JPH08308595A - 核酸ハイブリダイゼーション検定を行うためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中の標的分子を正確に検出することが出
来る簡便で且つ迅速な、核酸ハイブリダイゼーションサ
ンドイッチ検定を行うためのキットを提供する。 【解決手段】 選択された標的核酸配列を含む試料につ
いてハイブリダイゼーション検定を行うためのキットで
あって、標的核酸配列の第１の部分に相補的な核酸配列
を有する第１のプローブ、該第１のプローブに結合され
る第１の錯化剤、前記標的配列の第２の部分に相補的な
核酸配列を有し、前記第１のプローブに会合する第２の
一本鎖核酸プローブ、該第２のプローブに結合されるレ
ポーター基、前記第１のプローブに会合する固体支持
体、及び、前記第１の錯化剤結合部分に相補的な結合部
分を有する前記固体支持体に結合される第２の錯化剤を
含み、さらに、前記第１の錯化剤及び第２の錯化剤が、
抗原及び抗原に対する抗体、ならびにレクチン及び炭水
化物よりなる群から選択されることを特徴とするキッ
ト。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は一般に、核酸ハイブ
リダイゼーション検定を行うための方法及びキットに関
し、詳細には、標識付けしたヌクレオチドプローブと、
第１の錯化剤に結合したヌクレオチドプローブと、支持
体に結合した第２の錯化剤とを用いて、標的核酸を固体
支持体上に固定するための方法及びキットに関する。 【０００２】 【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】全ての
生物の遺伝性物質を形成する核酸の特性の一つは、ヌク
レオチドの相補的配列を持つ核酸と、配列に特異な水素
結合を形成する能力である。この核酸が核酸の相補鎖と
配列に特異な水素結合を生じる（即ち、ハイブリッド形
成する）能力は、一般にハイブリダイゼーション検定(h
ybridization assay) と呼ばれる技術に利用されてい
る。 【０００３】ハイブリダイゼーション検定においては、
既知の配列を有する核酸をプローブとして用いて、試料
のなかに『標的』となる相補的な配列がないか調べる。
プローブと標的によって形成されたハイブリッドに標識
を付けることにより、試料中の相補的配列の検出及び定
量が可能になる。 【０００４】特定の微生物の菌株は全て、ハイブリダイ
ゼーション検定によって鑑別されやすい核酸の形で遺伝
成分を共有しているので、このようなハイブリダイゼー
ション検定は、研究及び医療に非常に有用な手段であ
る。特異的な標的核酸を検出することができれば、ヒ
ト、動物及び植物の細菌性疾患、真菌性疾患及びウイル
ス性疾患の状態を正確に診断することができる。これに
加えて、特定のヌクレオチド配列をプローブによって調
べる能力は、ヒトの遺伝性疾患の認識及び診断に使用す
ることも可能であろう。 【０００５】ハイブリッドを検出する為にプローブに標
識付けをする方法の一つは、プローブに放射性同位体
（例えば、³²Ｐまたは¹²⁵Ｉ）を結合させることであ
る。 【０００６】非放射性標識付けシステムも使用出来る。
第１のタイプは、プローブに直接または共有結合で結合
する可能性のある標識、例えば螢光分子または化学発光
分子（例えばフルオレシイン(fluorescein) またはアク
リジニウム(acridinium)）を用いるものである。第２の
タイプは、DNAプローブに共有結合し且つ標識付けされ
た巨大分子に非共有結合で結合する部分を有する。 【０００７】非放射性標識付けシステムの第２のタイプ
の一例は、DNAプローブに共有結合し、且つ螢光標識を
付けたアビジン、もしくは化学発光標識を付けたアビジ
ン（またはストレプトアビジンなどのアビジン誘導体)
と共に錯体を形成するビオチン分子である。非放射性標
識付けシステムの別の例は、抗原を用いて『標識を付け
た』DNAプローブで、螢光標識を付けた抗体または化学
発光標識を付けた抗体と共に錯体を形成するものであ
る。 【０００８】標識付けシステムの第２のタイプにおいて
は、プローブをレポーター基で『標識付け』して、検出
可能にする。レポーターは、プローブに信号付けするこ
とによって、プローブの存在または位置を示すのに使用
される物質である。直接に感知される信号自体は、分離
したないしは分離可能な信号分子によって発生してもよ
い。標識とは、信号を合わせ持つタイプのレポーターで
ある。 【０００９】ビオチン標識したDNA プローブまたは抗原
標識した DNAプローブについては、アビジンまたは抗体
との錯体を各々形成し、続いて共有結合でまたは非共有
結合によって酵素と会合させることによって、信号を増
幅することも出来る。〔Leary等、Proc. Natl. Acad. S
ci. (USA)、80巻、4045〜4049頁(1983)〕。次にこのレ
ポーター基を適切な酵素基質とともにインキュベートし
て、ハイブリダイゼーション錯体中の標的の存在を示す
検出可能な信号を発生させることができる。 【００１０】プローブに標識を取り付ける１つの方法
が、Ward、欧州特許出願第63、879号に記載されてい
る。 Ward はプリン環またはピリミジン環に共有結合し
たビオチンレポーター分子を持つプローブの調製法を開
示している。選択されたビオチン基化したプリン及びピ
リミジンを、次いで、酵素的手段によって、プローブの
核酸のホスソジエステル骨格内に直接的に組み込む。ビ
オチン標識した天然の（二本鎖の）DNA は、アビジン、
ストレプトアビジン、またはビオチン特異抗体によって
認識されうることを示すために、Ward等はアフィニティ
ークロマトグラフィーを用いている。DNA ポリメラーゼ
によって、ビオチン標識またはイミノビオチン標識した
(iminobiotin-labelled)プリンまたはピリミジンから、
DNAの一本鎖上にDNA の相補鎖が合成される。その結果
生じた標識付けした二本鎖DNAは、標識付けしていない
DNAと比較すると、選択的にアビジンセファロースアフ
ィニティーカラムまたはストレプトアビジンセファロー
スアフィニティーカラムに保持される。Ward、上掲、24
〜26頁。 【００１１】ビオチン標識した核酸を用いてin situハ
イブリダイゼーションを行う方法があるが、この方法に
おいては、ビオチン標識したRNAと染色体圧砕物(squas
h)中の変性DNAとのハイブリッド形成を行う。ポリメタ
クリレート球はアビジンに共有結合し、次にアビジンは
ビオチンに結合する。こうして、RNAとハイブリッドを
形成したDNAの部分に標識を付ける。Manning 等、Chrom
osoma (Berl.)、53巻、107〜117頁(1975) 。さらに、特
定の遺伝子を持つ DNAのビオチン標識した鎖を分離する
ために、アビジンを被覆したポリメタクリレート球がア
フィニティークロマトグラフィーにおいて使用されてい
る。Manning 等、Biochemistry、16巻、1364〜1370頁(1
977)。 【００１２】in situハイブリダイゼーションの別の標
識付けの方法においては、ショウジョウバエのリボソー
ムタンパク質と偽似リボソーム遺伝子(pseudoribosomal
gene)間の天然に生じる結合が利用される。リボソーム
タンパク質に対する抗体を作製し、ポリメタクリレート
球に付ける。この球は電子顕微鏡技術用の標識として役
立つ。Chooi等、Mol. Gen. Genet.、182巻、245〜251頁
(1981)。 【００１３】検定を行う抗原物質と１以上の抗体との間
の錯体の形成は、イムノアッセイと呼ばれる別のタイプ
の生物学的検出技術の基礎にもなる。抗体は、白血球に
より産生されるタンパク質で、その抗原に対して特異的
な反応で抗原と結合することができる。抗原と抗体はい
ずれも免疫学的作用物質と呼ぶことが出来る。抗体は、
抗原の表面のある特定の部位 (抗原決定子) とのみ結合
するので、抗体が結合する決定子が別の抗原にも見出さ
れない程度に、抗体は特異性を有する。抗原／抗体の錯
体の少なくとも一方の構成メンバーを信号分子に結合さ
せることによって、試料中の複合していない標識付き抗
原もしくは抗体及び他の成分から、抗原と抗体の錯体を
分離させて、検出及び定量分析を行うことが出来る。異
なる幾つかの抗原決定子に対する抗体の混合物であるポ
リクローナル抗体、及び１個の抗原決定子に対する抗体
であるモノクローナル抗体を含めて、いかなる種類の抗
体でも、イムノアッセイに用いることができる。 【００１４】イムノアッセイ及びハイブリダイゼーショ
ン技法の双方は、２部位(two-site)検定すなわち『サン
ドイッチ』検定において使用される。サンドイッチ検定
においては、一度に標的上の異なる２箇所において、ハ
イブリッド錯体もしくは免疫錯体を形成する能力がある
標的物質を検定する。 【００１５】一般にサンドイッチイムノアッセイには、
第１の抗原決定子に対して作製されたモノクローナル抗
体を固体支持体に結合させ、その支持体に結合した抗体
を、第１及び第２の抗原決定子を有する物質を含んだ試
料に曝露する工程が含まれる。この結果、支持体に結合
した一次抗体─抗原錯体の形成によって、試料から抗原
物質が除去される。次に、この錯体を、抗原物質上の第
２の抗原決定子に対して作製された第２の標識付けされ
たモノクローナル抗体に曝露すると、抗体−抗原−抗体
サンドイッチが形成され、このサンドイッチは試料溶液
から分離して定量することができる。〔例として David
等、合衆国特許第4,376,110 号を参照のこと。〕 サンドイッチハイブリダイゼーション検定には、２段階
検定と１段階検定がある。２段階サンドイッチハイブリ
ダイゼーション法においては、固定した標的核酸を用
い、第１のステップにおいて、この標的核酸を、標的に
相補的な第１の部分と標的に相補的でない第２の部分と
を有する第１の核酸プローブに曝露する。第２の段階に
おいては、第１のプローブの第２の部分に相補的な第２
の標識付けされた核酸プローブを、第１のプローブとハ
イブリッド形成させ、標的と第２のプローブの間に第１
のプローブがある『サンドイッチ』を形成させる。Dunn
等、Cell、12巻、23〜36頁(1977) 。サンドイッチハイ
ブリダイゼーション手順は、比較的簡単に行うことがで
き、またタンパク質またはその他の生物学的汚染物質に
あまり影響されない。 Ranki等、Gene、21巻、77〜85
頁(1983)。しかしながら、２段階サンドイッチハイブリ
ダイゼーション検定は、試料をフィルターに固定するの
にかなりの手間を要する。 【００１６】１段階サンドイッチ検定では、フィルター
上に固定された第１の核酸プローブを用いる。第１の核
酸プローブは、標的核酸の第１の部分に相補的である。
一つの段階において、フィルターに結合した第１のプロ
ーブを、標的核酸配列について調べるべき試料に曝露
し、さらに、標的核酸の第２の部分に相補的な第２の標
識付けされた核酸プローブに曝露するが、前述の第２の
部分は、第１のプローブが相補的な標的の部分とは別
（すなわち、それらと重複していない）である。Ranki
等、合衆国特許第4,486,539号。この１段階手法は、フ
ィルター上に試料を固定化するのに要する手間を解消
し、また第１のプローブを支持体に適合するように選択
することができるので、リボ核酸（RNA)とデオキシリボ
核酸(DNA) をある種の支持体に結合させるのに必要な処
理のタイプの相違を無くし、さらには、標的が支持体に
結合される直接ハイブリダイゼーション検定よりは、試
料中の粘液等の汚染物質による影響を受けにくい。Rank
i 等、Curr. Top. Microbiol.Immunol.、104巻、307〜3
18頁(1983)。それでもなお第１のプローブが、ハイブリ
ダイゼーション中に支持体より漏れることがしばしばあ
り、検定の感度を甚だしく低減させる。 【００１７】生育しうる生物を必要とし且つ培養に２日
〜３日かかる従来の試験に比べると、イムノアッセイ及
びハイブリダイゼーションによる診断はいずれも迅速で
はあるが、特定の疾患において産生される抗原は患者ご
とに、細菌の菌株ごとに、またはウイルスの株ごとに異
なることがあるので、免疫学的診断が困難な場合もあ
る。一方、一つの細菌またはウイルスの株は全て、核酸
プローブの使用によって診断が可能な核酸の形で、共通
の遺伝成分を持っている。 【００１８】とりもなおさず、サンドイッチハイブリダ
イゼーション検定に使用するために、一本鎖の核酸プロ
ーブを固体の支持体に直接に結合するのは容易ではな
く、また便利でもない。例えば、核酸をニトロセルロー
スシートに結合させるには、シートに核酸を12〜15時間
接触させ、さらに２時間に渡って核酸をシート上にベー
キングして、核酸を固定する必要がある。一例として、
Thomas、Proc. Natl. Acad. Aci. (USA)、77巻、5201頁
(1980)を参照されたい。このようなデオキシリボ核酸で
被覆したニトロセルロースシートの調製には、まる１日
の作業が充分に必要であり、これは核酸ハイブリダイゼ
ーションの臨床上の実用性を限定する要因となってい
る。 【００１９】さらに、核酸プローブは、特定の標的分子
に対して特異的な配列でなければならないので、プロー
ブを支持体に結合させる手順を、検出しようとする各標
的分子について行わねばならない。従って、幾つかの異
なるDNA 配列を検出するには、異なるDNA 配列の数だけ
の種類の支持体を用意せねばならない。 【００２０】これに加えて、核酸の相補鎖をハイブリッ
ド形成するには、例えば抗原と抗体との免疫学的錯体を
形成するよりも一般に長い時間を要する。ハイブリダイ
ゼーション自体も、相補的配列の１つが固体の支持体に
結合している場合よりも、溶液中のほうがはるかに迅速
に行われる。 【００２１】核酸〔例えばInouye等、J. Biol. Chem.、
23巻、8125〜8129頁(1973)を参照〕または tRNA 〔Mill
er等、Biochim. Biophys. Acta、366巻、188〜198頁(19
74)〕または tRNA シストロン〔Salomon 等、Biochemis
try、14巻、4046〜4050頁(1975)〕の単離及び精製する
ために、アフィニティークロマトグラフィー技法を用い
ることができる。しかし、これらの技法は、核酸中の特
定の塩基に対する抗体を形成する困難な工程 (Inouye
等、上掲: Salomon 等、上掲) 、または誘導された天然
産生のリボ核酸（tRNA)(Miller等、上掲) の使用に依存
しており、そのために一般にハイブリダイゼーション検
定に容易に適用することは出来ない。 【００２２】従って、当該技術分野においては、試料中
の標的分子を正確に検出することが出来る簡便で且つ迅
速な、核酸ハイブリダイゼーション『サンドイッチ』検
定に対する絶え間ない関心及び要望が現存している。 【００２３】 【課題を解決するための手段】溶液から選択的に標的核
酸配列を分離し且つ定量的に検出するための、本発明の
方法には、溶液中の標的核酸配列を第１の一本鎖核酸プ
ローブにハイブリッド形成する工程を含み、該プローブ
は、標的配列の選択された部位に相補的な配列を有し、
またそれゆえにかかる部位とのハイブリッド形成が可能
なものである。第１のプローブ配列は、第１の錯化剤に
共有結合する。第２の一本鎖核酸プローブは、第１のプ
ローブに相補的な配列とは異なる標的配列の選択的部位
に対して相補的な配列を有し、標的とハイブリッド形成
する。検出可能なレポーター基を第２のプローブ配列に
付ける。 【００２４】下記の溶液ハイブリダイゼーション、すな
わち、本発明の方法には、さらに、固体支持体に結合さ
れ且つ第１のプローブ上の第１の錯化剤と結合すること
が出来る第２の錯化剤を、ハイブリダイゼーション溶液
に加えることによって、ハイブリッド配列を固定化する
工程が含まれる。こうして、第２の錯化剤─支持体を含
むサンドイッチが得られ、第１錯化剤─標的とハイブリ
ッド形成した第１プローブと錯体を形成し、さらに第２
のプローブとハイブリッド形成する。そして結合したレ
ポーター基を検出及び定量するために検定を行う。 【００２５】本発明のキットは、溶液から選択された標
的核酸配列を含む試料のハイブリダイゼーション検定を
行うのに用いられる。このキットでは、第１のプローブ
は、標的核酸配列の第１の部分に相補的な核酸配列を有
しており、第１の錯化剤に付けられる。第１の核酸プロ
ーブと会合する第２の一本鎖核酸プローブは、標的配列
の第２の部分に相補的な核酸配列を有しており、１番目
のプローブと会合する。第２の核酸プローブに、レポー
ター基が付けられる。第１の核酸プローブとも会合する
固体支持体が、第１の錯化剤結合部分を有する第２の錯
化剤に付けられる。 【００２６】本発明の別の方法は、標的核酸配列を固体
支持体上に固定する際の捕獲効率を高める。この方法に
おいては、標的核酸配列を少なくとも２つの第１プロー
ブに曝露するが、前記各プローブは標的核酸配列の異な
る部分に相補的な核酸配列を持ち、また各々が支持体と
結合する部分を持つ。溶液中において、標的核酸配列は
第１のプローブの少なくとも１つとハイブリッド形成す
る。第１のプローブのうちの少なくとも１つのプローブ
の支持体結合部分は、固体支持体上の第１のプローブ結
合部分と結合する。 【００２７】本発明に基づく別のキットは、１つの標的
核酸配列を含む試料のハイブリダイゼーション検定を行
うのに役立つ。このキットは、第１のプローブを少なく
とも２つ含み、各プローブは、標的核酸配列の異なった
部分と相補的な核酸配列を持つ。第２のプローブは第１
のプローブと会合する。第２のプローブは、第１のプロ
ーブのいずれかと相補的な部分とは別の標的核酸配列の
部分に相補的な配列を有する。第２のプローブは、レポ
ーター基１つにも結合する。固体支持体も第１のプロー
ブと会合し、第１のプローブと結合する部分を有する。 【００２８】本発明の他の態様及び利点は、下記の発明
の実施の形態を考慮すれは当業者には明確になるであろ
う。 【００２９】 【発明の実施の形態】本発明に基づく方法の望ましい実
施態様においては、溶液中の標的核酸配列は、従来の方
法によって固定化された『サンドイッチ』ハイブリッド
に伴う信号の量を測定することによって、検出または定
量が可能である。この方法は、検出を必要としない溶液
からハイブリッド形成した標的配列を分離するのにも有
用である。本発明の方法は、標的オリゴヌクレオチド配
列が、デオキシリボ核酸配列またはリボ核酸配列である
場合に採用できる。いずれの場合も、第１のプローブ
と、標識付けした第２のプローブと、標的との間の DNA
-DNAハイブリダイゼーション、RNA-RNA ハイブリダイゼ
ーション、またはDNA-RNA ハイブリダイゼーションの優
先性によって異なるが、プローブ配列はデオキシリボ核
酸配列またはリボ核酸配列でありうる。 【００３０】この方法は、望ましくは、ハイブリダイゼ
ーションにおける使用前に、二本鎖配列が変性している
場合に、二本鎖の標的配列に用られ、また一本鎖の標的
配列の検出にも有用である。この方法で用いる標的配列
の長さには特に制限は無いが、約20残基よりも長いこと
が望ましい。 【００３１】第１のプローブ配列自体は、選択された第
１の錯化剤と共有結合をすることが出来、且つ標的配列
の一部分と相補的であり且つ安定したハイブリッド形成
をするよう意図された少なくとも１つの部分を持つもの
であればどのような核酸配列であってもよい。第１の錯
化剤は、第１のプローブに共有結合するが、フルオレシ
インなどの抗原、もしくは抗フルオレシインなどの抗体
であってもよく、またはビオチンもしくはアビジンであ
ってもよく、またはコンカナバリンAなどのレクチンも
しくは、例えばコンカナバリンA に特異的なα-グルコ
シル残基もしくはα-マンノシル残基を持つ炭化水素で
あってもよい。 【００３２】レクチンは、他の分子の特定の炭化水素成
分と反応して、抗体と抗原の相互作用と同様の錯体を形
成する結合基を持つタンパク質である。ビタミンの一種
であるビオチンは、卵白に存在するタンパク質であるア
ビジンと結合して、ビオチン─アビジン錯体を形成する
イミダゾール誘導体である。このように、抗原とそれら
に結合する抗体、レクチンとそれらに結合する炭水化
物、そしてビオチンとアビジン、これらは全て非共有結
合を形成する錯化剤として、水素結合を形成する配列に
特異なハイブリッド形成作用物質である核酸と区別され
る。 【００３３】ハイブリダイゼーションに用いる一本鎖ポ
リヌクレオチドプローブを産生するために種々の技法が
使用されうる。所望の『標的』配列に相補的なプローブ
配列は、標的配列に対応するメッセンジャーRNA 配列と
して、または逆転写酵素によってメッセンジャーRNA の
逆転写から得られる相補的DNA として、またはエンドヌ
クレアーゼ消化によって標的ゲノムから得られるゲノム
DNAとして得ることができる。 【００３４】プローブ配列は、細菌宿主細胞内で複製す
るpBR322などの DNAプラスミドの中に挿入することによ
って『増幅』してもよい。プラスミド DNAは二本鎖であ
り、周知のニックトランスレーション手法によって標識
付けをしてもよい。 【００３５】また、プローブ配列は、所望の配列をバク
テリオファージM13 などの一本鎖ウイルス内に挿入して
増幅してもよい。その後に、プローブ配列を持つウイル
スは、細菌培養菌に感染して増殖し、ウイルス DNAに付
いたプローブ配列のコピーを数億産生する。ウイルス性
クローン DNAは、一本鎖 DNAまたは二本鎖 DNAのいずれ
かとして単離することができる。二本鎖ウイルス性 DNA
は、ニックトランスレーションによって標識付けをして
もよい。一本鎖ウイルス性 DNAは、Hu 等、Gene、17
巻、271〜277頁(1982)の手順によって、標識付けヌクレ
オチドを用い、相補鎖 DNAのプライム合成(primed synt
hesis)を用いることで検出可能とすることができる。サ
ンドイッチハイブリダイゼーション検定に用いる一本鎖
プローブを産生するための、M13 及びpBR322増幅システ
ムに関する Ranki等、Gene、21巻、77〜85頁(1983) を
参照されたい。 【００３６】第１のプローブと同様に、第２のプローブ
は、第１のプローブの核酸配列と異なっていて、第１の
プローブがハイブリッド形成する部分とは別の（すなわ
ち重複していない）標的部分と相補的であり且つハイブ
リッド形成するよう設計された核酸配列を有してもよ
い。 【００３７】レポーター基を第２のプローブに共有結合
することも出来る。レポーター基は、¹²⁵I、³²P 等の放
射性同位元素標識でもよい。または、エチレンジアミン
四酢酸(EDTA)またはジエチルトリアミノ五酢酸(DTPA)の
ような、キレート環を作る成分を用いて、重金属標識を
プローブに結合してもよい。適当な重金属標識として
は、⁵⁷Co、⁶³Ni、¹¹¹In、⁹⁹Tc、⁵⁵Fe、⁵¹Cr等がある。
螢光化合物及び化学発光化合物といった非放射性同位元
素の標識も、本発明に基づく方法に採用することができ
る。第２のプローブに結合する可能性のある非放射性同
位元素レポーター基としては、たとえば、ビオチンまた
はアビジンによって第２のプローブに結合されるアルカ
リ性ホスファターゼ酵素がある。リン酸メチルウンベリ
フェロン基質の溶液中で、インキュベーションをおこな
うと、酵素が基質に作用して螢光物質が生じる。 【００３８】多孔性及び非多孔性、重合体及び非重合体
の支持体をも含めて、本方法においては、錯化剤が結合
できる固体支持体はいずれも有用である。本方法で使用
するのに適した固体支持体の例としては、シリケート全
般及びガラス、シリカゲル、及びコントロールドポアガ
ラス、また、セルロースならびにニトロセルロースろ
紙、ポリスチレン、ラテックス及びゴム、そして、テフ
ロン(商標) 等の過フッ化炭化水素樹脂がある。 【００３９】支持体に結合する第２の錯化剤は、第１の
プローブ上で第１の錯化剤と錯体を形成するものであれ
ば、どんな錯化剤でもよい。たとえば、第２の錯化剤は
抗体（例えば、IgG、IgMまたはIgA)でもよい。前述の抗
体には、第１のプローブ上の抗体がフルオレシインであ
る抗フルオレシイン抗体のようなモノクローナル抗体が
含まれる。 【００４０】当業者には既に明らかなように、本発明に
は、第１の核酸プローブを固体支持体に結合させる従来
の方法と比べて、幾つかの利点がある。第１及び第２の
免疫物質の１つの組み合わせを、多様なプローブ配列及
び標的配列に用いることが可能であるので、本発明は実
験室で検出する各々の配列に特異な支持体を調製する必
要がなくなる。さらに、本発明に基づくハイブリダイゼ
ーションが、溶液中の相補鎖と別の固体支持体上の相補
鎖の間よりも、むしろ溶液中の相補鎖の間で生じる程度
に応じて、ハイブリダイゼーション手順が迅速に進む。
さらに、錯体形成はハイブリダイゼーションよりも遙か
に早いので、ハイブリダイゼーションではなく錯体形成
を用いて、標的を支持体に結合させると、検定時間がさ
らに短縮される。また、抗体、抗原、レクチン、炭水化
物、ビオチンまたはアビジンを固体支持体に結合するに
は、核酸配列を固体支持体に結合させるのに要するほど
のステップを必要としないし、また時間もかからない。
例えば、Thomas、Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)、7
7巻、5201〜5205頁(1980)を参照されたい。 【００４１】このように、本発明によりハイブリダイゼ
ーション診断試験を従来よりもはるかに容易に、迅速
に、且つ便利におこなう手段が提供される。 【００４２】以下の実施例は、本発明による方法の実施
を例示するものである。具体的には、２プローブシステ
ムを用いて、溶液中の所望の標的配列を検出し定量する
ための、ハイブリダイゼーション検定を示している。 【００４３】 【実施例】下記の実施例の溶液ハイブリダイゼーション
手順において用いるために、単純ヘルペス ウィルス
タイプＩ(HSV-I) 糖タンパク質 D (gD) 遺伝子の、(＋)
プラス (コーディング) 鎖または (−) マイナス（アン
チコーディング）鎖のいずれかを含む一本鎖ファージ
を、標的配列として採用した。二本鎖遺伝子配列の一部
分を下記の表１〜５に示すが、下段の鎖はアンチコーデ
ィング鎖である。この配列は、Watson等、Science、218
巻、381〜384頁(1982) に発表されたものである。本発
明に基づき、プラス鎖及びマイナス鎖の部分をプローブ
として採用している。これらの一本鎖プローブ配列は、
遺伝子のコーディング鎖の上の文字を付した線、または
遺伝子のアンチコーディング鎖の下の文字と数字を付し
た線を用いて、表１〜表５に示す。 【００４４】 【表１】【００４５】 【表２】 【００４６】 【表３】【００４７】 【表４】【００４８】 【表５】【００４９】実施例では、３つの異なる標的を用いた。
第１の一本鎖ファージ標的であるファージ２（Φ2)は、
HSV-I D (gD)遺伝子の塩基1360個を有する (すなわち、
167から1、526 までの塩基、プラスミド M13mp18にクロ
ーンされた番号241 の開始コドンヌクレオチド) 。Φ2
内の gD のマイナス鎖配列を、上記の (＋)プラス鎖プ
ローブに相補的な標的として用いる。第２の一本鎖ファ
ージ標的 NPE #1 は、HSV-I gD 配列の2.9 キロベース
全てを有しており、M13mp18 内にクローンされる。NPE
#1内の gD (＋) プラス鎖配列をクローンして、上記の
(−）マイナスプローブに相補的な標的を提供する。最
後に、二本鎖プラスミド標的 BamHI-Jは、HSV-I の Bam
HI制限断片であり、まわりの HSV-I配列3.3 キロベース
と共にHSV-IgD 配列2.9 キロベース全てを有する。BamH
I-J をプラスミド pBR322 内にクローンし、このプラス
ミドをHSV-I ウイルスへの模擬ハイブリダイゼーション
のための二本鎖標的として用いる。 Roizman等、Curr.
Top. Microbiol. Immunol.、104: 273 (1983) を参照の
こと。 【００５０】以下に示す実施例は、本発明の種々の態様
を示す一連の実験の説明である。 【００５１】実施例１は、抗体被覆した支持体が、標的
に結合した２つのプローブを有するハイブリダイゼーシ
ョンサンドイッチを捕獲する能力を示している。実施例
２は、複数個の抗原で標識付けしたプローブを用いるこ
とによって得られる捕獲効率の改善を示している。実施
例３は、本発明によるハイブリダイゼーション検定の効
率及び感度に、標的濃度が及ぼす影響を示している。実
施例４は、放射線標識したハイブリダイゼーションサン
ドイッチを検出する上での本発明の有用性を示してい
る。実施例５は、非放射線標識したハイブリダイゼーシ
ョンサンドイッチの検出における本発明の有効性を示し
ている。実施例６は、二本鎖のDNA 標的の存在の検出に
おける本発明に基づく方法の有用性を示している。 【００５２】（実施例１）抗体で被覆した固体支持体が
２つのプローブ及び標的によって形成されたハイブリダ
イゼーションサンドイッチを捕獲する能力を調べた。オ
リゴヌクレオチドの第１プローブは、抗原を用いてその
５’末端に標識付けした。第２のプローブは、レポータ
ー基を有するオリゴヌクレオチドであった。標的の一部
分は各プローブに相補的であった。 【００５３】もっと具体的に説明すると、第１のプロー
ブは、前述したようにオリゴヌクレオチドG であった。
前述のオリゴヌクレオチドG の５’標識付けは、フルオ
レシインを用いておこなってもよい。 【００５４】オリゴヌクレオチドG は、５’アミン機能
化オリゴヌクレオチドG をフルオレシインイソチオシア
ン酸塩と反応させることによって、５’フルオレシイン
標識した。５’アミン機能化オリゴヌクレオチドG は、
その３’末端によって固体支持体に結合しているオリゴ
ヌクレオチドG を、〔(CH₃)₂CH〕₂NP(OCH₃)O(CH₂)₈NH(D
MT) の一般式 (式中、DMT はジメトキシトリチル基であ
る) を持つホスホラミダイトと反応させることによって
形成された。 【００５５】このホスホラミダイトの合成においては、
ジアゾメタンエーテル溶液約８ mlを、メタノール10 ml
のω-アミノカプリル酸 ( ウィスコンシン州ミルウォー
キーのAldrich Chemicalが販売している) 159.2 mg (１
ミリモル）に加えた。メタノールを蒸発させて、ω-ア
ミノカプリル酸メチルエステル174.9 mgを得た。次に、
ω−アミノカプリル酸メチルエステル173 mg (１ミリモ
ル）、塩化ジメトキシトリチル 1ミリモル、及びジイソ
プロピルエチルアミン 1ミリモルを、０℃においてアル
ゴン雰囲気のもとで、無水テトラヒドロフラン5 mlに加
えた。この混合物を25℃まで温め、１時間にわたって攪
拌した。溶剤を蒸発させ、粗生成物を酢酸エチル50 ml
で希釈した後、水で２回、続いて飽和重炭酸塩及び塩水
で順次洗った。生成物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥
蒸発させ、ω-アミノカプリル酸メチルエステルのジメ
トキシトリチル誘導体(ACAM-DMT)460 mgを得た。 【００５６】−78℃のアルゴン雰囲気の下にある無水テ
トラヒドロフラン１ ml中のACAM-DMT 0.17 ミリモル
に、テトラヒドロフラン中の１モル水素化アルミニウム
リチウム1.24 mlを加えた。この反応混合物を−78℃で
５分間攪拌し、次に25℃で30分間攪拌し、その後に、テ
トラヒドロフラン中の５% の水10 ml、エーテル 200 m
l、セライト(cellite) ３g 及び無水硫酸マグネシウム
0.5 gで希釈した。得られた混合物を30分間攪拌してか
らろ過し、一般式 HO(CH₂)₈NH-DMT を持つアルコールを
得た。 【００５７】無水ジクロロメタン10 ml中のHO(CH₂)₈NH-
DMT 0.72 ミリモルに、ジイソプロピルエチルアミン 0.
76 ミリモルと、クロロ-N、N'-ジイソプロピルアミノメ
トキシホスフィン (chloro-N、N'-diisopropylaminomet
hoxy phosohene)( カリフォルニア州エメリービルの Am
erican Bionuclearが販売) 0.76ミリモルを加えた。こ
の混合物を25℃で40分間攪拌し、次に酢酸エチル 50ml
で希釈し、塩水で４回洗浄した。この反応の生成物は、
前述したオリゴヌクレオチドG の標識付けに用いられる
ホスホラミダイトであった。 【００５８】第２のプローブは、Maniatis 等、Cell、1
5巻、687頁(1978)の手順に従って、³²P で標識付けした
オリゴヌクレオチドA であった。使用した日のプローブ
の比放射能は、3.2 ×10⁶ cpm/pmole であった。 【００５９】５' フルオレシイン標識の無いオリゴヌク
レオチドG を、第１のプローブ対照として用いた。第２
の対照プローブは、標的配列の何れとも相補的でない
5'CATGATCTTGCGGTCGGATTCTTC3'の配列を持ち、³²P で標
識付けをしたもので、使用した日の比放射能は、3.2 ×
10⁶ cpm/ピコモルであった。 【００６０】標的として用いたのは一本鎖Φ2 であっ
た。一本鎖Φ2 は、第１及び第２のプローブ及び第１の
プローブ対照と相補的であるが、第２の対照プローブと
は相補的でない。 【００６１】支持体として、イリノイ州ロックランドの
Pierce Chemicalが販売しているものと同等の1/4 イン
チのポリスチレンビーズをフルオレシイン抗体 (抗フル
オレシイン) で被覆した。抗フルオレシインの産生に
は、ウサギを用いた。抗フルオレシインを、硫酸アンモ
ニウム沈澱、続いてDEAEセルロースクロマトグラフィー
によって精製した。溶液中では、抗フルオレシインは約
1012倍の親和性を持ち、フルオレシインの蛍光を約99%
消光した。 【００６２】抗フルオレシインを被覆したビーズを調製
するために、ビーズをpH８の10mM NaHCO₃ 緩衝液中で15
秒間超音波処理して洗浄する。超音波処理の後、ビーズ
を脱イオン水中で全ての微粒子が取り除かれるまで洗浄
する。10 mM NaHCO₃ 40 mlを用いて、約200 個のビー
ズを被覆する。次に、0.57 mg/ mlの濃度の精製抗フル
オレシイン７ mlを加える。ビーズを室温で約65時間イ
ンキュベートする。インキュベーションの後、ビーズを
脱イオン水で洗浄し、吸引フィルター上で風乾する。 【００６３】抗フルオレシインで被覆したビーズはそれ
ぞれ、１つのビーズをTDX 緩衝液(0.1 MNaPO₄、pH 7.5;
0.1% NaN₃; 0.1 % ウシガンマグロブリン) 中の１nMフ
ルオレシイン1.5 mlと共にインキュベートすることによ
って示されるように、約１ピコモルのフルオレシインと
結合することができる。25℃で20時間にわたるインキュ
ベーションによって、溶液から97% の蛍光が除去され
た。ビーズを５ mlの脱イオン水中で３回洗浄し、１回
洗浄する毎にビーズを吸い取り(blotting)によって乾燥
させ、その後に、0.1 M NaOH内で10分間インキュベート
したが、この間に最初に被覆したフルオレシインの60％
が溶液中に放出された。このように、各ビーズは約0.9
ピコモルのフルオレシインと結合する能力がある。 【００６４】(1) 5'-フルオレシイン標識したオリゴヌ
クレオチド、5'-ビオチン標識したオリゴヌクレオチド
(いずれも3'-³²P末端標識) 並びにキナーゼ化³²P 標識
したオリゴヌクレオチド、及び抗フルオレシインで被覆
したポリスチレンビーズを用いて、下記の条件において
一連の捕獲実験をおこなった。 【００６５】³²P 標識したオリゴヌクレオチドのうちの
１つを１ピコモル含む変性、せん断したサケ精子DNA(ミ
ズリー州セントルイスのSigma Chemical Company）200
μg/mlと、100μlのTDX 緩衝液(0.1 Mリン酸ナトリウ
ム、pH 7.5; 0.1% NaN₃;及び0.01% ウシガンマグロブリ
ン、ミズリー州セントルイスのSigma Chemical Compan
y) を混合した。抗フルオレシインで被覆したポリスチ
レンビーズをこの溶液に加えた。この系を25℃で18時間
にわたってインキュベートした後、ビーズを取り出し
て、25℃のTDX 緩衝液１ mlの中で５分間洗浄した。次
にビーズをシンチレーションカウンターで測定した。 【００６６】高温で５分間ビーズを洗浄して、ビーズ上
の抗体錯体の安定性を試験した。表６に、前述の一連の
ビーズの捕獲効率及び安定性を示す。 【００６７】 【表６】【００６８】表６に示すように、これらのビーズの捕獲
効率と安定性は高く、ハイブリダイゼーション捕獲系に
有用なものである。これらのビーズには、ビオチン標識
または32P 標識したオリゴヌクレオチドはほんの僅かし
か結合しないか、もしくは全く結合しないので、このよ
うな系におけるバックグラウンドは非常に低い。 【００６９】(2) フルオレシイン抗体被覆したビーズが
フルオレシイン標識したオリゴヌクレオチドを捕獲する
率をもっと詳細に測定するために、一連のビーズを一つ
づつ、³²P で3'末端標識してある１ピコモルの5'-フル
オレシイン標識したオリゴヌクレオチドを用いて、時間
を変えてインキュベートした。捕獲の百分率を各ビーズ
について測定した。その結果を表７に示す。 【００７０】 【表７】 【００７１】表７に示すように、ビーズによって２〜３
時間内に、5'フルオレシイン標識付きオリゴヌクレオチ
ドの90％が捕獲される。ビーズ上の放射性標識の量が時
間の経過とともに僅かに低減するのは、ビーズから抗体
が少し漏れることを示しているものと考えられる。 【００７２】(3) 実験１ 抗フルオレシインで被覆したビーズの捕獲効率が確定し
たので、第１のプローブ( 5'フルオレシイン標識付きの
オリゴヌクレオチドG ) １ピコモル、第２のプローブ（
³²P 標識付きのオリゴヌクレオチドA)１ピコモル（使用
当日の比放射能、3.2 ×10⁶ cpm/ピコモル) 、そして標
的 (Φ2 SS、第１及び第２のプローブの双方に相補的で
ある）１ピコモルを、20 X SSPE (3.6 M NaCl; 0.23 M
NaH₂PO₄、pH 7.5;及び20mM EDTA)を希釈して得た 5 X S
SPE で50μlに希釈した。このハイブリダイゼーション
溶液を50℃で３時間インキュベートした。このハイブリ
ダイゼーション溶液を100 μlのTDX 緩衝液で希釈し、
抗フルオレシインで被覆したビーズ１個を加えた。25℃
で３時間インキュベートした後、TDX 緩衝液１ mlを用
いて37℃で５分間ビーズを洗浄し、さらにシンチレーシ
ョンカウンターで測定する前に、再びTDX 緩衝液１ ml
を用いて37℃で５分間洗浄した。 【００７３】対照実験 同じプロトコールに基づき、しかし下記のように変更を
加えて、３つの対照実験を行った。第１の対照実験（対
照１）では、第１のプローブとして5'フルオレシイン標
識付きのオリゴヌクレオチドG 、第２のプローブとして
5' ³²P標識のオリゴヌクレオチドA を、標的を何も存在
させずに抗フルオレシインで被覆したビーズと共にイン
キュベートした。第２の対照実験（対照２）では、実験
１のフルオレシイン標識したオリゴヌクレオチドG の替
わりに、第１のプローブとして標識付けしていないオリ
ゴヌクレオチドG を１ピコモルを用いた。最後に、第３
の対照実験（対照３）では、第１のプローブとして5'フ
ルオレシイン標識付きのオリゴヌクレオチドG を１ピコ
モル、第２のプローブとして32-B₂ と呼ばれる³²P標識
付きオリゴヌクレオチド（配列はΦ2 SSと相補的ではな
い）１ピコモル、また標的としてΦ2 SS 1ピコモルを用
いた。 【００７４】これらの実験の結果を表８に要約する。 【００７５】 【表８】 【００７６】実験１と対照１を比較すると、フルオレシ
イン標識付きのオリゴヌクレオチドG 、Φ２ SS 及び³²
P 標識付きのオリゴヌクレオチドA から成るハイブリッ
ドは、抗フルオレシインで被覆した固体支持体によって
選択的に捕獲されることが分かる。対照２及び対照３
は、正しい抗原標識付きの第１のプローブが存在しなけ
れば、また、標的に相補的な正しい第２のプローブが存
在しなければ、ハイブリッドは効果的に産生されず、捕
獲もされないことを示している。 【００７７】（実施例２）本発明によるハイブリダイゼ
ーション検定の捕獲効率を高める試みとして、フルオレ
シイン標識付けしたオリゴヌクレオチドプローブを幾つ
か、ハイブリダイゼーション溶液に同時に導入した。同
一の反応条件下で４つの実験を行った。 【００７８】各実験において、合計250 フェムトモルの
フルオレシイン標識付けしたオリゴヌクレオチドを用い
た。実験１では、250 フェムトモルのフルオレシイン標
識付けしたオリゴヌクレオチド１つを用いた。実験２の
ハイブリダイゼーション溶液には、各々125 フェムトモ
ルの異なるフルオレシイン標識付けしたオリゴヌクレオ
チド２つを用い、実験３では、各々83フェムトモルの異
なったフルオレシイン標識付けしたオリゴヌクレオチド
３つを、ハイブリダイゼーション溶液に用いた。実験４
では、ハイブリダイゼーション溶液中に、各々28フェム
トモルの異なるフルオレシイン標識付けしたオリゴヌク
レオチド９つを用いた。 【００７９】具体的には、実験１では、5'フルオレシイ
ン標識付けしたオリゴヌクレオチドB を250 フェムトモ
ル、標的Φ2 SSを25フェムトモル、及び³²P 標識付けし
たオリゴヌクレオチドA を 100フェムトモルの5XSSPE溶
液を５分間煮沸して、存在する可能性のある二本鎖の二
次構造全てを変性させてから、50℃で３時間インキュベ
ートした。抗フルオレシインで被覆したビーズ１個を加
える前に、ハイブリダイゼーション溶液を50μlの5 X S
SPEで希釈した。ビーズをこの溶液中で25℃で４時間イ
ンキュベートしてから、１ mlの5 X SSPEを用いて25℃
で５分間洗浄した後、シンチレーションカウンターで測
定した。 【００８０】実験２においては、実験１の条件を繰り返
したが、但し、250 フェムトモルの5'フルオレシイン標
識付けしたオリゴヌクレオチドB の代わりに、5'フルオ
レシイン標識付けしたオリゴヌクレオチドJ 及びD を各
々125 フェムトモルを用いた。 【００８１】実験３では実験１の条件を繰り返したが、
但し、実験１における250 フェムトモルの5'フルオレシ
イン標識付けしたオリゴヌクレオチドB に代えて、5'フ
ルオレシイン標識付けしたオリゴヌクレオチドJ、G 及
びD を各々83フェムトモル用いた。 【００８２】実験４では実験１の条件を繰り返したが、
実験１における250 フェムトモルの5'フルオレシイン標
識付けしたオリゴヌクレオチドB の代わりに、5'フルオ
レシイン標識付けしたオリゴヌクレオチドB、C、D、E、
F、G、H、I 及び Jを各々28フェムトモル用いた。 【００８３】これら４つの実験の結果を表９に要約する
が、ビーズに捕獲されたサンドイッチハイブリダイゼー
ション錯体の百分率は、存在する標的の全量に対する捕
獲された³²P オリゴヌクレオチドA の比率として表す。 【００８４】 【表９】 【００８５】表９に示すように、使用する異なるプロー
ブの数が増加するとともに、ほぼ線型的にハイブリダイ
ゼーションの効率が高まった。９個全部のフルオレシイ
ンオリゴヌクレオチドを使用すると、60％の捕獲効率が
得られた。 【００８６】一般に、１つの系において厳密点（point
of stringency)の数が多いほど、偽の正量を検出する可
能性は小さくなる。従来のハイブリダイゼーションサン
ドイッチ検定において、標識付け及び固定化に別々のプ
ローブを用いることは、標的配列の検出に２つの互いに
独立した事象、すなわち、双方のプローブの標的へのハ
イブリダイゼーションが起きることを必要とする点で、
これら２つの目的に単一のプローブを用いる場合より
も、厳密点が１つ増えることになる。それゆえ、第１の
プローブを幾つか用いることによって、厳密点が線型的
に増大し、特定の標的配列の検出の効率は、間違った配
列を検出する効率と比べて増大すると考えられる。同様
に、第１のプローブを支持体に結合するために、非ハイ
ブリダイゼーション反応を用いることは、既に核酸に関
連する厳密点がある系に、抗体と抗原の相互作用に伴う
厳密点を導入することになり、さらに前述の系は、前述
の厳密点が導入されなければ、その代わりに別の核酸に
関連する厳密点を持つだけなので、偽の正量の検出を最
小限に抑えることになると考えられる。 【００８７】下記の実施例において、標的濃度の範囲
（10フェムトモルから16フェムトモル)におけるハイブ
リダイゼーション錯体の捕獲効率の直線性を２組の実験
によって調べた。 【００８８】（実施例３）本発明に基づく免疫ハイブリ
ダイゼーション検定を、外来性DNA が存在する下で行っ
た場合の効率及び感度に対する標的濃度の影響を測定す
るために、標的濃度を10フェムトモルから16フェムトモ
ルの範囲で変化させた。 【００８９】６つのハイブリダイゼーション反応の各々
において、5'フルオレシイン標識付けしたオリゴヌクレ
オチドB、C、D、E、F、G、H、I及びJ をそれぞれ111 フ
ェムトモルと、ヒト胎盤DNA(ミズリー州セントルイスの
Sigma Chemical Companyが販売)10μg と、³²P 標識付
けしたオリゴヌクレオチドA を100 フェムトモルとを、
5 X SSPEに溶かした溶液を調製した。この基準溶液に、
Φ2 SS標的を色々に量を変えて加えた。実験１では、10
フェムトモルの標的を加えた。実験２では、２フェムト
モルの標的を用いた。実験３、４及び５では各々0.4 フ
ェムトモル、0.08フェムトモル、及び0.016 フェムトモ
ルのΦ2 SS標的を基準溶液に加えた。対照実験では標的
は加えなかった。 【００９０】試料を５分間煮沸した後、50℃で１時間イ
ンキュベートした。各試料を、ウシガンマグロブリン
(ミズリー州セントルイスのSigma Chemical Company)
を0.1%と、アジ化ナトリウム (ウィスコンシン州ミルウ
ォーキーのAldrich Chemical)を0.1%とを含む400 μlの
5 X SSPEで希釈した。抗フルオレシインで被覆したビー
ズ１個を各溶液に加え、次に各溶液を25℃、220rpm で
３時間混合した。次に各ビーズを1 mlの5 X SSPE中で25
℃で５分間、次に1 mlの5 X SSPE中で37℃で５分間順次
洗浄した。次に各々のビーズをシンチレーションカウン
ターで測定した。表１０においては、ビーズに捕獲され
たサンドイッチハイブリダイゼーション錯体の百分率
を、(実験用ビーズに捕獲された³²P 標識付けしたオリ
ゴヌクレオチドA −対照ビーズによって捕獲された³²P
標識付けしたオリゴヌクレオチドA)/(実験系に存在した
標的の全量) として計算し、そして二回行った各実験結
果の平均を求めた。 【００９１】 【表１０】 【００９２】表１０の結果が示すように、本発明に基づ
く免疫ハイブリダイゼーション検定は、アトモルの領域
の標的DNA の存在を、フェムトモルの領域におけるもの
と変わらない能率で検出することが出来る。このよう
に、サンドイッチハイブリダイゼーション錯体の捕獲効
率は、標的濃度に依存しないように思われる。この系の
感度は、放射性標識付けしたプローブの比放射能によっ
てのみ限定されるものと思われる。従って、本発明に基
づく免疫ハイブリダイゼーション検定は、非常に少ない
DNA の量の存在を、短時間の間に（４〜５時間）ほんの
僅かの操作で検出するのに使用することが可能である。 【００９３】本発明による免疫ハイブリダイゼーション
検定の感度を高めるために、前記実施例の³²P 標識付け
したオリゴヌクレオチドプローブの代わりに、³²P 標識
付けしたニックトランスレーションしたCNA プローブを
用いた一連の実験を行った。下記の実施例に示すよう
に、ニックトランスレーションしたプローブの長さが長
くなるほど、標識が多く結合することが出来るので、低
いレベルの標的濃度を検出することが可能となる。 【００９４】（実施例４）５つの実験用混合物を調製し
た。各々において、基本溶液は、第１のプローブとして
3'フルオレシイン標識付けしたオリゴヌクレオチド A-
1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1、H-1 及びJ-1をそれぞれ1
11 フェムトモル、ヒト胎盤DNA(ミズリー州セントルイ
スの Sigma Chemical Company) 10μg 、使用時の比放
射能が 1.8×10⁸ cpm/μg である³²P 標識付きのニック
トランスレーションしたプラスミド第２プローブM13mp1
8 Rf (複製可能な形態、すなわち二本鎖）10μg を、20
X SSPE から希釈した5 X SSPE溶液に溶かしたものであ
る。Maniatis等、MolecularCloning、Cold Spring Harb
or Laboratory、109〜112頁(1982)を参照されたい。こ
の基本溶液に、各実験毎に異なる量の標的NPE #1一本鎖
DNA を加えた。実験１では80アトモル、実験２では16ア
トモル、実験３では３アトモル、実験４では0.6 アトモ
ルの標的を加え、対照実験では標的を加えなかった。 【００９５】各実験溶液を５分間煮沸し、次に50℃で17
時間インキュベートした。各試料は、5 XSSC (0.75 M N
aCl; 及び75 mM クエン酸ナトリウム、pH７.0) と、Joh
nson等、Gene Anal.Techn.、1巻、3〜8頁(1984)の示唆
に基づく0.1 % の脱脂粉乳と、0.1 %のアジ化ナトリウ
ムとを含んだ捕獲緩衝液 200μlで希釈した。捕獲緩衝
液で希釈した各溶液に抗フルオレシインで被覆したビー
ズ１個を加えた後、各溶液を63℃、200 rpm で１時間混
合した。次にビーズを１ mlの5 X SSC 中で25℃で５分
間、次いで１ mlの5 X SSC 中で63℃で５分間、順次洗
浄した。そしてビーズをシンチレーションカウンターで
測定した。各実験を２度行って平均を求めた結果を表１
１に示す。 【００９６】 【表１１】 【００９７】NPE #1一本鎖ファージDNA は、M13mp18 内
にクローンされたHSVgD 2.9 キロベースを有する。従っ
て、フルオレシイン標識付けした第１のプローブが、gD
配列の部分を相補し、第２のプローブが、M13mp18 配
列を相補することが予測された。表１１はこのような予
測が裏書きされたことを示している。 【００９８】これらの実験は、第２のプローブの感度を
高めることによって、この実施例では第２のプローブに
よって組み込まれる標識の量を増化させることによっ
て、本発明に基づく免疫ハイブリダイゼーション検定の
限界が拡大されることを意味する。上述したように、³²
P 標識付けしたニックトランスレーションしたDNA プロ
ーブを採用することによって、アトモルよりも少ない量
の標的を検出することが可能である。 【００９９】下記の実施例では、固定されたハイブリダ
イゼーション錯体を、非放射性検出系手段によって検出
する可能性を調べた。この実施例においては、第２のプ
ローブは、ビオチン基で 3' 標識付けし、³²Pで 5' 標
識付けをした。こうして得た固定されたハイブリダイゼ
ーション錯体は、放射性イムノアッセイ系、及び酵素ア
ッセイ系の双方によって、特にLeary 等、Proc. Natl.
Acad. Sci. (U.S.A.)、80巻、4045頁(1983)で考察され
ているビオチン基化したApase錯体であるアビジンを用
いて検出することが可能となる。 【０１００】（実施例５）実験 合計１ピコモルのフルオレシイン標識付けした第１プロ
ーブ（ 3' フルオレシイン標識付けしたオリゴヌクレオ
チドA-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1、H-1、I-1及び J-1
各々111 フェムトモル) と、第２のプローブとして 3'
ビオチン基化した且つ5' ³²P標識付けしたオリゴヌクレ
オチドB-1 を100 フェムトモルと、標的としてNPE #1を
10フェムトモルと、ヒト胎盤DNA (ミズリー州セントル
イスのSigma Chemicals) 10 μg とを5X SSCEに含んだ
塩基性溶液50μlを調製した。基本溶液を５分間煮沸
し、63℃で１時間インキュベートした。抗フルオレシイ
ンで被覆したビーズを加える前に、この溶液を捕獲緩衝
液 200μlで希釈した。ビーズを含んだ混合物を63℃、2
00 rpm で１時間にわたりインキュベートした。次に、
ビーズを１ mlの0.6 X SSC 中で63℃で５分間ずつ２回
洗浄し、シンチレーションカウンターで測定した。 【０１０１】次にビーズを500 μlの酵素溶液〔0.45μg
のビオチン基化子ウシのアルカリフォスファターゼ
（インディアナ州インディアナポリスの Boehringer Ma
nnheimから入手可能）であり且つLeary 等、上掲に説明
されているようにビオチン基化したもの、1.35μg のア
ビジンDN (カリフォルニア州バーリンゲームのVector L
aboratories から入手できる)、0.5 mlの NMZT 緩衝液
（３ M NaCl)、１ mM MgCl₂ 、0.1 mM ZnCl₂、30 mM ト
リエチルアノールアミン(pH 7.6)、0.23 %ウシ血清アル
ブミン (ミズリー州セントルイスのSigma Chemical Com
panyから入手可能) 〕内で、25℃で１時間インキュベー
トした。酵素溶液は使用前30分に調製した。１ mlのSCS
B緩衝液(50 mM炭酸ナトリウム─重炭酸塩、pH 9.0;２μ
M ZnCl₂; 0.5 mM MgCl₂;及び0.1 M NaCl) 中で25℃で５
分間の洗浄を３回行った。 【０１０２】分に調製した。ビーズを酵素溶液に曝露し
た後、ビーズを 次にビーズを500 μlの酵素基質溶液
(SCSB 緩衝液中の10-4 Mリン酸メチルウンベリフェロ
ン、ミズリー州セントルイスのSigma Chemical Company
から入手出来る) 中に入れ、37℃でインキュベートし
た。Isikawa 等、Scand. J. Immunol.、8巻、43頁(197
8)。１時間にわたってインキュベートした後、この酵素
基質溶液400 μlを酵素キラー溶液(3.0 M K₂HPO₄、pH 1
0.4)100μlと混合し、Perkin-Elmer 650S 螢光検出器で
分析した (励起380 nm、放出 445 nm)。 【０１０３】対照 対照実験は上記の実験と同じであるが、但し、NPE #1
標的を用いなかった。 【０１０４】実験１と対照実験それぞれ二回の平均結果
を表１２に示す。『螢光単位』は、ハイブリダイゼーシ
ョン錯体の酵素検定によって得られたものである。 【０１０５】 【表１２】 【０１０６】表１２の結果が示すように、本発明に基づ
く免疫ハイブリダイゼーション検定は、非放射性酵素検
定を用いて、わずかな量だけ存在する標的DNA を迅速に
検出するのに用いることが可能である。 【０１０７】二本鎖DNA の存在を非放射性検出系を用い
て検出するために、本発明による免疫ハイブリダイゼー
ション検定を用いる可能性を実施例６で調べた。臨床に
おいては標的DNA の試料はこの形態で得られることが多
いものと思われるので、二本鎖DNA を検出することは特
に必要である。 【０１０８】（実施例６）実験 BamHI-J プラスミドのSac-1(マサチューセッツ州ビバリ
ーのNew England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼ消化
によって、標的を得た。gD HSV-1の遺伝子コードを持つ
2.9 キロベースの断片をアガロースゲル上の電気泳動、
続いて電気溶離及びエタノール沈澱によって分離した。
この断片を沸騰水中で塩基を用いて変性させてから中和
し、標的として使用するまで氷の上で保存した。 【０１０９】プローブ配列 (表３〜４の735-989 の塩
基) をpUC8プラスミド (メリーランド州Gaithersburgの
Bethesda Research Laboratories、Inc.) 内に、EcoRI-
HindIII 制限断片としてクローニングして、この配列の
コピーを９つ含むプラスミド（pUCgD)を調製した。Hind
III でpUCgD プラスミドを切断して直線状プローブを形
成し、且つエキソヌクレアーゼ ExoIII (メリーランド
州GaithersburgのBethesda Research Laboratories、In
c.) を用いてプラスミドの (+)鎖を消化し、(-)鎖上に
プローブ配列のコピーを３〜４個表に出し、この分子の
gDプローブ部分を露出させた。次に、この部分的に一本
鎖であるDNA をビオチン基化したソラーレン誘導体で処
理して、ビオチン基化した第２のプローブを調製した。 【０１１０】溶液50μlを調製したが、この溶液は、総
量が1.2 ピコモルのフルオレシイン標識付けしたオリゴ
ヌクレオチドの第１プローブと、各々100 フェムトモル
のA-1、C-1、D-1、E-1、F-1、K-1、L-1、M-1、N-1、R-
1、S-1、T-1と、10フェムトモルのビオチン基化した第
２のプローブと、20μg の５×SSCE内のヒト胎盤DNA(ミ
ズリー州セントルイスの Sigma Chemical Company)とを
含んでいる。この基本溶液に100、30、10 または０アト
モルの標的を加えたが、標的を加えないものを対照とし
た。 【０１１１】溶液を５分間煮沸してから50℃で１時間イ
ンキュベートした。溶液を200 μlの水で希釈し、抗フ
ルオレシインで被覆したビーズを１個加えた。この混合
物を50℃、200 rpm で１時間にわたってインキュベート
した。ビーズを５×SSC １ mlを用いて25℃で５分間洗
浄し、さらに0.6 ×SSC １ mlを用いて50℃で５分間洗
浄した後、シンチレーションカウンターで測定した。 【０１１２】他の全ての面では、第１、第２、第３の実
験及び対照実験は、実施例５に挙げた材料及び条件をそ
のまま用いた。 【０１１３】それぞれの実験ならびに対照実験を２度行
って平均した結果を表１３に示す。表１３において、
『螢光単位』は、抗フルオレシインで被覆したビーズに
結合したハイブリダイゼーション錯体を酵素検定して得
たものである。 【０１１４】 【表１３】 【０１１５】従って、表１３の結果が示すように、本発
明に基づく免疫ハイブリダイゼーション系は、非放射性
酵素検定を用いて、僅かに存在する二本鎖の標的DNAの
量を迅速に検出するのに用いることができる。 【０１１６】本発明を検討すれば、当業者には種々の修
正及び変更が可能であろう。例えば、試験試料に特定の
標的DNA が存在するか否かを調べるのに必要な成分要素
を、予めキットの形態で集めることも可能であろう。と
りわけ、選択された標的に相補的であり且つ第１の免疫
剤に結合する第１のプローブと、レポーター基に結合し
且つ第１のプローブとは別の標的の部分に相補的である
第２のプローブと、支持体に結合する第２の免疫剤と
は、別々に包装した構成要素としてこのようなキットに
含んでもよい。このようなキットは、例えば Ranki等、
Curr. Top. Microbiol. Immunol.、104巻、317〜318頁
(1983) の手順に基づいて、標的について試験するため
に調製された試料とプローブ及び支持体を組み合わせ
て、キットの対象とされる標的の存在を検出して定量す
るのに用いることができるであろう。 【０１１７】同様に、レポーター結合した第２のプロー
ブを入れた容器、第２の免疫剤に結合した支持体或いは
混合物を入れた容器、或いはそれぞれ第１の免疫剤に結
合した幾つかの第１のプローブの容器をキットとしても
よい。いくつかの第１のプローブの配列は、必要な場合
はある程度重なり合っても（即ち、互いに異なるが重な
り合う）よいが、検定の感度の点からは、固定化された
標的にできるだけ標識を付けるために、第２のプローブ
の配列が第１のプローブのいずれの配列とも異なり且つ
離れている（即ち、重なり合わない）ことが特に望まし
い。 【０１１８】また、本発明は抗フルオレシインで被覆し
たビーズを採用した系に関して説明しているが、錯化剤
を用いて本発明を実施するための材料は容易に入手でき
る。例えば、アガロース結合したレクチン及びビオチン
基化したアガロースは、カリフォルニア州Burlingameの
Vector Laboratories、Inc.から入手できる。アビジン
で被覆したポリメタクリレート球及びビオチン標識付け
したRNA は、Manning等、Chromosoma (Berl.)、53巻、1
07〜117頁(1979)の手順によって得られる。 【０１１９】従って、本発明は請求の範囲に包含される
このような均等な変更の全てを含むものである。 【０１２０】 【発明の効果】本発明によれば、試料中の標的分子を正
確に検出することが出来る簡便で且つ迅速な、核酸ハイ
ブリダイゼーション検定を行うための方法及びキットが
提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 スニットマン， ディヴィッド エル. アメリカ合衆国 80303 コロラド ボウ ルダー イサカ ドライブ 1475 (72)発明者 ストロウプ， スティーブン ディー. アメリカ合衆国 60048 イリノイ リバ ーティヴィル ルーズヴェルト ドライブ 606

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１） 選択された標的核酸配列を含む試料についてハ
   イブリダイゼーション検定を行うためのキットであっ
   て、 標的核酸配列の第１の部分に相補的な核酸配列を有する
   第１のプローブ、 該第１のプローブに結合される第１の錯化剤、 前記標的配列の第２の部分に相補的な核酸配列を有し、
   前記第１のプローブに会合する第２の一本鎖核酸プロー
   ブ、 該第２のプローブに結合されるレポーター基、 前記第１のプローブに会合する固体支持体、及び、 前記第１の錯化剤結合部分に相補的な結合部分を有する
   前記固体支持体に結合される第２の錯化剤を含み、さら
   に、 前記第１の錯化剤及び第２の錯化剤が、 抗原及び抗原に対する抗体、ならびにレクチン及び炭水
   化物よりなる群から選択されることを特徴とするキッ
   ト。 （２） 前記第１の錯化剤が抗体であり、前記第２の錯
   化剤が抗原である、特許請求の範囲第１項記載のキッ
   ト。 （３） 前記第１の錯化剤が抗原であり、前記第２の錯
   化剤が抗体である、特許請求の範囲第１項記載のキッ
   ト。 （４） 前記抗体が抗フルオレシイン抗体であり、前記
   抗原がフルオレシインである、特許請求の範囲第２項記
   載のキット。 （５） 前記第１の錯化剤が炭水化物であり、前記第２
   の錯化剤がレクチンである、特許請求の範囲第１項記載
   のキット。 （６） 前記第１の錯化剤がレクチンであり、前記第２
   の錯化剤が炭水化物である、特許請求の範囲第１項記載
   のキット。 （７） 前記第２のプローブ配列に、検出可能な標識で
   ある同位体標識が共有結合される、特許請求の範囲第１
   項記載のキット。 （８） 前記第２のプローブに、検出可能な標識である
   放射性標識された重金属が、キレート成分によって結合
   される、特許請求の範囲第１項記載のキット。 （９） 前記第２のプローブ配列に、検出可能な標識で
   ある非放射性標識が会合される、特許請求の範囲第１項
   記載のキット。 （１０） 前記非放射性標識がビオチンを含み、且つ、
   前記第１のプローブにすべて会合される、アビジン、ビ
   オチン化された子ウシのアルカリフォスファターゼ及び
   リン酸メチルウンベリフェロンをさらに含む、特許請求
   の範囲第９項記載のキット。