JPH08308577A - 同じ細胞中でのブタ再生性呼吸系症候群ウイルスポリペプチド類の発現 - Google Patents
同じ細胞中でのブタ再生性呼吸系症候群ウイルスポリペプチド類の発現Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白
質の成熟形態の組換えＤＮＡ生産方法を提供する。 【解決手段】 同じ細胞によるＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、
ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の共発現により達成さ
れる。
質の成熟形態の組換えＤＮＡ生産方法を提供する。 【解決手段】 同じ細胞によるＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、
ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の共発現により達成さ
れる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＰＲＲＳＶのＯＲ
Ｆ３またはＯＲＦ４の蛋白質のグリコシル化形態の製造
方法、この方法において用いるための宿主細胞またはベ
クターウイルス、該ＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質を
エンコードするＤＮＡ分子、該ＯＲＦ３またはＯＲＦ４
の蛋白質のグリコシル化形態並びに該ＯＲＦ３またはＯ
ＲＦ４の蛋白質を含むワクチンに関する。
Ｆ３またはＯＲＦ４の蛋白質のグリコシル化形態の製造
方法、この方法において用いるための宿主細胞またはベ
クターウイルス、該ＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質を
エンコードするＤＮＡ分子、該ＯＲＦ３またはＯＲＦ４
の蛋白質のグリコシル化形態並びに該ＯＲＦ３またはＯ
ＲＦ４の蛋白質を含むワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】ブタ再生性呼吸系症候群ウイルス（ｐｏ
ｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅｓｐｉｒ
ａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ）（ＰＲＲ
ＳＶ）は、１９９０年の後半以来北欧の５，０００以上
の豚農場を襲ってきた新しい豚の病気の原因である。現
在ブタ再生性呼吸系症候群（ＰＲＲＳ）と呼ばれるこの
病気は、不可解豚病（Ｍｙｓｔｅｒｙ Ｓｗｉｎｅ Ｄ
ｉｓｅａｓｅ）としても知られている。最初この問題は
ドイツにおいて１９９０年の１２月に確認され、１９９
１年の初めには益々重大になった。１９９１年の１月お
よび２月には、該病気はオランダおよびベルギーに広が
った。勃発は、スペインからも報告されている。該病気
は経済的観点から非常に費用がかかるようになり、しか
してオーエスキー病に匹敵またはそれより悪くなろうと
予想されている。
ｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅｓｐｉｒ
ａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ）（ＰＲＲ
ＳＶ）は、１９９０年の後半以来北欧の５，０００以上
の豚農場を襲ってきた新しい豚の病気の原因である。現
在ブタ再生性呼吸系症候群（ＰＲＲＳ）と呼ばれるこの
病気は、不可解豚病（Ｍｙｓｔｅｒｙ Ｓｗｉｎｅ Ｄ
ｉｓｅａｓｅ）としても知られている。最初この問題は
ドイツにおいて１９９０年の１２月に確認され、１９９
１年の初めには益々重大になった。１９９１年の１月お
よび２月には、該病気はオランダおよびベルギーに広が
った。勃発は、スペインからも報告されている。該病気
は経済的観点から非常に費用がかかるようになり、しか
してオーエスキー病に匹敵またはそれより悪くなろうと
予想されている。
【０００３】雌ブタにおける主要な臨床的徴候は、食欲
減退および妊娠１１０日目までの後期流産である。子ブ
タの場合、呼吸系の問題に加えて、死産のおよび／また
は弱い子ブタの高い発生率が観察される。肥畜において
は、慢性肺炎および死亡率の増大が起こる。
減退および妊娠１１０日目までの後期流産である。子ブ
タの場合、呼吸系の問題に加えて、死産のおよび／また
は弱い子ブタの高い発生率が観察される。肥畜において
は、慢性肺炎および死亡率の増大が起こる。
【０００４】ＰＲＲＳに対してブタを保護するためのワ
クチンを開発するためにあるいはブタにおける感染を決
定するための診断方法を開発するために、この病気の病
原体が同定され、分離され、そしてワクチンにおける免
疫原または診断的検定における抗原として適合するよう
にされねばならない。
クチンを開発するためにあるいはブタにおける感染を決
定するための診断方法を開発するために、この病気の病
原体が同定され、分離され、そしてワクチンにおける免
疫原または診断的検定における抗原として適合するよう
にされねばならない。
【０００５】従来のワクチンは、化学的に不活性にされ
たウイルスワクチン、または変性生ウイルスワクチンか
らなり得る。しかしながら、不活性化ワクチンは、追加
的免疫化を必要とし、不利なことにはアジュバントを含
有し、製造するのに高価であり、また投与するのに骨が
折れる。更に、いくつかの感染ウイルス粒子が、不活性
化過程を生き残りそして当該動物に投与後病気を起こし
得る。
たウイルスワクチン、または変性生ウイルスワクチンか
らなり得る。しかしながら、不活性化ワクチンは、追加
的免疫化を必要とし、不利なことにはアジュバントを含
有し、製造するのに高価であり、また投与するのに骨が
折れる。更に、いくつかの感染ウイルス粒子が、不活性
化過程を生き残りそして当該動物に投与後病気を起こし
得る。
【０００６】一般に弱毒生ウイルスワクチンが好まれ、
何故ならそれらは、体液性反応および細胞性反応の両方
に基づく免疫応答をしばしば引き起こすからである。今
日まで、ＰＲＲＳＶ株に基づくかかるワクチンは、マク
ロファージ細胞培養における毒性株の培養および連続継
代によりのみ製造され得る。しかしながら、この処理の
ために、制御されない変異がウイルスのゲノム中に導入
されて、それらの毒性および免疫化の性質において異種
のウイルス粒子の集団をもたらす。加えて、かかる伝統
的な弱毒生ウイルスワクチンは毒力が戻って、接種され
た動物の病気および他の動物への病原体の蔓延をもたら
し得ることがよく知られている。更に、マクロファージ
細胞系におけるＰＲＲＳＶ株の培養は非常に骨が折れ、
また該ウイルスの低収量の結果となる。
何故ならそれらは、体液性反応および細胞性反応の両方
に基づく免疫応答をしばしば引き起こすからである。今
日まで、ＰＲＲＳＶ株に基づくかかるワクチンは、マク
ロファージ細胞培養における毒性株の培養および連続継
代によりのみ製造され得る。しかしながら、この処理の
ために、制御されない変異がウイルスのゲノム中に導入
されて、それらの毒性および免疫化の性質において異種
のウイルス粒子の集団をもたらす。加えて、かかる伝統
的な弱毒生ウイルスワクチンは毒力が戻って、接種され
た動物の病気および他の動物への病原体の蔓延をもたら
し得ることがよく知られている。更に、マクロファージ
細胞系におけるＰＲＲＳＶ株の培養は非常に骨が折れ、
また該ウイルスの低収量の結果となる。
【０００７】改善されたワクチンは、生ワクチンおよび
サブユニットワクチンの両方共、組換えＤＮＡ技術に基
づいて構築され得る。これらのワクチンは、ＰＲＲＳＶ
病原体に対して免疫応答を誘発することのできる必要な
および関連のＰＲＲＳＶ免疫原物質もしくは該物質をエ
ンコードする遺伝情報のみを有しそして生ワクチンまた
は不活性化ワクチンの上記の不利を示さないであろう。
サブユニットワクチンの両方共、組換えＤＮＡ技術に基
づいて構築され得る。これらのワクチンは、ＰＲＲＳＶ
病原体に対して免疫応答を誘発することのできる必要な
および関連のＰＲＲＳＶ免疫原物質もしくは該物質をエ
ンコードする遺伝情報のみを有しそして生ワクチンまた
は不活性化ワクチンの上記の不利を示さないであろう。
【０００８】該病気の病原体は今小さな包膜ＲＮＡウイ
ルスであると知られ、そしてこのウイルスの欧州型はウ
エンスヴールト等（「ザ・ヴェト・クオータリ（Ｔｈｅ
Ｖｅｔ． Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ），１３，１２１〜１
３０，１９９１」）に記載されている。乳酸デヒドロゲ
ナーゼを高めるウイルス（ＬＤＶ）およびウマ動脈炎ウ
イルスとのその関連性はコンゼルマン等（「ヴァイロロ
ジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１９３，３２９〜３３９，
１９９３」）によりあるいはメウレンベルグ等（「ヴァ
イロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１９２，６２〜７
２，１９９３」）により記載されており、かくして該ウ
イルスをアーテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄ
ａｅ）の群に位置付ける。
ルスであると知られ、そしてこのウイルスの欧州型はウ
エンスヴールト等（「ザ・ヴェト・クオータリ（Ｔｈｅ
Ｖｅｔ． Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ），１３，１２１〜１
３０，１９９１」）に記載されている。乳酸デヒドロゲ
ナーゼを高めるウイルス（ＬＤＶ）およびウマ動脈炎ウ
イルスとのその関連性はコンゼルマン等（「ヴァイロロ
ジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１９３，３２９〜３３９，
１９９３」）によりあるいはメウレンベルグ等（「ヴァ
イロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１９２，６２〜７
２，１９９３」）により記載されており、かくして該ウ
イルスをアーテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄ
ａｅ）の群に位置付ける。
【０００９】レリスタッドウイルス（ＬＶ）と呼ばれる
この欧州型の株は、オランダ国レリスタッドのザ・セン
トラル・ヴェテリナリ・インスティチュートによりＰＣ
ＴＷＯ９２／２１３７５と関連してフランス国パリのザ
・インスティチュート・パスツールに番号Ｉ−１１０２
下で寄託されている。
この欧州型の株は、オランダ国レリスタッドのザ・セン
トラル・ヴェテリナリ・インスティチュートによりＰＣ
ＴＷＯ９２／２１３７５と関連してフランス国パリのザ
・インスティチュート・パスツールに番号Ｉ−１１０２
下で寄託されている。
【００１０】別の欧州株が、ＥＰＡ第９１，２０２，６
４６．５号に記載されておりそしてフランス国パリのザ
・インスティチュート・パスツールのザ・コレクション
・ナチオナル・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオーガ
ニズムズ（ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−１１４０下で寄託され
ている。
４６．５号に記載されておりそしてフランス国パリのザ
・インスティチュート・パスツールのザ・コレクション
・ナチオナル・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオーガ
ニズムズ（ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−１１４０下で寄託され
ている。
【００１１】この欧州株は、最近コンゼルマン等（「ヴ
ァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１９３，３２９〜
３３９，１９９３」）により記載されている。
ァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１９３，３２９〜
３３９，１９９３」）により記載されている。
【００１２】該ウイルスのアメリカ型が、ベンフィール
ド等（「ジェイ・ヴェト・ダイアグン・インヴェスト
（Ｊ． Ｖｅｔ． Ｄｉａｇｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．），
４，１２７〜１３３，１９９２）」）に記載されてい
る。該アメリカ型の株は、ＡＴＣＣに番号ＶＲ−２３３
２下で寄託されておりそしてＰＣＴ ＷＯ９３／０３７
６０および欧州特許出願０，５２９，５８４に挙げられ
ている。該ウイルスが見つけられた後の早期に重要な観
察がウエンスヴールト等（「ジェイ・ヴェト・ダイアグ
ン・インヴェスト（Ｊ． Ｖｅｔ． Ｄｉａｇｎ． Ｉ
ｎｖｅｓｔ．），４，１３４〜１３８，１９９２）」）
によりなされ、しかして彼はアメリカ型および欧州型を
それらの抗原的特徴に基づいて比較しそしてアメリカ型
および欧州型の株がかなりの抗原的相違を示すことを実
証した。
ド等（「ジェイ・ヴェト・ダイアグン・インヴェスト
（Ｊ． Ｖｅｔ． Ｄｉａｇｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．），
４，１２７〜１３３，１９９２）」）に記載されてい
る。該アメリカ型の株は、ＡＴＣＣに番号ＶＲ−２３３
２下で寄託されておりそしてＰＣＴ ＷＯ９３／０３７
６０および欧州特許出願０，５２９，５８４に挙げられ
ている。該ウイルスが見つけられた後の早期に重要な観
察がウエンスヴールト等（「ジェイ・ヴェト・ダイアグ
ン・インヴェスト（Ｊ． Ｖｅｔ． Ｄｉａｇｎ． Ｉ
ｎｖｅｓｔ．），４，１３４〜１３８，１９９２）」）
によりなされ、しかして彼はアメリカ型および欧州型を
それらの抗原的特徴に基づいて比較しそしてアメリカ型
および欧州型の株がかなりの抗原的相違を示すことを実
証した。
【００１３】ＰＲＲＳＶの２種の欧州株のゲノムおよび
米国分離株のゲノムの一部が、分子的にクローニングさ
れそして配列決定された（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１３７
５；メウレンベルグ等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ），１９２，６２〜７２，１９９３」；コンゼルマ
ン等前掲；ワング等「ジェイ・ヴェト・ダイアグン・イ
ンヴェスト（Ｊ． Ｖｅｔ． Ｄｉａｇｎ． Ｉｎｖｅ
ｓｔ．），６，２９３〜２９６，１９９４」；マーダッ
シ等「ジェイ・ゲン・ヴァイロル（Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉ
ｒｏｌ．），７５，６８１〜６８５，１９９４」；メン
グ等「プロク・第１３回ＩＰＶＳコングレス（Ｐｒｏ
ｃ． １３ｔｈ ＩＰＶＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ），６
１，１９９４」）。
米国分離株のゲノムの一部が、分子的にクローニングさ
れそして配列決定された（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１３７
５；メウレンベルグ等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ），１９２，６２〜７２，１９９３」；コンゼルマ
ン等前掲；ワング等「ジェイ・ヴェト・ダイアグン・イ
ンヴェスト（Ｊ． Ｖｅｔ． Ｄｉａｇｎ． Ｉｎｖｅ
ｓｔ．），６，２９３〜２９６，１９９４」；マーダッ
シ等「ジェイ・ゲン・ヴァイロル（Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉ
ｒｏｌ．），７５，６８１〜６８５，１９９４」；メン
グ等「プロク・第１３回ＩＰＶＳコングレス（Ｐｒｏ
ｃ． １３ｔｈ ＩＰＶＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ），６
１，１９９４」）。
【００１４】ＰＲＲＳＶゲノムのＲＮＡは約１５ｋｂを
含みそして８つの開放型読み枠（ＯＲＦ）がその中で同
定され得、即ちＯＲＦ１Ａ，ＢおよびＯＲＦ２〜７であ
る。ＯＲＦ１Ａ，ＢはとりわけウイルスＲＮＡポリメラ
ーゼをエンコードするのに対し、ＯＲＦ２〜６はウイル
ス膜（エンベロープ）蛋白質をエンコードする。ＯＲＦ
７は、ヌクレオキャップシド蛋白質をエンコードする。
感染された細胞においては、６種の主要なサブゲノムｍ
ＲＮＡの３′共末端入れ子化セット（ｃｏｔｅｒｍｉｎ
ａｌ ｎｅｓｔｅｄ ｓｅｔ）が、欧州分離株および米
国分離株（メング等前掲）の両方において実証され得
る。第１表に、ＰＲＲＳＶの構造蛋白質をエンコードす
るＯＲＦ（コンゼルマン等前掲）の特徴が要約されてい
る。
含みそして８つの開放型読み枠（ＯＲＦ）がその中で同
定され得、即ちＯＲＦ１Ａ，ＢおよびＯＲＦ２〜７であ
る。ＯＲＦ１Ａ，ＢはとりわけウイルスＲＮＡポリメラ
ーゼをエンコードするのに対し、ＯＲＦ２〜６はウイル
ス膜（エンベロープ）蛋白質をエンコードする。ＯＲＦ
７は、ヌクレオキャップシド蛋白質をエンコードする。
感染された細胞においては、６種の主要なサブゲノムｍ
ＲＮＡの３′共末端入れ子化セット（ｃｏｔｅｒｍｉｎ
ａｌ ｎｅｓｔｅｄ ｓｅｔ）が、欧州分離株および米
国分離株（メング等前掲）の両方において実証され得
る。第１表に、ＰＲＲＳＶの構造蛋白質をエンコードす
るＯＲＦ（コンゼルマン等前掲）の特徴が要約されてい
る。
【００１５】
【表１】
【００１６】ＰＲＲＳＶゲノム上のＯＲＦの分布が、図
１に示されておりそしてメウレンベルグ等（前掲）によ
り見出されたものに相当する。
１に示されておりそしてメウレンベルグ等（前掲）によ
り見出されたものに相当する。
【００１７】前記に挙げられたＯＲＦにより発現される
ＰＲＲＳＶ蛋白質についてはほとんど知られていない。
約１５〜２６ｋＤの５種のウイルス蛋白質が、欧州また
は米国ＰＲＲＳ分離株で接種された細胞の溶菌液におい
て同定された（ネルソン等「ジェイ・クリン・マイクロ
バイオル（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．），３１，３１８４〜３１８９，１９９３）」およ
びベンフィールド等「プロク・第１３回ＩＰＶＳコング
レス（Ｐｒｏｃ． １３ｔｈ ＩＰＶＳ Ｃｏｎｇｒｅ
ｓｓ），６２，１９９４」）。ＯＲＦ７、ＯＲＦ６およ
びＯＲＦ５の蛋白質はビリオン中に存在することが実証
された（メウレンベルグ等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ），２０６，１５５〜１６３，１９９５」）。
今般、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の２種の形態即
ち小さな形態および大きな形態がＰＲＲＳＶで感染され
た細胞中に存在するが、しかし１種の形態のみが感染細
胞の上澄みから分離された精製ビリオン中に存在するこ
とが見出された。各ＯＲＦ蛋白質の２種の形態は、それ
らの炭水化物鎖のプロセッシングのレベルにより区別さ
れる。精製ビリオン中に存在する形態である大きな形態
はエンドグリコシダーゼＨ（エンド−Ｈ）耐性であるの
に対し、小さな形態はエンド−Ｈ感受性である。酵素エ
ンド−Ｈの基質は、糖蛋白質の“高マンノシル化”形態
のみである。この酵素は、アミノ酸アスパラギン（Ａｓ
ｎ）に結合されている炭水化物基ＧｌｃＮａｃ直後のオ
リゴ糖鎖を開裂する。より複雑な形態即ちグリコシル化
過程が完了している形態は、エンド−Ｈ開裂に対して耐
性である。ＯＲＦ３および４の蛋白質のグリコシル化過
程の段階を決定するために並びにＯＲＦ蛋白質の小さな
（“高マンノース”）形態をそれらの大きな（“複雑
な”）形態から区別するために、エンド−Ｈ耐性がここ
において用いられた。酵素ペプチド−Ｎ−グリコヒドロ
ラーゼ（ＰｎＧａｓｅ−Ｆ）を用いて、ＯＲＦ３および
４の完全に脱グリコシル化された形態（ポリペプチド骨
格）が得られた。ビリオン中に組み込まれたＯＲＦ３お
よび４の糖蛋白質は大きな（“複雑な”）形態であるこ
とが分かり、しかしてこれらの形態はそれらの前駆体で
ある小さな（“高マンノース”）形態から更なるプロセ
ッシングによりもたらされ、その結果該大きな形態はエ
ンド−Ｈ耐性になった。ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白
質形態のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された分子量（Ｍ
Ｗ）が第２表に示されている。
ＰＲＲＳＶ蛋白質についてはほとんど知られていない。
約１５〜２６ｋＤの５種のウイルス蛋白質が、欧州また
は米国ＰＲＲＳ分離株で接種された細胞の溶菌液におい
て同定された（ネルソン等「ジェイ・クリン・マイクロ
バイオル（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．），３１，３１８４〜３１８９，１９９３）」およ
びベンフィールド等「プロク・第１３回ＩＰＶＳコング
レス（Ｐｒｏｃ． １３ｔｈ ＩＰＶＳ Ｃｏｎｇｒｅ
ｓｓ），６２，１９９４」）。ＯＲＦ７、ＯＲＦ６およ
びＯＲＦ５の蛋白質はビリオン中に存在することが実証
された（メウレンベルグ等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ），２０６，１５５〜１６３，１９９５」）。
今般、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の２種の形態即
ち小さな形態および大きな形態がＰＲＲＳＶで感染され
た細胞中に存在するが、しかし１種の形態のみが感染細
胞の上澄みから分離された精製ビリオン中に存在するこ
とが見出された。各ＯＲＦ蛋白質の２種の形態は、それ
らの炭水化物鎖のプロセッシングのレベルにより区別さ
れる。精製ビリオン中に存在する形態である大きな形態
はエンドグリコシダーゼＨ（エンド−Ｈ）耐性であるの
に対し、小さな形態はエンド−Ｈ感受性である。酵素エ
ンド−Ｈの基質は、糖蛋白質の“高マンノシル化”形態
のみである。この酵素は、アミノ酸アスパラギン（Ａｓ
ｎ）に結合されている炭水化物基ＧｌｃＮａｃ直後のオ
リゴ糖鎖を開裂する。より複雑な形態即ちグリコシル化
過程が完了している形態は、エンド−Ｈ開裂に対して耐
性である。ＯＲＦ３および４の蛋白質のグリコシル化過
程の段階を決定するために並びにＯＲＦ蛋白質の小さな
（“高マンノース”）形態をそれらの大きな（“複雑
な”）形態から区別するために、エンド−Ｈ耐性がここ
において用いられた。酵素ペプチド−Ｎ−グリコヒドロ
ラーゼ（ＰｎＧａｓｅ−Ｆ）を用いて、ＯＲＦ３および
４の完全に脱グリコシル化された形態（ポリペプチド骨
格）が得られた。ビリオン中に組み込まれたＯＲＦ３お
よび４の糖蛋白質は大きな（“複雑な”）形態であるこ
とが分かり、しかしてこれらの形態はそれらの前駆体で
ある小さな（“高マンノース”）形態から更なるプロセ
ッシングによりもたらされ、その結果該大きな形態はエ
ンド−Ｈ耐性になった。ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白
質形態のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された分子量（Ｍ
Ｗ）が第２表に示されている。
【００１８】
【表２】
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】個々のＯＲＦで形質転
換された真核細胞中での個々のＯＲＦの発現後、ウイル
ス感染細胞とは対照的に専らＯＲＦ３およびＯＲＦ４の
蛋白質の小さな形態が産生されることが分かった。それ
らの個々の蛋白質は真核細胞中で完全にはプロセッシン
グされないので、小胞体からゴルジ装置の中嚢への該蛋
白質の輸送は可能でないということが最も有りそうであ
る。
換された真核細胞中での個々のＯＲＦの発現後、ウイル
ス感染細胞とは対照的に専らＯＲＦ３およびＯＲＦ４の
蛋白質の小さな形態が産生されることが分かった。それ
らの個々の蛋白質は真核細胞中で完全にはプロセッシン
グされないので、小胞体からゴルジ装置の中嚢への該蛋
白質の輸送は可能でないということが最も有りそうであ
る。
【００２０】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、ＰＲＲ
ＳＶのＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の大きな形態を
得るために１つの細胞中におけるＯＲＦ２、ＯＲＦ３お
よびＯＲＦ４の共発現が必要とされかつ充分であるとい
うことが今般見出された。感染過程中、動物は該蛋白質
の成熟（大きな）形態に直面する。それ故、本発明は、
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の成熟し
た大きな形態の組換えＤＮＡの調製方法を提供する。
ＳＶのＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の大きな形態を
得るために１つの細胞中におけるＯＲＦ２、ＯＲＦ３お
よびＯＲＦ４の共発現が必要とされかつ充分であるとい
うことが今般見出された。感染過程中、動物は該蛋白質
の成熟（大きな）形態に直面する。それ故、本発明は、
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の成熟し
た大きな形態の組換えＤＮＡの調製方法を提供する。
【００２１】それ故、本発明は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３
またはＯＲＦ４の蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片で
形質転換された適当な宿主細胞あるいはＯＲＦ３または
ＯＲＦ４の蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片を含むベ
クターウイルスで感染された宿主細胞を該蛋白質を発現
する条件下で培養する工程および発現された蛋白質を採
取する工程からなる、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲ
Ｆ４の蛋白質のグリコシル化形態の製造方法において、
同じ宿主細胞が同時にＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３
およびＯＲＦ４の蛋白質を発現することを特徴とする上
記方法を提供する。ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４
は、図１に示されているＰＲＲＳＶゲノム上のこれらの
ＯＲＦの分布を示す地図により定められるようなポリメ
ラーゼをエンコードする領域ＯＲＦ１の下流（３′方
向）の大きな蛋白質をエンコードする（部分的に重複す
る）領域として定められる。この地図は、メウレンベル
グ等（前掲）において示されたものと一致しそしてすべ
てのＰＲＲＳウイルスにとっての代表的地図と考えられ
る。ＯＲＦ５〜７もまた、前記の地図上のそれらの位置
により定められる。
またはＯＲＦ４の蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片で
形質転換された適当な宿主細胞あるいはＯＲＦ３または
ＯＲＦ４の蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片を含むベ
クターウイルスで感染された宿主細胞を該蛋白質を発現
する条件下で培養する工程および発現された蛋白質を採
取する工程からなる、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲ
Ｆ４の蛋白質のグリコシル化形態の製造方法において、
同じ宿主細胞が同時にＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３
およびＯＲＦ４の蛋白質を発現することを特徴とする上
記方法を提供する。ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４
は、図１に示されているＰＲＲＳＶゲノム上のこれらの
ＯＲＦの分布を示す地図により定められるようなポリメ
ラーゼをエンコードする領域ＯＲＦ１の下流（３′方
向）の大きな蛋白質をエンコードする（部分的に重複す
る）領域として定められる。この地図は、メウレンベル
グ等（前掲）において示されたものと一致しそしてすべ
てのＰＲＲＳウイルスにとっての代表的地図と考えられ
る。ＯＲＦ５〜７もまた、前記の地図上のそれらの位置
により定められる。
【００２２】特に、上記のＯＲＦは、コンゼルマン等
（前掲）に開示されたそれぞれのＯＲＦによりエンコー
ドされるＰＲＲＳＶ蛋白質のアミノ酸配列により特徴づ
けられる。
（前掲）に開示されたそれぞれのＯＲＦによりエンコー
ドされるＰＲＲＳＶ蛋白質のアミノ酸配列により特徴づ
けられる。
【００２３】特定のＯＲＦ蛋白質にとって、個々のＰＲ
ＲＳＶ分離株の間には自然変異が存在し得ることが理解
されよう。これらの変異は、全体の配列中の１つまたは
それ以上のアミノ酸の相違により実証され得る。かかる
変異ＰＲＲＳＶおよびこれらのＯＲＦ蛋白質のアミノ酸
配列の例は、メウレンベルグ等（前掲）により開示され
ている。
ＲＳＶ分離株の間には自然変異が存在し得ることが理解
されよう。これらの変異は、全体の配列中の１つまたは
それ以上のアミノ酸の相違により実証され得る。かかる
変異ＰＲＲＳＶおよびこれらのＯＲＦ蛋白質のアミノ酸
配列の例は、メウレンベルグ等（前掲）により開示され
ている。
【００２４】好ましくは、本発明において用いられるべ
きＯＲＦ蛋白質は、コンゼルマン等（前掲）により開示
されたアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列レベルに基
づいて少なくとも５５％一層好ましくは少なくとも７０
％の相同を示す。
きＯＲＦ蛋白質は、コンゼルマン等（前掲）により開示
されたアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列レベルに基
づいて少なくとも５５％一層好ましくは少なくとも７０
％の相同を示す。
【００２５】本発明の本質的観点は、全く同一の宿主細
胞がＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の
蛋白質を共発現することである。このことは、３つの該
ＯＲＦを含むＤＮＡ断片で宿主細胞を形質転換すること
によりあるいは３つすべてのＯＲＦが該細胞中に導入さ
れるように１種より多いＤＮＡ断片で該細胞を形質転換
することにより達成され得る。例えば、宿主細胞は、Ｏ
ＲＦ２を含む第１断片、ＯＲＦ３を含む第２断片および
ＯＲＦ４を含む第３断片である３種のＤＮＡ断片で共形
質転換され得る。
胞がＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の
蛋白質を共発現することである。このことは、３つの該
ＯＲＦを含むＤＮＡ断片で宿主細胞を形質転換すること
によりあるいは３つすべてのＯＲＦが該細胞中に導入さ
れるように１種より多いＤＮＡ断片で該細胞を形質転換
することにより達成され得る。例えば、宿主細胞は、Ｏ
ＲＦ２を含む第１断片、ＯＲＦ３を含む第２断片および
ＯＲＦ４を含む第３断片である３種のＤＮＡ断片で共形
質転換され得る。
【００２６】同様に、宿主細胞は、上記の３つのＯＲＦ
が同じ細胞中に導入される限り、１種のベクターウイル
スまたはそれ以上のベクターウイルスにより（共）感染
され得る。
が同じ細胞中に導入される限り、１種のベクターウイル
スまたはそれ以上のベクターウイルスにより（共）感染
され得る。
【００２７】ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４を有す
る宿主細胞中での同時発現がＯＲＦ３およびＯＲＦ４の
蛋白質の大きな成熟形態を生産するために必要とされか
つ充分であるけれども、所望するならＯＲＦ５〜７の１
つまたはそれ以上のようなＰＲＲＳＶの他のＯＲＦ特に
ＯＲＦ５および／またはＯＲＦ７もまた、該宿主細胞に
より共発現され得る。
る宿主細胞中での同時発現がＯＲＦ３およびＯＲＦ４の
蛋白質の大きな成熟形態を生産するために必要とされか
つ充分であるけれども、所望するならＯＲＦ５〜７の１
つまたはそれ以上のようなＰＲＲＳＶの他のＯＲＦ特に
ＯＲＦ５および／またはＯＲＦ７もまた、該宿主細胞に
より共発現され得る。
【００２８】更に、本発明による方法において、ＯＲＦ
２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４のすべては、これらのＯＲ
Ｆの発現が保証されるようにプロモーター配列の転写調
節下にある。好ましくは、各ＯＲＦは、別々のプロモー
ターに作動的に結合されている。
２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４のすべては、これらのＯＲ
Ｆの発現が保証されるようにプロモーター配列の転写調
節下にある。好ましくは、各ＯＲＦは、別々のプロモー
ターに作動的に結合されている。
【００２９】本発明において用いられるべきＤＮＡ断片
は、当該ＯＲＦが事実上会合または結合されない種々の
複製遂行ＤＮＡ配列を含み得、その結果適当な宿主の形
質転換のために用いられ得るいわゆる組換え核酸分子を
もたらす。かかるハイブリッドＤＮＡ分子は、好ましく
は、例えばプラスミドから誘導される。ＰＲＲＳＶのＯ
ＲＦをクローニングするために用いられ得る特定のベク
ターは、当該技術において公知でありそしてとりわけｐ
ＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭおよびブルースク
リプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミド（ロドリグ
クエズ・アール・エルおよびディー・ティー・デンハル
ト編集「ベクターズ（Ｖｅｃｔｏｒｓ）：分子クローニ
ングベクターおよびそれらの使用の調査（Ａ ｓｕｒｖ
ｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ），バタ
ーワースス，１９８８」；レンストラ・ジェイ・エイ等
「アーク・ヴァイロル（Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．），
１１０，１〜２４，１９９０」も参照）のようなプラス
ミドベクターを含む。かかる組換え核酸分子の構築のた
めに用いられるべき方法は、当業者に公知でありそして
とりわけマニアティス・ティー等（「分子クローニング
研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，第２編，
１９８９」）に記載されている。
は、当該ＯＲＦが事実上会合または結合されない種々の
複製遂行ＤＮＡ配列を含み得、その結果適当な宿主の形
質転換のために用いられ得るいわゆる組換え核酸分子を
もたらす。かかるハイブリッドＤＮＡ分子は、好ましく
は、例えばプラスミドから誘導される。ＰＲＲＳＶのＯ
ＲＦをクローニングするために用いられ得る特定のベク
ターは、当該技術において公知でありそしてとりわけｐ
ＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭおよびブルースク
リプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミド（ロドリグ
クエズ・アール・エルおよびディー・ティー・デンハル
ト編集「ベクターズ（Ｖｅｃｔｏｒｓ）：分子クローニ
ングベクターおよびそれらの使用の調査（Ａ ｓｕｒｖ
ｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ），バタ
ーワースス，１９８８」；レンストラ・ジェイ・エイ等
「アーク・ヴァイロル（Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．），
１１０，１〜２４，１９９０」も参照）のようなプラス
ミドベクターを含む。かかる組換え核酸分子の構築のた
めに用いられるべき方法は、当業者に公知でありそして
とりわけマニアティス・ティー等（「分子クローニング
研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，第２編，
１９８９」）に記載されている。
【００３０】適当な宿主細胞は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦの
蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片により形質転換され
得かつ該ＰＲＲＳＶのＯＲＦの蛋白質をグリコシル化形
態にて発現することのできる細胞である。ここで用いら
れる“形質転換”は、用いられる方法例えば直接取込み
または形質導入に無関係に、宿主細胞中への異種核酸配
列の導入を指す。該異種核酸配列は、宿主ゲノム中に統
合され得る。発現のために、異種ＤＮＡ断片は、選定さ
れた宿主と適合し得かつ挿入された核酸配列の発現を調
節し得る適切な発現制御配列を備える。
蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片により形質転換され
得かつ該ＰＲＲＳＶのＯＲＦの蛋白質をグリコシル化形
態にて発現することのできる細胞である。ここで用いら
れる“形質転換”は、用いられる方法例えば直接取込み
または形質導入に無関係に、宿主細胞中への異種核酸配
列の導入を指す。該異種核酸配列は、宿主ゲノム中に統
合され得る。発現のために、異種ＤＮＡ断片は、選定さ
れた宿主と適合し得かつ挿入された核酸配列の発現を調
節し得る適切な発現制御配列を備える。
【００３１】宿主は好ましくは、酵母例えばサッカロミ
セス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような真核源のものあるいはＨ
ｅＬａ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞を含めた昆虫、植物または哺乳類の細胞のよう
なより高等の真核細胞である。昆虫細胞は、スポドプテ
ラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ）のＳｆ９細胞系（ルッコウ等「バイオテク
ノロジー（Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６，４７〜
５５，１９８８」）を含む。真核クローニング系におけ
るＰＲＲＳＶのＯＲＦのクローニングおよび発現に関す
る情報は、エッサー・ケイ等（「真核生物のプラスミド
（Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ），
スプリンジャー・ヴェアラグ，１９８６」）に見られ得
る。
セス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような真核源のものあるいはＨ
ｅＬａ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞を含めた昆虫、植物または哺乳類の細胞のよう
なより高等の真核細胞である。昆虫細胞は、スポドプテ
ラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ）のＳｆ９細胞系（ルッコウ等「バイオテク
ノロジー（Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６，４７〜
５５，１９８８」）を含む。真核クローニング系におけ
るＰＲＲＳＶのＯＲＦのクローニングおよび発現に関す
る情報は、エッサー・ケイ等（「真核生物のプラスミド
（Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ），
スプリンジャー・ヴェアラグ，１９８６」）に見られ得
る。
【００３２】宿主細胞が酵母である場合、例示的な有用
な発現制御配列は、例えばα−接合因子を含む。昆虫細
胞に対しては、バクロウイルスのポリヘドリンまたはｐ
１０プロモーターが用いられ得る（スミス・ジー・イー
等「モル・セル・バイオル（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂ
ｉｏｌ．）３，２１５６〜６５，１９８３」）。宿主細
胞が哺乳類源のものである場合、例示的な有用な発現制
御配列は、例えばＳＶ−４０プロモーター（ベルマン・
ピー・ダブリュー等「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２
２２，５２４〜５２７，１９８３」）あるいは例えばメ
タロチオネインプロモーター（ブリンスター・アール・
エル「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９６，３９〜４
２，１９８２」）または熱ショックプロモーター（ヴォ
エルミー等「プロク・ナトル・アカド・サイ・ユーエス
エイ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ）８２，４９４９〜５３，１９８５」）を含
む。
な発現制御配列は、例えばα−接合因子を含む。昆虫細
胞に対しては、バクロウイルスのポリヘドリンまたはｐ
１０プロモーターが用いられ得る（スミス・ジー・イー
等「モル・セル・バイオル（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂ
ｉｏｌ．）３，２１５６〜６５，１９８３」）。宿主細
胞が哺乳類源のものである場合、例示的な有用な発現制
御配列は、例えばＳＶ−４０プロモーター（ベルマン・
ピー・ダブリュー等「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２
２２，５２４〜５２７，１９８３」）あるいは例えばメ
タロチオネインプロモーター（ブリンスター・アール・
エル「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９６，３９〜４
２，１９８２」）または熱ショックプロモーター（ヴォ
エルミー等「プロク・ナトル・アカド・サイ・ユーエス
エイ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ）８２，４９４９〜５３，１９８５」）を含
む。
【００３３】あるいは、適当な宿主細胞は、ＰＲＲＳＶ
のＯＲＦをエンコードするＤＮＡ断片を含むベクターウ
イルスによる感染を受けやすい細胞である。ベクターウ
イルスにおいて、異種ＤＮＡ断片が、該ウイルスの非必
須領域即ち該ウイルスの感染または複製に必要な機能の
ような該ウイルスの必須機能を壊すことなく該ＤＮＡ断
片の組込みのために用いられ得る領域中に挿入される。
かかる領域は、一般に、ヘルペスウイルスおよびポック
スウイルスを含めて種々のウイルスについて当該技術に
おいて知られている。
のＯＲＦをエンコードするＤＮＡ断片を含むベクターウ
イルスによる感染を受けやすい細胞である。ベクターウ
イルスにおいて、異種ＤＮＡ断片が、該ウイルスの非必
須領域即ち該ウイルスの感染または複製に必要な機能の
ような該ウイルスの必須機能を壊すことなく該ＤＮＡ断
片の組込みのために用いられ得る領域中に挿入される。
かかる領域は、一般に、ヘルペスウイルスおよびポック
スウイルスを含めて種々のウイルスについて当該技術に
おいて知られている。
【００３４】多量のＰＲＲＳＶのＯＲＦの蛋白質を得る
ために、好ましい発現系はバクロウイルス発現系（ＢＶ
ＥＳ）である。この系においては、スポドプテラ・フル
ギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａ）（Ｓｆ；ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１）のような昆虫細胞
は、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａ
ｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス
（ＡｃＮＰＶ）のように、バクロウイルス用の宿主とし
て細胞培養において保持される。ＡｃＮＰＶにおける遺
伝子のいくつかは、高レベルに発現されるがしかしウイ
ルス感染サイクルに対して非必須である。これらの遺伝
子は、ｐＡｃＡＳ３のようなバクロ転移プラスミドと野
性型（ｗｔ）ＡｃＮＰＶのＤＮＡとの間でトランスフェ
クションされた細胞における異種組換えの標的である。
ｐＡｃＡＳ３（ジェイ・ヴラック等「ヴァイロロジー
（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７９，３１２〜３２０，１９９
０」）においては、異種遺伝子は、組換え過程の標的を
定めるｗｔ ＡｃＮＰＶの配列により囲まれた非必須の
ｐ１０遺伝子の代わりにｐ１０プロモーターの下流に挿
入される。組換え体のスクリーニングを容易にするため
に、ｐＡｃＡＳ３はＬａｃＺ遺伝子をも含んでいて、培
地へのＸ−ｇａｌの添加時に組換え体プラークが青色に
変わるようにする。
ために、好ましい発現系はバクロウイルス発現系（ＢＶ
ＥＳ）である。この系においては、スポドプテラ・フル
ギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａ）（Ｓｆ；ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１）のような昆虫細胞
は、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａ
ｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス
（ＡｃＮＰＶ）のように、バクロウイルス用の宿主とし
て細胞培養において保持される。ＡｃＮＰＶにおける遺
伝子のいくつかは、高レベルに発現されるがしかしウイ
ルス感染サイクルに対して非必須である。これらの遺伝
子は、ｐＡｃＡＳ３のようなバクロ転移プラスミドと野
性型（ｗｔ）ＡｃＮＰＶのＤＮＡとの間でトランスフェ
クションされた細胞における異種組換えの標的である。
ｐＡｃＡＳ３（ジェイ・ヴラック等「ヴァイロロジー
（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７９，３１２〜３２０，１９９
０」）においては、異種遺伝子は、組換え過程の標的を
定めるｗｔ ＡｃＮＰＶの配列により囲まれた非必須の
ｐ１０遺伝子の代わりにｐ１０プロモーターの下流に挿
入される。組換え体のスクリーニングを容易にするため
に、ｐＡｃＡＳ３はＬａｃＺ遺伝子をも含んでいて、培
地へのＸ−ｇａｌの添加時に組換え体プラークが青色に
変わるようにする。
【００３５】
【発明の実施の形態】請求項に記載された方法におい
て、上記に定められた宿主細胞は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ
２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の発現にとって好
都合である条件下で培養され得る。ワクチンまたは診断
的検定体は粗製培養物、宿主細胞溶菌液または宿主細胞
抽出物の試料を用いて調製され得るけれども、別の具体
的態様においては使用目的に依存してより精製されたＯ
ＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質が製造され得る。生産さ
れた蛋白質を精製するために、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およ
びＯＲＦ３の全てを発現する宿主細胞が適切な容量にて
培養されそして産生された蛋白質がかかる細胞からある
いは該蛋白質が分泌されるならば培地から単離される。
培地中に排出された蛋白質は標準的技法例えば塩分別、
遠心分離、限外濾過、クロマトグラフィー、ゲル濾過免
疫沈降または免疫アフィニティークロマトグラフィーに
より単離されそして精製され得、一方細胞内蛋白質は最
初に該細胞を収集し、これらの細胞を例えば音波処理に
よりまたはフレンチプレスのような他の機械的破壊手段
により破壊し、次いで所望するなら該蛋白質を他の細胞
内成分から分離することにより単離され得る。細胞破壊
はまた、化学的手段（例えば、ＥＤＴＡ処理）またはリ
ゾチーム消化のような酵素的手段により達成され得よ
う。
て、上記に定められた宿主細胞は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ
２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質の発現にとって好
都合である条件下で培養され得る。ワクチンまたは診断
的検定体は粗製培養物、宿主細胞溶菌液または宿主細胞
抽出物の試料を用いて調製され得るけれども、別の具体
的態様においては使用目的に依存してより精製されたＯ
ＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質が製造され得る。生産さ
れた蛋白質を精製するために、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およ
びＯＲＦ３の全てを発現する宿主細胞が適切な容量にて
培養されそして産生された蛋白質がかかる細胞からある
いは該蛋白質が分泌されるならば培地から単離される。
培地中に排出された蛋白質は標準的技法例えば塩分別、
遠心分離、限外濾過、クロマトグラフィー、ゲル濾過免
疫沈降または免疫アフィニティークロマトグラフィーに
より単離されそして精製され得、一方細胞内蛋白質は最
初に該細胞を収集し、これらの細胞を例えば音波処理に
よりまたはフレンチプレスのような他の機械的破壊手段
により破壊し、次いで所望するなら該蛋白質を他の細胞
内成分から分離することにより単離され得る。細胞破壊
はまた、化学的手段（例えば、ＥＤＴＡ処理）またはリ
ゾチーム消化のような酵素的手段により達成され得よ
う。
【００３６】本発明の更なる具体的態様によれば、１種
またはそれ以上の異種ＤＮＡ断片を含むベクターウイル
スにおいて、該ＤＮＡ断片がＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、Ｏ
ＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質をエンコードすることを
特徴とする上記ベクターウイルスが提供される。かかる
ベクターウイルスは、一般的意味で既に上記に記載され
ている。このベクターウイルスは、ワクチンの開発の新
しい手法即ち弱毒生ウイルスワクチン株をキャリヤー
（ウイルスワクチンベクター）として用いる外来病原体
の遺伝子の発現において用いられ得る。生ベクターウイ
ルスによる抗原の発現は、自然感染後の発現を模擬し得
そして体液性および細胞性の両方の免疫応答を刺激し得
る。かかるベクターは、適切なワクチンが現在入手され
ないかあるいは安全的にまたは容易に作られ得ない病気
対する免疫化のために用いられ得る。上記に概略されて
いるように、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４を含
むベクターウイルスによる免疫原の発現は、本発明によ
るベクターウイルスが適用される場合のみ自然感染を模
擬する。
またはそれ以上の異種ＤＮＡ断片を含むベクターウイル
スにおいて、該ＤＮＡ断片がＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、Ｏ
ＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質をエンコードすることを
特徴とする上記ベクターウイルスが提供される。かかる
ベクターウイルスは、一般的意味で既に上記に記載され
ている。このベクターウイルスは、ワクチンの開発の新
しい手法即ち弱毒生ウイルスワクチン株をキャリヤー
（ウイルスワクチンベクター）として用いる外来病原体
の遺伝子の発現において用いられ得る。生ベクターウイ
ルスによる抗原の発現は、自然感染後の発現を模擬し得
そして体液性および細胞性の両方の免疫応答を刺激し得
る。かかるベクターは、適切なワクチンが現在入手され
ないかあるいは安全的にまたは容易に作られ得ない病気
対する免疫化のために用いられ得る。上記に概略されて
いるように、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４を含
むベクターウイルスによる免疫原の発現は、本発明によ
るベクターウイルスが適用される場合のみ自然感染を模
擬する。
【００３７】ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯ
ＲＦ４の同時発現のために適するウイルスベクターは、
当業者に知られておりそしてワクチニア（ピッシニおよ
びパオレッチ「アドヴ・ヴァイル・レス（Ａｄｖ． Ｖ
ｉｒ． Ｒｅｓ．）３４，４３〜６４，１９８８」；リ
ヴィエレ等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ． Ｖｉｒｏ
ｌ．）６６，３４２４〜３４３４，１９９２」；メンゲ
リング等「アーク・ヴァイロル（Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏ
ｌ．）１３４，２５９〜２６９，１９９４」）のような
ポックスウイルス、豚痘（ヴァン・デア・リーク等「ザ
・ヴェト・レコード（Ｔｈｅ Ｖｅｔ． Ｒｅｃｏｒ
ｄ）１３４，１３〜１８，１９９４」）、アデノウイル
ス（フス等「ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）１２，６０
７，１９９４」）および仮性狂犬病ウイルスのようなヘ
ルペスウイルスを含む。
ＲＦ４の同時発現のために適するウイルスベクターは、
当業者に知られておりそしてワクチニア（ピッシニおよ
びパオレッチ「アドヴ・ヴァイル・レス（Ａｄｖ． Ｖ
ｉｒ． Ｒｅｓ．）３４，４３〜６４，１９８８」；リ
ヴィエレ等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ． Ｖｉｒｏ
ｌ．）６６，３４２４〜３４３４，１９９２」；メンゲ
リング等「アーク・ヴァイロル（Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏ
ｌ．）１３４，２５９〜２６９，１９９４」）のような
ポックスウイルス、豚痘（ヴァン・デア・リーク等「ザ
・ヴェト・レコード（Ｔｈｅ Ｖｅｔ． Ｒｅｃｏｒ
ｄ）１３４，１３〜１８，１９９４」）、アデノウイル
ス（フス等「ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）１２，６０
７，１９９４」）および仮性狂犬病ウイルスのようなヘ
ルペスウイルスを含む。
【００３８】本発明において用いられるべき好ましいベ
クターウイルスは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）から
誘導される。
クターウイルスは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）から
誘導される。
【００３９】例えば、ＰＲＶについては、いつくかの非
必須領域が開示されておりかつｇｐ５０、ｇｐ６３、ｇ
Ｉ、ｇＩＩＩ、ｇＸ、１１Ｋ、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）、蛋白質
キナーゼ（ＰＫ）または２８Ｋ（ピーターズ等「ジェイ
・ヴァイロル（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６７，１７０〜１
７７，１９９３」；デ・ウインド・エヌ等「ジェイ・ヴ
ァイロル（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６４，４６９１〜４６
９６，１９９０」；ムーアマン・アール・ジェイ・エム
等「ジェイ・ゲン・ヴァイロル（Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉ
ｒｏｌ．）７１，１５９１〜１５９５，１９９０」；ペ
トロヴスキス・イー・エイ等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）１５９，１９３〜１９５，１９８７」；ヴ
ァン・ジイル・エム等「ジェイ・ゲン・ヴァイロル
（Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．）７１，１７４７〜１
７５５，１９９０」；トムセン・ディー・アール等「ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）５７，２６１〜２６５，１９８７」；
キーラー・シー・エル等「ジーン（Ｇｅｎｅ）５０，２
１５〜２２４，１９８６」；ウイーレイ・エム・イー等
「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６２，４
１８５〜４１９４，１９８８」；ヴァン・ジイル・エム
等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６５，
２７６１〜２７６５，１９９１」；メッテンレイター・
ス・シー等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７
９，４９８〜５０３，１９９０」；米国特許第４，６０
９，５４８号、欧州特許第０２６３２０７号、欧州特許
出願第９４２０３６４３号およびＰＣＴ出願ＷＯ／９４
／０１５７３）をエンコードする遺伝子のような異種Ｄ
ＮＡ配列の組込みのために用いられている。
必須領域が開示されておりかつｇｐ５０、ｇｐ６３、ｇ
Ｉ、ｇＩＩＩ、ｇＸ、１１Ｋ、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）、蛋白質
キナーゼ（ＰＫ）または２８Ｋ（ピーターズ等「ジェイ
・ヴァイロル（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６７，１７０〜１
７７，１９９３」；デ・ウインド・エヌ等「ジェイ・ヴ
ァイロル（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６４，４６９１〜４６
９６，１９９０」；ムーアマン・アール・ジェイ・エム
等「ジェイ・ゲン・ヴァイロル（Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉ
ｒｏｌ．）７１，１５９１〜１５９５，１９９０」；ペ
トロヴスキス・イー・エイ等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）１５９，１９３〜１９５，１９８７」；ヴ
ァン・ジイル・エム等「ジェイ・ゲン・ヴァイロル
（Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．）７１，１７４７〜１
７５５，１９９０」；トムセン・ディー・アール等「ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）５７，２６１〜２６５，１９８７」；
キーラー・シー・エル等「ジーン（Ｇｅｎｅ）５０，２
１５〜２２４，１９８６」；ウイーレイ・エム・イー等
「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６２，４
１８５〜４１９４，１９８８」；ヴァン・ジイル・エム
等「ジェイ・ヴァイロル（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６５，
２７６１〜２７６５，１９９１」；メッテンレイター・
ス・シー等「ヴァイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７
９，４９８〜５０３，１９９０」；米国特許第４，６０
９，５４８号、欧州特許第０２６３２０７号、欧州特許
出願第９４２０３６４３号およびＰＣＴ出願ＷＯ／９４
／０１５７３）をエンコードする遺伝子のような異種Ｄ
ＮＡ配列の組込みのために用いられている。
【００４０】周知の、ＤＮＡ配列をクローニングベクタ
ー中に挿入するための処理操作並びに生体内の同種組換
えまたはコスミドクローニングの技法が、ＯＲＦをヘル
ペスウイルスのゲノムの非必須領域中に挿入するために
用いられ得る（マニアティス・ティー等「分子クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，１９８９；
欧州特許出願第０７４８０８号；ロイズマン・ビーおよ
びジェンキンス・エフ・ジェイ「サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）２２９，１２０８，１９８５」；ヒグチ・アー
ル等「ニュウクレイック・アシッズ・レス（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１６，７３５１，１９８
８」；デ・ウインド・エヌ等「ジェイ・ヴァイロル
（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６４，４６９１〜４６９６，１
９９０」；ヴァン・ジイル・エム等「ジェイ・ヴァイロ
ル（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６２，２１９１〜２１９５，
１９８８」；アッカーマン・エム「ジェイ・ヴェト−メ
ド・ビー（Ｊ． Ｖｅｔ− Ｍｅｄ． Ｂ．），３５，
３７９〜３９６，１９８８」並びに上記のパラグラフに
記載されている方法）。
ー中に挿入するための処理操作並びに生体内の同種組換
えまたはコスミドクローニングの技法が、ＯＲＦをヘル
ペスウイルスのゲノムの非必須領域中に挿入するために
用いられ得る（マニアティス・ティー等「分子クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，１９８９；
欧州特許出願第０７４８０８号；ロイズマン・ビーおよ
びジェンキンス・エフ・ジェイ「サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）２２９，１２０８，１９８５」；ヒグチ・アー
ル等「ニュウクレイック・アシッズ・レス（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１６，７３５１，１９８
８」；デ・ウインド・エヌ等「ジェイ・ヴァイロル
（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６４，４６９１〜４６９６，１
９９０」；ヴァン・ジイル・エム等「ジェイ・ヴァイロ
ル（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）６２，２１９１〜２１９５，
１９８８」；アッカーマン・エム「ジェイ・ヴェト−メ
ド・ビー（Ｊ． Ｖｅｔ− Ｍｅｄ． Ｂ．），３５，
３７９〜３９６，１９８８」並びに上記のパラグラフに
記載されている方法）。
【００４１】ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３またはＯ
ＲＦ４の蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片は、ベクタ
ーウイルスゲノムの同じまたは異なる領域において挿入
され得る。
ＲＦ４の蛋白質をエンコードするＤＮＡ断片は、ベクタ
ーウイルスゲノムの同じまたは異なる領域において挿入
され得る。
【００４２】当然本発明はまた２種またはそれ以上好ま
しくは２種または３種のベクターウイルスの混合物を提
供し、しかして該混合物は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、Ｏ
ＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質が同じ細胞により生体内
で同時に発現されるように生体内で宿主細胞を共感染す
ることができるものである。この混合物はまた、ワクチ
ン中の活性成分として用いられ得る。該混合物が２種の
ベクターウイルスを含む場合、一方のウイルスは上記の
３つのＯＲＦのうちの２つを含みそして第２のウイルス
は第３の所要ＯＲＦを含む。該混合物が３種のベクター
ウイルスを含む場合、各ウイルスは所要ＯＲＦのうちの
１つを含む。所望するなら、該混合物中のベクターウイ
ルスの１種またはそれ以上がＰＲＲＳＶのＯＲＦ５〜７
のうちの１つまたはそれ以上を含む。
しくは２種または３種のベクターウイルスの混合物を提
供し、しかして該混合物は、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、Ｏ
ＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質が同じ細胞により生体内
で同時に発現されるように生体内で宿主細胞を共感染す
ることができるものである。この混合物はまた、ワクチ
ン中の活性成分として用いられ得る。該混合物が２種の
ベクターウイルスを含む場合、一方のウイルスは上記の
３つのＯＲＦのうちの２つを含みそして第２のウイルス
は第３の所要ＯＲＦを含む。該混合物が３種のベクター
ウイルスを含む場合、各ウイルスは所要ＯＲＦのうちの
１つを含む。所望するなら、該混合物中のベクターウイ
ルスの１種またはそれ以上がＰＲＲＳＶのＯＲＦ５〜７
のうちの１つまたはそれ以上を含む。
【００４３】好ましくは該混合物において組み込まれる
べきベクターウイルスはＰＲＶワクチンウイルスから誘
導され、しかして好ましくは遺伝子型的にｇＤ- （およ
び所望するなら表現型的にｇＤ+ ）および／またはｇＥ
- であるＰＲＶ株（ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０１５７３，
ＥＰ出願第９４２０３６４３号）が用いられる。
べきベクターウイルスはＰＲＶワクチンウイルスから誘
導され、しかして好ましくは遺伝子型的にｇＤ- （およ
び所望するなら表現型的にｇＤ+ ）および／またはｇＥ
- であるＰＲＶ株（ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０１５７３，
ＥＰ出願第９４２０３６４３号）が用いられる。
【００４４】本発明によるベクターウイルスまたは上記
の混合物中に組み込まれるべきベクターウイルスは該ベ
クターウイルスで感染された宿主細胞を培養することに
より製造され得、その後ウイルス含有細胞および／また
は該細胞中で生長されたベクターウイルスが、随意に純
粋な形態にて、収集されそしてワクチン中に随意に凍結
乾燥された形態にて組み込まれ得あるいは診断的検定に
用いられ得る。
の混合物中に組み込まれるべきベクターウイルスは該ベ
クターウイルスで感染された宿主細胞を培養することに
より製造され得、その後ウイルス含有細胞および／また
は該細胞中で生長されたベクターウイルスが、随意に純
粋な形態にて、収集されそしてワクチン中に随意に凍結
乾燥された形態にて組み込まれ得あるいは診断的検定に
用いられ得る。
【００４５】本発明は更に、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、Ｏ
ＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質をエンコードする核酸配
列を含むＤＮＡ断片において、該蛋白質をエンコードす
る各ＯＲＦが作動的にプロモーターに結合されている該
ＤＮＡ断片を提供する。かかるＤＮＡ断片は、上記に定
められた宿主細胞またはベクターウイルスの製造のため
に用いられ得る。
ＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質をエンコードする核酸配
列を含むＤＮＡ断片において、該蛋白質をエンコードす
る各ＯＲＦが作動的にプロモーターに結合されている該
ＤＮＡ断片を提供する。かかるＤＮＡ断片は、上記に定
められた宿主細胞またはベクターウイルスの製造のため
に用いられ得る。
【００４６】本発明の範囲内には、精製されたエンド−
Ｈ耐性のＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質
も含まれる。該エンド−Ｈ耐性のＯＲＦ３またはＯＲＦ
４の蛋白質の好ましい形態は、それぞれ５５〜６０ｋＤ
または４０〜４７ｋＤの分子量を有する。
Ｈ耐性のＰＲＲＳＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質
も含まれる。該エンド−Ｈ耐性のＯＲＦ３またはＯＲＦ
４の蛋白質の好ましい形態は、それぞれ５５〜６０ｋＤ
または４０〜４７ｋＤの分子量を有する。
【００４７】これらのエンド−Ｈ耐性ＯＲＦ蛋白質は、
本発明による方法により得られる、これらが通常事実上
会合されるＰＲＲＳＶ物質を含まない実質的に純粋な形
態にてあるいはＰＲＲＳＶ蛋白質の混合物として提供さ
れ得る。
本発明による方法により得られる、これらが通常事実上
会合されるＰＲＲＳＶ物質を含まない実質的に純粋な形
態にてあるいはＰＲＲＳＶ蛋白質の混合物として提供さ
れ得る。
【００４８】更に、本発明は、ＰＲＲＳウイルスに対し
てブタにおいて効果的な免疫応答を誘発するワクチンを
提供する。このワクチンは、製薬上受容され得るキャリ
ヤーまたは希釈剤と一緒に本発明による方法により産生
されたＯＲＦ３および／またはＯＲＦ４の蛋白質を含む
サブユニットワクチンであり得る。
てブタにおいて効果的な免疫応答を誘発するワクチンを
提供する。このワクチンは、製薬上受容され得るキャリ
ヤーまたは希釈剤と一緒に本発明による方法により産生
されたＯＲＦ３および／またはＯＲＦ４の蛋白質を含む
サブユニットワクチンであり得る。
【００４９】あるいは、製薬上受容され得るキャリヤー
または希釈剤と一緒に本発明によるベクターウイルスも
しくは上記に定められたベクターウイルスの混合物を含
むベクターワクチンが提供される。
または希釈剤と一緒に本発明によるベクターウイルスも
しくは上記に定められたベクターウイルスの混合物を含
むベクターワクチンが提供される。
【００５０】例えば、該ワクチンはまた、例えば活性お
よび／または貯蔵寿命を増大させるためにしばしば他の
成分と混合されているところの、水性媒質または水含有
懸濁液を含み得る。これらの成分は、塩、ｐＨ緩衝剤、
安定剤（脱脂乳、カゼイン加水分解物またはクエン酸
等）あるいはチメロサール、メルチオレートおよびゲン
タマイシンのような保存剤で有り得る。
よび／または貯蔵寿命を増大させるためにしばしば他の
成分と混合されているところの、水性媒質または水含有
懸濁液を含み得る。これらの成分は、塩、ｐＨ緩衝剤、
安定剤（脱脂乳、カゼイン加水分解物またはクエン酸
等）あるいはチメロサール、メルチオレートおよびゲン
タマイシンのような保存剤で有り得る。
【００５１】所望するなら、本発明によるワクチンは、
１種またはそれ以上のアジュバントと共に処方される。
適当な例は、クイル（Ｑｕｉｌ）Ａのようなサポニン、
水酸化アルミニウム、コレラトキソイドまたはテタヌス
トキソイド、オイル乳濁液（ｏ／ｗまたはｗ／ｏ）およ
び水性ビタミンＥ分散液である。
１種またはそれ以上のアジュバントと共に処方される。
適当な例は、クイル（Ｑｕｉｌ）Ａのようなサポニン、
水酸化アルミニウム、コレラトキソイドまたはテタヌス
トキソイド、オイル乳濁液（ｏ／ｗまたはｗ／ｏ）およ
び水性ビタミンＥ分散液である。
【００５２】本発明によるワクチンは、慣用の能動免疫
化スキーム即ち投与量処方と適合し得るようにおよび発
症予防上および／または治療上効果的でかつ免疫原性が
ある量にて一回投与または反復投与にて投与され得る。
該ワクチンの投与は、例えば皮内に、皮下に、筋肉内
に、腹膜腔内に、静脈内に、鼻内にまたは経口的になさ
れ得る。
化スキーム即ち投与量処方と適合し得るようにおよび発
症予防上および／または治療上効果的でかつ免疫原性が
ある量にて一回投与または反復投与にて投与され得る。
該ワクチンの投与は、例えば皮内に、皮下に、筋肉内
に、腹膜腔内に、静脈内に、鼻内にまたは経口的になさ
れ得る。
【００５３】本発明はまた“免疫化学試薬”に関し、し
かして該試薬は本発明の方法により産生されたＰＲＲＳ
ＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質の少なくとも１種
を含む。
かして該試薬は本発明の方法により産生されたＰＲＲＳ
ＶのＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質の少なくとも１種
を含む。
【００５４】用語“免疫化学試薬”は、該蛋白質が適当
な支持体に結合されているかあるいは標識性物質を備え
ていることを意味する。
な支持体に結合されているかあるいは標識性物質を備え
ていることを意味する。
【００５５】用いられ得る支持体は、例えば、微小試験
用ウェルまたはキュベットの内壁、チューブまたはキャ
ピラリー、膜、フィルター、試験用ストリップあるいは
例えばラテックス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルま
たはゾル粒子としての金属化合物のような粒子の表面で
ある。
用ウェルまたはキュベットの内壁、チューブまたはキャ
ピラリー、膜、フィルター、試験用ストリップあるいは
例えばラテックス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルま
たはゾル粒子としての金属化合物のような粒子の表面で
ある。
【００５６】適当な標識性物質は、とりわけ、放射性同
位元素、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾルまたは
ゾル粒子としての金属化合物である。
位元素、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾルまたは
ゾル粒子としての金属化合物である。
【００５７】“免疫化学試薬”は、抗ＰＲＲＳＶ抗体を
含有する疑いのあるサンプルと共に該試薬がインキュベ
ーションされそしてその後該抗体の有無が決定される診
断的検定において用いられ得る。
含有する疑いのあるサンプルと共に該試薬がインキュベ
ーションされそしてその後該抗体の有無が決定される診
断的検定において用いられ得る。
【００５８】本発明はまた免疫検定において用いられる
べき試験キットに関し、しかしてこの試験キットは少な
くとも１種の本発明による免疫化学試薬を含有する。
べき試験キットに関し、しかしてこの試験キットは少な
くとも１種の本発明による免疫化学試薬を含有する。
【００５９】この試験キットを用いて行われる免疫化学
反応は、好ましくはサンドイッチ反応、凝集反応、競合
反応または阻害反応である。
反応は、好ましくはサンドイッチ反応、凝集反応、競合
反応または阻害反応である。
【００６０】
【実施例】実施例１ ワクチニアウイルスによる同じ細胞中での複数のＰＲＲ
ＳＶのＯＲＦの遷移的同時発現 ＰＲＲＳＶからのｃＤＮＡクローンｐＲＲＳＶ−Ｔ１の
製造および分析は、コンゼルマン等（前掲）において記
載された。ＰＲＲＳＶの完全なＯＲＦを含有しかつそれ
ぞれのＡＴＧ開始コドンに近くで始まる断片が、クレノ
ウポリメリラーゼでの処理後、ベクタープラスミドブル
ースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫＩＩ−
（ストラタゲン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＴ７プロ
モーターの下流においてＥｃｏＲＶ制限部位（ＯＲＦ２
およびＯＲＦ５）またはＳｍａＩ制限部位（ＯＲＦ３お
よびＯＲＦ４）中にクローニングされた。これらの挿入
体は、次のＰＲＲＳＶ−Ｔ１配列残基を含有していた
（コンゼルマン等，前掲）。
ＳＶのＯＲＦの遷移的同時発現 ＰＲＲＳＶからのｃＤＮＡクローンｐＲＲＳＶ−Ｔ１の
製造および分析は、コンゼルマン等（前掲）において記
載された。ＰＲＲＳＶの完全なＯＲＦを含有しかつそれ
ぞれのＡＴＧ開始コドンに近くで始まる断片が、クレノ
ウポリメリラーゼでの処理後、ベクタープラスミドブル
ースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫＩＩ−
（ストラタゲン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＴ７プロ
モーターの下流においてＥｃｏＲＶ制限部位（ＯＲＦ２
およびＯＲＦ５）またはＳｍａＩ制限部位（ＯＲＦ３お
よびＯＲＦ４）中にクローニングされた。これらの挿入
体は、次のＰＲＲＳＶ−Ｔ１配列残基を含有していた
（コンゼルマン等，前掲）。
【００６１】ＯＲＦ２： （ＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅｌ，ク
レノウ充填（ｆｉｌｌ−ｉｎ））１６０２〜２３８１ ＯＲＦ３： （ＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｆＩ，クレノウ充
填）２２０７〜３０４０ ＯＲＦ４： （ＢｓｔＹＩ−ＳｐｅＩ，クレノウ充填）
２６７３〜４９２０ ＯＲＦ５： （ＢｓｔＸＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ，クレノウ
充填）３３０４〜３９５４ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するｖＴＦ７−３（フ
エルスト等，１９８６，ＰＮＡＳ８３，８１２２〜８１
２６）での５の感染多重度における感染後のクローンＢ
ＳＲであるＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓）細胞
において、トランスフェクション実験を行った。１時間
の後感染細胞を、製造者の指図に従ってストラタゲン
“哺乳類トランスフェクションキット”を用いて、２μ
ｇのプラスミドでトランスフェクションした。
レノウ充填（ｆｉｌｌ−ｉｎ））１６０２〜２３８１ ＯＲＦ３： （ＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｆＩ，クレノウ充
填）２２０７〜３０４０ ＯＲＦ４： （ＢｓｔＹＩ−ＳｐｅＩ，クレノウ充填）
２６７３〜４９２０ ＯＲＦ５： （ＢｓｔＸＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ，クレノウ
充填）３３０４〜３９５４ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するｖＴＦ７−３（フ
エルスト等，１９８６，ＰＮＡＳ８３，８１２２〜８１
２６）での５の感染多重度における感染後のクローンＢ
ＳＲであるＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓）細胞
において、トランスフェクション実験を行った。１時間
の後感染細胞を、製造者の指図に従ってストラタゲン
“哺乳類トランスフェクションキット”を用いて、２μ
ｇのプラスミドでトランスフェクションした。
【００６２】メチオニン不含の培地でのトランスフェク
ション後４時間して、細胞を洗浄した。３０分間の飢餓
後皿当たり５０μＣｉのＴｒａｎ（３５Ｓ）標識を添加
し、そしてこれらの細胞を３７℃にて２４時間インキュ
ベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１％トリトン
（Ｔｒｉｔｏｎ）中で溶解し、そして蛋白質を９５℃お
よび２％ＳＤＳにより変性した。
ション後４時間して、細胞を洗浄した。３０分間の飢餓
後皿当たり５０μＣｉのＴｒａｎ（３５Ｓ）標識を添加
し、そしてこれらの細胞を３７℃にて２４時間インキュ
ベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１％トリトン
（Ｔｒｉｔｏｎ）中で溶解し、そして蛋白質を９５℃お
よび２％ＳＤＳにより変性した。
【００６３】ケッスラー（「メソッズ・エンジモル（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）７３，４４２〜４５
９，１９８１」）に従って、粗製蛋白質のサンプルを抗
ＯＲＦ４モノクローナル抗体（ｍａｂ３５）および固定
スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）細胞と共に沈澱させた。こ
れらの免疫複合体を遠心分離により収集した。生じたペ
レットを、３０μｌのラエムミリ（Ｌａｅｍｍｉｌｉ）
サンプル緩衝液中に再懸濁しそして９５℃にて５分間イ
ンキュベーションした。遠心分離後、上澄みをＳＤＡ−
１０％ポリアクリルアミドゲル中で分析した。ゲルを固
定し、Ｅｎ３Ｈａｎｃｅで含浸し、ワットマン３ＭＭ濾
紙上で乾燥しそして−７０℃にてコダックＸ−ＡＲ５フ
ィルムに露光した。
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）７３，４４２〜４５
９，１９８１」）に従って、粗製蛋白質のサンプルを抗
ＯＲＦ４モノクローナル抗体（ｍａｂ３５）および固定
スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）細胞と共に沈澱させた。こ
れらの免疫複合体を遠心分離により収集した。生じたペ
レットを、３０μｌのラエムミリ（Ｌａｅｍｍｉｌｉ）
サンプル緩衝液中に再懸濁しそして９５℃にて５分間イ
ンキュベーションした。遠心分離後、上澄みをＳＤＡ−
１０％ポリアクリルアミドゲル中で分析した。ゲルを固
定し、Ｅｎ３Ｈａｎｃｅで含浸し、ワットマン３ＭＭ濾
紙上で乾燥しそして−７０℃にてコダックＸ−ＡＲ５フ
ィルムに露光した。
【００６４】発現された蛋白質のエンド−Ｈによる脱グ
リコシル化を、次のように行った。沈澱および洗浄され
た免疫複合体をＮＥＢ緩衝液（ニュー・イングランド・
バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ））中に再懸濁した。１．５単位のエンド−Ｈを添加
し、そしてこのサンプルを３７℃にて１６時間インキュ
ベーションしそして次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため
に３０μｌのラエムミリ（Ｌａｅｍｍｉｌｉ）サンプル
緩衝液中に再懸濁した。
リコシル化を、次のように行った。沈澱および洗浄され
た免疫複合体をＮＥＢ緩衝液（ニュー・イングランド・
バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ））中に再懸濁した。１．５単位のエンド−Ｈを添加
し、そしてこのサンプルを３７℃にて１６時間インキュ
ベーションしそして次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため
に３０μｌのラエムミリ（Ｌａｅｍｍｉｌｉ）サンプル
緩衝液中に再懸濁した。
【００６５】第１実験（図２）において、いくつかのＯ
ＲＦ組合わせの共発現を行った。ＯＲＦ４の成熟した大
きな形態（４０〜４７ｋＤ）の発現を支持するためにＯ
ＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の共発現が必要とされ
かつ充分であることが実証されている。ＯＲＦ４の蛋白
質の観察された分子量形態がビリオン中に存在するもの
と同様であることを実証するために、エンド−Ｈでの脱
グリコシル化実験を異なる組合わせの発現生産物に関し
て行った（図３）。ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４
で共形質転換された細胞のみがＯＲＦ４の蛋白質の大き
な形態を発現すること並びにこれらの大きな形態はエン
ド−Ｈ処理に対して耐性であることが示されている。
ＲＦ組合わせの共発現を行った。ＯＲＦ４の成熟した大
きな形態（４０〜４７ｋＤ）の発現を支持するためにＯ
ＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の共発現が必要とされ
かつ充分であることが実証されている。ＯＲＦ４の蛋白
質の観察された分子量形態がビリオン中に存在するもの
と同様であることを実証するために、エンド−Ｈでの脱
グリコシル化実験を異なる組合わせの発現生産物に関し
て行った（図３）。ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４
で共形質転換された細胞のみがＯＲＦ４の蛋白質の大き
な形態を発現すること並びにこれらの大きな形態はエン
ド−Ｈ処理に対して耐性であることが示されている。
【００６６】実施例２ ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、３および４を発現するＰＲＶベ
クターウイルスの混合物 ＰＲＶ ｇＤ- およびｇＥ- ベクターウイルスの構築。
クターウイルスの混合物 ＰＲＶ ｇＤ- およびｇＥ- ベクターウイルスの構築。
【００６７】ＰＲＶ ＮＩＡ−３株から、ｇＤを含有す
るＰｓｔＩ ＮｃｏＩ断片をＰＧＥＭ５ＺＦ（＋）ベク
ターにおいてサブクローニングした。トランスフォーマ
ー（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商標））処理操作（クロ
ネテク（ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））でもって、ＳｐｅＩお
よびＡｖｒＩＩの制限部位を導入した。ＳｐｅＩ部位
は、ｇＤのＡＴＧ開始コドンの上流の１７ヌクレオチド
の所にて導入された。ＡｖｒＩＩ部位は、ＴＧＡ終止コ
ドンの後の最初のヌクレオチドの所にて導入された。こ
れらの変異が導入された後、ＳｐｅＩおよびＡｖｒＩＩ
での制限酵素消化により完全なｇＤ遺伝子を除去した。
以前のｇＤ部位上に、ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｖｒＩＩの制限部位を含有
するオリゴヌクレオチドを挿入した。次いで、ＰｓｔＩ
−ＮｃｏＩ断片をプラスミドから分離し、そしてピータ
ーズ等（ジェイ・ヴァイロロジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ）６６，８９４〜９０５，１９９２）により記載さ
れた方法によるＰＲＶ Ｒ１株（デ・ウインド等「ジェ
イ・ヴァイロロジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６４，
４６９１〜４６９６，１９９０」）での同種組換えのた
めに用いた。
るＰｓｔＩ ＮｃｏＩ断片をＰＧＥＭ５ＺＦ（＋）ベク
ターにおいてサブクローニングした。トランスフォーマ
ー（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商標））処理操作（クロ
ネテク（ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））でもって、ＳｐｅＩお
よびＡｖｒＩＩの制限部位を導入した。ＳｐｅＩ部位
は、ｇＤのＡＴＧ開始コドンの上流の１７ヌクレオチド
の所にて導入された。ＡｖｒＩＩ部位は、ＴＧＡ終止コ
ドンの後の最初のヌクレオチドの所にて導入された。こ
れらの変異が導入された後、ＳｐｅＩおよびＡｖｒＩＩ
での制限酵素消化により完全なｇＤ遺伝子を除去した。
以前のｇＤ部位上に、ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｖｒＩＩの制限部位を含有
するオリゴヌクレオチドを挿入した。次いで、ＰｓｔＩ
−ＮｃｏＩ断片をプラスミドから分離し、そしてピータ
ーズ等（ジェイ・ヴァイロロジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ）６６，８９４〜９０５，１９９２）により記載さ
れた方法によるＰＲＶ Ｒ１株（デ・ウインド等「ジェ
イ・ヴァイロロジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６４，
４６９１〜４６９６，１９９０」）での同種組換えのた
めに用いた。
【００６８】ｇＤ−およびｇＥ−マイナスの変異体を得
るために、ＰＲＶのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ断片のＮｄｅＩ
−ＳｔｕＩ断片を、ｇＤ欠失を含むＮｄｅＩ−ＳｔｕＩ
断片で置換した。このＨｉｎｄＩＩＩ断片もまた、ｇＥ
を包囲する欠失（位置６８３１におけるＤｒａＩ部位か
ら位置８５６２における変異体３２４（デ・ウインド
等，１９９０，前掲）のリンカー挿入部位）を含有して
いた。生じたプラスミドを次いで、野性型コスミドｃ−
１７９、ｃ−２７およびｃ−４４３（ヴァン・ジイル等
「ジェイ・ヴァイロロジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）
６２，２１９１〜２１９５，１９８８」）での組換えに
よりｇＤ−，ｇＥ−ウイルスを発生させるために用い
た。
るために、ＰＲＶのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ断片のＮｄｅＩ
−ＳｔｕＩ断片を、ｇＤ欠失を含むＮｄｅＩ−ＳｔｕＩ
断片で置換した。このＨｉｎｄＩＩＩ断片もまた、ｇＥ
を包囲する欠失（位置６８３１におけるＤｒａＩ部位か
ら位置８５６２における変異体３２４（デ・ウインド
等，１９９０，前掲）のリンカー挿入部位）を含有して
いた。生じたプラスミドを次いで、野性型コスミドｃ−
１７９、ｃ−２７およびｃ−４４３（ヴァン・ジイル等
「ジェイ・ヴァイロロジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）
６２，２１９１〜２１９５，１９８８」）での組換えに
よりｇＤ−，ｇＥ−ウイルスを発生させるために用い
た。
【００６９】ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、３および４を発現
するＰＲＶ ｇＤ変異体の構築。
するＰＲＶ ｇＤ変異体の構築。
【００７０】上記の仮性狂犬病ｇＤ−，ｇＥ−ベクター
Ｄ５７において、各ＯＲＦを別々に挿入した。次のやり
方が組換えウイルスを得るのに用いられた。ＯＲＦは、
ポリメリラーゼ連鎖反応を用いることにより特異的に増
幅された。増幅された生成物は、次いでｐＣＲtmＩＩベ
クター中にクローニングされた。次いで、ＯＲＦはこの
ベクターから分離され、そして転移ベクターｐＤＨβ中
にクローニングされた。このベクターは次いで、ＰＲＲ
ＳＶのＯＲＦをＰＲＶ Ｄ５７株のウイルスゲノム中に
転移するのに用いられた。
Ｄ５７において、各ＯＲＦを別々に挿入した。次のやり
方が組換えウイルスを得るのに用いられた。ＯＲＦは、
ポリメリラーゼ連鎖反応を用いることにより特異的に増
幅された。増幅された生成物は、次いでｐＣＲtmＩＩベ
クター中にクローニングされた。次いで、ＯＲＦはこの
ベクターから分離され、そして転移ベクターｐＤＨβ中
にクローニングされた。このベクターは次いで、ＰＲＲ
ＳＶのＯＲＦをＰＲＶ Ｄ５７株のウイルスゲノム中に
転移するのに用いられた。
【００７１】ＰＲＲＳＶのＯＲＦのＰＣＲ増幅 特定のＯＲＦを増幅するために、ＰＲＲＳＶ配列に対応
する次のプライマー対を用いた。
する次のプライマー対を用いた。
【００７２】ＯＲＦ２：上方プライマー，ヌクレオチド
１６０９〜１６２８（１６０９および１６２８を含め
て） 下方プライマー，ヌクレオチド２３５１〜２３７０（２
３５１および２３７０を含めて）の相補的配列 ＯＲＦ３：上方プライマー，ヌクレオチド２２１１〜２
２３０（２２１１および２２３０を含めて） 下方プライマー，ヌクレオチド３０２５〜３０４４（３
０２５および３０４４を含めて）の相補的配列 ＯＲＦ４：上方プライマー，ヌクレオチド２７４７〜２
７６６（２７４７および２７６６を含めて） 下方プライマー，ヌクレオチド３２９６〜３３１５（３
２９６および３３１５を含めて）の相補的配列 すべてのヌクレオチド番号は、コンゼルマン等（ヴァイ
ロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１９３，３２９〜３３
９，１９９３）により与えられているようなＰＲＲＳＶ
配列を指す。
１６０９〜１６２８（１６０９および１６２８を含め
て） 下方プライマー，ヌクレオチド２３５１〜２３７０（２
３５１および２３７０を含めて）の相補的配列 ＯＲＦ３：上方プライマー，ヌクレオチド２２１１〜２
２３０（２２１１および２２３０を含めて） 下方プライマー，ヌクレオチド３０２５〜３０４４（３
０２５および３０４４を含めて）の相補的配列 ＯＲＦ４：上方プライマー，ヌクレオチド２７４７〜２
７６６（２７４７および２７６６を含めて） 下方プライマー，ヌクレオチド３２９６〜３３１５（３
２９６および３３１５を含めて）の相補的配列 すべてのヌクレオチド番号は、コンゼルマン等（ヴァイ
ロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１９３，３２９〜３３
９，１９９３）により与えられているようなＰＲＲＳＶ
配列を指す。
【００７３】これらのＯＲＦを、ＰＲＲＳＶのすべての
構造遺伝子を含有するプラスミド（ｐＰＲＲＳＶ）から
次の方法により増幅した。
構造遺伝子を含有するプラスミド（ｐＰＲＲＳＶ）から
次の方法により増幅した。
【００７４】５μｌ（１０ｘ）ＰＣＲ緩衝液（酵素供給
者から購入）、５μｌ（２ｍＭ）ｄＮＴＰ類、５μｌ
（１０μＭ）上方プライマー、５μｌ（１０μＭ）下方
プライマー、０．２Ｕスーパー・タク（Ｓｕｐｅｒ Ｔ
ａｑ）（セファロ（Ｓｅｐｈａｒｏ）Ｑ）、１μｌ（１
μｇ／μｌ）ｐＰＲＲＳＶおよび５０μｌの総容量にな
るまでの水を添加することにより、ＰＣＲミックスを調
製した。この混合物の上に鉱油を１滴垂らした後、９４
℃にて１分、５５℃にて１分および７２℃にて１分のサ
イクルを３０回用いてＰＣＲを遂行した。増幅後、それ
らの生成物は、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含
有する２％アガロースゲル上で可視化され得た。
者から購入）、５μｌ（２ｍＭ）ｄＮＴＰ類、５μｌ
（１０μＭ）上方プライマー、５μｌ（１０μＭ）下方
プライマー、０．２Ｕスーパー・タク（Ｓｕｐｅｒ Ｔ
ａｑ）（セファロ（Ｓｅｐｈａｒｏ）Ｑ）、１μｌ（１
μｇ／μｌ）ｐＰＲＲＳＶおよび５０μｌの総容量にな
るまでの水を添加することにより、ＰＣＲミックスを調
製した。この混合物の上に鉱油を１滴垂らした後、９４
℃にて１分、５５℃にて１分および７２℃にて１分のサ
イクルを３０回用いてＰＣＲを遂行した。増幅後、それ
らの生成物は、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含
有する２％アガロースゲル上で可視化され得た。
【００７５】増幅化されたＯＲＦのクローニング 増幅化された生成物を、インヴィトロゲン（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）ＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲtm
ＩＩベクター中にクローニングした。すべての処理操作
は製造者の指図に従って遂行された。このベクターか
ら、ＯＲＦを転移ベクターｐＤＨβ中にクローニングし
た。正しい配向（ｒｉｇｈｔ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏ
ｎ）にてクローニングされたＰＣＲ生成物（ｐＣＲtmＩ
ＩベクターのＴ７プロモーターの側面に位置するＡＴＧ
出発コドンＯＲＦ）を該ベクターからＢａｍＨＩ消化に
より除去し、次いで平滑末端を生ずるためのクレノウ処
理およびその後ＸｂａＩ消化を行った。それらの生成物
を１％アガロースゲル上で分離し、そしてＯＲＦを含有
する帯域を該ゲルから製造者の指図に従ってゲネクリー
ン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）で精製した。このベクターを
最初ＥｃｏＲＩでそしてその後ＸｂａＩで消化し、ゲル
上で分離し、そしてこの線状ベクターをゲネクリーン
（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）の使用して精製した。すべての
ＯＲＦ含有断片を、Ｔ４リガーゼを用いて該線状化され
たベクター中に連結した。すべての酵素はファーマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から購入し、そしてすべての方
法は標準的技法（モレキュラー・バイオロジー（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）のカレント・プロトコ
ールズ）を用いて遂行された。
ｒｏｇｅｎ）ＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲtm
ＩＩベクター中にクローニングした。すべての処理操作
は製造者の指図に従って遂行された。このベクターか
ら、ＯＲＦを転移ベクターｐＤＨβ中にクローニングし
た。正しい配向（ｒｉｇｈｔ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏ
ｎ）にてクローニングされたＰＣＲ生成物（ｐＣＲtmＩ
ＩベクターのＴ７プロモーターの側面に位置するＡＴＧ
出発コドンＯＲＦ）を該ベクターからＢａｍＨＩ消化に
より除去し、次いで平滑末端を生ずるためのクレノウ処
理およびその後ＸｂａＩ消化を行った。それらの生成物
を１％アガロースゲル上で分離し、そしてＯＲＦを含有
する帯域を該ゲルから製造者の指図に従ってゲネクリー
ン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）で精製した。このベクターを
最初ＥｃｏＲＩでそしてその後ＸｂａＩで消化し、ゲル
上で分離し、そしてこの線状ベクターをゲネクリーン
（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）の使用して精製した。すべての
ＯＲＦ含有断片を、Ｔ４リガーゼを用いて該線状化され
たベクター中に連結した。すべての酵素はファーマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から購入し、そしてすべての方
法は標準的技法（モレキュラー・バイオロジー（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）のカレント・プロトコ
ールズ）を用いて遂行された。
【００７６】ＰＲＲＳＶ挿入体を含有するＰＲＶ変異体
の発生 ｇＤおよびｇＥ遺伝子が欠失しているＰＲＶウイルス
（Ｄ５７株）を、ｇＤを補足するＶｅｒｏ細胞にて培養
した。完全ＣＰＥにおいてウイルスを採取し、そしてそ
のＤＮＡを標準的技法により抽出した。ウイルスＤＮＡ
を、形式的（ｆｏｒｍａｌ）ｇＤ遺伝子座中に位置する
ユニークＥｃｏＲＩ部位を用いてＥｃｏＲＩで開裂し
た。ＰＲＲＳＶ挿入体を含有するｐＤＨβベクターをＭ
ｌｕＩで線状化した。この線状化されたプラスミドおよ
び切断されたウイルスＤ５７のＤＮＡを、製造者の指図
に従ってＤＯＴＡＰ（ベーリンガー・マンハイム）と混
合した。総量５μｇのＤＮＡが、総容量５００μｌの２
０ｍＭヘペス緩衝液中の１０μｌのＤＯＴＡＰと混合さ
れた。該ＤＮＡについては、１０コピーのプラスミドＤ
ＮＡ対１コピーのウイルスＤＮＡのモル比が用いられ
た。該混合物を、培地が除去されていた該ｇＤを補足す
るＶｅｒｏ細胞の８０％の集密的単層上において３７℃
にて６時間インキュベーションした。このインキュベー
ション期間後、培地を添加しそしてそれらのプレートを
更に３７℃にてインキュベーションした。完全ＣＰＥに
おいて、その培地を採取した。最後に、採取された培地
から組換えウイルスを限界希釈により分離し、そして免
疫蛍光を用いて挿入ＰＲＲＳＶ遺伝子の発現により同定
した。ＯＲＦ２、３および４を発現するベクターウイル
スの混合物が、製造されそしてブタの免疫化のために用
いられる。
の発生 ｇＤおよびｇＥ遺伝子が欠失しているＰＲＶウイルス
（Ｄ５７株）を、ｇＤを補足するＶｅｒｏ細胞にて培養
した。完全ＣＰＥにおいてウイルスを採取し、そしてそ
のＤＮＡを標準的技法により抽出した。ウイルスＤＮＡ
を、形式的（ｆｏｒｍａｌ）ｇＤ遺伝子座中に位置する
ユニークＥｃｏＲＩ部位を用いてＥｃｏＲＩで開裂し
た。ＰＲＲＳＶ挿入体を含有するｐＤＨβベクターをＭ
ｌｕＩで線状化した。この線状化されたプラスミドおよ
び切断されたウイルスＤ５７のＤＮＡを、製造者の指図
に従ってＤＯＴＡＰ（ベーリンガー・マンハイム）と混
合した。総量５μｇのＤＮＡが、総容量５００μｌの２
０ｍＭヘペス緩衝液中の１０μｌのＤＯＴＡＰと混合さ
れた。該ＤＮＡについては、１０コピーのプラスミドＤ
ＮＡ対１コピーのウイルスＤＮＡのモル比が用いられ
た。該混合物を、培地が除去されていた該ｇＤを補足す
るＶｅｒｏ細胞の８０％の集密的単層上において３７℃
にて６時間インキュベーションした。このインキュベー
ション期間後、培地を添加しそしてそれらのプレートを
更に３７℃にてインキュベーションした。完全ＣＰＥに
おいて、その培地を採取した。最後に、採取された培地
から組換えウイルスを限界希釈により分離し、そして免
疫蛍光を用いて挿入ＰＲＲＳＶ遺伝子の発現により同定
した。ＯＲＦ２、３および４を発現するベクターウイル
スの混合物が、製造されそしてブタの免疫化のために用
いられる。
【図１】決定されたＰＲＲＳＶ配列中の開放型読み枠の
分布並びにサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇ ｍＲＮＡ，囲み
はリーダーＲＮＡを表す）の所在を示す図である。
分布並びにサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇ ｍＲＮＡ，囲み
はリーダーＲＮＡを表す）の所在を示す図である。
【図２】遷移的に発現されたＰＲＲＳＶのＯＲＦのラジ
オイムノ沈降を示す電気泳動写真である。発現された蛋
白質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡゲル上で分離された。左の
レーンは、マーカー（Ｍ）蛋白質を含む。他のレーン
は、上部に挙げられているＯＲＦで形質転換された宿主
細胞により発現された標識された蛋白質の電気泳動を示
す。
オイムノ沈降を示す電気泳動写真である。発現された蛋
白質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡゲル上で分離された。左の
レーンは、マーカー（Ｍ）蛋白質を含む。他のレーン
は、上部に挙げられているＯＲＦで形質転換された宿主
細胞により発現された標識された蛋白質の電気泳動を示
す。
【図３】図２と同じくラジオイムノ沈降を示す電気泳動
写真である。追加的ないくつかの発現生産物が、エンド
−Ｈ（ＥＨ）で処理された。
写真である。追加的ないくつかの発現生産物が、エンド
−Ｈ（ＥＨ）で処理された。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (11)
- 【請求項１】ａ．ブタ再生性呼吸系症候群ウイルス（Ｐ
ＲＲＳＶ）のＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質をエンコ
ードするＤＮＡ断片で形質転換された適当な宿主細胞あ
るいはＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質をエンコードす
るＤＮＡ断片を含むベクターウイルスで感染された適当
な宿主細胞を該蛋白質を発現する条件下で培養する工程
および ｂ．発現された蛋白質を採取する工程 からなる、グリコシル化形態のＰＲＲＳＶのＯＲＦ３ま
たはＯＲＦ４の蛋白質の製造方法において、同じ宿主細
胞が同時にＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲ
Ｆ４の蛋白質を産生することを特徴とする上記方法． - 【請求項２】 同じ宿主細胞をＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、
ＯＲＦ３およびＯＲＦ４で形質転換することを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 同じ宿主細胞が、１種またはそれ以上の
ベクターウイルスでの（共）感染の結果としてＰＲＲＳ
ＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４を含むことを特
徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 ベクターウイルスがバクロウイルスであ
ることを特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３および
ＯＲＦ４で形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 １種またはそれ以上の異種ＤＮＡ断片を
含むベクターウイルスにおいて、該ＤＮＡ断片がＰＲＲ
ＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４の蛋白質をエ
ンコードすることを特徴とする上記ベクターウイルス。 - 【請求項７】 ウイルスが仮性狂犬病ウイルスであるこ
とを特徴とする請求項６に記載のベクターウイルス。 - 【請求項８】 各ベクターウイルスが１種またはそれ以
上のＰＲＲＳＶのＯＲＦを含む２種またはそれ以上のベ
クターウイルスの混合物であって、しかも宿主細胞に共
感染しかつ該細胞中でＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３
およびＯＲＦ４を発現することのできる該混合物。 - 【請求項９】 各ＯＲＦが作動的にプロモーターに結合
されているＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲ
Ｆ４をエンコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子。 - 【請求項１０】 エンド−Ｈ耐性の形態のＰＲＲＳＶの
ＯＲＦ３またはＯＲＦ４の蛋白質。 - 【請求項１１】 ＰＲＲＳウイルスに対してブタにおい
て効果的な免疫応答を誘発するワクチンであって、請求
項１から４のいずれか一項に記載の方法により産生され
たＯＲＦ蛋白質類、請求項１０に記載のＯＲＦ３および
／またはＯＲＦ４の蛋白質、請求項６または７に記載の
ベクターウイルスまたは請求項８に記載のベクターウイ
ルスの混合物を製薬的に受容され得るキャリヤーまたは
希釈剤と一緒に含む該ワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95200609 | 1995-03-14 | ||
| NL95200609.6 | 1995-03-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08308577A true JPH08308577A (ja) | 1996-11-26 |
| JP4149008B2 JP4149008B2 (ja) | 2008-09-10 |
Family
ID=8220087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05790196A Expired - Fee Related JP4149008B2 (ja) | 1995-03-14 | 1996-03-14 | 同じ細胞中でのブタ再生性呼吸系症候群ウイルスポリペプチド類の発現 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5858729A (ja) |
| EP (1) | EP0732340B1 (ja) |
| JP (1) | JP4149008B2 (ja) |
| CN (1) | CN1079832C (ja) |
| AT (1) | ATE268783T1 (ja) |
| CA (1) | CA2171699C (ja) |
| DE (1) | DE69632658T2 (ja) |
| DK (1) | DK0732340T3 (ja) |
| ES (1) | ES2223058T3 (ja) |
| PT (1) | PT732340E (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002505294A (ja) * | 1998-03-02 | 2002-02-19 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | ブタのウイルス疾患の処置 |
| KR101420850B1 (ko) * | 2011-05-30 | 2014-08-13 | 건국대학교 산학협력단 | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 백신 |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69201441T3 (de) * | 1991-06-06 | 2008-12-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Erreger der mysteriösen schweinekrankheit,impfstoff-zusammensetzungen und diagnose kits. |
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| US6773908B1 (en) * | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US6592873B1 (en) * | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
| US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
| US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
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