）,Genes & Development 4,1
57-166(1990) ジャング、ワイ.-ピィ. ら( Jiang,Y.-P. et al.）、Mo
l.Cell.Biol. 13,2942-2951(1993)
R.S.P.et al.)、Development 106,37-46(1989);ベンソ
ンら( Benson et al.）、Ann.Rev.Biochem.54,101-134
(1985) ブルナー、ディ. ジィ. 、 リン- チャオ、エス. およ
びコーエン、エス. エヌ.( Brenner,D.G.,Lin-Chao,S.
& Cohen,S.N.）、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86,5517-5521
(1989).ブルンス、エヌ. ら( Burns,N.et al.）、Gene
Dev.8,1087-1105(1994).カサダバンら( Casadaban et a
l.）、J Bacteriol.143,971-980(1980) カール、エス. ジェイ. ら( Clarl,S.J et al.）、Pro
c.Nat.Acad.Sci.USA 84,1649-1653(1987).エムルら( Em
r et al.）、Mol Cell Biol.4,2347-2355(1984) ファイアーら( Fire et al. ）、Gene 93,189-198(199
0) フリードリッヒ、ジィ. およびソリアノ、ピィ.( Fried
rich,G.&Soriano P.）、Genes Dev.5,1513-1523(1991) フロハム、エム. エー. 、ダッシュ、エム. ケィ. およ
びマーチン、ジィ.( Frohman,M.A.,Dush,M.K.&Martin
G. ）、 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85,8998-9002(1988).
ギラルディ- ヘベンストライト、ピィ. ら( Gilardi-He
benstreit,P.et al.）、Oncogene 7,2499-2506(1992) ゴスラー、エー. 、ジョイナー エー. エル. 、ロサン
ト、ジェイ. およびスカルネス、ダブリュ. シィ.( Gos
sler,A.,Joyner,A.L.,Rossant,J.&Skarnes,W.C.）、Sci
ence 244,463-465(1989) ハートマンら( Hartman et al.）、PNAS 86,5786-5790
(1989) ハイ エス.( High,S.）Bioessays 14,535-540(1992) ハートレイ、エス. エム.( Hurtley,S.M. ）J.Cell Sc
i.106,649-655(1993) イシイ、エヌ. ら( Ishii,N.et al.）、,Neuron 9,873-
881(1992) ジャシンら( Jasin et al.）,Genes & Development 4,1
57-166(1990) ジャング、ワイ.-ピィ. ら( Jiang,Y.-P. et al.）、Mo
l.Cell.Biol. 13,2942-2951(1993)
【００３７】ジョイナー、エー. エル. 、スカルネス、
ダブリュ. シィ. およびロッサント、ジェイ.( Joyner
A.L.,Skarnes,W.C. &Rossant,J. ）、 Nature 338,153-
156(1989) ケネディ、ティ. イー. ら(Kennedy,T.E. et al.）、Ce
ll 78,425-435(1994) ケール、ダブリュ. ジィ. 、ノーラン、ジィ. ピィ. 、
セラフィニ、エー. ティ. およびヘルツェンベルグ、エ
ル. エー.( Kerr,W.G., Nolan,G.P.,Serafini,A.T.& He
rzenberg,L.A. ）、Cold Spring Habor Symp.Quant.Bio
l.54,767-776(1989) ロンゴ、エフ. エム. ら( Longo,F.M.et al.）、J. Bio
l.Chem.268,26503-26511(1993) ロゥウェル、シィ. エー. 、ソリアノ、ピィ. および
バルマス、エッチ.( Lowell,C.A.,Soriano,P. & Varmu
s,H. ）、Gene &Dev. 8,387-398(1994) マホネィ、ピィ. エー. ら(Mahoney,P.A.et al. ）、Ce
ll 67,853-868(1991) ニエト、エム. ら( Nieto,M.et al.）、Development 11
6,1137-1150(1992) ラドニッキ、エム. エー. ら( Rudnicki,M.A.et al.
）、Cell 75,1351-1359(1993) サイト、エッチ.( Saito,H. ）、Semin.Cell Biol.4,37
9-387 (1993) セラフィニ、ティ. ら( Serafini,T. et al.）、 Cell
78,409-424(1994) シルハビィら( Silhavy et al.）、Microbiol.Rev.49,3
98-418(1985) スカルネス、ダブリュ. シィ.( Skarnes,W.C. ）、Biot
echnology. 8,827-831(1990) スカルネス、ダブリュ. シィ. 、アウァーバッハ、エ
ー. およびジョイナー エー. エル.( Skarnes,W.C.,Au
erbach,A. & Joyner,A.L. ）、 Genes Dev.6,903-918(1
992) スタイン、ピィ. エル. 、ボーゲル エッチ. およびソ
リアノ、ピィ.( Stein,P.L.,Vogel,H. & Soriano,P.
）、Genes & Dev.8,1999-2007(1994) ステバルト、シィ. エル.( Stewart,C.L. ）、Methds E
nzymol.225,823-855(1993) ステロイリ、エム. ら( Streuli,M. et al. ）、J.Exp.
Med.168,1523-1530(1988) タシロら( Tashiro et al.）、Science 261,600-603(19
93) イエノフスキー、アール. エル. 、フィン、エム. およ
びペロゥ、ジェイ. ダブリュ. ( Yenofsky,R.L.,Fine,
M. & Pellow,J.W. ）、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87,3435
-3439(1991)
ダブリュ. シィ. およびロッサント、ジェイ.( Joyner
A.L.,Skarnes,W.C. &Rossant,J. ）、 Nature 338,153-
156(1989) ケネディ、ティ. イー. ら(Kennedy,T.E. et al.）、Ce
ll 78,425-435(1994) ケール、ダブリュ. ジィ. 、ノーラン、ジィ. ピィ. 、
セラフィニ、エー. ティ. およびヘルツェンベルグ、エ
ル. エー.( Kerr,W.G., Nolan,G.P.,Serafini,A.T.& He
rzenberg,L.A. ）、Cold Spring Habor Symp.Quant.Bio
l.54,767-776(1989) ロンゴ、エフ. エム. ら( Longo,F.M.et al.）、J. Bio
l.Chem.268,26503-26511(1993) ロゥウェル、シィ. エー. 、ソリアノ、ピィ. および
バルマス、エッチ.( Lowell,C.A.,Soriano,P. & Varmu
s,H. ）、Gene &Dev. 8,387-398(1994) マホネィ、ピィ. エー. ら(Mahoney,P.A.et al. ）、Ce
ll 67,853-868(1991) ニエト、エム. ら( Nieto,M.et al.）、Development 11
6,1137-1150(1992) ラドニッキ、エム. エー. ら( Rudnicki,M.A.et al.
）、Cell 75,1351-1359(1993) サイト、エッチ.( Saito,H. ）、Semin.Cell Biol.4,37
9-387 (1993) セラフィニ、ティ. ら( Serafini,T. et al.）、 Cell
78,409-424(1994) シルハビィら( Silhavy et al.）、Microbiol.Rev.49,3
98-418(1985) スカルネス、ダブリュ. シィ.( Skarnes,W.C. ）、Biot
echnology. 8,827-831(1990) スカルネス、ダブリュ. シィ. 、アウァーバッハ、エ
ー. およびジョイナー エー. エル.( Skarnes,W.C.,Au
erbach,A. & Joyner,A.L. ）、 Genes Dev.6,903-918(1
992) スタイン、ピィ. エル. 、ボーゲル エッチ. およびソ
リアノ、ピィ.( Stein,P.L.,Vogel,H. & Soriano,P.
）、Genes & Dev.8,1999-2007(1994) ステバルト、シィ. エル.( Stewart,C.L. ）、Methds E
nzymol.225,823-855(1993) ステロイリ、エム. ら( Streuli,M. et al. ）、J.Exp.
Med.168,1523-1530(1988) タシロら( Tashiro et al.）、Science 261,600-603(19
93) イエノフスキー、アール. エル. 、フィン、エム. およ
びペロゥ、ジェイ. ダブリュ. ( Yenofsky,R.L.,Fine,
M. & Pellow,J.W. ）、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87,3435
-3439(1991)
【００３８】本明細書に列記した文献および特許出願の
全ては、各々個々の文献または特許出願が参考として編
入されることを特別にそして個々に示したように、ここ
で参考として編入される。これまでの発明が明確な理解
の目的で説明および実施例により詳細に記載されている
とはいえ、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱
することなく一定の変化および修正がこれに施されるこ
とも本発明の技術の点で当業者にとって直ちに明らかで
あろう。
全ては、各々個々の文献または特許出願が参考として編
入されることを特別にそして個々に示したように、ここ
で参考として編入される。これまでの発明が明確な理解
の目的で説明および実施例により詳細に記載されている
とはいえ、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱
することなく一定の変化および修正がこれに施されるこ
とも本発明の技術の点で当業者にとって直ちに明らかで
あろう。
【図１】CD4 / βgeo 融合たんぱく質を発現するために
デザインされたベクターを示し、一時的トランスフェク
ション実験の要約である。
デザインされたベクターを示し、一時的トランスフェク
ション実験の要約である。
【図２】遺伝子捕捉ベクター(pSAβgeo)および(pGT1.8g
eo) および第二の捕捉ベクター(pGT1.8TM)のデザインお
よびES細胞の安定なトランスフェクションにおける相対
的効果を示す。pSA βgeo は最小アデノウィルスII型メ
ジャーレイトスプライス受容体(SA;開放ボックス、イン
トロン；影付きボックス、エキソン）およびウシ成長ホ
ルモンポリアデニル化シグナルを含む。pSA βgeo に存
在するneo(* ) における突然変異は、βgeo のClaI(C)/
SphI(S) フラグメントの置換により訂正される。pGT1.8
geo およびpGT1.8TMはマウスEn-2スプライス受容体( ゴ
スラーら、1989) およびSV40ポリアデニル化シグナルを
含むがしかし翻訳開始シグナル(ATG) を含まない。分泌
捕捉ベクターpGT1.8TMは、pGT1.8geo におけるβgeo で
トランスメンブラン領域挿入in-frameを含むCD4 の0.7k
b PstI/NdeI フラグメントを含む。
eo) および第二の捕捉ベクター(pGT1.8TM)のデザインお
よびES細胞の安定なトランスフェクションにおける相対
的効果を示す。pSA βgeo は最小アデノウィルスII型メ
ジャーレイトスプライス受容体(SA;開放ボックス、イン
トロン；影付きボックス、エキソン）およびウシ成長ホ
ルモンポリアデニル化シグナルを含む。pSA βgeo に存
在するneo(* ) における突然変異は、βgeo のClaI(C)/
SphI(S) フラグメントの置換により訂正される。pGT1.8
geo およびpGT1.8TMはマウスEn-2スプライス受容体( ゴ
スラーら、1989) およびSV40ポリアデニル化シグナルを
含むがしかし翻訳開始シグナル(ATG) を含まない。分泌
捕捉ベクターpGT1.8TMは、pGT1.8geo におけるβgeo で
トランスメンブラン領域挿入in-frameを含むCD4 の0.7k
b PstI/NdeI フラグメントを含む。
【図３】分泌捕捉ベクターにおけるβgal の選択的活性
化の我々のモデルを示す。
化の我々のモデルを示す。
【図４】三つのリーディングフレームの各々およびエキ
ソン捕捉デザインを捕獲するためにデザインされた分泌
捕捉ベクターの相対的効率を示す。各リーディングフレ
ーム(pGT1tm から3tm)におけるベクターは、すべてでは
なくEn-2の30bpのExoIII欠失と続くBg1II リンカーの挿
入により構築された。エキソン捕捉ベクター(pETtm) は
pGT1.8TMからEn-2スプライス受容体を除くことにより作
られた。
ソン捕捉デザインを捕獲するためにデザインされた分泌
捕捉ベクターの相対的効率を示す。各リーディングフレ
ーム(pGT1tm から3tm)におけるベクターは、すべてでは
なくEn-2の30bpのExoIII欠失と続くBg1II リンカーの挿
入により構築された。エキソン捕捉ベクター(pETtm) は
pGT1.8TMからEn-2スプライス受容体を除くことにより作
られた。
Claims (11)
- 【請求項１】 次のもの：標的真核遺伝子へ挿入する
と、発現時に(1) 標的真核遺伝子の核酸配列によりコー
ドされるアミノ酸配列の部分および(2) ベクターの核酸
配列によりコードされるアミノ酸の部分を有するポリペ
プチドをコードする修飾遺伝子を産生する成分を有する
ベクターであって、該ベクターが、その結果前記ポリペ
プチドが宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関
係で位置することになるアミノ酸配列をコードする核酸
配列の標的真核遺伝子における存在と示差的に結合する
特性をポリペプチドに付与する一つ以上の配列を含むこ
とを特徴とするベクター。 - 【請求項２】 標的真核遺伝子における前記成分の検出
を促進する核酸配列、分泌または膜間たんぱく質と結合
するシグナル配列の標的真核遺伝子における存在と示差
的に結合する特性をポリペプチドに付与する一つ以上の
配列、およびベクターの成分が標的真核遺伝子へ挿入さ
れた結果形質転換された細胞の選択および／または同定
を可能にする核酸標識配列を含む請求項１のベクター。 - 【請求項３】 分泌または膜間たんぱく質と結合するシ
グナル配列の標的真核遺伝子における存在と示差的に結
合する特性をポリペプチドにおいて付与する一つ以上の
配列を有するレポーター遺伝子を含み、その際ベクター
のレポーター遺伝子要素によりコードされるたんぱく質
生成物が標的遺伝子が分泌または膜間たんぱく質と結合
するシグナル配列を含むかどうかにしたがって、標的遺
伝子へ組み込み時に、二つの立体配置の一つを強制的に
とることができ、その際前記ポリペプチドが宿主細胞の
構造成分と予め決められた空間的関係に位置することに
なる前記アミノ酸配列がシグナル配列であり、予め決め
られた空間的関係が細胞からの分泌からなる請求項１の
ベクター。 - 【請求項４】 以下の工程： (1) II型トランスメンブラン領域および腔−感受性指
示標識物をコードするベクターを複数の細胞へ導入し、
その際前記指示標識物は前記II型トランスメンブラン領
域の3'へ配向し、これにより前記ベクターは前記複数の
細胞のゲノムへ安定的に組み込まれ複数の通過性(trans
genic)細胞を形成し、前記複数の細胞の少なくとも一つ
の細胞において、前記ベクターは安定的にN-末端シグナ
ル配列を有する細胞外たんぱく質をコードする遺伝子へ
組み込まれ； (2) 前記複数の細胞を、前記細胞または前記細胞の派
生物における前記細胞外たんぱく質のN-末端領域との融
合たんぱく質として優先的活性形で発現し、そしてN-末
端シグナル配列を有する細胞外たんぱく質のN-末端領域
との融合たんぱく質として前記指示標識物発現しない前
記複数の細胞における優先的不活性形で発現しないまた
は発現する条件下でインキュベートし； (3) 前記細胞または前記細胞の派生物で活性指示標識
物の発現を検出し； (4) 前記細胞外たんぱく質の少なくともN-末端領域を
コードする核酸を前記細胞または前記細胞の派生物から
単離することからなる細胞外たんぱく質をコードする標
的真核遺伝子を単離する方法。 - 【請求項５】 前記ベクターがさらに選択性標識物をコ
ードする請求項４の方法。 - 【請求項６】 前記細胞が胚幹細胞である請求項４の方
法。 - 【請求項７】 前記優先的活性形が検出可能な量の触媒
活性であり、前記優先的不活性形が検出不可能な量の触
媒活性である請求項４の方法。 - 【請求項８】 以下の工程： (1) II型トランスメンブラン領域および腔- 感受性指
示標識物をコードするベクターを複数の細胞へ導入し、
その際前記指示標識物は前記II型トランスメンブラン領
域の3'へ配向し、これにより前記ベクターは複数の細胞
のゲノムへ安定的に組み込まれ複数の通過性細胞を形成
し、前記複数の細胞の少なくとも一つの細胞において、
前記ベクターはN-末端シグナル配列を有する細胞外たん
ぱく質をコードする遺伝子へ安定的に組み込まれ； (2) 前記複数の細胞または前記複数の細胞の派生物
を、前記マーカーが前記細胞または前記細胞の派生物に
おける前記細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合たん
ぱく質として優先的活性形で発現し、そしてN-末端シグ
ナル配列を有する細胞外たんぱく質のN-末端領域との融
合たんぱく質として前記指示標識物発現しない前記複数
の細胞における優先的不活性形で発現しないまたは発現
する条件下でインキュベートし； (3) 前記細胞または前記細胞の派生物で活性指示標識
物の発現を検出し；その際前記細胞が細胞外たんぱく質
をコードする遺伝子における突然変異を含む通過性細胞
であることからなる細胞外たんぱく質をコードする遺伝
子における突然変異を含む通過性細胞を作る方法。 - 【請求項９】 前記ベクターがさらに選択可能な標識物
をコードする請求項８の方法。 - 【請求項１０】 前記細胞が多分化能性細胞である請求
項８の方法。 - 【請求項１１】 前記優先的活性形が検出可能な量の触
媒活性であり、前記優先的不活性形が検出不可能な量の
触媒活性である請求項８の方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9500423.0A GB9500423D0 (en) | 1995-01-10 | 1995-01-10 | Novel vectors and use thereof for capturing target genes |
| US08/404,727 US5767336A (en) | 1995-01-10 | 1995-03-15 | Gene trap vectors comprising a type II transmembrane domain |
| US08/404727 | 1995-06-30 | ||
| US9500423:0 | 1995-06-30 | ||
| US08/497,076 US5789653A (en) | 1995-01-10 | 1995-06-30 | Secretory gene trap |
| US08/497076 | 1995-06-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08308576A true JPH08308576A (ja) | 1996-11-26 |
| JP3592426B2 JP3592426B2 (ja) | 2004-11-24 |
Family
ID=27267545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02979296A Expired - Lifetime JP3592426B2 (ja) | 1995-01-10 | 1996-01-10 | ターゲット遺伝子を捕捉するための新規ベクター及びその使用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5789653A (ja) |
| EP (1) | EP0731169A1 (ja) |
| JP (1) | JP3592426B2 (ja) |
| AU (1) | AU673650B2 (ja) |
| CA (1) | CA2166850C (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5928888A (en) * | 1996-09-26 | 1999-07-27 | Aurora Biosciences Corporation | Methods and compositions for sensitive and rapid, functional identification of genomic polynucleotides and secondary screening capabilities |
| US7332338B2 (en) | 1996-10-04 | 2008-02-19 | Lexicon Pharmaceuticals, Inc. | Vectors for making genomic modifications |
| US20040072243A1 (en) * | 1996-10-11 | 2004-04-15 | Lexicon Genetics Incorporated | Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same |
| DE19650714A1 (de) * | 1996-12-06 | 1998-06-10 | Melchner Harald Von Prof Dr | Genfallen-Konstrukt zur Identifizierung und Isolierung von Genen |
| GB9701492D0 (en) * | 1997-01-24 | 1997-03-12 | Univ Edinburgh | Transfection of embryonic stem cells |
| CA2205888A1 (en) | 1997-07-11 | 1999-01-11 | John J. Priatel | Complementation trap |
| AU8203598A (en) * | 1997-07-11 | 1999-02-08 | Mount Sinai Hospital Corporation | Methods for identifying genes expressed in selected lineages, and a novel genes identified using the methods |
| DE19740578A1 (de) * | 1997-09-15 | 1999-04-01 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Identifizierung von Zielgenen von Transkriptionsfaktoren |
| US6046000A (en) * | 1997-11-07 | 2000-04-04 | Millennium Biotherapeutics, Inc. | Method for identifying genes encoding signal sequences |
| WO1999049028A1 (en) * | 1998-03-23 | 1999-09-30 | Genentech, Inc. | Method of selection for genes encoding secreted and transmembrane proteins |
| US6808921B1 (en) | 1998-03-27 | 2004-10-26 | Lexicon Genetics Incorporated | Vectors for gene mutagenesis and gene discovery |
| US6436707B1 (en) | 1998-03-27 | 2002-08-20 | Lexicon Genetics Incorporated | Vectors for gene mutagenesis and gene discovery |
| US6248934B1 (en) * | 1998-10-26 | 2001-06-19 | The Regents Of The University Of California | Gene trap vectors |
| EP1379697A4 (en) * | 2001-03-30 | 2007-09-12 | Chronix Biomedical Inc | DETECTION OF NUCLEIC ACIDS FOR DIAGNOSTIC PURPOSES |
| EP1417347A4 (en) * | 2001-05-02 | 2005-06-22 | Univ South Florida | VECTOR SYSTEM FOR THE SELECTION OF SEPARATED PROTEINS AND MEMBRANE-BONDED PROTEINS CODING GENES |
| CN1860232A (zh) * | 2003-09-30 | 2006-11-08 | 莱克康遗传公司 | 鉴别基因功能的方法和组合物 |
| GB0519197D0 (en) * | 2005-09-20 | 2005-10-26 | Stem Cell Sciences Uk Ltd | Cell selection and reporter system |
| US7798645B2 (en) * | 2006-05-16 | 2010-09-21 | Mark Costin Roser | Visual and memory stimulating retina self-monitoring system |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4914025A (en) * | 1985-12-05 | 1990-04-03 | Colin Manoil | Export of intra-cellular substances |
| ES2061482T3 (es) * | 1986-05-02 | 1994-12-16 | Gist Brocades Nv | Metodo para la identificacion de secuencias de señal secretora para sintesis de proteina extracelular en bacillus. |
| FR2726576B1 (fr) * | 1994-11-07 | 1997-01-31 | Pf Medicament | Production de peptides analogues de peptides hydrophobes, peptide recombinant, sequence d'adn correspondante |
| US5712149A (en) * | 1995-02-03 | 1998-01-27 | Cell Genesys, Inc. | Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals |
| US6103521A (en) * | 1995-02-06 | 2000-08-15 | Cell Genesys, Inc. | Multispecific chimeric receptors |
-
1995
- 1995-06-30 US US08/497,076 patent/US5789653A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-01-09 AU AU40873/96A patent/AU673650B2/en not_active Expired
- 1996-01-09 CA CA002166850A patent/CA2166850C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-09 EP EP96300152A patent/EP0731169A1/en not_active Withdrawn
- 1996-01-10 JP JP02979296A patent/JP3592426B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4087396A (en) | 1996-07-18 |
| JP3592426B2 (ja) | 2004-11-24 |
| CA2166850A1 (en) | 1996-07-11 |
| EP0731169A1 (en) | 1996-09-11 |
| US5789653A (en) | 1998-08-04 |
| AU673650B2 (en) | 1996-11-14 |
| CA2166850C (en) | 1999-05-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5789653A (en) | Secretory gene trap | |
| US6743967B2 (en) | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes | |
| Skarnes et al. | Capturing genes encoding membrane and secreted proteins important for mouse development. | |
| CA2250682C (en) | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes | |
| US8288610B2 (en) | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes | |
| US7005299B1 (en) | Expression of heterologous genes according to a targeted expression profile | |
| KR19990007937A (ko) | 큰 게놈 ｄｎａ 결실 유발법 | |
| JP2003510072A (ja) | 遺伝子発現を改変するための組成物および方法 | |
| JP2019537445A (ja) | 細胞株の開発のための相同組換えベクターの高速生成のためのｄｎａプラスミド | |
| JP2005504552A (ja) | ターゲティングベクターの調製方法およびその使用 | |
| US5767336A (en) | Gene trap vectors comprising a type II transmembrane domain | |
| US20020146689A1 (en) | Dna expression in transfected cells and assays carried out in transfected cells | |
| EP1321034A1 (en) | Disruption of the phosphodieterase 10 gene | |
| US20040053361A1 (en) | Nucleic acid construct useful for expressing transgenes in particular in embryonic stem cells | |
| CA2429724C (en) | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes | |
| ES2434799T3 (es) | Cromosomas artificiales, sus usos y métodos para preparar cromosomas artificiales | |
| Tucker | Creating targeted mutations in mouse embryonic stem cells using yeast artificial chromosomes | |
| WO2007062474A1 (en) | An expression system construct comprising ires and uses thereof | |
| AU2004201732A1 (en) | Artificial Chromosomes, Uses Thereof and Methods for Preparing Artificial Chromosomes | |
| AU2007254628A1 (en) | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes | |
| HK1157389A (en) | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20031215 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040315 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040318 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040615 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040726 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040825 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080903 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080903 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090903 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100903 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100903 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110903 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120903 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130903 Year of fee payment: 9 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |