JPH08319295A - 核酸化合物及びその合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 方向性が環状骨格で固定されかつ実質的
に同一方向に向く２つの官能基を有する非核酸環状骨格
と、前記各官能基を介して前記非核酸環状骨格に結合し
た２本の核酸鎖とからなる核酸化合物。 【効果】 細胞膜透過性に優れた核酸化合物、同一分子
内での相補塩基対構造の形成を促進する核酸化合物、及
び第３の核酸鎖と三重鎖を形成し得る２本の核酸鎖を同
一分子内にもつ核酸化合物が化学合成によって得られ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞膜透過性に優
れた核酸化合物、同一分子内での相補塩基対構造の形成
を促進する核酸化合物、第３の核酸鎖と三重鎖構造の形
成を促進する核酸化合物、及びそれら核酸化合物の合成
方法、並びにそれら核酸化合物を与える化合物に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】核酸化合物としては、核酸の塩基、糖、
もしくはリン酸ジエステル部分を直接修飾して疎水性や
核酸分解酵素耐性などを高めたもの、又はリンカーを介
して疎水性基、蛍光性基、電荷中和基などの機能性基、
もしくはインターカレーションする基を有する化合物な
どを核酸の５'末端、３'末端、もしくはそれら以外の部
位に結合させたものが知られている（E. Uhlmann及び
A. Peyman、 Chemical Reviews 90巻 543-584、1990
年；F. Eckstein編、 Oligonucleotides and Analogues
−A Practical Approach、IRL Press、1991年； J. F.
Milliganら、Medicinal Chemistry 38巻 1923-1937、1
993年）。

【０００３】しかし、これらのいずれにおいても、同一
分子内での相補塩基対構造の形成を促進するような機能
を持つものは、見当たらない。また、第３の核酸鎖と三
重鎖形成能を持つように機能性基を導入したものや、疎
水性の機能性基を２本の核酸鎖の間に有するものも知ら
れていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、同一
分子内での相補塩基対構造の形成を促進する核酸化合
物、第３の核酸鎖と三重鎖構造の形成を促進する核酸化
合物、細胞膜透過性を向上させた核酸化合物、該核酸化
合物の合成方法、及び該核酸化合物を与える化合物を提
供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らは、所定の構造を有する非核酸化合
物を用いることより、効率よく一対の核酸鎖が相補塩基
対を形成する核酸化合物が得られること、第３の核酸鎖
と三重鎖構造の形成を促進する核酸化合物が得られるこ
と、及び細胞膜透過性を向上させた核酸化合物が得られ
ることを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、方向性が環状骨格で
固定されかつ実質的に同一方向に向く２つの官能基を有
する非核酸環状骨格と、前記各官能基を介して前記非核
酸環状骨格に結合した２本の核酸鎖とからなる核酸化合
物である。また、本発明は、方向性が環状骨格で固定さ
れかつ実質的に同一方向を向く２つの官能基を有する非
核酸化合物の該官能基のそれぞれに、核酸鎖を付加する
ことを特徴とする核酸化合物の合成方法である。さら
に、本発明は、下記構造式(3) 又は(4)

【０００７】

【化１１】

【０００８】（但し、Ｒ及びＲ'は水素原子又は保護基
である。）

【０００９】

【化１２】

【００１０】（但し、Ｒ及びＲ'は水素原子又は保護基
である。）で表される新規なトリテルペノイド系化合物
である。さらに、本発明は、下記構造式(5) 又は(6)

【００１１】

【化１３】

【００１２】（但し、Ｒは水素原子又は保護基であ
る。）

【００１３】

【化１４】

【００１４】（但し、Ｒは水素原子又は保護基であ
る。）で表される新規なフォスフォロアミダイト体であ
る。さらに、本発明は、下記構造式(7) 又は(8)

【００１５】

【化１５】

【００１６】（但し、Ｒは水素原子又は保護基であ
る。）

【００１７】

【化１６】

【００１８】（但し、Ｒは水素原子又は保護基であ
る。）で表される新規なチオフォスファイト体である。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の核酸化合物は、特定の２つの官能基を有する非
核酸の骨格と、その２つの官能基を介して非核酸の骨格
に結合した２本の核酸鎖とからなるものである。２本の
核酸鎖はいかなる塩基配列を有するものであってもよい
が、互いに相補的であるものや、１本の核酸鎖は第３の
核酸鎖に対して相補的であり、それらが形成する相補塩
基対と残りの１本の核酸鎖とが三重鎖を形成し得るもの
が好ましいものである。ここでいう第３の核酸鎖とは、
２つの官能基を介して非核酸の骨格に結合した上記２本
の核酸鎖以外の核酸鎖であって、上記非核酸の骨格に結
合していない核酸鎖を意味し、一般的には末端フリーと
なっているものをいう。

【００２０】非核酸の骨格は環状の構造を有しており
（従って、この非核酸の骨格を非核酸環状骨格とい
う。）、２つの官能基は実質的に同一方向に向き得る状
態でこの非核酸環状骨格に固定されて、その方向性が定
められている。通常、相補塩基対や三重鎖を形成してい
る核酸の鎖間の距離は、0.8 〜1.2 nmであるため、上記
非核酸環状骨格の２つの官能基間の距離は0.6 〜1.4 nm
であるのが好ましく、特に0.8 〜1.2 nmであるのが好ま
しい。

【００２１】このような非核酸環状骨格としては、トリ
テルペノイド骨格、ステロイド骨格、縮合多環芳香族を
有する骨格、アダマンタン骨格、多環系脂環族炭化水素
を有する骨格、ヘテロ環を有する骨格、金属錯体を有す
る骨格、天然物由来の骨格等が挙げられる。トリテルペ
ノイド骨格としては、例えば下記の構造式(1')又は(2')

【００２２】

【化１７】

【００２３】

【化１８】

【００２４】で表されるものや、下記の構造式(9)
（(1')におけるＨの立体構造が逆のもの）又は(10)
（(2')におけるＨの立体構造が逆のもの）

【００２５】

【化１９】

【００２６】

【化２０】

【００２７】で表されるものが挙げられる。上記構造式
(1')で表されるトリテルペノイド骨格に２本の核酸鎖、
特に互いに相補的な２本の核酸鎖、又は第３の核酸鎖と
三重鎖を形成し得る２本の核酸鎖を結合してなる核酸化
合物は、例えば以下のようにして合成することができ
る。 ａ）まず、一般に市販されている、下記の構造式(11)

【００２８】

【化２１】

【００２９】で表されるグリシルレチン酸を、メタノー
ルを用いてエステル化する。エステル化するには、グリ
シルレチン酸を十分な量のメタノールに溶かすととも
に、濃硫酸を適量加えて還流する。好ましくは、これを
２回以上繰り返す。次いで、メタノールをエバポレート
し、その後、例えばシリカゲルショートカラムにかけ
て、下記の構造式(12)

【００３０】

【化２２】

【００３１】で表される化合物（これを化合物(12)とい
う。）を得る。

【００３２】ｂ）化合物(12)を、水素化ジイソブチルア
ルミニウム（ＤＩＢＡＬ）と反応させる。それには、例
えば、窒素雰囲気下、化合物(12)を十分な量の溶媒、例
えば塩化メチレンに溶かし、−60〜−78℃に冷却してDI
BAL（1.5M程度のトルエン溶液として）を加えた後、室
温に戻し、約一晩撹拌する。反応を停止させるには、塩
化メチレンの約1/3 程度の量の水を加えればよい。反応
停止後、溶媒をエバポレートする。好ましくは、残渣に
再度塩化メチレン等の溶媒を加え、固体を十分に砕いて
撹拌した後、固体を濾過し、溶媒をエバポレートする。

【００３３】次いで、このようにして得られた粗アルコ
ールを酸化する。酸化するには、粗アルコールを溶媒、
例えば塩化メチレンに溶かすとともに、適量のMnO₂を加
え、室温下で約一晩撹拌する。得られる固体を濾過した
後、溶媒をエバポレートし、残渣を分離精製する。分離
精製は、例えばプレパラティブＴＬＣを用いて行うこと
ができる。このようにして得られる化合物は、下記の構
造式（１３）

【００３４】

【化２３】

【００３５】で表される（これを化合物（１３）とい
う）。この化合物(13)のＡ環上にある２級（３位）のＯ
Ｈ基とＥ環上にある１級（30位）のＯＨ基は、実質的に
同方向を向くことが可能であり、それらの距離は約 1.2
5nm であるため、構造的に無理なく同一分子内での相補
塩基対構造を形成すること、又は第３の核酸鎖とで三重
鎖を形成し得る２本の核酸鎖を同一分子内に取り込むこ
とができる。他の方法として、工程ａ）及びｂ）を次の
ようにして行うこともできる。 ａ'）一般に市販されている、下記の構造式(11)

【００３６】

【化２４】

【００３７】で表されるグリシルレチン酸を、水素化リ
チウムアルミニウムで還元する。還元するには、無水テ
トラヒドロフラン中で、好ましくは室温下で一晩撹拌す
る。過剰の水素化リチウムアルミニウムを水と水酸化ナ
トリウム水溶液とで分解した後、その溶液を濃縮乾固し
て白色の結晶を得る。これをメタノールで再結晶させ、
下記の構造式(14)

【００３８】

【化２５】

【００３９】で表される化合物（これを化合物(14)とい
う。）を得る。 ｂ'）化合物(14)を酸化する。酸化するには、化合物(1
4)を溶媒、例えば塩化メチレンに溶かすとともに、適量
のMnO₂を加え、室温下で約一晩撹拌する。生成した固体
を濾過した後、溶媒を濃縮乾固し、得られた白色の結晶
を例えばメタノールなどから再結晶させると、化合物(1
3)が得られる。

【００４０】このｂ'）の工程において、化合物(14)を
脱水することもできる（工程ｂ''））。即ち、化合物(1
4)を例えばメタノール及び塩酸の混合物に溶かし、室温
で好ましくは１時間程度撹拌した後、濃縮乾固して白色
結晶を得る。これを例えばメタノールなどから再結晶さ
せると、下記の構造式（１５）

【００４１】

【化２６】

【００４２】で表される化合物（これを化合物（１５）
という。）が得られる。 ｃ）得られた化合物(13)又は(15)の30位の炭素（Ｃ）に
結合した水酸基の反応性を低下させるために、保護基を
導入する。そのような保護基としては、公知のものが種
々利用でき、具体的に例示すれば、トリチル基、メトキ
シトリチル基、ジメトキシトリチル基、アセチル基、ベ
ンゾイル基、p-アニソイル基、トリブチリル基等が挙げ
られる。ここでは、保護基としてジメトキシトリチル基
を導入する例を挙げて説明する。

【００４３】化合物(13)又は(15)を、塩化4,4'-ジメト
キシトリチル（ＤＭＴｒＣｌ）と反応させる。それに
は、例えば、まず化合物(13)又は(15)を乾燥ピリジンに
溶かしてエバポレートし、乾燥させる。好ましくは、こ
の工程を３〜４回繰り返す。乾燥した化合物(13)又は(1
5)をもう一度乾燥ピリジンに溶かし、塩化4,4'-ジメト
キシトリチル、ジメチルアミノピリジン及びトリエチル
アミンを溶かし、窒素雰囲気下、室温で約一晩撹拌す
る。もしくは、塩化4,4'-ジメトキシトリチルを加え、
窒素雰囲気下、室温で約６時間撹拌する。いずれの場合
も、塩化4,4'-ジメトキシトリチルの添加量は、化合物
(13)又は(15)に対して２当量程度であるのが好ましく、
ジメチルアミノピリジンの添加量は、化合物(13)又は(1
5)に対して0.01当量程度であるのが好ましい。また、ト
リエチルアミンの添加量は、化合物(13)又は(15)に対し
て1.5 当量程度であるのが好ましい。これを、例えば酢
酸エチル−水に分配し、有機層を例えば無水Na₂SO₄で乾
燥させる。その後、溶媒をエバポレートし、精製する。
精製は、例えばシリカゲルカラムを用いて行うことがで
きる。このようにして得られる化合物は、下記の構造式
(3')又は(4')

【００４４】

【化２７】

【００４５】（ここでは、ＲはＤＭＴｒ、Ｒ'はＨを表
す。）

【００４６】

【化２８】

【００４７】（ここでは、ＲはＤＭＴｒ、Ｒ'はＨを表
す。）で表される（それぞれ化合物(3')，化合物(4')と
いう）。 ｄ）化合物(3')又は(4')を、フォスフォロアミダイト、
例えば2-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピル
フォスフォロアミダイトと反応させる。2-シアノエチル
-N,N,N',N'-テトライソプロピルフォスフォロアミダイ
トは、下記の構造式(16)

【００４８】

【化２９】

【００４９】で表される。上記反応を行うには、例え
ば、まず化合物(3')又は(4')を乾燥アセトニトリルに溶
かしてエバポレートし、乾燥させる。好ましくは、この
工程を２〜３回繰り返す。これを、例えばアルゴン雰囲
気下で、アセトニトリルに溶かし、2-シアノエチル-N,
N,N',N'-テトライソプロピルフォスフォロアミダイトを
加えるとともに、テトラゾールを加えて、一晩程度反応
させる。2-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピ
ルフォスフォロアミダイトの添加量は化合物(3')又は
(4')に対して1.1 当量程度であるのが好ましく、テトラ
ゾールの添加量は化合物(3')又は(4')に対して1.1 当量
程度であるのが好ましい。

【００５０】得られた反応物を、例えば酢酸エチル−飽
和炭酸水素ナトリウム水に分配し、酢酸エチル層を無水
Na₂SO₄で乾燥後、エバポレートして濃縮する。このよう
にして得られる化合物は、下記の構造式(5')又は
（６’）

【００５１】

【化３０】

【００５２】（ここでは、ＲはＤＭＴｒを表す。）

【００５３】

【化３１】

【００５４】（ここでは、ＲはＤＭＴｒを表す。）で表
される（それぞれ化合物（５’）、化合物(6')とい
う）。 ｅ）最後に、化合物(5')又は(6')を溶媒、例えばアセト
ニトリル−塩化メチレンに溶かし、通常のＤＮＡ合成機
またはＲＮＡ合成機などを用いて核酸塩基を結合させ
る。この核酸塩基の結合は、所望の段階で行うことがで
きる。例えば、２本の核酸鎖のうちの１本の合成が終わ
った段階で、それを化合物(5')又は(6')に結合させ、続
いて他方の核酸塩基を合成し、結合させることができ
る。また別の方法として、工程ｃ）の前まで上のいずれ
かの方法と同様にして合成を行い、化合物(13)又は(15)
を得た後、これを例えばクロロフォルムに溶かし、これ
と例えば下記の構造式(17)

【００５５】

【化３２】

【００５６】で表される2-クロロフェノキシ-2,5-ジメ
チルチオクロロフォスフィンとを反応させて、下記の構
造式(7')又は(8')

【００５７】

【化３３】

【００５８】（ここでは、ＲはＤＭＴｒを表す。）

【００５９】

【化３４】

【００６０】（ここでは、ＲはＤＭＴｒを表す。）で表
される化合物（それぞれ化合物(7')、化合物(8')とい
う。）を得ることができる。化合物(7')又は(8')が得ら
れたら、上記と同様にして核酸塩基を結合させればよ
い。

【００６１】合成で得られたＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖又は核
酸化合物は、通常のプロトコールで脱保護し、逆相型の
充填剤を用いるＨＰＬＣや、セップパックなどの簡易型
カラム、又はイオン交換型の充填剤を用いるＨＰＬＣや
その他の分析手段を用いて精製することができる。逆相
ＨＰＬＣによる精製は、例えばＣ18カラム（和光社製）
を0.05M トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（pH
7.0 ）又は0.05M ギ酸アンモニウムに対してアセトニト
リルを増加させる溶媒条件で行うことができる。

【００６２】本実施例では、フォスフォロアミダイトを
使用しているため、フォスフォロアミダイト法を用いる
ことができる。フォスフォロアミダイト法とは、修飾デ
オキシリボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドの
３'末端にシアノエチル基などで保護したフォスフォロ
アミダイトを結合した試薬を用いて、別の修飾デオキシ
リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、オリゴ修飾
デオキシリボヌクレオチド、オリゴ修飾リボヌクレオチ
ド等の５'末端に縮合させることを基本とするオリゴデ
オキシリボヌクレオチドやオリゴリボヌクレオチドなど
の核酸関連化合物の合成法である。

【００６３】フォスフォロアミダイト法は、例えばアプ
ライドバイオシステム社製の381A DNA合成機又は394 DN
A/RNA 合成機などを用いて、同社の手順書又はF.Eckste
in編、Oligonucleotides and Analogues: A Practical
Approach、IRL Press 、1991年を参照して行うことがで
きる。また、チオフォスファイトを用いるチオフォスフ
ァイト法によっても、同一の構造を持つ核酸化合物を得
ることができる。このようにして得られる核酸化合物
は、下記の構造式(18a) 又は(18b)

【００６４】

【化３５】

【００６５】（式中、Ｘ及びＹは互いに相補的な、もし
くは第３の核酸鎖と三重鎖を形成し得るＤＮＡ鎖、ＲＮ
Ａ鎖又は核酸鎖を表す。）

【００６６】

【化３６】

【００６７】（式中、Ｘ及びＹは互いに相補的な、もし
くは第３の核酸鎖と三重鎖を形成し得るＤＮＡ鎖、ＲＮ
Ａ鎖又は核酸鎖を表す。）を有する。ここで、互いに相
補的なＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖又は核酸鎖（Ｘ、Ｙ）は、実
質的に相補的であればいかなる配列であってもよい。ま
た、第３の核酸鎖と三重鎖を形成し得るＤＮＡ鎖、ＲＮ
Ａ鎖又は核酸鎖（Ｘ、Ｙ）は、第３の核酸鎖と実質的に
三重鎖を形成することができるものであれば、いかなる
配列であってもよい。

【００６８】この核酸化合物では、ＸとＹとが互いに相
補的な、もしくは第３の核酸鎖と三重鎖を形成し得るＤ
ＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖、ＤＮＡとＲＮＡをともに含有する核
酸鎖、又はフォスフォロチオエート型などの修飾された
ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖もしくはそれらをともに含有する核
酸鎖として一定の空間的位置関係にあり、それを規定す
るものとして、Ｘ及びＹの端部に構造式(1) 又は(2) を
有する化合物が結合している。即ち、本核酸化合物で
は、構造式(1) 又は(2) で表される骨格が、いわゆるヘ
アピン構造におけるループ部分に相当することとなる。
この構造式(1) 又は(2) で表される骨格を有する核酸化
合物は、細胞膜透過性に優れている。

【００６９】以上、構造式(1) 又は(2) で表される骨格
を含有する核酸化合物の合成方法について一例を挙げて
説明したが、本発明ではこれに限定されることなく、種
々の化合物を用いて同一分子内での相補塩基対構造の形
成又は第３の核酸鎖と三重鎖構造の形成を促進する核酸
化合物、及び細胞膜透過性に優れた核酸化合物を合成す
ることができる。

【００７０】本発明の核酸化合物は、細胞膜透過性に優
れ、細胞内取り込みが大きいため、優れたアンチセンス
核酸効果が得られ、医薬や診断薬として有用である。特
に、同一分子内での相補塩基対構造の形成を促進する核
酸化合物は核酸分解酵素耐性に優れているため、医薬や
診断薬として有用であり、また、第３の核酸鎖と三重鎖
を形成し得る核酸化合物は蛋白質発現阻害効率が高いた
め、いわゆるアンチセンス核酸法の応用などとして病因
遺伝子の発現阻害の目的などに用いることができる。

【００７１】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

【００７２】（実施例１） ａ）グリシルレチン酸（18β-Glycyrrhetinic acid、Al
drich 社製、G1,010-5）５ｇ（10.6mmol）をメタノール
200 mlに溶かし、濃硫酸４mlを加え、３時間還流した。
さらに濃硫酸４mlを加え、３時間還流した。メタノール
をエバポレートし、シリカゲルショートカラム（シリカ
ゲル100 ｇ、ヘキサン−酢酸エチル＝１：４、Wako-gel
C200 ）にかけ、下記の構造式（１２）

【００７３】

【化３７】

【００７４】で表される粗メチルエステルを得た。その
収量は４．０ ｇ、収率は77.7％であった。グリシルレ
チン酸についての ¹Ｈ ＮＭＲ（CDCl₃,200MHz）の測定
結果を図１に、得られた化合物についての ¹Ｈ ＮＭＲ
（CDCl₃,200MHz）の測定結果を図２に示す。

【００７５】ｂ）構造式(12)で表される化合物1.89ｇ
（3.9 mmol）を窒素雰囲気下、塩化メチレン30mlに溶か
し、−78℃に冷却後、DIBAL（1.5Mトルエン溶液、7.9 m
l、11.8mmol）を加え、室温に戻し、一晩撹拌した。10m
lの水を加えて反応を停止し、溶媒をエバポレートし
た。残渣に塩化メチレンを加え、固体を良く砕き、撹拌
した後、固体を濾過し除いた。次いで塩化メチレンをエ
バポレートし、粗アルコールを得た。これを40mlの塩化
メチレンに溶かし、MnO₂２ｇを加え、室温下で一晩撹拌
し、酸化した。固体を濾過した後、塩化メチレンをエバ
ポレートし、残渣をプレパラティブＴＬＣ（分離条件：
ヘキサン−酢酸エチル＝１：４、Rf＝0.7 、メルク社
製）で分離精製し、下記の構造式（１３）

【００７６】

【化３８】

【００７７】で表される新規化合物（化合物（１３））
を得た。その収量は806 mg、収率は45％であった。得ら
れた化合物(13)についての ¹Ｈ ＮＭＲ（CDCl₃,200MH
z）の測定結果を図３に、ＦＡＢ（positive）の測定結
果を図４に示す。図４より、M+1=458であることが分か
った。

【００７８】ｃ）化合物(13) 806mg（1.77mmol）を乾燥
ピリジンに溶かしてエバポレートし、乾燥させた（20ml
×３回）。次いで、乾燥させた化合物(13)をもう一度乾
燥ピリジン（30ml）に溶かし、さらに塩化4,4'−ジメト
キシトリチル960 mg（2.83mmol）、ジメチルアミノピリ
ジン20mg（0.16mmol）及びトリエチルアミン380 ml（2.
8 mmol）を上記乾燥ピリジン30mlに加え、窒素雰囲気
下、室温で一晩撹拌した。得られたものを酢酸エチル−
水に分配し、有機層を無水Na₂SO₄で乾燥後、エバポレー
トした。これをシリカゲルカラム（条件；メタノール：
塩化メチレン＝５：95）により精製し、下記の構造式
（１９）

【００７９】

【化３９】

【００８０】で表される化合物を得た。その収量は７３
０ ｍｇ、収率は54％であった。得られた化合物につい
ての ¹Ｈ ＮＭＲ（CDCl₃,200MHz）の測定結果を図５に
示す。

【００８１】ｄ）構造式(19)で表される化合物730 mg
（0.96mmol）を乾燥アセトニトリルに溶かしてエバポレ
ートし、乾燥させた（５ml×３回）。これをアルゴン雰
囲気下、アセトニトリル２mlに溶かし、2-シアノエチル
-N,N,N',N'-テトライソプロピルフォスフォロアミダイ
ト（Aldrich 社製、30,599-5）285 mg（1.06mmol）を加
え、1Hテトラゾール２ml（0.5M）を加えて、室温下で一
晩反応させた。その後、酢酸エチル−飽和炭酸水素ナト
リウム水に分配し、酢酸エチル層を無水Na₂SO₄で乾燥
後、エバポレートして濃縮し、下記の構造式（２０）

【００８２】

【化４０】

【００８３】で表される新規化合物を得た。その収量は
７４６ ｍｇ、収率は81％であった。

【００８４】ｅ）構造式(20)で表される化合物をアセト
ニトリル−塩化メチレン（１：１）に溶かし、0.1M溶液
とした。これをＤＮＡ合成機（ABI 381A）に装着し、通
常の合成サイクル（カップリング30秒、ヨウ素酸化20
秒、キャッピング15秒、脱DMTr基100 秒）でＤＮＡ合成
した。合成するＤＮＡ鎖としては、5'-d(CTAGGC)- とそ
れに相補的な3'-d(GATCCG)- を使用した。合成ＤＮＡは
通常のプロトコールで脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより精
製した。得られた新規な核酸化合物は、下記の構造式
（２１）

【００８５】

【化４１】

【００８６】を有すると考えられる（これを核酸化合物
（２１）という）。

【００８７】上記の構造を有することを確認するため
に、核酸化合物に対して蛇毒フォスファターゼ及びアル
カリフォスファターゼを作用させて酵素分解した。具体
的には、0.1 mM（塩基濃度）の核酸化合物(21)、50mMの
カコジル酸ナトリウム（pH７）、蛇毒フォスファターゼ
0.03unit及びアルカリフォスファターゼ10unitを含む溶
液を一晩37℃でインキュベートした。

【００８８】ＨＰＬＣ（カラム：Ｃ18、溶媒：ギ酸アン
モニウム50mM，アセトニトリル０→50％／30分、流速：
1.5 ml/min、検出：254 nm(UV)）による分析の結果、ヌ
クレオチドCTAGGC（GATCCG）と、下記の構造式（２２）

【００８９】

【化４２】

【００９０】で表される化合物（これを化合物（２２）
という。）が得られた。分析結果は図６に示す。なお、
標品としては、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシグ
アノシン（ｄＧ）、デオキシチミジン（ｄＴ）及びデオ
キシアデノシン（ｄＡ）（全てヤマサ醤油(株)製）を用
いた。

【００９１】また、得られた化合物(22)についての ¹Ｈ
ＮＭＲ（D₂O,500MHz）の測定結果を図７に、ＦＡＢ（p
ositive）の測定結果を図８に示す。図８の結果より、M
+1=787 、M+Na=807であった。これらの結果から、得ら
れた核酸化合物(21)は、構造式(21)を有することが分か
る。

【００９２】さらに、核酸化合物(21)の融解点を測定し
た。即ち、緩衝液として10mMリン酸ナトリウム（pH7.
0）を用い、核酸濃度は塩基濃度をもとに0.05mMとし、
２℃／分で昇温して測定した。その結果、核酸化合物(2
1)の核酸塩基部分に相当する２種類の６量体の等モル混
合物では、その融解点は20.6℃であったが、核酸化合物
(21)の融解点は71.3℃であった。この結果より、核酸化
合物(21)は、同一分子内での相補塩基対の形成を促進し
ていることがわかる。

【００９３】（実施例２）化合物(13)を得るために、実
施例１における工程ａ）及びｂ）に代えて、工程ａ'）
及びｂ'）を行った。 ａ'）3.0 ｇの水素化リチウムアルミニウムを100 mlの
無水テトラヒドロフランに懸濁し、これに2.0 ｇのグリ
シルレチン酸（18β-Glycyrrhetinic acid、Aldrich 社
製、G1,010-5）を含む無水テトラヒドロフラン溶液を加
え、室温で一晩攪拌した。過剰の水素化リチウムアルミ
ニウム及び金属錯体を分解させるために、３mlの水、次
いで３mlの15％水酸化ナトリウム水溶液、さらに９mlの
水を順次加え、この溶液を濃縮乾固した。これをメタノ
ールから再結晶することにより、下記の構造式(14)

【００９４】

【化４３】

【００９５】で表される化合物(14) 1.1ｇが白色結晶と
して得られた（収率57％）。この化合物(14)の分析結果
を以下に示す。

【００９６】¹Ｈ ＮＭＲ（CDCl₃,200MHz）δ 0.81(s,3
H),0.84(s,3H),0.88(s,3H),0.98(s,3H),1.09(s,3H),1.2
1(s,3H),1.37(s,3H),0.80-2.05(m,21H),3.22(dd,1H,J=
9.6,5.7Hz),3.47(d,1H,J=10.8Hz),3.54(d,1H,J=10.8H
z),4.28(brs 1H),5.29(d,1H,J=4.2Hz).¹³ Ｃ ＮＭＲ（CDCl₃,100MHz）δ15.71,18.10,18.70,19.
37,25.26,26.38,27.04,27.12,27.37,28.35,28.45,29.5
5,32.27,33.21,35.55,36.34,38.29,38.68,38.75,39.50,
41.86,42.52,46.49,52.48,55.75,66.63,66.74,79.06,12
6.04,147.97 ＨＲ ＦＡＢＭＳ（positive ion）m/z 459.3838(M+H,45
9.3838 calcd for C₃₀H₅₁O₃). ｂ'）工程ａ'）で得られた化合物(14)1.1gを、200 mlの
塩化メチレンに溶かした。この溶液に7.0gのMnO₂を加
え、室温で一晩攪拌した。その後MnO₂を濾取し、濾液を
濃縮乾固した。これをメタノールから再結晶することに
より、下記の構造式(13)

【００９７】

【化４４】

【００９８】で表される化合物(13) 553mgが白色結晶と
して得られた（収率51％）。この化合物(13)の分析結果
を以下に示す。

【００９９】¹Ｈ ＮＭＲ（CDCl₃,200MHz）δ0.78(s,3
H),0.83(s,3H),0.89(s,3H),0.97(s,3H),1.09(s,3H),1.1
0(s,3H),1.35(s,3H),0.62-2.10(m,19H),2.30(s,1H),2.7
5(m,1H),3.20(dd,1H,J=9.8,5.7Hz),3.44(d,1H,J=11.2H
z),3.59(d,1H,J=11.2Hz),5.56(s,1H).¹³ Ｃ ＮＭＲ（CDCl₃,100MHz）δ15.56,16.35,17.46,18.
69,23.39,26.37,26.70,27.27,27.32,28.07,28.56,29.3
8,32.28,32.74,35.41,35.92,37.07,39.11,40.29,43.39,
45.37,46.98,50.80,54.92,61.76,66.21,79.04,128.31,1
69.87,200.25 ＨＲ ＦＡＢＭＳ（positive ion）m/z 457.3681(M+H,45
7.3681 calcd for C₃₀H₄₉O₃).

【０１００】（実施例３）化合物(15)を得るために、実
施例２における工程ｂ'）に代えて、工程ｂ''）を行っ
た。 ｂ''）1.1 ｇの化合物(14)を、20mlのメタノールと１ml
の１Ｎ塩酸との混合物に溶かし、室温で１時間攪拌し
た。得られた溶液を濃縮乾固し、メタノールから再結晶
することにより、下記の構造式(15)

【０１０１】

【化４５】

【０１０２】で表される化合物(15) 237 mg が白色結晶
として得られた（収率22％）。この化合物(15)の分析結
果を以下に示す。

【０１０３】¹Ｈ ＮＭＲ（CDCl₃,200MHz）δ0.81(s,3
H),0.87(s,3H),0.98(s,3H),1.03(s,3H),1.13(s,3H),1.1
6(s,3H),1.55(s,3H),0.6-2.1(m,19H),3.17-3.27(m,2H),
3.44-3.53(m,2H),5.49(d,1H,J=5.5Hz),5.56(d,1H,J=5.5
Hz) ＦＡＢＭＳ（positive ion）ｍ／ｚ ４４１（Ｍ＋Ｈ，
Ｃ_３０Ｈ_４９Ｏ_２）．

【０１０４】（実施例４）使用するＤＮＡ鎖を変更する
以外、実施例１と同様にして下記の構造式（２３）

【０１０５】

【化４６】

【０１０６】で表される核酸化合物（核酸化合物(23)）
を合成・精製し、その三重鎖形成能を調べた。即ち、核
酸化合物(23)と塩基配列(24) ５'−ｄ（ＡＡＡＧＡＡＡＧＡ） …(24) を有する核酸鎖（核酸鎖(24)）との相互作用を、塩基配
列(25) ５'−ｄ（ＴＣＴＴＴＣＴＴＴ） …(25) を有する核酸鎖（核酸鎖(25)）と核酸鎖(24)との相互作
用、及び塩基配列(26) ５'−ｄ（ＴＴＴＣＴＴＴＣＴ） …(26) を有する核酸鎖（核酸鎖(26)）の存在下における核酸鎖
(25)と核酸鎖(24)との相互作用と比較した。

【０１０７】ここで、塩基配列(24)は核酸化合物(23)の
３'末端側の塩基配列の半分と相補的な配列であり、塩
基配列(25)は核酸化合物(23)の３'末端側の塩基配列の
半分と同一の配列である。また、塩基配列(26)は核酸化
合物(23)の５'末端側の塩基配列の半分と同一の配列で
ある。核酸鎖(26)は、核酸化合物(23)の３'末端側の核
酸鎖と核酸鎖(24)とが形成する二重鎖、又は核酸鎖(25)
と核酸鎖(24)とが形成する二重鎖にさらに結合し、三重
鎖を形成し得る。

【０１０８】これら核酸化合物−核酸鎖間及び核酸鎖−
核酸鎖間の相互作用を、紫外吸収分光法及び円二色性分
光法を用いて調べた。具体的には、緩衝液として 100mM
塩化ナトリウムを加えた10mMリン酸ナトリウム（pH7.
0）を用い、核酸濃度は各化合物濃度をもとに４μMと
し、紫外吸収スペクトル及び円二色性スペクトルを温度
制御下で測定した。また、紫外吸収スペクトルを測定す
る際に、温度を0.5 ℃／分で昇温及び降温させ、二重鎖
構造もしくは三重鎖構造などを形成して相互作用してい
る核酸鎖の融解温度を求めた。

【０１０９】その結果、核酸化合物(23)と核酸鎖(24)と
を混合した場合(a) の融解温度は27.4℃であり、核酸鎖
(24)と核酸鎖(25)とを混合した場合(b) の融解温度（1
8.0℃）や、核酸鎖(24)、核酸鎖(25)及び核酸鎖(26)の
三者を混合した場合(c) の融解温度（16.8℃）に比べ、
明らかに高かった。この結果は、(b) や(c) の場合に比
べ、(a) 場合には化合物間の相互作用が強まっているこ
とを示す。

【０１１０】融解温度における吸光度の変化、即ち融解
温度における高温側の吸光度（換言すれば一重鎖ランダ
ムコイル状態における吸光度の値Ａ：図９で融解温度以
上の温度において吸光度変化が温度変化に対し直線とな
った部分（Ｕ線）を融解温度まで外挿した点における吸
光度）と融解温度における低温側の吸光度（換言すれば
核酸鎖同士が二重鎖もしくは三重鎖などを形成して相互
作用している状態における吸光度の値Ｂ：図９で融解温
度以下の温度で吸光度変化が温度変化に対し直線となっ
た部分（Ｌ線）を融解温度まで外挿した点における吸光
度）との差（ΔＡ＝Ａ−Ｂ）を融解温度における高温側
の吸光度の値Ａで除した値（ΔＡ／Ａ）は、その物理学
的意味より、二重鎖状態から一重鎖ランダムコイル状態
への転移と三重鎖状態から一重鎖ランダムコイル状態へ
の転移とでは異なることが予想される。

【０１１１】算出した結果、(a) におけるΔＡ／Ａは0.
188 であり、(b) におけるΔＡ／Ａは0.101 であり、
(c) におけるΔＡ／Ａは0.097 であった。この結果よ
り、(a)の場合の値は(b) の場合の値に比べて有意に大
きく、さらに(b) と(c) とでは有意な差はほとんどな
く、実質的に一致していると考えられる。このことは、
(b)の場合には融解温度以下での二重鎖状態の可能性が
専ら考えられるのに対し、(a) の場合には融解温度以下
で二重鎖状態以外の状態をとっていること、そしてその
状態は、二重鎖状態よりもスタッキングが進行した状態
であることを示す。

【０１１２】さらに、10℃における(a) 、(b) 及び(c)
の場合の円二色性スペクトルを図10に示す。図10から分
かるように、(a) の場合には211nm に負のバンドが認め
られるが、そのようなバンドは(b) や(c) の場合には認
められない。三重鎖構造が形成されている場合には、21
0nm 付近に負のバンドが認められることが知られている
（D. M. Grayら、Methods in Enzymology 246巻 19-3
4、1995年）。上述した２つの実験結果をも踏まえて円
二色性スペクトルの結果を解析すると、(a) の場合に見
られる211nm 付近の負のバンドは、三重鎖構造に起因す
ると結論付けることができる。

【０１１３】以上の実験結果より、トリテルペノイド骨
格を含有する核酸化合物(23)は、それが有する一方のオ
リゴ核酸塩基配列（本実施例では３'末端側であるが、
設計の仕方により５'末端側とすることもできる。）に
相補的なオリゴ核酸鎖とワトソン−クリック型水素結合
を介して二重鎖を形成し、さらに核酸化合物(23)が有す
るもう一方のオリゴ核酸鎖とフーグスティン型水素結合
を介して相互作用をし、全体として三重鎖を形成し得る
ことが分かった。

【０１１４】（実施例５）使用するＤＮＡ鎖を変更する
以外、実施例１と同様にして下記の構造式（２７）

【０１１５】

【化４７】

【０１１６】で表される核酸化合物（核酸化合物（２
７））を合成・精製した。ただし、トリテルペノイド体
から５'方向にかけてのリン酸ジエステル結合をフォス
フォロチオエート型結合とするために、Beaucage試薬
（[3H]1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide）を用いて
合成を行った。

【０１１７】上記化合物を取り込ませた場合における取
り込み量の増加を、上記の核酸鎖のみを細胞に取り込ま
せた場合と対照として比較した。対照として、塩基配列
(28) ５'−ｄ（Ｔ^*Ｇ^*Ｇ^*Ｔ^*Ｇ^*Ａ^*Ｇ^*Ｇ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｇ^*Ａ^*Ｔ^*Ｃ^*Ｃ^*Ｇ^*Ｃ^*Ａ^*Ｔ） …(28) （*はフォスフォロチオエート型結合を示す）を有する
核酸鎖（核酸鎖(28)）（すべてのリン酸ジエステル結合
は、フォスフォロチオエート型結合である。）を合成・
精製した。

【０１１８】得られた核酸化合物(27)及び核酸鎖(28)の
５'末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと［γ−
³²Ｐ］ＡＴＰ (10mCi/ml) で標識し、ヒト肺癌由来のＡ
５４９細胞への取り込みを検討した。この細胞内取り込
みを核酸化合物の膜透過性の評価の指標とした。標識
は、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰと上記化合物とを37℃で一晩イ
ンキュベートすることにより行った。

【０１１９】Ａ５４９細胞への核酸化合物(27)及び核酸
鎖(28)の取り込みは、次のようにして調べた。即ち、Ａ
５４９細胞を37℃、５％ＣＯ₂ 存在下、３日間96穴プレ
ートで培養し（培地10％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）、コンフル
エントの状態（約１×10⁵ cell/well ）にした後、無血
清培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ）で洗浄した。このＡ５４９
細胞に、５'末端を³²Ｐで標識した核酸化合物(27)及び
核酸鎖(28)をそれぞれの非標識化合物とともに加え、そ
れぞれの最終の総濃度が１μM （各ウェル当たり5.5 ×
10⁴ cpm ）となるように（標識核酸化合物(27)と非標識
核酸化合物(27)との合計が１μM 、標識核酸鎖(28)と非
標識核酸鎖(28)との合計が１μM となるように）ＯＰＴ
Ｉ−ＭＥＭ培地に添加し、37℃、５％ＣＯ₂ 存在下で４
時間保持した。

【０１２０】その後、上記プレートの培地を除去してＰ
ＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、0.05％トリプ
シン／0.53 mM ＥＤＴＡで細胞を処理した。この処理に
より、細胞はウェル底から剥がれるとともに、細胞膜表
面に付着している標識された核酸化合物または核酸鎖が
除去される。

【０１２１】トリプシン処理の後、上記プレートを1,50
0 rpmで10分間遠心し上清を除いた。ウェル底に残った
細胞を１％ＳＤＳ溶液に溶解し、200 μｌをバイアルに
移してシンチレーターを用いて細胞内に取り込まれた上
記核酸化合物及び核酸鎖の量を測定した。その結果、核
酸鎖(28)の取り込み量を１とした場合、核酸化合物(27)
の細胞内取り込み量は2.1 ±0.6 であり、有意に増大し
ていることが分かった。以上のことから、トリテルペノ
イド体を含有する核酸化合物(27)は、細胞内への取り込
み量が大きいことが示された。

【０１２２】

【発明の効果】本発明によれば、細胞膜透過性に優れた
核酸化合物、同一分子内での相補塩基対構造の形成を促
進する核酸化合物、及び第３の核酸鎖と三重鎖を形成し
得る２本の核酸鎖を同一分子内にもつ核酸化合物が化学
合成によって得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】グリシルレチン酸についての ¹Ｈ ＮＭＲ（CDC
l₃,200MHz）の測定結果を示すグラフである。

【図２】構造式(12)で表される化合物についての ¹Ｈ
ＮＭＲ（CDCl₃,200MHz）の測定結果を示すグラフであ
る。

【図３】構造式(13)で表される化合物についての ¹Ｈ
ＮＭＲ（CDCl₃,200MHz）の測定結果を示すグラフであ
る。

【図４】構造式(13)で表される化合物についてのＦＡＢ
（positive）の測定結果を示すグラフである。

【図５】構造式(19)で表される化合物についての ¹Ｈ
ＮＭＲ（CDCl₃,200MHz）の測定結果を示すグラフであ
る。

【図６】構造式(21)で表される化合物を酵素分解したも
のについてＨＰＬＣにより分析した結果を示すグラフで
ある。

【図７】構造式(22)で表される化合物についての ¹Ｈ
ＮＭＲ（D₂O,500MHz）の測定結果を示すグラフである。

【図８】構造式(22)で表される化合物についてのＦＡＢ
（positive）の測定結果を示すグラフである。

【図９】紫外光領域での温度変化による吸収強度の変化
の割合（ΔＡ／Ａ）を示すグラフである。

【図１０】10℃における円二色性スペクトルを示すグラ
フである。上段は核酸化合物(23)と核酸鎖(24)との混合
物、中段は核酸鎖(25)と核酸鎖(24)との混合物、下段は
核酸鎖(26)、核酸鎖(25)及び核酸鎖(24)の三者混合物に
ついてのものである。ここで、縦軸の数値はモル楕円率
（θ）で表した場合の値であり、その単位はdeg・cm²／
decimoleである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 内田 貴義 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 松田 陽子 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 内多 潔 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 方向性が環状骨格で固定されかつ実質的
   に同一方向に向く２つの官能基を有する非核酸環状骨格
   と、前記各官能基を介して前記非核酸環状骨格に結合し
   た２本の核酸鎖とからなる核酸化合物。
2. 【請求項２】 ２本の核酸鎖が互いに相補的であること
   を特徴とする請求項１記載の核酸化合物。
3. 【請求項３】 非核酸環状骨格の２つの官能基が0.6 〜
   1.4 nm離れていることを特徴とする請求項１記載の核酸
   化合物。
4. 【請求項４】 ２本の核酸鎖のうちの１本が、第３の核
   酸鎖に対して相補的であり、残りの１本が前記第３の核
   酸鎖を介して三重鎖を形成し得る塩基配列を有するもの
   であることを特徴とする請求項１記載の核酸化合物。
5. 【請求項５】 非核酸環状骨格がトリテルペノイド骨格
   であることを特徴とする請求項１記載の核酸化合物。
6. 【請求項６】 非核酸環状骨格が下記の構造式(1) 【化１】 で表される骨格であることを特徴とする請求項１記載の
   核酸化合物。
7. 【請求項７】 非核酸環状骨格が下記の構造式(2) 【化２】 で表される骨格であることを特徴とする請求項１記載の
   核酸化合物。
8. 【請求項８】 方向性が環状骨格で固定されかつ実質的
   に同一方向を向く２つの官能基を有する非核酸化合物の
   該官能基のそれぞれに、核酸鎖を付加することを特徴と
   する核酸化合物の合成方法。
9. 【請求項９】 付加する核酸鎖が互いに相補的であるこ
   とを特徴とする請求項８記載の核酸化合物の合成方法。
10. 【請求項１０】 付加する２本の核酸鎖のうちの１本が
    第３の核酸鎖に対して相補的であり、残りの１本が前記
    第３の核酸鎖を介して三重鎖を形成し得る塩基配列を有
    する核酸鎖であることを特徴とする請求項８記載の核酸
    化合物の合成方法。
11. 【請求項１１】 非核酸化合物の２つの官能基が0.6 〜
    1.4 nm離れていることを特徴とする請求項８記載の核酸
    化合物の合成方法。
12. 【請求項１２】 非核酸化合物の２つの官能基にフォス
    フォロアミダイト又はチオフォスファイト体を経て核酸
    鎖が付加されることを特徴とする請求項８記載の核酸化
    合物の合成方法。
13. 【請求項１３】 非核酸化合物がトリテルペノイド系化
    合物であることを特徴とする請求項８記載の核酸化合物
    の合成方法。
14. 【請求項１４】 非核酸化合物が下記の構造式(1) 【化３】 で表される骨格を有する化合物であることを特徴とする
    請求項８記載の核酸化合物の合成方法。
15. 【請求項１５】 非核酸化合物が下記の構造式(2) 【化４】 で表される骨格を有する化合物であることを特徴とする
    請求項８記載の核酸化合物の合成方法。
16. 【請求項１６】 下記構造式(3) 【化５】 （但し、Ｒ及びＲ'は水素原子又は保護基である。）で
    表される新規なトリテルペノイド系化合物。
17. 【請求項１７】 下記構造式(4) 【化６】 （但し、Ｒ及びＲ'は水素原子又は保護基である。）で
    表される新規なトリテルペノイド系化合物。
18. 【請求項１８】 下記構造式(5) 【化７】 （但し、Ｒは水素原子又は保護基である。）で表される
    新規なフォスフォロアミダイト体。
19. 【請求項１９】 下記構造式(6) 【化８】 （但し、Ｒは水素原子又は保護基である。）で表される
    新規なフォスフォロアミダイト体。
20. 【請求項２０】 下記構造式(7) 【化９】 （但し、Ｒは水素原子又は保護基である。）で表される
    新規なチオフォスファイト体。
21. 【請求項２１】 下記構造式(8) 【化１０】 （但し、Ｒは水素原子又は保護基である。）で表される
    新規なチオフォスファイト体。