JPH08308912A - 結合組織物質におけるプリオンの不活性化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 結合組織物質の性能特性に影響を与えること
なく、プリオンおよび他の感染因子を不活性化するため
の結合組織物質の処理方法を提供すること。 【解決手段】 プリオンおよび他の感染因子を不活性化
して、少なくとも10⁵の保護を与えるようにするための
結合組織物質の処理方法であって、該方法は、以下のa)
およびb)の工程を包含する： a) 該結合組織物質を液体溶液に入れ、それにより、該
結合組織分子の表面領域を暴露して、該プリオンおよび
他の感染因子を処理に曝す工程；および b) 該結合組織物質の液体溶液を、約25℃以下の温度
で、該結合組織物質の性能特性に影響を与えることな
く、該プリオンおよび他の感染因子を不活性化するのに
充分な時間にわたって、該液体溶液中の水酸化ナトリウ
ム濃度が約0.1M〜約0.7Mの範囲となるように、水酸化ナ
トリウムと接触させる工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、感染因子(特に、
プリオン)の不活性化のために、結合組織分子を処理す
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】カリフォルニア大学の神経学および生物
化学および生物物理学部(サンフランシスコ)のStanley
B. Prusinerは、数多くの文献を最近著し、「過去30年
間の注目すべき発見により、動物のスクレイピー(Scrap
ie)およびヒトの４種の病気(クールー(Kuru)、クロイツ
フェルト・ヤコブ病(CJD)、ゲルストマン・ストラウス
ラー・シャインカー病、および致命的な家族性不眠症)
を引き起こす伝染性病原体の分子的および遺伝的な特徴
を見出した。この感染性病原体をウイルスおよびウイロ
イドから区別するために、用語「プリオン(PRION)」を
導入してそのタンパク質様の性質および感染性の性質を
強調した。」ということを記述した。この感染性のプリ
オン粒子の構造には、種々の仮説があり、これらには、
1)そのタンパク質をコードする核酸を取り囲むタンパク
質；2)小さなポリヌクレオチドと会合しているタンパク
質；および3)核酸の欠けたタンパク質が挙げられる。Pr
usiner博士は、仮説3)を主張している。いずれにしろ、
プリオンの構造および伝播の独特の特徴により、プリオ
ンは、他の全ての伝染性病原体から区別される。

【０００３】「Biology and Genetics of Prion Disease
s」(Annu. Rev. Microbial. (1994)48: 655-686)におい
て、Prusiner博士は、プリオンの概念およびヒトのプリ
オン病の発展を記述した。彼は、角膜移植、汚染された
EEG(脳波用)電極移植、および汚染された器具または装
置を使った外科手術(この場合、使用した準備処置は、
ヒトプリオンを不活性化するのには、不充分であった)
によって、CJDが偶然にヒトに伝染することを述べた。
それゆえ、プリオンは、一般人を感染から確実に保護す
るために、それ自体独特の不活性化処理が必要な伝染性
病原体である。

【０００４】さらに、ヒトに移植する医療デバイスに動
物およびヒトの組織を使用すること、このような組織を
医薬に使用すること、および頻度は低いが化粧品に使用
することに関する公衆衛生上の問題がある。特に問題な
のは、このような組織中にプリオンが存在する可能性が
あることであり、これらプリオンは、不活性化するのが
特に困難である。

【０００５】1985年４月16日にPlayらに発行された米国
特許第4,511,653号は、ヒトの胎盤組織からヒトのコラ
ーゲン性物質を工業的に調製する方法を記述している。
この方法は、肝炎ウイルスの不活性化を目的として、10
℃以下の温度で、この胎盤組織を、水酸化ナトリウム(N
aOH)の0.5M溶液、水酸化カリウム(KOH)の0.5M溶液また
は飽和石灰水溶液でアルカリ処理することを包含する。
水酸化ナトリウム処理を受ける胎盤コラーゲンは、不溶
性コラーゲンであり、ここで、処理されるコラーゲンの
おおよそ10％〜20％は、水酸化ナトリウム処理により可
溶化される。この方法は、タンパク質分解酵素を使用す
ることなく、全コラーゲンの20〜35％までの連続的な可
溶化を促進しつつ、肝炎を不活性化するという利点があ
ると言われている。

【０００６】1986年６月のthe Journal of Infectious
Diseases, Concise Communications(Vol. 153, No. 6)
には、種々の濃度の水酸化ナトリウムを室温で１時間用
いる、プリオン(例えば、20％脳ホモジネート中に存在
するスクレイピーおよびCJD)の不活性化が記述されてい
る。

【０００７】1991年９月のRecommendations for Minimi
zing the Risk of Infection by Agents Causing Zoono
ses and Other Animal Infections in the Manufacture
ofMedical Products, Federal Journal of Official P
ublications(BAnz., Germany)(No. 164, p. 6120)に
は、感染因子を不活性化する目的で、20℃で１時間にわ
たり、医用物質を１N(1M)NaOHで処理することが記述さ
れている。この処理は、ウシ海綿状脳症(BSE)およびウ
シ起源の物質に適用するように特に推奨された。

【０００８】1992年のPublic Health Issues Related t
o Animal and Human Spongiform Encephalophathies: M
emorandum from a WHO Meeting, Bulletin of the Worl
d Health Organization, 70(2): pp 183-190には、BS
E、すなわち、一群の伝染性の海綿状脳症(TSE)(その原
型は、スクレイピーである)に関する論述が提示されて
いる。BSEの感染性を取り除くかまたは低減する工業的
な方法として、ウシ組織に由来する医用製品を、20℃で
１時間にわたり、NaOH(好ましくは、１M NaOH)で処理す
ることが推奨されている。

【０００９】Darwin R. ErnstおよびRichard E. Race
は、「Comparative analysis of scrapie agent inacti
vation methods」, Journal of Virological Methods,
41 (1993) 193-202にて、スクレイピーに感染したハム
スターの脳ホモジネートの不活性化処理を記述してい
る。異なる濃度の水酸化ナトリウムまたはLpH(水性酸フ
ェノール誘導体)を単独でまたは両者を組み合わせて、
種々の時間にわたりオートクレーブにかけることによる
不活性化処理が開示されている。この文献は、0.1Nまた
は1.0NのいずれかのNaOHだけを用いたハムスター脳の懸
濁液の処理を行ったことを述べているものの、データは
提示されていない。

【００１０】D. M. Taylorらは、「Decontamination st
udies with the agents of bovinespongioform encepha
lopathy and scrapie」, Arch. Virol. (1994) 139: 31
3-326にて、ウシ海綿状脳症(BSE)因子に感染したウシの
脳、スクレイピー因子の263K株に感染させたげっ歯類の
脳、およびスクレイピー因子のME7株に感染させたげっ
歯類の脳の細胞解離物を処理するために、水酸化ナトリ
ウムを使用することを記述している。これらの細胞解離
物は、120分間以内で、1.0Mまたは2.0Mの水酸化ナトリ
ウムに曝されたが、「いずれの方法も、試験した全ての
因子を完全には不活性化しなかった」。Taylorらは、種
々の研究所のデータに不一致があるので、研究を行っ
た、と説明した。彼らは、このNaOH不活性化実験のデー
タから、いずれの時間(30分間から120分間まで)および
モル濃度(１Mおよび２M)を組み合わせても、BSE因子お
よびスクレイピー因子を一貫して不活性化しないことが
立証されることを発見した。さらに、このNaOH実験で
は、263K株、BSEおよびおそらくME7を用いると、２時間
の暴露は、30分間または60分間の暴露より効果が低いと
いう、説明できない結果があった。

【００１１】Collagen Corporation(本出願の譲受人)
は、主要成分としてウシコラーゲンを有する種々の製品
を製造している。さらに、Collagen社は、ヒトまたは動
物の損傷した結合組織を修復し交換するのに有用な多く
の結合組織物質を含めた製品を開発している。このよう
な結合組織物質の例には、コラーゲン、フィブリン(お
よびその前駆体であるフィブリノーゲン)、ムコ多糖、
フィブロネクチン、エラスチンおよびプロテオグリカン
が包含されるが、これらは、例示のために挙げており限
定するためのものではない。コラーゲンは、これらの結
合組織物質のうちでは、不溶性の繊維を形成するという
点で独特ではあるものの、これらの物質は、多くの特徴
を共有しており、それには、これらが大きな嵩高い分子
であって、この分子は架橋反応を介してそれ自体とまた
は他の結合組織分子と結合する傾向があるという特徴が
挙げられる。これらの分子が共に結合して繊維状の鎖を
形成し、架橋するかからまりあってマトリックスになる
傾向がある結果、プリオンの不活性化が困難になるなぜ
ならこの不活性化剤は、プリオン(これは、結合組織物
質の保護マトリックスに取り囲まれていることがある)
に到達する必要があるからである。

【００１２】Donald G. Wallaceらは、「Multiple Dena
turational Transitions in Fibrillar Collagen」, Bi
opolymers, Vol. 25, 1875-1893 (1986)にて、ペプシン
で処理したウシ繊維状コラーゲンの熱変性を記述してお
り、ここでは、示差走査熱量測定(DSC)を使用して、こ
のコラーゲン繊維の熱変性転移を研究した。コラーゲン
溶液から再構成したコラーゲン繊維は、いくつかの異な
る原繊維種から構成され、これらは、このコラーゲン繊
維のDSC熱変性の間に観察される複数の融解吸熱に対応
し得ることが提案された。

【００１３】Shenoyらの係属中の特許出願第08/274,673
号(これもまた、Collagen社に譲渡されており、その全
内容は、本明細書中で参考として援用される)は、感染
因子を不活性化するために、コラーゲンの溶液または分
散液を化学試薬で処理することを記述している。特に、
このような分散液および溶液は、約20℃でおおよそ１時
間にわたり、１M濃度の水酸化ナトリウムを用いて処理
された。この処理した溶液または分散液からその後生成
したコラーゲン繊維は、NaOHで処理しなかった溶液また
は分散液から生成したコラーゲン繊維とは、かなり異な
っていた。このコラーゲン繊維の相違は、DSCデータ、
このコラーゲン繊維の懸濁液の不透明度データ、および
種々の処方物中のこの繊維の物理的特性により、指摘さ
れた。溶液中のコラーゲン分子の水酸化ナトリウム処理
により、このコラーゲン繊維は不安定化され、それは、
引き続いて、この溶液から沈澱した。このコラーゲン繊
維を安定化するために、Shenoyらは、物理的繊維安定化
剤を使用した。これらの繊維を種々の製品に調製し、こ
の製品が、これらの繊維を、繊維を小集合体(subassemb
ly)に解離させる溶媒または試薬(例えば、リドカインま
たは高い濃度の塩)に曝すとき、この物理的繊維安定化
剤は、この(水酸化ナトリウム処理により弱められた)繊
維の安定性を保護する。別の好ましい繊維安定化方法で
は、この水酸化ナトリウム処理に続いて、化学試薬(好
ましくは、架橋剤)が使用されて、コラーゲン繊維の形
成後に、それが安定化される。これらの安定化方法を用
いて調製したコラーゲン繊維は、(プリオンを不活性化
するための水酸化ナトリウム処理を行うことなく、以前
に製造した)多くの製品の製品仕様を満たし得るもの
の、この安定化した繊維がこの生成物要件に適合できな
いような用途も存在し得る。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】それゆえ、結合組織分
子の構造を損なうことなく、この結合組織物質に存在し
得るプリオンを不活性化する方法を提供することが、極
めて望ましい。特に、コラーゲンベースの結合組織の繊
維形成能に影響を与えることなく、プリオンを不活性化
する方法が必要である。

【００１５】

【課題を解決するための手段】結合組織分子が不活性化
処理によって悪影響を受けないような様式で、プリオン
を不活性化するために、結合組織物質の溶液を処理する
ことが可能であることを発見した。例えば、可溶化した
アテロペプチドコラーゲンは、この可溶化コラーゲンが
安定した繊維を形成する能力に影響を与えることなく、
プリオンおよび他の感染因子を不活性化するために、水
酸化ナトリウムで処理され得る。さらに、処理したコラ
ーゲンから形成される繊維は、水酸化ナトリウムで処理
しなかったコラーゲンと比較して、融解温度、分光光度
法で測定したときの不透明度、繊維を繊維小集合体に解
離させる傾向のある試薬の存在下での安定性、および繊
維形成速度に関して、同じ挙動を示す。この分子のテロ
ペプチド部分を含むコラーゲンは、同様の様式で、アテ
ロペプチドコラーゲンに処理し得る。しかしながら、そ
の純粋な形状では、このコラーゲンの大部分は、そのテ
ロペプチド領域で架橋される傾向にあるので、この分子
のこの領域を除去して溶解性にする必要がある場合もあ
る。

【００１６】本発明に従って、プリオンおよび他の感染
因子を不活性化して少なくとも10⁵の保護(5 logs of Pr
otection)を与えるようにするための結合組織物質(例え
ば、コラーゲン)の第１の処理方法は、以下のa)および
b)の工程を包含する： a) 該結合組織物質を液体溶液に入れ、それにより、該
結合組織分子の表面領域を暴露して、該プリオンおよび
他の感染因子を処理に曝す工程；および b) 該結合組織物質の液体溶液を、約25℃以下の温度
で、該結合組織物質の性能特性に影響を与えることな
く、該プリオンおよび他の感染因子を不活性化するのに
充分な時間にわたって、該液体溶液中の水酸化ナトリウ
ム濃度が約0.1M〜約0.7Mの範囲となるように、水酸化ナ
トリウムと接触させる工程。

【００１７】本発明の最も好ましい結合組織物質は、コ
ラーゲンであり、その性能特性として、コラーゲンの水
酸化ナトリウム処理した溶液から生成したコラーゲン繊
維の安定性を調べた。

【００１８】このプリオンの不活性化に対して所望の10
⁵の保護を与える、最も希薄な水酸化ナトリウムを使用
するのが好ましいので、0.7M未満の種々の水酸化ナトリ
ウム濃度を調べた。これより低い濃度の水酸化ナトリウ
ムを、プリオン不活性化の有効性、およびこの結合組織
分子に対する効果の両方について、調べた。コラーゲン
の場合には、コラーゲンに対する水酸化ナトリウム処理
の効果は、特に、溶液中の処理されたコラーゲン分子か
ら形成されたコラーゲン繊維の安定性について、証明さ
れた。それゆえ、特定の水酸化ナトリウム濃度にコラー
ゲン分子を曝した時のコラーゲン分子に対する効果の指
標として、繊維安定性を用いた。

【００１９】さらに、本発明に従って、コラーゲン分子
に影響を与えることなく、25℃以下の温度でのプリオン
および他の感染因子を不活性化して、少なくとも10⁵の
保護を与えるためのコラーゲンの処理方法では、特定の
水酸化ナトリウム濃度において、以下の処理時間が使用
され得る。0.5Mの水酸化ナトリウム濃度に対しては、プ
リオンを不活性化するためのコラーゲン溶液の処理に
は、80分間以内の時間が使用され得る。0.35Mの水酸化
ナトリウム濃度に対しては、90分間以内の時間が使用さ
れ得る。0.25Mの水酸化ナトリウム濃度に対しては、対
応する時間は100分以内である。0.10Mの水酸化ナトリウ
ム濃度に対しては、対応する時間は、150分間以内であ
る。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明の詳細な説明の前置きとし
て、本明細書および添付の請求の範囲で用いるように、
単数形は、文脈にて他に明らかに指示がなければ、複数
物の指示物を包含する。例えば、「コラーゲン繊維」と
の記載は、１種またはそれ以上の繊維を含み、「小集合
体繊維グループ」との記載は、その小集合体単位の種々
の成分の全てを含み、そして「そのコラーゲン」との表
示は、異なるタイプの複数のコラーゲンの混合物を含む
など。

【００２１】本発明の記述に特に重要な用語を、以下に
定義する：用語「アテロペプチドコラーゲン」は、テロ
ペプチド領域(これは、ヒトにおいて、他の動物、例え
ば、ウシに由来するコラーゲンに対し免疫応答を引き起
こす原因となることが知られている)を除去するよう
に、化学的に処理するかまたは加工したコラーゲンを意
味する。

【００２２】本願明細書で使用する用語「コラーゲン」
は、全てのタイプおよび形状のコラーゲンを意味し、こ
れらには、天然に生じる原料(例えば、ウシ真皮または
ヒト胎盤)から抽出したものが含まれ、これらは処理、
または変性されていてもよい。

【００２３】用語「コラーゲン懸濁液」は、塩を含むか
または含まない水性担体(例えば、水またはリン酸緩衝
生理食塩水(PBS)溶液)中の架橋したまたは架橋していな
いコラーゲン繊維の懸濁液を意味する。

【００２４】用語「繊維状コラーゲン」は、その中で、
三重らせん状の分子が、分子間電荷および疎水性相互作
用により凝集して、繊維を形成しているコラーゲンを意
味する。

【００２５】用語「繊維集合体」または「集合した繊
維」は、多くの繊維小集合体を含有し得る、完全に凝集
した繊維を意味する。

【００２６】用語「繊維小集合体」は、繊維に凝集する
個々の異なる種類の原繊維を意味する。多くの異なる種
類の原繊維があり、これらは、互いに充填順位、原繊維
幅および架橋レベルの異なる３種またはそれ以上の帯状
種または非帯状種により代表され得る。

【００２７】用語「可溶性コラーゲン」または「溶液中
コラーゲン」は、繊維集塊物が前駆体原繊維形状では存
在しないか、または少量でしか存在しない程度まで、周
囲の媒体で溶媒和されているコラーゲン分子を意味す
る。繊維集塊物がコラーゲン分子および／または前駆体
原繊維に解離すると、粘稠で光学的に透明な溶液が得ら
れる。

【００２８】１．概念 コラーゲンは、マトリックス様の構造を形成する大きな
分子から構成される多くの結合組織物質の１種にすぎな
い。本発明の概念は、このような一般的な結合組織物質
に適用できるものの、ここに含まれる記述は、コラーゲ
ン繊維に関する。

【００２９】出願人の初期の研究(これは、1994年７月1
3日に出願された米国特許出願第08/674,273号(この出願
は、同時係属中である)に記述されている)に基づいて、
溶液中で1.0Mの水酸化ナトリウムで処理した(約20℃で
約60〜70分間)コラーゲン分子から生成したコラーゲン
繊維の安定性が、水酸化ナトリウム処理により影響を受
けることを、出願人は知っていた。この研究は、コラー
ゲン分子から形成した繊維が安定でなくなるように、こ
の水酸化ナトリウム処理がコラーゲン分子に影響を与え
ることを指摘した。この第'273号出願は、水酸化ナトリ
ウムで処理したコラーゲン繊維を安定化する方法に関す
る。

【００３０】ここで開示の発明は、このコラーゲン繊維
の不安定性が、この主要な繊維集合体内の小さな繊維の
小集合体の解離に起因することを示すデータを含む。こ
の処理により起こる繊維の不安定性の程度は、処理時の
溶液中の水酸化ナトリウム濃度、処理が行われる温度、
および処理時間に依存する。処理濃度、処理温度および
処理時間が増加するにつれて、このコラーゲン分子は、
この主要な繊維集合体内の小集合体繊維の集塊物の不安
定性を増すような様式で、影響を受ける。この繊維の不
安定性は、これらの繊維を懸濁液中で不安定環境(例え
ば、高い塩濃度)に曝すか、または解離を起こす特定の
活性剤(例えば、リドカイン)に曝すと、明らかとなる。
解離した小集合体単位が多量に存在していること自体
は、このコラーゲン繊維のうち低温で融解する部分の増
加を示す示差走査熱量測定曲線により、明らかとなる。
さらに、解離した小集合体単位が多量に存在しているこ
とにより、このコラーゲン繊維の懸濁液を分光光度法で
評価したとき、不透明度の読みが低くなる(このこと
は、繊維サイズが小さいことを示す)。

【００３１】

【実施例】実施例１；1.0M水酸化ナトリウム処理 図１のDSC曲線で描写されるコラーゲン繊維を、以下の
ようにして調製した。可溶性のウシアテロペプチドコラ
ーゲン200ml(水溶液中の3.0mg/mlタンパク質、pH2.0)
を、15分間にわたる3.0M水酸化ナトリウム(NaOH)100ml
の添加により、1.0MのNaOH濃度にした。この水酸化ナト
リウムの添加は、蠕動ポンプを用いて行い、この添加中
ずっと、この混合物を撹拌した。次いで、この混合物を
20℃で60分間インキュベートした。この水酸化ナトリウ
ムの処理期間後すぐに、1600 ml(可溶性コラーゲン溶液
の８倍の量)の冷水(約４℃)を加えて、この水酸化ナト
リウム処理を停止した。希釈した混合物を、10分間にわ
たって、冷塩酸(HCl)(約４℃)で中和した。この混合物
(pH2.0)を、おおよそ3.0mg/mlタンパク質まで濃縮し、
次いで、少なくとも4.5倍容量の0.013MのHClに対し、一
定容量でダイアフィルターした。

【００３２】大容量の冷水を添加することにより、この
混合物中のNaOH濃度をおおよそ0.15Mに下げ、温度を約
６℃まで低下させた。この停止操作の結果、このコラー
ゲン分子に対する効果は、20℃で約60分間にわたり1.0M
のNaOHに曝すことに帰着することになる。引き続いて、
溶液中の3.0mg/mlのコラーゲンを、水酸化ナトリウムを
用いてpHを11.2に調整した0.2Mのリン酸二ナトリウム緩
衝液の添加により、約17℃で沈澱させた。このコラーゲ
ン溶液と緩衝液との容積比は、９：１であった。沈澱し
た生成物は、7.0〜7.4のpHでおおよそ2.7mg/mlの繊維状
コラーゲン濃度を有していた。この沈澱物を、遠心分離
により、35mg/mlを越えるタンパク質含量にまで濃縮し
た。この遠心分離物を、水ベースのPBSで希釈すること
により調製し、7.0〜7.4のpHで0.02Mのリン酸緩衝液中
の35mg/mlのコラーゲン懸濁液を得た。この最終調製物
を、DSCおよび不透明度試験に用いた。

【００３３】図１に関して、曲線100は、上記方法で生
成したコラーゲン繊維の示差走査熱量測定(DSC)曲線を
示す。35mg/ml(pH7.0〜7.4の0.02Mリン酸緩衝液中のタ
ンパク質濃度)に調製する際には、塩またはリドカイン
が存在しないために、水酸化ナトリウム処理によるこの
コラーゲン小集合体繊維に対する効果は、マスクされて
いる。大きな集合した繊維だけが認められる。この大き
な集合した繊維は、約58.3℃の融解温度および2.1の不
透明度を有する。ここで記述の不透明度は、ベックマン
(Backman)分光光度計(Model DU 650)を用いて測定し
た。35mg/mlのコラーゲン懸濁液試料を、試験前に約４
℃と７℃の間の温度で24時間冷却し、８℃で試験した。
この分光光度計は、１mm光路のキュベットにて410nm
で、水をブランクとした。

【００３４】実施例２；1.0M水酸化ナトリウム処理 図２は、図１で示したものと同じ水酸化ナトリウム処理
コラーゲン分子であって、同じ沈澱操作中に繊維に沈澱
したもののDSC曲線200を示す。しかしながら、沈澱した
繊維をPBS緩衝液中で35mg/mlの濃度まで調製したとき、
リドカインが存在していた。その遠心分離物は、6.3のp
Hにて、0.02Mのリン酸二ナトリウム、３mg/mlのリドカ
イン(2-ジエチルアミノ-2',6'-アセトキシリジド)およ
び1.3Mの塩化ナトリウムを含有する水ベースの溶液で希
釈することにより、調製した。得られた生成物は、7.0
〜7.4のpHで、約35mg/mlの繊維状コラーゲン、３mg/ml
のリドカイン、0.02Mのリン酸二ナトリウム、および0.1
3Mの塩化ナトリウムを含有する水性分散液から構成され
ていた。このリドカインは、大きな集合した繊維が繊維
小集合体に解離するのを促進する薬剤として作用し、こ
のことから、この大きな集合したコラーゲン繊維の安定
性は、この水酸化ナトリウム処理により影響を受けたこ
とが明らかである。この繊維が影響を受ける様式は、低
い融点および小さいサイズ(これは、低い不透明度によ
り示される)を有する、多量の小集合体繊維の存在によ
り、証明される。例えば、このDSC走査200には、４個の
小集合体が含まれる。約41.5℃の融解温度を有する小集
合体202は、その全体的な効果に関して、おそらく無視
できる程度に充分に小さい。約45℃の融点を有する小集
合体204は、このDSC曲線の領域のおおよそ30〜45パーセ
ントを構成する。約53.5℃の融点を有する小集合体206
は、このDSC曲線の領域のおおよそ50〜55パーセントを
構成する。約55℃の融点を有する小集合体208は、このD
SC曲線の領域の数パーセントを構成する。この小集合体
の群の35mg/ml懸濁液の不透明度は、1.10であった。リ
ドカインが存在するとき、この繊維集合体の不透明度が
2.10から1.10に低下したことは、さらに、リドカインの
存在下にて、この繊維集合体の大部分が解離したことの
証拠となる。

【００３５】実施例３；水酸化ナトリウム処理なし 図３は、水酸化ナトリウムで処理しなかったコラーゲン
分子溶液から沈澱した対照コラーゲン繊維のDSC曲線300
を示す。沈澱したコラーゲン繊維を、３mg/mlのリドカ
インおよび0.13Mの塩と共に、図２に関して記述したの
と同じ方法で、35mg/mlのタンパク質濃度の最終生成物
まで調製した。このリドカインは、再度、大きな集合し
た繊維を繊維小集合体に解離させるが、水酸化ナトリウ
ム処理していないコラーゲン繊維を典型的に構成する小
集合体繊維に関連する割合を示す。この対照コラーゲン
繊維集合体に関し、そのDSC走査300には、２個の主要な
小集合体が含まれる。約44.5℃の融解温度を有する小集
合体302は、このDSC走査曲線の領域のおおよそ12〜15パ
ーセントを構成する。約54.8℃の融解温度を有する小集
合体304は、このDSC曲線の領域のおおよそ85〜88パーセ
ントを構成する。図３で示した対照コラーゲン繊維含有
物質の不透明度は、1.65であり、1.0Mの水酸化ナトリウ
ム処理コラーゲン繊維の不透明度1.10と比較すると、1.
0Mの水酸化ナトリウム処理コラーゲン繊維は、解離した
繊維小集合体成分の量が多いことを示す。図２と図３と
を比較すると、リドカインの存在によって、主要な繊維
に含まれる小集合体の不安定性が暴露されることが示さ
れ、このことは、この調製物中のリドカインの存在が、
溶液中コラーゲンに対する水酸化ナトリウム処理の効
果、および安定な繊維集合体を形成する能力を決定する
有用な手段になることを示す。

【００３６】より低い融解温度(および、より小さい繊
維サイズ)を示す小集合体が形成される度合は、水酸化
ナトリウムと直接関係しているが、水酸化ナトリウムは
繊維安定性に影響を与えるこのコラーゲン分子に作用す
る。出願人の先の米国特許出願第08/674,273号は、安定
化されたコラーゲン分散液の物理的特性、例えば、生成
物の張力を弱める作用(これは、針のような導管を通る
物質の押出性に影響する)およびゲル弾性は、この水酸
化ナトリウム処理によって影響を受けるという事実を記
述している。それゆえ、このコラーゲン繊維の最終用途
に依存して、プリオンおよび他の感染因子を不活性化す
るために水酸化ナトリウム処理をするにもかかわらず、
この繊維の物理的特性が保持されるように、このコラー
ゲン繊維集合体の安定性を制御することが決定的に重要
である。

【００３７】２．プリオンの不活性化 従来技術の項で参照したように、世界保健機構は、20℃
で少なくとも１時間にわたって、動物組織を1.0Mの水酸
化ナトリウムで処理することを推奨しているが、これは
プリオン(これはまた、「緩慢に作用するウイルス」と
呼ばれている)を不活性化することを目的としている。

【００３８】適度にプリオンを不活性化しつつ、コラー
ゲン繊維の安定性に対する影響を少なくするように、さ
らに低い濃度(1.0M以下)、温度および時間にて、結合組
織分子(特に、アテロペプチドコラーゲン分子)の溶液を
水酸化ナトリウムで処理し得るかどうかを決定するため
に、本出願人の指示の下で、詳細な研究が行われた。

【００３９】この研究は、ハムスターのスクレイピー株
263Kの感染性の不活性化レベルを測定して行われ、この
不活性化は、2.25mg/mlの濃度の可溶性コラーゲンの存
在下にて、20℃で、1.0M(1.0 N)、0.5Mおよび0.25Mの水
酸化ナトリウムに60分間曝し、続いて、3.0M、1.5Mまた
は0.75Mの塩酸でそれぞれ５分間中和した後に行われ
た。Brown, P.; Rohwer, R.G.; およびGajdusek, D.C.
の公開された研究、「Newer data on the inactivation
of scrapie virus or Creutzfeldt-Jakob disease vir
us in brain tissue」, J. Infect. Dis., 153: 1145-1
148 (1986)により、1.0Mの水酸化ナトリウムが、脳ホモ
ジネートのスクレイピー感染性を不活性化するのに必要
な予定の能力以上の能力を与えるのに対して、0.1Mの水
酸化ナトリウムは、有意に不活性化させる下限に近いこ
とが示された。このようなデータは、溶液中のアテロペ
プチドコラーゲンのこのような処理の効能には利用でき
ない。このスクレイピー263K株をアテロペプチドコラー
ゲンの溶液中での不活性化研究のために選択したが、そ
れはこの株が周知の最も短い潜伏期型(incubationモデ
ル)であり、その潜伏期間は用量に依存し、そして限界
希釈には240〜360日を要するからである。

【００４０】このスクレイピー263K株の不活性化研究に
用いた各実験プロトコルの詳細な説明は、ここでは述べ
ない。これらの多くの技術が当該技術分野で用いられ、
充分に文献に記載されているからである。しかしなが
ら、方法論的な原理は、本研究では重要な特定要因なの
で、以下に記述する。

【００４１】Ａ．方法論的な原理 大脳半球間にスクレイピー因子を接種したゴールデンシ
リアハムスターにおいて、このハムスターに適応したス
クレイピー因子を定量的にタイターすることは、伝染性
の海綿状脳症因子に対し今までに開発された最も速くか
つ定量的な分析法である。

【００４２】このスクレイピー因子は、組織培養では、
タイターに有用なようには成長しない。従って、この因
子は、生きている動物に直接接種することにより、タイ
ターされ、次いで、この動物の病気の進行を観察しなけ
ればならない。スクレイピーは、プリオン(「遅発性ウ
イルス」)病であるので、この観察期間は、非常に長
い。このハムスターに適応したスクレイピー263K株(こ
れは、現在知られている最も短い潜伏期型である)の場
合には、潜伏期間は用量に依存し、限界希釈には、240
〜360日を要した。

【００４３】定量は、試料を10倍の連続希釈をして、接
種した動物の50％だけを殺す希釈を分析することにより
行われる。少なくとも４匹のハムスターに、各希釈物を
大脳半球間に連続して接種する。高い濃度の因子を含有
する低希釈物は、接種したハムスターを全て殺す。高希
釈物は、一定の点からは、因子を含有せず、接種したハ
ムスターのいずれをも殺さない。このタイターにおい
て、それまで殺さなかったハムスターを殺す希釈物変化
点は「ブレークポイント」と呼ぶ。ブレークポイントに
おける希釈物の逆数は、この因子の力価のおおよその評
価値である。

【００４４】このブレークポイントが、接種した全ての
動物を殺す少なくとも１種の希釈物と、いずれの動物を
も殺さない希釈物とによって境界づけられているなら、
さらに優れた評価値が統計的に算出され得る。このブレ
ークポイントは、未知の力価の試料については、あらか
じめ知ることはできないので、通常、全ての一連の希釈
物を接種し、最も高い力価の試料でも発症しない点を越
えたところまで、さらに希釈を行うことが、最善であ
る。

【００４５】この力価の精度は、各希釈について接種し
た動物の数の関数である。４匹の動物について得られる
力価は、10個の要因のうちのおおよそ１個程度の確実性
しかない。

【００４６】この試験対象に高希釈のチャレンジを加え
ると、チャレンジホモジネートに由来する脳組織の汚染
の影響が最小になる。この試験対象に対して低希釈のチ
ャレンジを加えると、このアッセイの動的範囲が広くな
る。この試験対象が処理中に希釈されるなら、高い初期
力価の誘発感染性を用いて、これを補填すべきである。

【００４７】脳内のハムスター因子の力価は、１グラム
あたり10¹¹程度に高いので、１パーセントの懸濁液は、
10⁹/ml程度のハムスター因子を含有し得る。接種し得る
最大容量は、0.05mlであり、それゆえ、接種し得る最大
力価は、５×10⁷であり得る。この値はまた、アッセイ
の最大の動的範囲を決定する。この範囲をカバーするた
めには、８＋１の順次の10倍希釈が必要である。

【００４８】各希釈物を４匹のハムスターに接種する。
最大力価の接種物を受けたハムスターは、60日以内に発
病する。限界用量を受けたハムスターのほとんどは、24
0日までに発病した。落伍動物が生じるが、それはおそ
らく、大脳半球間に接種を受けて、感染前に血液または
溶液中コラーゲンに因子が移動したために、周辺部位か
ら発病した動物である。この病気の潜伏期間からおおよ
その力価値が分かり、このタイターの進行を追跡するの
に使用できる。この目的のために、全ての他のデータ
は、そのチャレンジ力価に戻って関連づけなければなら
ないので、このチャレンジ力価は、二重に測定される。
このアッセイの統計的な精度もまた、ブレークポイント
があると予想される一連の希釈領域において、さらに別
の動物を接種することにより、改善し得る。

【００４９】Ｂ．プリオンの不活性化の現在の研究 1) 安全性に関する予防措置：スクレイピー感染を含め
た全ての作業は、ボルチモアのバージニア(VA)医学セン
ター研究所の動物の生物学的安全性レベルIIIの施設に
おいて、この施設の標準的な操作手順に従って、行っ
た。これらの作業は、Dr. Robert G. Rohwer, Ph.D.に
より、本出願人およびDr. Rohwerが認めた実験プロトコ
ルに基づいて、行った。

【００５０】2) スクレイピー感染チャレンジの調製：
この感染チャレンジは、脳の力価が最も高いとき、その
病気の臨床段階の後期に殺されたハムスターから集めた
脳から調製した。脳ホモジネートは、超音波を用いて調
製した。

【００５１】3) スクレイピー因子のチャレンジストッ
クのタイター：このチャレンジストックを、その同じ６
mlアリコートの２個の完全に別の希釈系列を用いて、二
重に力価を測定した。これにより、このチャレンジスト
ックの力価の統計的な有意性が増し、この力価は、その
後のクリアランス値の全ての計算の標準となるので、最
も重要な測定値である。

【００５２】この結果の統計的な有意性をさらに増すた
めに、10^-8倍および10^-9倍の希釈において、８匹の動物
を用いた。

【００５３】4) 水酸化ナトリウム不活性化：各操作段
階の容量および濃度の要約については、以下の表１を参
照のこと。各実験は、別々に行った。

【００５４】

【表１】

【００５５】i) スクレイピー因子を固定した(spiked)
物質の調製： a) 1.0Mの水酸化ナトリウム pH7.2のPBSに10％スクレイピーハムスターの脳ホモジネ
ート(SBH)を20ml含有する50mlチューブ１個を解凍し、
この10％のSBHの18mlを、溶液中の3.97mg/mlコラーゲン
102mlに加え、これを、500mlのステンレス鋼焼き戻しビ
ーカーにて一定速度で撹拌することにより混合し、再循
環浴に接続して、20℃で維持した。これにより、脳ホモ
ジネートの1.5％懸濁液となり、3.0Mの水酸化ナトリウ
ム60mlで希釈したとき、１％の感染性スパイクおよび2.
25mg/mlの可溶性コラーゲンの最終濃度であった。

【００５６】b) 0.5Mの水酸化ナトリウム pH7.2のPBSに10％のSBHを20ml含有する50mlチューブ１
個を解凍し、この10％のSBHの18mlを、溶液中の3.97mg/
mlコラーゲン102mlに加え、これを、上記のように混合
した。これにより、1.5Mの水酸化ナトリウム60mlで希釈
したとき、１％の感染性スパイクおよび2.25mg/mlの可
溶性コラーゲンの最終濃度となった脳ホモジネートの1.
5％懸濁液を生成した。

【００５７】c) 0.25Mの水酸化ナトリウム pH7.2のPBSに10％のスクレイピー脳ホモジネートを18ml
含有する50mlチューブを解凍し、この10％のSBHの18ml
を、溶液中の3.97mg/mlコラーゲン102mlに加え、これ
を、上記のように混合した。これにより、0.75Mの水酸
化ナトリウム60mlで希釈したとき、１％の感染性スパイ
クおよび2.25mg/mlの可溶性コラーゲンの最終濃度とな
った脳ホモジネートの1.5％懸濁液を生成した。

【００５８】ii) 水酸化ナトリウム処理しスパイクし
たコラーゲン溶液の調製： a) このスパイクしたコラーゲン懸濁液および水酸化ナ
トリウム不活性化剤は、この水酸化ナトリウムを20℃の
水浴に入れ、そしてこの水浴を再循環浴に接続して、こ
のスパイクしたコラーゲンを20℃で維持することによ
り、20℃で平衡化した。

【００５９】b) ３種の水酸化ナトリウム処理しスパイ
クしたコラーゲン溶液のそれぞれを調製するために、1.
0M、0.5Mまたは0.35Mの水酸化ナトリウムの適当量を、
１分間あたりおおよそ４mlの割合で、この撹拌しスパイ
クしたコラーゲン溶液にポンプで加えた。この間、この
混合物を20℃で維持した。次いで、各混合物を、一定速
度で撹拌しつつ、20℃で60分間インキュベートした。こ
の60分間のインキュベーション／不活性化の期間後、各
混合物を４℃の再循環浴に接続し、続いて、この混合物
に、中和組成物を添加した。この中和組成物は、４℃の
10X Dulbeccosのリン酸塩緩衝液(D-PBS)(Gibco BRL 310
-4200)26.7mlと適当なモル数の塩酸(この混合物中の水
酸化ナトリウムの濃度に依存して、3.0M、1.5Mまたは0.
75M)の55mlとが配合されていた。

【００６０】1.0M水酸化ナトリウム処理、0.5M水酸化ナ
トリウム処理物質および0.25M水酸化ナトリウム処理
で、得られた水酸化ナトリウム処理しスパイクしたコラ
ーゲン溶液は、それぞれ、以下のとおりである：1) 1.5
2mg/mlコラーゲン、0.2mMリン酸塩、820mM塩化ナトリウ
ムおよび0.68％脳ホモジネートの混合物267ml；2) 1.52
mg/mlコラーゲン、9.2mMリン酸塩、480mM塩化ナトリウ
ムおよび0.68％脳ホモジネートの混合物267ml；および
3) 1.52mg/mlコラーゲン、9.2mMリン酸塩、310mM塩化ナ
トリウムおよび0.68％脳ホモジネートの混合物267ml。

【００６１】5) ハムスターの接種：離乳したばかりの
雄のゴールデンシリアハムスター複数を業者から購入
し、それらの状態を確認するために、隔離状態に置い
た。適当な状態にあると分かったものには、購入後３〜
５週で接種した。36匹の動物のそれぞれに、上記の1.0M
の水酸化ナトリウム処理混合物を接種した。36匹の動物
のそれぞれに、上記の0.5Mの水酸化ナトリウム処理混合
物を接種した。36匹の動物のそれぞれに、上記の0.25M
の水酸化ナトリウム処理混合物を接種した。さらに、以
下の表２は、接種した動物のチャレンジストックタイタ
ーの要約を示す。

【００６２】

【表２】

【００６３】6) 病気のスコア化：動物を、スクレイピ
ー病の徴候について週２回調べ、驚き反応「Ｓ」；歩行
困難「Ｇ」；活動過剰「Ｈ」；歩行のよろけ／頭の上下
運動「Ｗ」；養育放棄「Ｒ」；衰弱「Ｐ」；および死亡
「Ｄ」の有無について、スコア化した。併発症、闘争、
傷害または他の異常現象の発生も記した。上の徴候のい
ずれかについて「有り」と評価した動物は、病気の進行
について、引き続き毎日調べた。一旦、明白で一貫した
スクレイピーの徴候が明らかになると、すなわち、動物
が歩行のよろけ、頭の上下運動および養育放棄を現わす
と、その動物を、CO₂による酸素欠乏によって殺した。
力価の最終的な確認は、主として、ブレークポイント希
釈における、病気に罹った動物と罹らなかった動物との
比に依存する。そのために、ブレークポイントにおける
全ての動物、およびブレークポイント以上および以下の
一定希釈における１匹の動物を、その臨床的な状態の確
認のために病気の組織学的な徴候について、調べた。病
気に罹らなかった動物は、組織病理学的な検査のため
に、接種の６ヶ月目および12ヶ月目に殺す。

【００６４】Ｃ．不活性化研究の結果 ３種の水酸化ナトリウムで処理しスパイクしたコラーゲ
ン溶液の全ては、一定期間内において、いずれの発病動
物も生じなかった。このことは、３種の水酸化ナトリウ
ム処理条件の全てが、少なくとも10⁵の高力価感染性を
不活性化したことを意味する。

【００６５】図４は、スクレイピー感染した脳ホモジネ
ートでスパイクした水酸化ナトリウム未処理コラーゲン
溶液を接種した動物の応答を示す。個々の各動物に認め
られた最初のスクレイピー徴候が生じるまでの接種後経
過時間を、その動物に投与した接種物の希釈に対して、
プロットした。記号が重なっている場合には、一定の位
置に実際に何匹の動物がはいるか分かるように、記号を
僅かにずらしている。図４における6.8×10^-3上の点線4
02は、３種の水酸化ナトリウム実験のうちの最初の希釈
物を表す。もし、感染因子が、この水酸化ナトリウム処
理に耐えたとしたら、病気に罹る最初の動物は、この希
釈物上になり、そのデータ点は、この線上に入る。病気
に罹った動物はいなかった。このデータ点の実線404お
よび破線406は、それぞれ独立して、データの分散した
２種のチャレンジタイターに由来する。

【００６６】このチャレンジデータに認められる分散
は、スクレイピータイターに典型的であり、この制限の
範囲内において、２つのタイター測定には充分に一貫性
がある。102日目では、３種の実験のいずれかにより水
酸化ナトリウム処理物質を受けた動物には、スクレイピ
ー病の徴候は認められなかった。このことは、少なくと
も10⁵のクリアランスを表している。この分析により、
この水酸化ナトリウム３実験の全ての６個の最大希釈物
が、感染性を有していないことが示される。この水酸化
ナトリウム実験の動物がスクレイピーに罹ったとした
ら、まず最初に、6.8×10^-3の希釈物で罹るであろう。
しかしながら、このような遅い発症が代表するであろう
最大力価は、そのチャレンジの用量応答により示され
る。可能な最大力価(Dr. Rohwerらの過去の実験に基づ
くと、10¹¹倍)に対する用量応答まで広げると、図４の
線408で示されるように、この試料に残留している感染
性は10³倍以下であることが分かる。伸長線408およびそ
の情報を、410に示すように、仮説データ点に戻して移
動させると、図４の412に示すように、10^-5倍以下の希
釈物は感染性がないことが分かる。

【００６７】３．水酸化ナトリウム処理のコラーゲン繊
維安定性に対する効果 アテロペプチドコラーゲン溶液中に含有されたプリオン
(ハムスタースクレイピー株263K)の不活性化に関して上
記で提示したデータに基づいて、出願人は、0.25M以上
の水酸化ナトリウム濃度が(おそらく、それより低い濃
度でも)、不活性化には充分であることを確認した。し
かしながら、出願人は、コラーゲン溶液を約20℃の温度
で60〜70分間にわたり1.0Mの水酸化ナトリウムと接触さ
せることは、コラーゲン分子に影響を与え、結果とし
て、不安定な繊維を生じることを明らかにした。従っ
て、次の問題は、溶液中のコラーゲン分子に著しい影響
を与えることなく、プリオンを不活性化できる水酸化ナ
トリウム濃度が存在するかどうかということであった。

【００６８】本実施例(好ましい実施態様)で使用するコ
ラーゲン溶液は、牛皮から誘導したが、コラーゲンは、
種々の家畜(例えば、牛、豚、羊およびヤギ)の結合組織
から、商業的に有用な量で得られ得る。天然のコラーゲ
ン繊維は、コラーゲン分子と呼ばれる規則的に配列した
サブユニット構造から構成される。コラーゲン分子は、
典型的には、長さ約3000Å、直径15Åである。その長く
堅い棒状構造は、三重らせん状立体配置において、互い
に巻き付いた３個のポリペプチド鎖からなる。典型的に
は、この構成鎖の２個は組成が同じであり、第三の鎖は
異なる。いずれかの一定のポリペプチド一本鎖の長さに
沿ったアミノ酸残基の特徴的な分布(ここで、三組の繰
り返し単位は、各三番目の位置にグリシンを含む)は、
らせん状立体配置の形成に好ましい。個々のコラーゲン
分子は、集合して原繊維(小集合体)となり、これらは合
体し、繊維(集合体)を形成する。合体した繊維集合体
は、高い塩濃度および活性化剤(例えば、リドカイン)に
曝されると、先に述べたように、解離し得る。

【００６９】本明細書中の実施例(好ましい実施態様)で
用いたウシコラーゲンは、牛皮から得た。牛皮を物理的
に洗浄して、非コラーゲン物質(例えば、毛、脂肪、炭
水化物、ムコ多糖など)を除去した。次いで、この牛皮
をコミューテーション(粉砕および高速せん断)にかけ
て、引き続く処理(例えば、精製)を高め、このコラーゲ
ン分子のテロペプチド領域(これは、望ましくない免疫
原性を有する)の酵素的除去を促進する。

【００７０】粗く分割した結合組織を、非変性条件下に
て、酸性水溶液で膨潤させた。広範囲にわたる湿潤粉砕
により、さらに分散を行って、酵素が天然コラーゲンへ
接近できるようにした。希酸溶液を低温で使用して、変
性を最小限にとどめる。適当な酸には、酢酸、マロン
酸、もしくは乳酸、または25℃でのpK値が約２〜約５の
他の離液系列のカルボン酸がある。この分散媒体中の酸
濃度は、約0.01M〜1.0Mの範囲であり得、温度は、約４
℃〜約25℃で変化させ得る。酸処理により得られる分散
液は、天然コラーゲンの微小集塊物、および溶液中の天
然コラーゲン少量を含有する粘稠分散液であった。

【００７１】この粘稠な生成物を酵素処理にかけて、テ
ロペプチドを除去し、可溶性のアテロペプチドコラーゲ
ンを生成した。本来のコラーゲン分子の主要部分をその
まま残しつつ、テロペプチドを優先的に攻撃する種々の
タンパク質分解酵素が、使用可能である。酵素として
は、例えば、ペプシン、トリプシンおよびプロナーゼが
挙げられる。米国特許第3,131,130号および第3,530,037
号を参照のこと。

【００７２】好ましい酵素はペプシンであり、これは、
一般に、約２〜４のpHの、酸性溶液と組み合わせて用い
た。この酵素の濃度は、存在するコラーゲンの重量をベ
ースにして、約0.001〜約10重量％の範囲である。この
コラーゲンタンパク質の濃度は、一般に、約0.5g/l〜約
10g/lの範囲である。好ましくは、その酸度は、約0.01M
〜約1.0Mの濃度のカルボン酸により提供される。必要に
応じて、そのpHを、鉱酸、塩酸の添加により調整した。
この酵素処理は、このコラーゲンが実質的に完全に可溶
化するまで、その進行を定期的に追跡しつつ、一般に、
約０℃〜約30℃の範囲の温度で、２日〜２週間の範囲の
期間にわたって行った。

【００７３】得られた溶液を処理して、不溶性コラーゲ
ン、酵素、残留アミノ酸およびテロペプチド単位(これ
は、このコラーゲン分子からあらかじめ分離された)か
ら、可溶性アテロペプチドコラーゲンを分離した。主と
して、この処理は、異なるイオン強度の種々の溶液に対
する分離、沈澱および透析を含んでいた。適切な温度
(通常、約４℃〜約30℃)を使用し、特定の塩に依存し
て、種々のイオン強度または濃度(約0.01M〜約3.5M)の
塩溶液を使用した。イオン強度は、通常、約0.01〜3.5
であった。

【００７４】この溶液をアルカリ物質(例えば、水酸化
ナトリウム)で処理し、そのpHを少なくとも約７まで上
げて酵素を不活性化した。この酵素の不活性化後、この
不活性化処理中に沈澱した不溶な不純物を濾過して、溶
液中のコラーゲンを含有する濾液を得た。

【００７５】この溶液中のコラーゲンは、セライト(cel
ite)床に通し、引き続いて、限外濾過により処理して、
約３mg/mlのアテロペプチドコラーゲンを含有する透明
の精製溶液を得た。このコラーゲン濃縮溶液は、高度の
集塊物がほとんどなく、サブミクロン濃縮濾液(CSF)と
呼ばれている。本明細書中に記載される好ましい実施態
様において、プリオンおよび他の感染因子の不活性化の
目的で、水酸化ナトリウムで処理したのは、このCSFで
あった。

【００７６】この水酸化ナトリウム処理、およびそれに
続く塩酸での中和の後、この混合物を3.0mg/mlのタンパ
ク質濃度まで濃縮し、0.013Mの塩酸を用い、一定容量で
ダイアフィルターして、残留塩の濃度を20mM未満まで低
下させた。次いで、このコラーゲン溶液をバッチ式カチ
オン交換カラムにかけ、HCl(pH2.0)を用いる二段階溶出
でさらに精製して、0.3mg/mlタンパク質のコラーゲン溶
液を生成する。次いで、この溶出液を、限外濾過により
約2.5〜3.0mg/mlタンパク質まで濃縮し、少なくとも2.5
倍容量の0.013MのHClでダイアフィルターする。この濃
縮され、精製されたpH2.0のコラーゲン溶液に、次い
で、適切な緩衝液を添加することにより沈澱を生成し、
試験用に調製する。

【００７７】プリオン不活性化の大局的な観点から見る
と、分散液中で沈澱したコラーゲン繊維を処理するより
もむしろ、コラーゲン溶液を水酸化ナトリウムで処理す
る方が好ましい。この可溶性コラーゲン分子、および溶
液中に存在するいずれかの初期原繊維は、解離して、そ
れにより、繊維構造内に存在するか取り込まれ得るいず
れかの感染因子を最大限に利用することが可能となる。
このコラーゲン三重らせんは、非常に堅固に巻き付いて
いる(直径1.5nm)ために(現在、我々が知っている限
り)、ウイルスやプリオンは、このコラーゲン分子内に
存在し得なくなる。従って、このようなウイルスまたは
プリオンは、この溶液内に存在しているか、またはコラ
ーゲン分子の表面に吸着されているのかいずれかであ
る。この可溶性の環境では、コラーゲン繊維がコラーゲ
ン分子に解離する場合、物質移動障壁(このような障壁
があると、この水酸化ナトリウムがコラーゲン分子表面
の感染因子に到達するには、固形物(集合した繊維)を通
って水酸化ナトリウムが拡散する必要が生じる)は存在
しない。

【００７８】このコラーゲン分子が、不活性化処理によ
って影響を受けないような様式で、プリオンの不活性化
のためにコラーゲン分子の溶液を処理することが可能で
あることが見出された。例えば、水酸化ナトリウムで処
理した可溶化アテロペプチドコラーゲンから形成される
繊維は、水酸化ナトリウムで処理しなかったコラーゲン
と比較して、融解温度、分光光度法で測定したときの不
透明度、繊維の解離を起こす溶媒および試薬の存在下で
の安定性、および繊維形成速度について、同じ挙動を示
し得る。

【００７９】少なくとも10⁵の保護が得られるような、
プリオンおよび他の感染因子の不活性化のためのコラー
ゲンの処理において、35mg/mlに調製したコラーゲンのD
SC曲線データおよび不透明度測定に基づけば、以下の工
程は、安定なコラーゲン繊維の形成に著しく影響を与え
ないことを見出した： a) コラーゲンを溶液に入れ、それにより、処理すべき
結合組織の表面領域を暴露させ、上記プリオンおよび他
の感染因子を処理に曝す工程；および b) 上記溶液または分散液中の水酸化ナトリウム濃度が
0.7M以下となるように、約25℃以下の温度で約30分間以
内の時間にわたり、コラーゲン分子の溶液を水酸化ナト
リウムと接触させる工程。

【００８０】25℃以上では、約0.7Mより高い濃度の水酸
化ナトリウムについては、たとえ暴露時間が５分間程度
に短くても、このコラーゲン分子の小集合体形成能は、
著しく変化する。

【００８１】このコラーゲン処理溶液の水酸化ナトリウ
ム濃度は、(約25℃で)、約0.5M以下に維持するのが好ま
しい。この範囲の水酸化ナトリウム濃度は、60分間以内
にプリオンを不活性化することができ、この水酸化ナト
リウムの中和時の熱移動の問題点を低減し、処理したコ
ラーゲン分子が安定な繊維を形成する能力に対して、僅
かな影響しかないか、または全く影響がないことが証明
されているからである。

【００８２】実施例４〜７；種々のモル濃度の水酸化ナ
トリウムによる処理 コラーゲン溶液を以下の工程を用いて水酸化ナトリウム
で処理した。数種の異なる水酸化ナトリウム濃度の効果
を評価した。特に、個々のコラーゲン溶液を、以下の濃
度の水酸化ナトリウムを用いて処理した：0.75M、0.5
M、0.35M、0.25Mおよび0.1M。この水酸化ナトリウム処
理の効果を、他の処理変数からできるだけ独立させて個
々に評価するために、この水酸化ナトリウム処理期間の
最後において、多量(コラーゲン溶液の容量の８倍)の冷
水(約４℃)を加えて、この水酸化ナトリウム濃度を低レ
ベルにし、その反応温度を低下させて実験を行った。そ
れにより、このコラーゲン分子にさらに著しい影響を与
えることなく、この水酸化ナトリウムの中和を可能にし
た。

【００８３】特に、ウシアテロペプチドコラーゲン(水
をベースとする溶液中の3.0mg/mlタンパク質、pH2.0)25
0ｇに、20℃未満の温度で15分間にわたり１Mの水酸化ナ
トリウムを添加することにより、試験する水酸化ナトリ
ウム濃度(0.75M、0.5M、0.35M、0.25Mまたは0.1M)にし
た。水酸化ナトリウムの添加は、蠕動ポンプを用いて行
い、この添加中ずっと、この混合物を撹拌した。次い
で、この混合物を20℃で60分間保持した(この操作は、
0.75M以外の全ての水酸化ナトリウム濃度について行
い、0.75Mの水酸化ナトリウム濃度のものは、20℃で30
分間保持した)。この水酸化ナトリウム処理の完了時点
で、2000mlの冷水(約４℃)を素早く(１分間にわたって)
加えて、この水酸化ナトリウムの反応を停止した。希釈
した混合物をおおよそ３分間撹拌し、次いで、15分間に
わたって、１Mの塩酸で中和した。この混合物(pH2.0)
を、Filtron Ultrasette Omegaシリーズのポリエーテル
スルホン膜を用いて、おおよそ3.0mg/mlのタンパク質量
まで濃縮し、次いで、４倍容量の0.013Mの塩酸に対し
て、一定容量でダイアフィルターした。大容量の冷水を
添加することにより、この水酸化ナトリウムを、無視で
きる濃度まで下げ、その温度を約６℃まで低下させた。
引き続いて、水酸化ナトリウムを用いてpHを11.2に調整
した0.2Mのリン酸二ナトリウム緩衝液を添加して、溶液
中の3.0mg/mlのコラーゲンを約17℃で沈澱させた。この
コラーゲン溶液と緩衝液との容積比は、９：１であっ
た。生成した沈澱物は、7.0〜7.4のpHでおおよそ2.7mg/
mlの繊維状コラーゲンタンパク質濃度を有していた。こ
の沈澱物を、遠心分離により、35mg/mlを越えるタンパ
ク質含量にまで濃縮した。

【００８４】沈澱した繊維を、リドカイン３mg/mlを存
在させつつ、PBS緩衝液中で35mg/mlの濃度まで調製し
た。具体的には、その遠心分離物を、6.3のpHにて、0.0
2Mのリン酸二ナトリウム、３mg/mlのリドカインおよび
1.3Mの塩化ナトリウムを含有する水ベースの溶液で希釈
することにより、調製した。得られた生成物は、7.0〜
7.4のpHで、約35mg/mlの繊維状コラーゲン、３mg/mlの
リドカイン、0.02Mのリン酸二ナトリウムおよび0.13Mの
塩化ナトリウムを含有する水性分散液から構成されてい
た。このリドカインは、集合した不安定な大繊維を繊維
小集合体に解離させ、このことは、この水酸化ナトリウ
ム処理の繊維安定性への効果を明らかにする。

【００８５】0.75Mの濃度の水酸化ナトリウムに対する
水酸化ナトリウム処理時間は、30分間であるので、本実
施例のデータを以下の実施例10に提示する。

【００８６】実施例４：水酸化ナトリウム濃度0.5M 図５は、コラーゲン溶液を、約20℃で約60分間にわたっ
て、0.5Mの水酸化ナトリウムに曝したとき(さらに水酸
化ナトリウムをコラーゲン溶液に添加する間の15分間低
濃度の水酸化ナトリウムに曝されている)生成するアテ
ロペプチドコラーゲンのDSC曲線500を示す。この小集合
体繊維の塊状物は、曲線502の領域に入り、約55.6℃の
融解温度を有する。小集合体繊維の少量部分は、曲線50
4に現れ、約46.5℃の融解温度を示す。約60℃の融解温
度を有する第三の小集合体繊維群506が存在する可能性
があるが、この小集合体単位は、このDSC曲線の502小集
合体部分にある程度マスクされている。しかしながら、
このコラーゲン繊維の不安定性の点に関する主な問題点
は、低温融解性の小集合体群(例えば、504；これは、図
５では、全体的な繊維組成のうちの非常に少量の成分で
あると思われる)が生じることにある。水酸化ナトリウ
ム処理していないコラーゲン対照繊維(図３)と図５とを
比較すると、いずれの場合にも、低温融解性の小集合体
群の量は、同様に、このコラーゲン繊維組成の少量部分
であることが分かる。この0.5Mの水酸化ナトリウムで処
理したコラーゲンについて、そのコラーゲン繊維懸濁液
の不透明度は、図３に示したコラーゲン標準繊維の不透
明度1.7と比較すると、2.1であった。不透明度の上昇
は、明らかに、図３の対照コラーゲンと比較して、この
0.5M水酸化ナトリウム処理コラーゲン繊維が、55.5℃以
上で融解する小集合体をある程度多い割合で含むことに
起因している。主な問題点は、上記のように、低温融解
性の小集合体群の量にあるので、この0.5M水酸化ナトリ
ウム処理コラーゲン繊維溶液は、適切な安定性を有する
コラーゲン繊維を提供すると考えられる。

【００８７】実施例５：水酸化ナトリウム濃度0.35M 図６は、このコラーゲン溶液を、約20℃で約60分間にわ
たって、0.35Mの水酸化ナトリウムに曝したとき(さらに
水酸化ナトリウムをコラーゲン溶液に添加する間の15分
間低濃度の水酸化ナトリウムに曝されている)生成する
アテロペプチドコラーゲンのDSC曲線600を示す。この小
集合体繊維の塊状物は、曲線602の領域に入り、約54.8
℃の融解温度を有する。小集合体繊維の少量部分は、曲
線604に現れ、約46℃の融解温度を示す。今回も、約60
℃の融解温度を有する第三の小集合体繊維群606が存在
する可能性がある。この小集合体単位は、このDSC曲線
の602小集合体部分にある程度マスクされている。その
量は、0.05M水酸化ナトリウム処理コラーゲン繊維中に
存在する量よりも低いことが明らかである。この0.35M
の水酸化ナトリウムで処理したコラーゲンについて、そ
のコラーゲン繊維懸濁液の不透明度は、図３に示したコ
ラーゲン標準繊維の不透明度1.7と比較すると、2.0であ
った。今回も、不透明度の上昇は、明らかに、図３の対
照コラーゲンと比較して、この0.35M水酸化ナトリウム
処理コラーゲン繊維は、55.5℃以上で融解する小集合体
をある程度高い割合で含むことに起因している。上記の
ように、主な関心が低融解温度の小集合体群の量にある
ので、0.35Mの水酸化ナトリウムで処理したコラーゲン
溶液が受容できる安定性を有するコラーゲン繊維を提供
する。曲線600上の低融解温度の小集合体繊維604の量
は、0.5Mの水酸化ナトリウム濃度で認められた量よりも
僅かに高くなっているが、おそらく、この方法の実験誤
差の範囲内であろう。

【００８８】実施例６：水酸化ナトリウム濃度0.25M 図７は、このコラーゲン溶液を、約20℃で約60分間にわ
たって、0.25Mの水酸化ナトリウムに曝したとき(さらに
水酸化ナトリウムをコラーゲン溶液に添加する間の15分
間低濃度の水酸化ナトリウムに曝されている)生成する
アテロペプチドコラーゲンのDSC曲線700を示す。この小
集合体繊維の塊状物は、曲線702の領域に入り、約55.8
℃の融解温度を有する。小集合体繊維の少量部分は、曲
線704に現れ、約46.5℃の融解温度を示す。この0.25Mの
水酸化ナトリウムで処理したコラーゲンについて、その
コラーゲン繊維懸濁液の不透明度は、図３に示したコラ
ーゲン標準繊維の不透明度1.7と比較すると、2.1であっ
た。不透明度がコラーゲン標準繊維懸濁液よりも上昇し
ているのは、この0.25M水酸化ナトリウム処理コラーゲ
ン中の低温融解性の小集合体成分の量の減少に起因して
いると思われる。この低温融解性の小集合体成分の減少
は、おそらく、この水酸化ナトリウム処理が原因である
とは思われず、この溶液中コラーゲン出発物質の相違に
よる可能性が高い。

【００８９】実施例７：水酸化ナトリウム濃度0.10M 図８は、このコラーゲン溶液を、約20℃で約120分間に
わたって、0.10Mの水酸化ナトリウムに曝したとき(さら
に水酸化ナトリウムをコラーゲン溶液に添加する間の15
分間低濃度の水酸化ナトリウムに曝されている)生成す
るアテロペプチドコラーゲンのDSC曲線800を示す。この
小集合体繊維の塊状物は、曲線802の領域に入り、約54.
2℃の融解温度を有する。小集合体繊維の少量部分は、
曲線804に現れ、約45.5℃の融解温度を示す。今回も、6
0℃の融解温度では、小集合体繊維群は存在しないと思
われ、低温融解性(45.5℃)の小集合体繊維の量は、0.5
M、0.35Mおよび0.25Mの水酸化ナトリウムで処理した繊
維の量よりも低下している。この0.10Mの水酸化ナトリ
ウムで処理したコラーゲンについて、そのコラーゲン繊
維懸濁液の不透明度は、図３に示したコラーゲン標準繊
維の不透明度1.7と比較すると、2.1であった。不透明度
がコラーゲン標準繊維懸濁液よりも上昇しているのは、
この0.10M水酸化ナトリウム処理コラーゲン中の低温融
解性の小集合体成分の量の減少に起因していると思われ
る。この低温融解性の小集合体成分の減少は、おそら
く、この水酸化ナトリウム処理が原因であるとは思われ
ず、この溶液中コラーゲン出発物質の相違による可能性
が高い。しかしながら、この水酸化ナトリウムの処理濃
度が0.35Mから0.25M、0.10Mへと低下するにつれて、明
らかに、低温融解性の小集合体成分の量が低下している
ことに注目すべきである。これらの実施例の全てにおい
て、この溶液中コラーゲン出発物質は同じであった。

【００９０】水酸化ナトリウムで処理しなかった対照コ
ラーゲン繊維のDSC曲線(図３)と、0.5Mまたはそれ以下
の濃度の水酸化ナトリウムで処理したコラーゲン分子か
ら形成したコラーゲン繊維のDSC曲線(図５〜８)とを比
較すると、処理したコラーゲン溶液から生成したコラー
ゲン繊維の安定性に対する水酸化ナトリウム処理の効果
は、適切な範囲内に入ることが示される。この適合性
は、水酸化ナトリウム処理に曝さなかったコラーゲン分
子から生成したコラーゲン繊維と同程度の低温融解性の
小集合体繊維成分の量に基づいている。

【００９１】出願人のデータは、約20℃でのコラーゲン
溶液の水酸化ナトリウム処理に限定されている。かなり
高い温度(例えば、30℃)では、水酸化ナトリウムの濃度
を低くする必要があるかも知れない。

【００９２】このプリオンの不活性化に対して所望の10
⁵の保護を与える、最も希薄な水酸化ナトリウムを使用
するのが好ましいので、0.7M未満の種々の水酸化ナトリ
ウム濃度を調べた。さらに低い濃度の水酸化ナトリウム
を、プリオン不活性化の有効性、およびこの結合組織分
子に対する効果の両方について調べた。コラーゲンの場
合には、コラーゲンに対する水酸化ナトリウム処理の効
果は、特に、溶液中の処理したコラーゲン分子から形成
したコラーゲン繊維の安定性について、証明された。そ
れゆえ、特定の水酸化ナトリウム濃度にコラーゲン分子
を曝した時のコラーゲン分子に対する効果の指標とし
て、繊維安定性を用いた。

【００９３】一定の水酸化ナトリウム濃度について、25
℃以下の処理温度では、以下の工程は、コラーゲン分
子、およびこのような分子から形成した繊維の安定性に
著しく影響を与えないことを見出したが、これは３mg/m
lのリドカインおよび0.13MのNaClの存在下35mg/mlに調
製したコラーゲンのDSC曲線データおよび不透明度測定
に基づいている。

【００９４】a) コラーゲンを溶液に入れ、それによ
り、処理すべき結合組織の表面領域を暴露させ、上記プ
リオンおよび他の感染因子を処理に曝す工程；および b) 約25℃以下の温度で、以下の一定時間および一定水
酸化ナトリウム濃度にて、コラーゲン分子の溶液を水酸
化ナトリウムと接触させる工程：1)0.5Mで80分間以内；
2)0.35Mで90分間以内；3)0.25Mで100分間以内；4)0.1M
で150分間以内。

【００９５】実施例８〜10：水酸化ナトリウム処理時間
の変化 実施例８：1.0M水酸化ナトリウム、30分間の処理時間 図９は、このコラーゲン溶液を、約20℃で約30分間にわ
たって、1.0Mの水酸化ナトリウムに曝したとき(さらに
水酸化ナトリウムをコラーゲン溶液に添加する間の15分
間低濃度の水酸化ナトリウムに曝されている)生成する
アテロペプチドコラーゲンのDSC曲線900を示す。この小
集合体繊維の大部分は、曲線902の領域に入り、約54.8
℃の融解温度を有する。しかしながら、小集合体繊維の
多くの部分は、曲線904に現れ、約46.5℃の融解温度を
示す。

【００９６】1.0Mの水酸化ナトリウムで約60分間(プラ
ス添加時間)処理した繊維のDSC曲線(図２)と、30分間
(プラス添加時間)の処理に対する図９のDSC曲線とを比
較すると、高温融解性の繊維小集合体単位と低温融解性
の繊維小集合体単位との相対量が類似していることが分
かる。30分間処理コラーゲンについて、そのコラーゲン
繊維懸濁液の不透明度は、60分間処理懸濁液の不透明度
1.10、および図３に示したコラーゲン標準繊維の不透明
度1.7と比較すると、1.03であった。

【００９７】実施例９：1.0M水酸化ナトリウム、５分間
の処理時間 図10は、このコラーゲン溶液を、約20℃で約５分間にわ
たって、1.0Mの水酸化ナトリウムに曝したとき(さらに
水酸化ナトリウムをコラーゲン溶液に添加する間の15分
間低濃度の水酸化ナトリウムに曝されている)生成する
アテロペプチドコラーゲンのDSC曲線1000を示す。今回
も、この小集合体繊維の大部分は、曲線1002の領域に入
り、約54℃の融解温度を有する。驚いたことに、小集合
体繊維の大部分は、曲線1004に引き続き存在し、約46.5
℃の融解温度を示す。それゆえ、この溶液中コラーゲン
を1.0Mの濃度の水酸化ナトリウムに曝す時間を60分間か
ら30分間、５分間へと低下させても、低温融解性の小集
合体の形成量を減らすことには役立たなかった。５分間
処理コラーゲンについて、そのコラーゲン繊維懸濁液の
不透明度は、30分間処理懸濁液の不透明度1.03、60分間
処理懸濁液の不透明度1.10と比較すると、1.05であり、
これらの物質は、全て、図３に示したコラーゲン標準繊
維(未処理)の不透明度1.7よりずっと低い不透明度を示
した。このことは、1.0Mの水酸化ナトリウム処理濃度に
ついて、処理時間を５分間に低下させることは、低温融
解性の小集合体繊維の量を低下させる(繊維の不安定性
を低下させる)のには役立たなかったことをさらに示し
ている。

【００９８】1.0Mの水酸化ナトリウムで約60分間、また
は30分間、または５分間処理した繊維のDSC曲線を比較
すると、高温融解性の繊維小集合体単位と低温融解性の
繊維小集合体単位との相対量が類似していることが分か
る。このことは、この水酸化ナトリウムが、1.0Mの濃度
では、非常に迅速にコラーゲン分子に作用し、温度を低
くしてこの作用を緩和しない限り、このコラーゲン分子
は、この水酸化ナトリウム濃度では、著しい影響を受け
ることを示している。

【００９９】実施例10：0.75M水酸化ナトリウム；30分
間の処理時間 図11は、このコラーゲン溶液を、約20℃で約30分間にわ
たって、0.75Mの水酸化ナトリウムに曝したとき(さらに
水酸化ナトリウムをコラーゲン溶液に添加する間の15分
間低濃度の水酸化ナトリウムに曝されている)生成する
アテロペプチドコラーゲンのDSC曲線1100を示す。この
小集合体繊維の塊状物は、曲線1102の領域に入り、約5
5.8℃の融解温度を有する。この小集合体繊維の大部分
は、曲線1104の領域に入り、約47.5℃の融解温度を示
す。この0.75M水酸化ナトリウム、30分間処理につい
て、そのコラーゲン繊維懸濁液の不透明度は、1.0M水酸
化ナトリウム、30分間処理の不透明度1.03と比較する
と、1.13であり、これらの物質のいずれも、図３に示し
たコラーゲン標準繊維(未処理)の不透明度1.7よりずっ
と低い不透明度を示した。

【０１００】1.0Mの水酸化ナトリウムで約30分間処理し
た繊維のDSC曲線(図９)と、0.75Mの水酸化ナトリウムで
同じ時間処理した繊維のDSC曲線を示す図11とを比較す
ると、低融解温度の小集合体繊維の部分が減少している
ことが分かる。しかしながら、0.75Mの水酸化ナトリウ
ムで処理したコラーゲン繊維中に存在する低温融解性の
小集合体繊維の量は、対照コラーゲン繊維(未処理)に対
して認められる量の２倍以上である。

【０１０１】0.5M水酸化ナトリウム処理については、60
分間の処理時間でも、小集合体部分の非常に著しい減少
が立証され(図５)、このことは、0.75M未満の水酸化ナ
トリウム濃度が特に有利であることを示す。

【０１０２】上記データを考慮すると、コラーゲン分子
に悪影響を与えることなく、少なくとも10⁵の保護を提
供する水酸化ナトリウムの濃度で、溶液中のコラーゲン
分子を処理することが明らかに可能である。

【０１０３】当業者は、上記で特定した範囲内の水酸化
ナトリウムの一定濃度に対し、また提供した濃度の間の
濃度に対し、本開示を考慮して、最小限の実験により、
処理時間を最適化し得る。

【０１０４】当業者は、先の請求の範囲で限定した本発
明の課題を含むように、本願明細書に記載の概念を拡張
し得るので、本願明細書に記載の発明は、本願明細書に
記載の好ましい実施態様に限定する意図はない。

【０１０５】

【発明の効果】組織結合物質（例えば、コラーゲン分
子）に影響を与えることなく、25℃以下の温度で、特定
の水酸化ナトリウム濃度で処理する。その結果、プリオ
ンおよび他の感染因子を不活性化して、少なくとも10⁵
の保護を与えることができた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、溶液中コラーゲンから生成したアテ
ロペプチドコラーゲン繊維の示差走査熱量測定(DSC)曲
線を示す。ここで、この溶液中のコラーゲン分子が水酸
化ナトリウムに曝される時間は、注意深く制御した。こ
の溶液中のコラーゲン分子の処理中において、最大の水
酸化ナトリウム濃度は、１Mであり、その処理温度は、
約20℃であり、1.0M濃度での処理時間は、約60分間であ
った。この水酸化ナトリウム濃度は、次いで、大容量の
４℃の水を添加することにより、直ちに、約0.11Mにま
で低下させ、続いて、塩酸で中和した。引き続いて、コ
ラーゲン繊維を溶液から沈澱させ、塩またはリドカイン
なしで、35mg/mlのタンパク質まで調製した。

【図２】 図２は、この繊維を35mg/mlのタンパク質ま
で調製したとき、３mg/mlのリドカインおよび0.13MのNa
Clが存在していたこと以外は、図１に記述の方法と同じ
方法で製造したアテロペプチドコラーゲン繊維のDSC曲
線を示す。

【図３】 図３は、溶液中コラーゲンから製造したアテ
ロペプチドコラーゲン繊維の示差走査熱量測定(DSC)曲
線を示すが、この溶液中のコラーゲン分子は、水酸化ナ
トリウムに曝さなかった。このDSC曲線は、このコラー
ゲン繊維対照試料を表わす。溶液から沈澱させたコラー
ゲン繊維を、３mg/mlのリドカインおよび0.13MのNaClの
存在下にて、35mg/mlのタンパク質まで調製した。

【図４】 図４は、ハムスタースクレイピー株263Kを含
むハムスター脳ホモジネートを用いた大脳半球間の接種
に対する、シリアハムスターの用量応答のプロットを示
す。このスクレイピー含有脳ホモジネートをプリオン不
活性化のために水酸化ナトリウムで処理しなかったハム
スターだけが、応答を示した。

【図５】 図５は、最高の水酸化ナトリウム濃度が約0.
5Mであること以外は、図１に記述の方法と同じ方法で生
成したアテロペプチドコラーゲン繊維のDSC曲線を示
す。

【図６】 図６は、最高の水酸化ナトリウム濃度が約0.
35Mであること以外は、図１に記述の方法と同じ方法で
生成したアテロペプチドコラーゲン繊維のDSC曲線を示
す。

【図７】 図７は、最高の水酸化ナトリウム濃度が約0.
25Mであること以外は、図１に記述の方法と同じ方法で
生成したアテロペプチドコラーゲン繊維のDSC曲線を示
す。

【図８】 図８は、最高の水酸化ナトリウム濃度が約0.
10Mであること以外は、図１に記述の方法と同じ方法で
生成したアテロペプチドコラーゲン繊維のDSC曲線を示
す。

【図９】 図９は、コラーゲン溶液を1.0Mの水酸化ナト
リウム濃度に曝した時間が約30分間であること以外は、
図１に記述の方法と同じ方法で生成したアテロペプチド
コラーゲン繊維のDSC曲線を示す。

【図１０】 図10は、コラーゲン溶液を1.0Mの水酸化ナ
トリウム濃度に曝した時間が約５分間であること以外
は、図１に記述の方法と同じ方法で生成したアテロペプ
チドコラーゲン繊維のDSC曲線を示す。

【図１１】 図11は、コラーゲン溶液を30分間曝した水
酸化ナトリウム濃度が0.75Mであること以外は、図９に
記述の方法と同じ方法で生成したアテロペプチドコラー
ゲン繊維のDSC曲線を示す。

フロントページの続き (72)発明者 ティモシー ティー． レバク アメリカ合衆国 カリフォルニア 94024, ロス アルトス， モラ グレン ドラ イブ 23121

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】プリオンおよび他の感染因子を不活性化し
   て、少なくとも10⁵の保護を与えるようにするための結
   合組織物質の第１の処理方法であって、該方法は、以下
   のa)およびb)の工程を包含する： a) 該結合組織物質を液体溶液に入れ、それにより、該
   結合組織分子の表面領域を暴露させ、該プリオンおよび
   他の感染因子を処理に曝す工程；および b) 該結合組織物質の液体溶液を、約25℃以下の温度
   で、該結合組織物質の性能特性に影響を与えることな
   く、該プリオンおよび他の感染因子を不活性化するのに
   充分な時間にわたって、該液体溶液中の水酸化ナトリウ
   ム濃度が約0.1M〜約0.7Mの範囲となるように、水酸化ナ
   トリウムと接触させる工程。
2. 【請求項２】前記結合組織物質が、コラーゲンである、
   請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】プリオンおよび他の感染因子を不活性化し
   て、少なくとも10⁵の保護を与えるようにするためのコ
   ラーゲンの処理方法であって、該方法は、以下のa)およ
   びb)の工程を包含する： a) 該コラーゲンを液体溶液に入れ、それにより、該コ
   ラーゲン分子の表面領域を該プリオンおよび他の感染因
   子に曝して処理する工程；および b) 該コラーゲン分子の液体溶液を、約25℃以下の温度
   で、該コラーゲンの性能特性に影響を与えることなく、
   該プリオンおよび他の感染因子を不活性化するのに充分
   な時間にわたって、該液体溶液中の水酸化ナトリウム濃
   度が約0.1M〜約0.5Mの範囲となるように、水酸化ナトリ
   ウムと接触させる工程。
4. 【請求項４】前記時間が、80分間以内である、請求項３
   に記載の方法。
5. 【請求項５】プリオンおよび他の感染因子を不活性化し
   て、少なくとも10⁵の保護を与えるようにするためのコ
   ラーゲンの処理方法であって、該方法は、以下のa)およ
   びb)の工程を包含する： a) 該コラーゲンを液体溶液に入れ、それにより、該コ
   ラーゲン分子の表面領域を該プリオンおよび他の感染因
   子に曝して処理する工程；および b) 該コラーゲン分子の液体溶液を、約25℃以下の温度
   で、該コラーゲンの性能特性に影響を与えることなく、
   該プリオンおよび他の感染因子を不活性化するのに充分
   な時間にわたって、該液体溶液中の水酸化ナトリウム濃
   度が約0.1M〜約0.35Mの範囲となるように、水酸化ナト
   リウムと接触させる工程。
6. 【請求項６】前記時間が、90分間以内である、請求項５
   に記載の方法。
7. 【請求項７】プリオンおよび他の感染因子を不活性化し
   て、少なくとも10⁵の保護を与えるようにするためのコ
   ラーゲンの処理方法であって、該方法は、以下のa)およ
   びb)の工程を包含する： a) 該コラーゲンを液体溶液に入れ、それにより、該コ
   ラーゲン分子の表面領域を該プリオンおよび他の感染因
   子に曝して処理する工程；および b) 該コラーゲン分子の液体溶液を、約25℃以下の温度
   で、該コラーゲンの性能特性に影響を与えることなく、
   該プリオンおよび他の感染因子を不活性化するのに充分
   な時間にわたって、該液体溶液中の水酸化ナトリウム濃
   度が約0.1M〜約0.25Mの範囲となるように、水酸化ナト
   リウムと接触させる工程。
8. 【請求項８】前記時間が、約100分間以内である、請求
   項７に記載の方法。
9. 【請求項９】プリオンおよび他の感染因子を不活性化し
   て、少なくとも10⁵の保護を与えるようにするためのコ
   ラーゲンの処理方法であって、該方法は、以下のa)およ
   びb)の工程を包含する： a) 該コラーゲンを液体溶液に入れ、それにより、該コ
   ラーゲン分子の表面領域を該プリオンおよび他の感染因
   子に曝して処理する工程；および b) 該コラーゲン分子の液体溶液を、約25℃以下の温度
   で、該コラーゲンの性能特性に影響を与えることなく、
   該プリオンおよび他の感染因子を不活性化するのに充分
   な時間にわたって、該液体溶液中の水酸化ナトリウム濃
   度が約0.1Mであるように、水酸化ナトリウムと接触させ
   る工程。
10. 【請求項１０】前記時間が、約150分間以内である、請
    求項９に記載の方法。