JPH08317788A - マイコプラズマ−感染した細胞培養物の汚染除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 マイコプラズマ−感染した細胞培養物の汚染
除去方法を提供する。 【解決手段】 式 【化１】 式中、Ｒ¹はメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、シクロプロピル、ビニル、２−ヒドロキシエチル、
２−フルオロエチル、メトキシ、アミノ、メチルアミ
ノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、フェニル、４−フ
ルオロフェニルまたは２,４−ジフルオロフェニルを表
わし、Ｒ²は水素、炭素原子１〜４個を有するアルキル
または（５−メチル−２−オキソ−１,３−ジオキソル
−４−イル）−メチルを表わし、Ｒ³はメチルまたは環
式アミノ基を表わし、ＡはＮまたはＣ−Ｒ⁹を表わす、
のキノロン−または１,８−ナフチリドンカルボン酸よ
りなる活性化合物の汚染除去有効量をマイコプラズマ−
感染した細胞培養物と接触させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はマイコプラズマ(mycoplasma)−感
染した細胞培養物の汚染除去のためのキノロン−及び
１,８−ナフチリドン−３−カルボン酸の使用、マイコ
プラズマ−感染した細胞培養物の汚染除去のための組成
物、並びにキノロン−及び１,８−ナフチリドン−３−
カルボン酸を含有する細胞培地に関する。

【０００２】細胞培養、殊に永続的な細胞ライン(perma
nent cell lines)は、細胞培養において多くの抑制不
能な変化を誘発し得るマイコプラズマで度々汚染され
る。バクテリア及び菌・カビ(fungi)による感染と対照
的に、マイコプラズマ感染は、ひどく汚染された細胞培
養物でも正常の増殖を示し、そして培地が透明を保持す
るために、度々見分けがつかない。

【０００３】基礎研究(例えば培養細胞における遺伝学
的及び生理学的因子)、応用研究(例えばモノクロナール
抗体を得るためのリンパ球細胞融合)並びに、なかで
も、例えば人間に投与するための生成物を得る細胞培養
のバイオテクノロジー利用における多くの目的に対し
て、マイコプラズマを含まぬ細胞培養によって操作する
必要がある。培養物がひとたびマイコプラズマで汚染さ
れれば、汚染除去を必要に応じて種々な方法で達成され
るが、多くの場合に可能であるにしても極めて困難であ
る；かくして、感染した細胞培養物は４１℃で１８時間
高熱処理に付すか[エル・ヘイフリツク(Ｌ．Ｈayflic
k)、ネイチヤー(Ｎature)１８５、７８３−７８４(１９
６０)]、細胞をブロモウラシルまたはブロモデオキシウ
リジン＋フルオロクロムヘキスト(fluorochromehoechs
t)３３２５８及びＵＶ線で処理するか［エム・マルカス
(Ｍ．Ｍarcus)等、Ｎature２８５、６５９〜６６１(１
９８０)；ケイ・ジエイ・フオウラー(Ｋ．Ｊ．Ｆowler)
等、エキスペリメンタル・セル・リサーチ(Ｅxp．Ｃel
l．Ｒes．)１４９、３０３−３０６(１９８３)］、これ
らのものを適当ならば抗生物質を加えてマクロファージ
と共に培養するか［エル・シンメルフエング(Ｌ．Ｓchi
mmelpfeng)等、Ｎature２８５、６６１−６６２(１９８
０)］、或いはこれらのものをヌードマウス(nude mous
e)による継代に付す[デイー・エヌ・ホーウエル(Ｄ．
Ｎ．Ｈowell)等、ヒユーマン・イムノロジー(Ｈuman
Ｉmmunol．)５、２３３−２３８(１９８２)］。しかし
ながら、これらの方法は常用汚染除去に対して適当でな
い。

【０００４】またマイコプラズマ−汚染された細胞培養
物及び細胞ラインの抗生物質チアムリン(tiamulin)及び
ミノサイクリン(minocycline)処理により、マイコプラ
ズマを含まぬ培養物を生ずることが報じられている。し
かしながら、特に価値ある細胞ラインにおいて完全にマ
イコプラズマを含まぬ培養を確立するために、処理の種
々な工程、細胞のクローニング(cloning)及びチエツク
を行う必要がある[ジエイ・シユミツト(Ｊ．Ｓchmidt)
及びブイ・エルフル(Ｖ．Ｅrfle)、Ｅxp．Ｃell．Ｒe
s．１５２、５６５−５７０(１９８４)]。

【０００５】今回、場合によりチアムリン及び加えてミ
ノサイクリンと共に同時に培養される細胞培養物の処理
において、細胞培養物１ml当り好ましくは１乃至１００
０μg間、殊に好ましくは２０−１００μg、殊に極めて
好ましくは５０μgの濃度における式（Ｉ）

【０００６】

【化５】

【０００７】式中、Ｒ¹はメチル、エチル、プロピル、
イソプロピル、シクロプロピル、ビニル、２−ヒドロキ
シエチル、２−フルオロエチル、メトキシ、アミノ、メ
チルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、フエニ
ル、４−フルオロフエニルまたは２,４−ジフルオロフ
エニルを表わし、Ｒ²は水素、炭素原子１〜４個を有す
るアルキルまたは(５−メチル−２−オキソ−１,３−ジ
オキソル−４−イル)−メチルを表わし、Ｒ³はメチルま
たは環式アミノ基、例えば

【０００８】

【化６】

【０００９】を表わし、Ｒ⁴は水素、炭素原子１〜４個
を有するアルキル、２−ヒドロキシエチル、アリル、プ
ロパルギル、２−オキソプロピル、３−オキソブチル、
フエナシル、ホルミル、ＣＦＣl₂−Ｓ−、ＣＦＣl₂−Ｓ
Ｏ₂−、ＣＨ₃Ｏ−ＣＯ−Ｓ−、ベンジル、４−アミノベ
ンジルまたは

【００１０】

【化７】

【００１１】を表わし、Ｒ⁵は水素またはメチルを表わ
し、Ｒ⁶は水素、炭素原子１〜４個を有するアルキル、
フエニルまたはベンジルオキシメチルを表わし、Ｒ⁷は
水素、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、アミノメ
チル、メチルアミノメチル、エチルアミノメチル、ジメ
チルアミノメチル、ヒドロキシルまたはヒドロキシメチ
ルを表わし、Ｒ⁸は水素、メチル、エチルまたは塩素を
表わし、Ｘはフツ素、塩素またはニトロを表わし、そし
てＡはＮまたはＣ−Ｒ⁹を表わし、ここで、Ｒ⁹は水素、
ハロゲン、例えばフツ素もしくは塩素、メチルまたはニ
トロを表わし、或いはまたＲ¹と一緒になって、構造式

【００１２】

【化８】

【００１３】の架橋を形成することもできる、のキノロ
ン−及び１,８−ナフチリドンカルボン酸は、チアムリ
ン及びミノサイクリンのみによる処理では成功しない付
着性細胞の培養物に度々存在するような特に耐性のマイ
コプラズマ感染の汚染除去をもたらすことが見出され
た。本方法は、培養物の永続する汚染除去を達成するた
めに、数日間の処理時間を必要とするのみである。種々
な他の工程、例えば細胞のクローニングを全体として省
くことができる。

【００１４】汚染除去のために細胞培養物１ml当り活性
化合物１〜１０００μgを用いることが有利である。

【００１５】本発明による方法に対して、シプロフロキ
サシン(ciprofloxacin)、ノルフロキサシン(norfloxaci
n)、ペフロキサシン(pefloxacin)、アミフロキサシン(a
mifloxacin)、ピアフロキサシン(pirfloxacin)、ピロキ
サシン(piroxacin)、オフロキサシン(ofloxacin)及びエ
ノキサシン(enoxacin)を用いることが殊に好ましい。

【００１６】本発明に従えば式（ＩＩ）

【００１７】

【化９】

【００１８】式中、Ｒは水素、メチル、エチルまたはβ
−ヒドロキシエチルを表わす、の１−シクロプロピル−
６−フルオロ−１,４−ジヒドロ−４−オキソ−７−ピ
ペラジノ−キノリン−３−カルボン酸並びにその製薬学
的に利用し得る酸付加塩及び水和物を用いることが好ま
しい。

【００１９】また本発明は殊に極めて好ましくは、１−
シクロプロピル−６−フルオロ−１,４−ジヒドロ−４
−オキソ−７−ピペラジノキノリン−３−カルボン酸に
よる汚染除去が、６−エテニルデカヒドロ−５−ヒドロ
キシ−４,６,９,１０−テトラメチル−１−オキソ−３
a,９−プロパノ−３aＨ−シクロペンタシクロオクテン
−８−イル［(２−(ジエチルアミノ)エチル)−チオ］−
アセテート＝チアムリン及び／又は４,７−ビス(ジメチ
ルアミノ)−１,４,４a,５,５a,６,１１,１２a−オクタ
ヒドロ−３,１０,１２,１２a−テトラヒドロキシ−１,
１１−ジオキソ−２−ナフタセンカルボキシアミド＝ミ
ノサイクリンによる細胞培養物の処理と平行して行われ
るような方法で、細胞培養物からのマイコプラズマの汚
染除去のために１−シクロプロピル−６−フルオロ−
１,４−ジヒドロ−４−オキソ−７−ピペラジノキノリ
ン−３−カルボン酸及び１−シクロプロピル−６−フル
オロ−１,４−ジヒドロ−４−オキソ−７−(４−エチル
−ピペラジノ)−キノリン−３−カルボン酸並びに実施
例の化合物を使用することに関するものである。これに
は細胞培養物１ml当りチアムリン及び／またはミノサイ
クリン１〜１０００μgを使用する必要がある。この処
理は、適当ならば活性化合物チアムリン及び／またはミ
ノサイクリンと組合せて、活性化合物１−シクロプロピ
ル−６−フルオロ−１,４−ジヒドロ−４−オキソ−７
−ピペラジノキノリン−３−カルボン酸または１−シク
ロプロピル−６−フルオロ−１,４−ジヒドロ−４−オ
キソ−７−(４−エチルピペラジノ)−キノリン−３−カ
ルボン酸が細胞培養物に７〜１４日間作用するような方
法で行われる。

【００２０】更に本発明は、マイコプラズマ−感染した
細胞培養物の汚染除去に対する組成物の製造において式
（Ｉ）及び（ＩＩ）のキノリン−及び１,８−ナフチリ
ドン−３−カルボン酸を使用すること、並びに殊に、適
当ならばこのタイプの組成物を製造するために、チアム
リン及び／またはミノサイクリンとの組合せにおいて、
１−シクロプロピル−６−フルオロ−１,４−ジヒドロ
ー４−オキソ−７−ピペラジノキノリン−３−カルボン
酸を使用することに関する。

【００２１】最後に、本発明は、式（Ｉ）及び（ＩＩ）
のキノロン−及び１,８−ナフチリドン−３−カルボン
酸を含む細胞培地並びに式（Ｉ）及び（ＩＩ）のキノロ
ン−及びナフチリドン−３−カルボン酸及び場合により
チアムリン及び／またはミノサイクリンを含む細胞培養
物に関する。

【００２２】マイコプラズマ感染が細胞培養物、特に価
値ある細胞ラインに検出された場合、適当な培養容器、
例えばプラステイク材料からできた細胞培養びん中で、
例えば１０³〜１０⁶細胞／mlの密度で、適当な培地中に
てこれらの細胞の新しい接種を行うことが適当であり且
つ有利である。次にこれらの新しく接種した細胞に、例
えばシプロフロキサシンのあらかじめ製造した溶液、並
びに場合によりチアムリン及び／またはミノサイクリン
の溶液を加えることができる。例えば抗生物質を細胞培
養基に溶解させることができ、必要に応じて、必要な容
量で細胞培養物に加えることができる；かくして、例え
ば細胞培養物約５〜２０ml中に抗生物質溶液約１００〜
５００μlをピペツト注入することが有用である。細胞
及び抗生物質を接種すれば、細胞がそれ以後の日に増殖
する;次にシプロフロキサシン並びに適当ならばチアム
リン及び／またはミノサイクリンはこの期間中にマイコ
プラズマに対するその抗感染作用を及ぼすことができ
る。細胞が密集して増殖したならば(増殖の定常期)、専
門家には公知の方法を用いてこの細胞を収穫し、そして
低細胞密度にて新しい培養器中に新たに接種することが
有利である;この目的のために新しい培地を使用すべき
であり、そして必要に応じて、シプロフロキサシン溶液
並びに適当ならばチアムリン及び／またはミノサイクリ
ン溶液を加えるべきである。

【００２３】

【実施例】

実施例１ 特異性の確認されないマイコプラズマで汚染された種々
な細胞ライン(例えばＵ２６６ヒト骨髄腫細胞及びＬ９
２９マウス線維芽細胞)の懸濁または付着細胞を、濃度
１０⁵／ml及び容量１０〜１５mlで７５cm³細胞培養びん
に接種した。使用した培地はウシ胎児血清(ＦＣＳ)１０
％、Ｌ−グルタミン(２mＭ)、ヘペス(hepes)緩衝剤(４m
Ｍ)及び２ーメルカプトエタノール(５０μＭ)を含有す
るＲＰＭＩ １６４０であった。３〜４日後、各々の場
合に培養液は定常期にあり、次にこのものを収穫した
(付着細胞の場合にはトリプシン／ＥＤＴＡ[０．２５％
／０．０２％]を使用)。次に細胞を再び新しい培地に１
０⁵／mlで接種した。

【００２４】マイコプラズマ汚染を処理するために、培
養物に次のものを加えた： a)チアムリン(１０μg／ml、４日間)及び次いでミノサ
イクリン(５μg／ml、３日間)；b)シプロフロキサシン
(５０μg／ml、７日間)；c)a)と同様のチアムリン及び
ミノサイクリン＋b)と同様のシプロフロキサシン。

【００２５】各露出時間の終了時に、抗生物質を培地で
洗浄し、細胞を更に継代に付した。処理前及び処理して
種々な時間後、細胞培養物０．１mlをマイコプラズマ検
出のためにヘイフリツク寒天に塗りつけ［Ｌ．Ｈayflic
k、テキサス・リポーツ・オン・バイオロジイー・アン
ド・メデイシン・アンド・サプリメント(Ｔexas Ｒepo
rts Ｂiol．Ｍed．)２３、補足１、２８５〜３００(１
９６５)］、そして３７℃で少なくとも１週間嫌気的に
培養した。

【００２６】使用した寒天培地(５ml／ペトリ皿)は次の
組成を有していた:ＰＰＬＯ寒天［デイフコ(Ｄifco)；
７０部］、ウマ血清(２０部)、酵母エキス[フロー(Ｆlo
w)；２５％；１０部]、グルコース(５０％;２部)、ベン
ジルペニシリン(１０００００Ｕ／ml；１部)及び酢酸タ
リウム(I)(２％;２．５部)。寒天上の典型的な「フライ
ド・エツグ・シエープ」(“fried egg shape")をもつ
集落の発生はマイコプラズマによる細胞培養物の汚染を
意味する。第１表は処理したＬ９２９細胞培養物による
結果を示す。

【００２７】第１表 チアムリン／ミノサイクリン(Ｔ／Ｍ)、シプロフロキサ
シン(Ｃ)、チアムリン−シプロフロキサシン／ミノサイ
クリン−シプロフロキサシン(Ｔ−Ｃ／Ｍ−Ｃ)で処理し
て７日後、または処理せず(φ)、種々な期間でのＬ９２
２細胞培養物中のマイコプラズマ汚染；＋＝マイコプラ
ズマ汚染あり、−＝マイコプラズマ汚染なし。

【００２８】日数 ０ ４ ７ １４ ２１ ３１ ３６ Ｔ／Ｍ − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ Ｃ − − − ＋ ＋ ＋ ＋ T-C/M-C − − − − − − − φ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 処理直後には３種の処理群のいずれにもマイコプラズマ
は検出できなかったが、チアムリン／ミノサイクリン処
理の中止後４日目にマイコプラズマが再び見出され、一
方、シプロフロキサシン処理して７日後、マイコプラズ
マは検出されなかった。これに対比して、チアムリン−
シプロフロキサシン／ミノサイクリン−シプロフロキサ
シンによる組合せ処理後１カ月以上、マイコプラズマが
検出されず、従ってこれらの細胞は汚染除去されたとみ
なさねばならない。

【００２９】実施例２ 使用した活性化合物は１−シクロプロピル−６−フルオ
ロ−１,４−ジヒドロ−４−オキソ−７−(４−エチル−
ピペラジノ)−キノリン−３−カルボン酸であり、これ
を以下に大文字Ａで示した。

【００３０】特異性の確認されないマイコプラズマで汚
染された種々な細胞ライン(例えばＵ２６６ヒト骨髄腫
細胞及びＬ９２９マウス線維芽細胞)の懸濁または付着
性細胞を、濃度１０⁵細胞／ml及び容量１０〜１５mlで
７５cm³細胞培養びんに接種した。使用した培地はウシ
胎児血清(ＦＣＳ)１０％、Ｌ−グルタミン(２mＭ)及び
ヘペス緩衝剤(４mＭ)を含有するＲＰＭＩ １６４０であ
った。３〜４日後、各々の場合に培養物は定常期にあ
り、次にこのものを収穫した(付着性細胞の場合にはト
リプシン／ＥＤＴＡ[０．２５％／０．０２％]を使
用)。次に細胞を再び新しい培地に１０⁵細胞／mlで接種
した。

【００３１】マイコプラズマ汚染を処理するために、培
養物に次のものを加えた: a)Ａ(５０μg／ml、７日間)；b)Ａ(１０μg／ml、４日
間)＋チアムリン(１０μg／ml、４日間)及び次にＡ(１
０μg／ml、３日間)＋ミノサイクリン(５μg／ml、３日
間)。

【００３２】各露出時間の終了時に、抗生物質を培地で
洗浄し、細胞を更に継代に付した。処理前及び処理して
種々な時間後、細胞培養物０．１mlをマイコプラズマ検
出のためにヘイフリツク寒天に塗りつけ［Ｌ．Ｈayflic
k、Ｔexas Ｒeports Ｂiol．Ｍed．２３、Ｓuppl．
１、２８５〜３００(１９６５)］、そして３７℃で少な
くとも１週間嫌気的に培養した。

【００３３】使用した寒天培地(５ml／ペトリ皿)は次の
組成を有していた：ＰＰＬＯ寒天(デイフコ；７０部)、
ウマ血清(２０部)、酵母エキス(フロー；２５％；１０
部)、グルコース(５０％；２部)、ベンジルペニシリン
(１０００００Ｕ／ml；１部)及び酢酸タリウム(Ｉ)(２
％；２．５部)。寒天上の典型的な「フライド・エツグ・
シエープ」をもつ集落の発生はマイコプラズマによる細
胞培養物の汚染を意味する。第２表は処理したＵ２６６
細胞培養物の結果を示す。

【００３４】第２表 チアムリン１０μg／mlと共に４日間、次にミノサイク
リン５μg／mlと共に３日間(Ｔ−Ａ／Ｍ−Ａ)、Ａ５０
μg／mlまたは１０μg／mlで処理して７日後、または処
理せず(φ)、種々な期間でのＵ２６６細胞培養物中のマ
イコプラズマ汚染;＋＝マイコプラズマ汚染あり、−＝
マイコプラズマ汚染なし。

【００３５】日 数 ０ ２１ ２８ ３５ Ａ − − − − T-A/M-A − − − − φ ＋ ＋ ＋ ＋ 未処理対照と比較して、処理の終了後１ケ月以上、いず
れの処理群にもマイコプラズマは検出されなかった。従
って、これらの細胞は汚染除去されたとみなさねばなら
ない。

【００３６】実施例３ 本実施例における培養物及び試験条件は実施例２と同様
であった。この場合、チアムリンまたはミノサイクリン
を使用せずに、Ｕ２６６細胞培養物にキノロン類のみを
用いた。

【００３７】８−クロロ−１−シクロプロピル−６−フ
ルオロー１,４−ジヒドロ−４−オキソ−７−(３−メチ
ル−１−ピペラジニル)−３−キノリンカルボン酸＝
Ｂ、８−クロロ−１−シクロプロピル−６−フルオロ−
１,４−ジヒドロ−４−オキソ−７−(１−ピペラジニ
ル)−３−キノリンカルボン酸＝Ｄ、及び８−クロロ−
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７−メチル−１,
４−ジヒドロ−５−オキソ−３−キノリンカルボン酸＝
Ｅを用いた。

【００３８】第３表 エタノールに溶解し、加えて超音波処理した物質Ｂ
(Ｂ)、Ｄ(Ｄ)またはＥ(Ｅ)の各々１０μg／ml(培養物中
のエタノール濃度０．２５％)で処理して７日後、また
は処理せず(φ)、種々な期間でのＵ２６６細胞培養物中
のマイコプラズマ汚染；＋＝マイコプラズマ汚染あり、
−＝マイコプラズマ汚染なし。

【００３９】 未処理対照と比較して、全ての処理が成功し、従って、
処理終了後、１カ月以上にわたってマイコプラズマ汚染
が検出されなかった。従って、これらの培養物は汚染除
去されたとみなさねばならない。最後に、物質Ｄ及びＥ
は培養物にいくぶん毒作用を及ぼす、即ち、処理中に細
胞の増殖が抑制されるが、しかし、処理終了後、細胞増
殖の能力における明白な減少がないことを指摘すべきで
ある。

フロントページの続き (72)発明者 ハンス−ヨアヒム・ツアイラー ドイツ連邦共和国デー5620フエルベルト 15・エルスベーカーシユトラーセ46

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 式中、Ｒ¹はメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
   ル、シクロプロピル、ビニル、２−ヒドロキシエチル、
   ２−フルオロエチル、メトキシ、アミノ、メチルアミ
   ノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、フェニル、４−フ
   ルオロフェニルまたは２,４−ジフルオロフェニルを表
   わし、Ｒ²は水素、炭素原子１〜４個を有するアルキル
   または（５−メチル−２−オキソ−１,３−ジオキソル
   −４−イル）−メチルを表わし、Ｒ³はメチルまたは環
   式アミノ基、例えば 【化２】 を表わし、ここでＲ⁴は、水素、炭素原子１〜４個を有
   するアルキル、２−ヒドロキシエチル、アリル、プロパ
   ルギル、２−オキソプロピル、３−オキソブチル、フェ
   ナシル、ホルミル、ＣＦＣｌ₂−Ｓ−、ＣＦＣｌ₂−ＳＯ
   ₂−、ＣＨ₃Ｏ−ＣＯ−Ｓ−、ベンジル、４−アミノベン
   ジルまたは 【化３】 を表わしＲ⁵は水素またはメチルを表わし、Ｒ⁶は水素、
   炭素原子１〜４個を有するアルキル、フェニルまたはベ
   ンジルオキシメチルを表わし、Ｒ⁷は水素、アミノ、メ
   チルアミノ、エチルアミノ、アミノメチル、メチルアミ
   ノメチル、エチルアミノメチル、ジメチルアミノメチ
   ル、ヒドロキシルまたはヒドロキシメチルを表わし、Ｒ
   ⁸は水素、メチル、エチルまたは塩素を表わし、Ｘはフ
   ッ素、塩素またはニトロを表わし、そしてＡはＮまたは
   Ｃ−Ｒ⁹を表わし、ここで、Ｒ⁹は水素、ハロゲン、例え
   ばフッ素もしくは塩素、メチルまたはニトロを表わし、
   或いはまたＲ¹と一緒になって、構造式 【化４】 の架橋を形成することもできる、のキノロン−または
   １,８−ナフチリドンカルボン酸よりなる活性化合物の
   汚染除去有効量をマイコプラズマ−感染した細胞培養物
   と接触させることを特徴とするマイコプラズマ−感染し
   た細胞培養物の汚染除去方法。
2. 【請求項２】 さらに細胞培養物をチタムリン及び／ま
   たはミノサイクリンで処理することからなる請求項１に
   記載の方法。