JPH083199A - コラーゲン−軟骨細胞複合体 - Google Patents
コラーゲン−軟骨細胞複合体Info
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- JPH083199A JPH083199A JP6156754A JP15675494A JPH083199A JP H083199 A JPH083199 A JP H083199A JP 6156754 A JP6156754 A JP 6156754A JP 15675494 A JP15675494 A JP 15675494A JP H083199 A JPH083199 A JP H083199A
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- JP
- Japan
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- collagen
- cartilage
- bfgf
- cell
- tissue
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- Pending
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Abstract
(57)【要約】
【目的】生体適合性がよく、生体内で軟骨細胞を増殖さ
せ、かつ軟骨組織の再生を促進し、多くの軟骨疾患に適
用できるｂＦＧＦ含有コラーゲン−軟骨細胞複合体を提
供する。 【構成】塩基性線維芽細胞増殖因子含有コラーゲン−軟
骨細胞複合体。
せ、かつ軟骨組織の再生を促進し、多くの軟骨疾患に適
用できるｂＦＧＦ含有コラーゲン−軟骨細胞複合体を提
供する。 【構成】塩基性線維芽細胞増殖因子含有コラーゲン−軟
骨細胞複合体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、塩基性線維芽細胞増殖
因子（Basic Fibroblast Growth Factor、以下ｂＦＧＦ
と略称する）を含有するコラーゲン−軟骨細胞複合体お
よび該複合体からなる軟骨組織再生治療材に関するもの
である。
因子（Basic Fibroblast Growth Factor、以下ｂＦＧＦ
と略称する）を含有するコラーゲン−軟骨細胞複合体お
よび該複合体からなる軟骨組織再生治療材に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】ｉｎ ｖｉｔｒｏで軟骨細胞を増殖させ
て軟骨組織を再生できれば、再建外科においてきわめて
有用である。しかし、軟骨細胞は通常の培地を用いたｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ培養下では盛んに増殖するにもかかわら
ず、軟骨組織には分化しない。そのため、軟骨組織の再
建という作業は生体に託したほうが近道のように思われ
る。すでに、生体内分解吸収性合成高分子であるポリ乳
酸を足場としてそれに軟骨細胞を付着させてヌードマウ
ス体内に埋め込むことによって軟骨組織の再建ができた
という報告はあるが、これらは数カ月以上の長時間を要
している。
て軟骨組織を再生できれば、再建外科においてきわめて
有用である。しかし、軟骨細胞は通常の培地を用いたｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ培養下では盛んに増殖するにもかかわら
ず、軟骨組織には分化しない。そのため、軟骨組織の再
建という作業は生体に託したほうが近道のように思われ
る。すでに、生体内分解吸収性合成高分子であるポリ乳
酸を足場としてそれに軟骨細胞を付着させてヌードマウ
ス体内に埋め込むことによって軟骨組織の再建ができた
という報告はあるが、これらは数カ月以上の長時間を要
している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ｂＦＧ
Ｆを含有するコラーゲン−軟骨細胞複合体が、わずか２
週間という短期間で効率よく、生体内での軟骨組織再生
に著明な効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
Ｆを含有するコラーゲン−軟骨細胞複合体が、わずか２
週間という短期間で効率よく、生体内での軟骨組織再生
に著明な効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明のｂＦＧＦ含有コ
ラーゲン−軟骨細胞複合体は、生体適合性がよく、生体
内で軟骨細胞を増殖させ、かつ軟骨組織の再生を促進
し、多くの軟骨疾患に適用できる。
ラーゲン−軟骨細胞複合体は、生体適合性がよく、生体
内で軟骨細胞を増殖させ、かつ軟骨組織の再生を促進
し、多くの軟骨疾患に適用できる。
【０００５】本発明のｂＦＧＦ含有コラーゲン−軟骨細
胞複合体におけるｂＦＧＦは、脳下垂体、脳、網膜、黄
体、副腎、腎、胎盤、前立腺、胸腺などの臓器より抽出
されるもの、組換えＤＮＡ技術などの遺伝子工学的手法
で製造されるもの、さらにこれらの修飾体であって線維
芽細胞増殖因子として作用し得るものを含む。
胞複合体におけるｂＦＧＦは、脳下垂体、脳、網膜、黄
体、副腎、腎、胎盤、前立腺、胸腺などの臓器より抽出
されるもの、組換えＤＮＡ技術などの遺伝子工学的手法
で製造されるもの、さらにこれらの修飾体であって線維
芽細胞増殖因子として作用し得るものを含む。
【０００６】ｂＦＧＦの修飾体としては、例えば上記の
抽出により得られたまたは遺伝子工学的手法で得られた
ｂＦＧＦのアミノ酸配列においてアミノ酸が付加された
もの、アミノ酸の一部が他のアミノ酸で置換されたも
の、またはアミノ酸の一部が欠損したものなどが挙げら
れる。本発明においては、これらのｂＦＧＦまたはその
修飾体は単独で用いてもよいし、これらの混合物として
用いてもよい。
抽出により得られたまたは遺伝子工学的手法で得られた
ｂＦＧＦのアミノ酸配列においてアミノ酸が付加された
もの、アミノ酸の一部が他のアミノ酸で置換されたも
の、またはアミノ酸の一部が欠損したものなどが挙げら
れる。本発明においては、これらのｂＦＧＦまたはその
修飾体は単独で用いてもよいし、これらの混合物として
用いてもよい。
【０００７】上記ｂＦＧＦとしては、好ましくは、例え
ばＷＯ８７／０１７２８（特表昭６３−５００８４３号
公報）、ＷＯ８９／０４８３２（特表平２−５０４４６
８号公報）、ＷＯ８６／０７５９５（特表昭６３−５０
００３６号公報）、ＷＯ８７／０３８８５（特表昭６３
−５０１９５３号公報）、欧州特許出願公開第２３７９
６６号（特開昭６３−２２６２８７号公報）、欧州特許
出願公開第２８１８２２号（特開平２−１９３号公
報）、欧州特許出願公開第３２６９０７号（特開平２−
２０９８９４号公報）、欧州特許出願公開第３９４９５
１号（特開平３−６１４９４号公報）、欧州特許出願公
開第４９３７３７号（特開平５−１２４９７５号公報）
などに記載のものが挙げられる。
ばＷＯ８７／０１７２８（特表昭６３−５００８４３号
公報）、ＷＯ８９／０４８３２（特表平２−５０４４６
８号公報）、ＷＯ８６／０７５９５（特表昭６３−５０
００３６号公報）、ＷＯ８７／０３８８５（特表昭６３
−５０１９５３号公報）、欧州特許出願公開第２３７９
６６号（特開昭６３−２２６２８７号公報）、欧州特許
出願公開第２８１８２２号（特開平２−１９３号公
報）、欧州特許出願公開第３２６９０７号（特開平２−
２０９８９４号公報）、欧州特許出願公開第３９４９５
１号（特開平３−６１４９４号公報）、欧州特許出願公
開第４９３７３７号（特開平５−１２４９７５号公報）
などに記載のものが挙げられる。
【０００８】これらのｂＦＧＦのうち、ＷＯ８７／０１
７２８に記載の遺伝子工学的手法で製造した配列表にお
ける配列番号１の１５４個のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドおよび配列番号２の１５３個のアミノ酸配列を
有するポリペプチドが、安定性および材料として必要な
量を常時供給することが容易であるという点から特に好
ましい。
７２８に記載の遺伝子工学的手法で製造した配列表にお
ける配列番号１の１５４個のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドおよび配列番号２の１５３個のアミノ酸配列を
有するポリペプチドが、安定性および材料として必要な
量を常時供給することが容易であるという点から特に好
ましい。
【０００９】一方、コラーゲンは皮膚などのＩ型コラー
ゲンからなる動物組織より調製したのち、種々の形状、
例えばスポンジ状、ゲル状、綿状、さらには実際に適用
する耳や鼻などの形状に加工し使用できる。特に、スポ
ンジ状が好ましく、そのスポンジの孔は径１００〜５０
０μｍ、密度は０．０１ｇ／ｃｍ3 が好ましい。また、
必要に応じ、グルタルアルデヒドや熱を加えることによ
り架橋を導入できる。
ゲンからなる動物組織より調製したのち、種々の形状、
例えばスポンジ状、ゲル状、綿状、さらには実際に適用
する耳や鼻などの形状に加工し使用できる。特に、スポ
ンジ状が好ましく、そのスポンジの孔は径１００〜５０
０μｍ、密度は０．０１ｇ／ｃｍ3 が好ましい。また、
必要に応じ、グルタルアルデヒドや熱を加えることによ
り架橋を導入できる。
【００１０】スポンジ状のｂＦＧＦ含有コラーゲン−軟
骨細胞複合体を調製するには、該コラーゲンスポンジを
使用目的に応じた大きさに調製した後、あるいは適当な
大きさに調製した後、例えば、ｂＦＧＦの生理食塩水溶
液またはリン酸緩衝生理食塩水溶液１〜１０００μｇ／
ｍｌを１２〜２４時間、０℃〜室温にて含浸し、さらに
軟骨細胞分散液を調製したｂＦＧＦ含有コラーゲンスポ
ンジに注入して１〜２時間静置することにより、ｂＦＧ
Ｆを含有したコラーゲン−軟骨細胞複合体を得ることが
できる。その他の形状の複合体も同様の方法にて調製で
きる。本複合体を調製する際のｂＦＧＦの濃度は、使用
目的、使用部位、疾病の程度にて、適宜変えられるが、
好ましくは１〜１０００μｇ／ｍｌである。本複合体を
例えば耳の軟骨の再建に用いる場合は、ｂＦＧＦ濃度１
μｇ／ｍｌに含浸し軟骨細胞分散液を注入した本発明複
合体を使用部位へ埋め込ことにより再建できる。
骨細胞複合体を調製するには、該コラーゲンスポンジを
使用目的に応じた大きさに調製した後、あるいは適当な
大きさに調製した後、例えば、ｂＦＧＦの生理食塩水溶
液またはリン酸緩衝生理食塩水溶液１〜１０００μｇ／
ｍｌを１２〜２４時間、０℃〜室温にて含浸し、さらに
軟骨細胞分散液を調製したｂＦＧＦ含有コラーゲンスポ
ンジに注入して１〜２時間静置することにより、ｂＦＧ
Ｆを含有したコラーゲン−軟骨細胞複合体を得ることが
できる。その他の形状の複合体も同様の方法にて調製で
きる。本複合体を調製する際のｂＦＧＦの濃度は、使用
目的、使用部位、疾病の程度にて、適宜変えられるが、
好ましくは１〜１０００μｇ／ｍｌである。本複合体を
例えば耳の軟骨の再建に用いる場合は、ｂＦＧＦ濃度１
μｇ／ｍｌに含浸し軟骨細胞分散液を注入した本発明複
合体を使用部位へ埋め込ことにより再建できる。
【００１１】
【実施例】細胞培養の足場として、Ｉ型コラーゲンスポ
ンジを用いた。スポンジを円形（直径９ｍｍ）に打ち抜
いて二枚重ね合わせ、周囲を縫い合わせて袋状とした。
７０％エタノールに１日間浸漬した後、１０００μｇ／
ｍｌのｂＦＧＦ溶液に１日間浸漬し、コラーゲンスポン
ジ内に軟骨細胞分散液を注射器で１×１０6 個注入し、
２時間静置して細胞を付着させ、ｂＦＧＦ含有コラーゲ
ン−軟骨細胞複合体を得た。なお、軟骨細胞は細切した
ラット肋軟骨をコラゲナーゼ処理し、培養シャーレ上で
約１ヶ月間静置培養して初代軟骨細胞株を得た。
ンジを用いた。スポンジを円形（直径９ｍｍ）に打ち抜
いて二枚重ね合わせ、周囲を縫い合わせて袋状とした。
７０％エタノールに１日間浸漬した後、１０００μｇ／
ｍｌのｂＦＧＦ溶液に１日間浸漬し、コラーゲンスポン
ジ内に軟骨細胞分散液を注射器で１×１０6 個注入し、
２時間静置して細胞を付着させ、ｂＦＧＦ含有コラーゲ
ン−軟骨細胞複合体を得た。なお、軟骨細胞は細切した
ラット肋軟骨をコラゲナーゼ処理し、培養シャーレ上で
約１ヶ月間静置培養して初代軟骨細胞株を得た。
【００１２】
【試験例】実施例で調製したコラーゲン−軟骨細胞複合
体さらに対照として未処理のコラーゲンスポンジ（以下
対照１と略記する）およびｂＦＧＦを含有しないコラー
ゲン−軟骨細胞複合体（以下対照２と略記する）をそれ
ぞれヌードマウスの背部皮下に埋め込み、所定期間埋入
後にサンプルを取り出し、常法に従って切片を作成後、
ヘマトキシリン−エオジン、サフラニンＯ−ファストグ
リーン、およびチオニン染色を行い、光学顕微鏡にて観
察した。
体さらに対照として未処理のコラーゲンスポンジ（以下
対照１と略記する）およびｂＦＧＦを含有しないコラー
ゲン−軟骨細胞複合体（以下対照２と略記する）をそれ
ぞれヌードマウスの背部皮下に埋め込み、所定期間埋入
後にサンプルを取り出し、常法に従って切片を作成後、
ヘマトキシリン−エオジン、サフラニンＯ−ファストグ
リーン、およびチオニン染色を行い、光学顕微鏡にて観
察した。
【００１３】各試料を埋め込んだ後、ヌードマウスの外
観を４週間観察した。対照１の試料を埋め込んでから４
週間後には外見上ほとんど吸収されていた。対照２の試
料を埋め込んでから２週間後までは軟骨組織は認められ
なかったが、４週間後の組織切片を観察すると軟骨特有
の組織の形成されているのが認められたが、それは埋め
込んだ試料のごく一部のみであった。本発明の複合体を
埋め込んでから１週間後では、軟骨組織は認められなか
ったが、チオニンの異染色から、細胞間に軟骨プロテオ
グリカンの産生されているのが認められた。試料内には
多数の毛細血管も新生していた。４週間後では、埋め込
んだ試料のほぼ全面に軟骨組織が観察される。また、こ
の場合、試料全体を白色の塊としてマウスから取り出す
ことができた。
観を４週間観察した。対照１の試料を埋め込んでから４
週間後には外見上ほとんど吸収されていた。対照２の試
料を埋め込んでから２週間後までは軟骨組織は認められ
なかったが、４週間後の組織切片を観察すると軟骨特有
の組織の形成されているのが認められたが、それは埋め
込んだ試料のごく一部のみであった。本発明の複合体を
埋め込んでから１週間後では、軟骨組織は認められなか
ったが、チオニンの異染色から、細胞間に軟骨プロテオ
グリカンの産生されているのが認められた。試料内には
多数の毛細血管も新生していた。４週間後では、埋め込
んだ試料のほぼ全面に軟骨組織が観察される。また、こ
の場合、試料全体を白色の塊としてマウスから取り出す
ことができた。
【００１４】以上の結果から、コラーゲンスポンジに軟
骨細胞を付着させてヌードマウスに埋め込むことによっ
て軟骨組織の再生されることがわかった。さらに、ｂＦ
ＧＦを加えることによって組織の再生量と速度を格段に
高めることが認められた。
骨細胞を付着させてヌードマウスに埋め込むことによっ
て軟骨組織の再生されることがわかった。さらに、ｂＦ
ＧＦを加えることによって組織の再生量と速度を格段に
高めることが認められた。
【００１５】
【発明の効果】本発明のｂＦＧＦ含有コラーゲン−軟骨
細胞複合体は、生体適合性がよく、生体内で軟骨細胞を
増殖させ、かつ軟骨組織の再生を促進し、多くの軟骨疾
患に適用できる。
細胞複合体は、生体適合性がよく、生体内で軟骨細胞を
増殖させ、かつ軟骨組織の再生を促進し、多くの軟骨疾
患に適用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/50 8318−4Ｈ 19/00 8318−4Ｈ // Ａ６１Ｋ 38/17 ＡＢＪ 38/22
Claims (4)
- 【請求項１】塩基性線維芽細胞増殖因子含有コラーゲン
−軟骨細胞複合体。 - 【請求項２】コラーゲンがスポンジ状であることを特徴
とする請求項１記載のコラーゲン−軟骨細胞複合体 - 【請求項３】軟骨細胞がヒト軟骨細胞であることを特徴
とする請求項１記載のコラーゲン−軟骨細胞複合体。 - 【請求項４】請求項１ないし３記載のコラーゲン−軟骨
細胞複合体からなる軟骨組織再生治療材。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6156754A JPH083199A (ja) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | コラーゲン−軟骨細胞複合体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6156754A JPH083199A (ja) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | コラーゲン−軟骨細胞複合体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH083199A true JPH083199A (ja) | 1996-01-09 |
Family
ID=15634592
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6156754A Pending JPH083199A (ja) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | コラーゲン−軟骨細胞複合体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH083199A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4952521A (en) * | 1985-04-26 | 1990-08-28 | Fujitsu Limited | Process for fabricating a semiconductor device with selective growth of a metal silicide |
| WO1997043312A1 (de) * | 1996-05-09 | 1997-11-20 | Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess Ag | Gelatine überwiegend bestehend aus den polypeptiden der kollagene ii, vi, ix, x, xi, xii und xiv, verfahren zur herstellung derselben und ihre verwendung |
| JP2001519210A (ja) * | 1997-10-10 | 2001-10-23 | エド・ガイストリヒ・ゼーネ・アクチエンゲゼルシャフト・フューア・ヒェーミシェ・インドゥストリー | 組織再生誘導に使用する膜 |
| JP2004255110A (ja) * | 2003-02-27 | 2004-09-16 | Sangaku Renkei Kiko Kyushu:Kk | 人工リンパ節 |
-
1994
- 1994-06-15 JP JP6156754A patent/JPH083199A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4952521A (en) * | 1985-04-26 | 1990-08-28 | Fujitsu Limited | Process for fabricating a semiconductor device with selective growth of a metal silicide |
| WO1997043312A1 (de) * | 1996-05-09 | 1997-11-20 | Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess Ag | Gelatine überwiegend bestehend aus den polypeptiden der kollagene ii, vi, ix, x, xi, xii und xiv, verfahren zur herstellung derselben und ihre verwendung |
| JP2001519210A (ja) * | 1997-10-10 | 2001-10-23 | エド・ガイストリヒ・ゼーネ・アクチエンゲゼルシャフト・フューア・ヒェーミシェ・インドゥストリー | 組織再生誘導に使用する膜 |
| JP4819995B2 (ja) * | 1997-10-10 | 2011-11-24 | エド・ガイストリヒ・ゼーネ・アクチエンゲゼルシャフト・フューア・ヒェーミシェ・インドゥストリー | 組織再生誘導に使用する膜 |
| JP2004255110A (ja) * | 2003-02-27 | 2004-09-16 | Sangaku Renkei Kiko Kyushu:Kk | 人工リンパ節 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040316 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040727 |