JPH08322585A - パラチノースおよびトレハルロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 初期活性に優れ、活性の持続性が良好で、再
生により繰り返し使用ができる担体に固定化したα−グ
ルコシルトランスフェラーゼを用いて、パラチノース及
びトレハルロースを製造する。 【構成】 粒状多孔質キトサンに脂肪族ポリアルコール
のジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテル
を反応させて得られた酵素固定化用担体に、α−グルコ
シルトランスフェラーゼを固定化し、ここで得られた固
定化α−グルコシルトランスフェラーゼに蔗糖溶液を接
触させてパラチノース及びトレハルロースを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、固定化α−グルコシル
トランスフェラーゼを用いて、蔗糖からパラチノースお
よびトレハルロースを効率良く製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】パラチノース（別名：イソマルチュロー
ス）およびトレハルロースは、グルコースとフラクトー
スが、それぞれα−１，６およびα−１，１で結合した
甘味を有する非う蝕性の二糖類であり、近年、低う蝕原
性甘味料として広く使用されている。

【０００３】従来より、パラチノースおよびトレハルロ
ースは、グルコースとフラクトースがα−１，２で結合
している蔗糖が、プロタミノバクター（Protaminobacte
r ）属、セラチア（Serratia）属、エルヴィニア（Erwi
nia ）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、シュードモ
ナス（Pseudomonas ）属、アグロバクテリウム（Agroba
cterium ）属等の微生物に含有されるα−グルコシルト
ランスフェラーゼと呼ばれる糖転移酵素と接触すること
によって生成されることが特開平３−１８０１７２号、
特開平４−１６９１９０号、特開平５−１３０８８６号
公報等で開示されている。また、パラチノースおよびト
レハルロースを工業的に製造するには、２０〜６０％の
蔗糖の水溶液に、α−グルコシルトランスフェラーゼを
含有する微生物を加えて攪拌し、温度１５〜３０℃、ｐ
Ｈ６付近に管理しながら２０時間程度反応させた後、反
応液から微生物を遠心分離法等にて除去し、イオン交換
樹脂等により精製し得られることも知られている。しか
し係る製造工程において、反応液中から微生物を除去す
ることは、微生物と反応液の比重差が少なく、微生物の
サイズも小さいことから能率が悪く、工業的には不適当
である。この様な問題を解決するために、例えば特公昭
６０−９７９７号公報には、α−グルコシルトランスフ
ェラーゼを含有する微生物を、アルギン酸カルシウムや
ポリアクリルアミド、寒天等のゲルに包括したものや、
α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物の
全細胞または破砕細胞の成分を、ＤＥＡＥ−セルロース
や骨炭といった水不溶性の担体に吸着し、必要に応じて
グルタルアルデヒドで架橋させたものを用いることが開
示されており、特公昭５８−３６９５９号公報には、α
−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物を、
アルギン酸カルシウムゲルに包括させて粒状化し、この
粒状化物にポリエチレンイミンを浸透させた後、グルタ
ルアルデヒドで架橋させたものを用いることが開示され
ている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述の従来技術におい
て、特公昭６０−９７９７号公報記載の固定化α−グル
コシルトランスフェラーゼのうち、アルギン酸カルシウ
ムゲル等に微生物を包括させたものや、特公昭５８−３
６９５９号公報に記載の固定化α−グルコシルトランス
フェラーゼは、蔗糖溶液のｐＨが５．８以上のときや、
粗精製の蔗糖に含まれるナトリウムイオン等との接触に
より、アルギン酸カルシウムが水溶性のアルギン酸ナト
リウムに変換されて溶出し、ゲルの物理的強度が低下し
てしまうという欠点があった。この欠点は蔗糖溶液にカ
ルシウム塩を添加することにより改善できるが、反応液
に脱塩処理を施さなければならないという問題が新たに
発生する。また、α−グルコシルトランスフェラーゼを
含有する微生物を包括固定させる方法は、固定化量が低
い上、糖転移反応の活性を持つα−グルコシルトランス
フェラーゼの高次構造の変化と、蔗糖溶液との接触が包
括されることにより妨げられる立体的な障害を伴い、活
性が低くなってしまうという欠点がある。更に、固定化
したα−グルコシルトランスフェラーゼが失活した場
合、ゲル担体を再生して繰り返し使用することができな
いという大きな欠点を抱えていた。

【０００５】このような欠点を解決する有力な手段とし
ては、特公昭６０−９７９７号公報にＤＥＡＥ−セルロ
ース等の水不溶性の担体にα−グルコシルトランスフェ
ラーゼを固定化する方法が開示されている。この方法で
あれば、固定化量を多くすることができ、α−グルコシ
ルトランスフェラーゼの高次構造が変化しにくく、α−
グルコシルトランスフェラーゼが担体の表面に固定化さ
れるため蔗糖溶液との接触も阻害しない。しかも失活し
た固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを熱アルカ
リ処理し、未使用の新たなα−グルコシルトランスフェ
ラーゼを固定化することで、担体を容易に再生させるこ
とができる。しかしこの方法で得た固定化α−グルコシ
ルトランスフェラーゼは、活性の持続性が極端に悪く、
初期活性や再生について満足のいくものではない。

【０００６】このような観点から、物理的強度に優れ、
再生が可能な水不溶性の担体にα−グルコシルトランス
フェラーゼを固定化したもので、初期活性に優れ、活性
の持続性が良好で、再生による繰り返し使用ができる担
体に固定化したα−グルコシルトランスフェラーゼを用
いて、パラチノースおよびトレハルロースを製造する方
法の開発が強く要望されていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決すべく鋭意研究の結果、粒状多孔質キトサン
に、脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフ
ェニルグリシジルエーテルを反応させた酵素固定化担体
にα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化させるこ
とにより、優れた初期活性と良好な活性持続性が得ら
れ、しかも失活した際、熱アルカリ処理した後に、再度
α−グルコシルトランスフェラーゼを固定化することに
よって、再生が可能で繰り返し使用ができることを見出
し、本発明に到達した。

【０００８】即ち、本発明は、粒状多孔質キトサンに脂
肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニル
グリシジルエーテルを反応させて得られた酵素固定化用
担体に、α−グルコシルトランスフェラーゼを固定化
し、ここで得られた固定化α−グルコシルトランスフェ
ラーゼに蔗糖溶液を接触させることを特徴とするパラチ
ノースおよびトレハルロースの製造方法を提供するもの
である。

【０００９】本発明に用いる、粒状多孔質キトサンに脂
肪族ボリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニル
グリシジルエーテルを反応させた酵素固定化用担体は、
出願人が先に特願平７−３９１７２号で出願した酵素固
定化用担体の製造方法で製造することができる。

【００１０】即ち、（Ａ）平均分子量が１０，０００〜
２３０，０００の低分子量キトサンを蟻酸、酢酸、乳酸
等の有機酸や塩酸、硝酸等の無機酸の酸性水溶液に溶解
し、該キトサン酸性溶解液を塩基性溶液中に落下せしめ
て得た粒状多孔質キトサンに、脂肪族ボリアルコールの
ジグリシジルエーテルを反応させて架橋粒状多孔質キト
サンとし、次いで界面活性剤を用いて水中にフェニルグ
リシジルエーテルを懸濁し、該架橋粒状多孔質キトサン
に残存するアミノ基を主体に反応させた後、充分に水洗
するか、または、（Ｂ）上述と同様で得た粒状多孔質キ
トサンに、極性溶剤中でフェニルグリシジルエーテルを
反応させ、次いで脂肪族ポリアルコールのジグリシジル
エーテルを、該粒状多孔質キトサンに残存するアミノ基
を主体に反応させた後、充分に水洗して酵素固定化用担
体を得る。

【００１１】ここで用いる脂肪族ポリアルコールのジグ
リシジルエーテルとしては、エチレングリコールジグリ
シジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエ
ーテル等のポリエチレングリコールジグリシジルエーテ
ル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ジプ
ロピレングリコールジグリシジルエーテル等のポリプロ
ピレングリコールジグリシジルエーテル、またはグリセ
ロールポリグリシジルエーテル等が挙げられる。

【００１２】ここで使用されるフェニルグリシジルエー
テルの量は、後に固定化するα−グルコシルトランスフ
ェラーゼの優れた性能を発揮させるために、（Ａ）の場
合は架橋粒状多孔質キトサン１Ｌに対し２０〜２００
ｇ、好ましくは３５〜２００ｇ、（Ｂ）の場合は粒状多
孔質キトサン１Ｌに対し５０〜２００ｇ、好ましくは７
５〜２００ｇである。

【００１３】（Ａ）に用いる界面活性剤としては、カチ
オン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤および非イオ
ン性界面活性剤が挙げられる。しかし架橋粒状キトサン
のアミノ基とイオン的な反発ないしは吸着が起こらな
い、一般に使用されている非イオン性界面活性剤が好ま
しい。

【００１４】（Ｂ）に用いる極性溶剤としては、ジオキ
サン、エタノール、イソプロピルアルコール等の極性溶
剤が挙げられ、これらの中から選択し使用される。

【００１５】次に、このようにして得られた酵素固定化
用担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化し
て、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを得る。
固定化する方法としては通常の手法を採用することがで
きる。例えば酵素固定化用担体をα−グルコシルトラン
スフェラーゼを含有する溶液中で数時間処理し、酵素固
定化用担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを吸着
させて、残留している該溶液を除去し水洗する方法，ま
たは水洗後に架橋剤溶液中で数時間処理して、酵素固定
化用担体とα−グルコシルトランスフェラーゼを架橋
し、残留している該溶液を除去して水洗する方法，或い
は酵素固定化用担体を架橋剤溶液中で数時間処理して、
架橋剤の官能基の一部と酵素固定化用担体を結合させ、
残留している該溶液を除去して水洗した後、α−グルコ
シルトランスフェラーゼを含有する溶液中で数時間処理
して、酵素固定化用担体と結合している架橋剤の未反応
の官能基部分にα−グルコシルトランスフェラーゼを結
合させ、残留している該溶液を除去して水洗する方法等
が採用されるが、架橋剤を用いる方法が特に好ましい。

【００１６】上述の固定化方法で用いられる架橋剤とし
ては、酵素固定化用担体に導入された２種のグリシジル
エーテルが反応していない残存アミノ基と、α−グルコ
シルトランスフェラーゼの有するアミノ基とを架橋する
化合物、即ちイソシアネート基やエポキシ基、アルデヒ
ド基、カルボニル基といった官能基を２個以上備えた化
合物であれば良く、具体的にはヘキサメチレンジイソシ
アネート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、
グルタルアルデヒド等が挙げられる。

【００１７】グルタルアルデヒドを用いた反応は、通常
０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％のグルタルア
ルデヒド溶液を、酵素固定化用担体１容量に対して０．
１〜１０倍容量、好ましくは０．５〜２倍容量加え、室
温にて１０分〜２４時間、好ましくは３０分〜４時間処
理して架橋させる。

【００１８】上述の固定化方法で用いられるα−グルコ
シルトランスフェラーゼは、蔗糖からパラチノースおよ
びトレハルロースを生成する糖転移活性を持つものであ
れば特別限定されるものではなく、例えばプロタミノバ
クター（Protaminobacter ）属やセラチア（Serratia）
属、エルヴィニア（Erwinia ）属、クレブシエラ（Kleb
siella）属、シュードモナス（Pseudomonas ）属、アグ
ロバクテリウム（Agrobacterium ）属等の微生物を含有
する培養液を、ホモジナイザーによって破砕して得た未
精製のα−グルコシルトランスフェラーゼや、これを液
体クロマトグラフィー等の手法によって、不純物を除い
た精製α−グルコシルトランスフェラーゼが挙げられる
が、工業的には操作が簡便な未精製のα−グルコシルト
ランスフェラーゼを用いることが好ましい。

【００１９】次に上述で得た固定化α−グルコシルトラ
ンスフェラーゼを、蔗糖溶液に接触させるが、その方法
については特別限定されるものではなく、例えば蔗糖溶
液の入った攪拌設備のある容器に固定化α−グルコシル
トランスフェラーゼを添加し一定時間攪拌処理する方法
や、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼをカラム
に充填し、このカラムに蔗糖溶液を通液させる方法等が
挙げられる。工業的には連続処理が可能な後者の方法が
好ましい。この場合に用いられる蔗糖溶液の濃度は１〜
６０％、好ましくは２０〜６０％、ｐＨは４〜８、好ま
しくは５〜７、温度は５〜６０℃、好ましくは１５〜４
０℃、通液速度（空間速度）は０．１〜５．０ｈｒ^-1、
好ましくは０．２〜２．０ｈｒ^-1で処理する。この様な
方法で固定化α−グルコシルトランスフェラーゼに蔗糖
溶液を接触させることにより、所望のパラチノースおよ
びトレハルロースを含有するシロップが得られる。得ら
れたシロップは必要に応じて中和処理、脱塩処理、結晶
化処理、イオン交換樹脂を用いた通常の液体クロマトグ
ラフィー処理等により、パラチノースとトレハルロース
の混合製品や高純度のパラチノース製品、及び高純度の
トレハルロース製品といった製品を得ることができる。

【００２０】ここで使用する固定化α−グルコシルトラ
ンスフェラーゼは、蔗糖溶液との接触により、徐々に糖
転移活性が低下していく。そこで使用限界以下に低下し
た場合は、通常の担体結合法による固定化酵素の再生方
法により、酵素固定化用担体を繰り返し使用することが
できる。即ち使用限界以下に活性が低下した固定化α−
グルコシルトランスフェラーゼ１容量に対し０．１〜５
Ｎ、好ましくは０．５〜１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を
０．５〜１０倍容量加え、４０〜９０℃、好ましくは６
０〜８０℃に加温し、１０分〜２４時間、好ましくは３
０分〜４時間処理して、固定化されているα−グルコシ
ルトランスフェラーゼを分解し、水洗除去した後、再度
上述の如く新たなα−グルコシルトランスフェラーゼを
固定化する。

【００２１】本発明は、酵素固定化用担体として粒状多
孔質キトサンに、脂肪族ポリアルコールのジグリシジル
エーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させて得
られたものを用いることにより、物理的強度と初期活性
に優れ、活性の持続性が良好で、再生による繰り返し使
用が可能な担体を用いた固定化α−グルコシルトランス
フェラーゼを得ることができる。しかも、ここで得られ
た固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを用いるこ
とによって、反応液の脱塩処理が不要となり、連続的に
高い生産性をもって蔗糖からパラチノースおよびトレハ
ルロースを製造することができる。

【００２２】

【実施例】以下に、本発明を実施例をあげて具体的に説
明するが、本発明は、この範囲に限定されるものではな
い。なお、パラチノースおよびトレハルロースの定量は
次の方法により行った。

【００２３】パラチノースおよびトレハルロースの定量
方法反応溶液を次に示す高速液体クロマトグラフ操作条
件で注入し、高速液体クロマトグラムを得、パラチノー
スおよびトレハルロースのピークと内部標準物質のピー
クとの面積比から算出した。 〈高速液体クロマトグラフ操作条件〉 カラム：ＥＲＣ−ＮＨ１１７１ ６×２００mm（エルマ
光学社製） 移動層：アセトニトリル８０：水２０ 流 速：１ｍｌ／分 検出器：示差屈折計 感 度：８〜１６×１０^-5 （ＲＩＵＦＳ） 注入量：２０μｌ

【００２４】（実施例１）脱アセチル化度７９％、平均
分子量４６，０００のキトサン２１０ｇを３．５％酢酸
水溶液２，７９０ｇに溶解した。該キトサン酸性溶液を
７％水酸化ナトリウム、２０％エタノール、７３％水に
よりなる凝固溶液中に落下し、キトサンを粒状多孔質に
凝固再生後、中性になるまで十分水洗し、平均粒径１mm
の粒状多孔質キトサン３，０００ml（湿潤）を得た。得
られた粒状多孔質キトサンの１，５００mlに水１，５０
０mlとエチレングリコールジグリシジルエーテル７．５
ｇを加えて８０℃で１時間反応させた。反応終了後、十
分水洗し架橋粒状多孔質キトサン１，４７０mlを得た。

【００２５】次に表１に示した配合で所定量のフェニル
グリシジルエーテルと非イオン性界面活性剤、商品名ニ
ューポールＰＥ６４（三洋化成工業（株）製）を水１０
０mlに加え、夫々攪拌機で十分攪拌して懸濁液を得た。
次いで架橋粒状多孔質キトサン各１００mlを該懸濁液１
００mlに加え、７０℃で４時間攪拌し反応させた。反応
終了後、反応残液を除去し水で十分に洗浄し、酵素固定
化用担体（担体Ａ〜Ｇ）各９７mlを得た。

【００２６】

【表１】

【００２７】蔗糖３０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス３
ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水
２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌと
し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製
した培地１５Ｌを３０Ｌのジャーファーメンターに入れ
て殺菌し、プロタミノバクター・ルブルム（Protaminob
acter rubrum）ＣＢＳ５７４．７７を接種して、温度２
８℃、通気量１３．０Ｌ／min ，攪拌速度３５０ｒ．
ｐ．ｍで１６時間培養してα−グルコシルトランスフェ
ラーゼ活性の高い培養液を得た。遠心分離してα−グル
コシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラ
リー３．６Ｌを得た後、該スラリーの全量をホモジナイ
ザーで粉砕処理し、プロタミノバクター・ルブルム由来
のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶
液３．３Ｌを得た。

【００２８】担体Ａ〜Ｇをそれぞれ２５ml秤量し３．０
％のグルタルアルデヒド水溶液２０mlに加えて２５℃で
２時間処理した後、水洗し、未反応のグルタルアルデヒ
ドを十分除去した。ついでグルタルアルデヒド処理した
各酵素固定化用担体をプロタミノバクター・ルブルム由
来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素
溶液各８８mlに、温度２５℃にて３時間攪拌した後、水
洗して固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＡ^* 〜
Ｇ^* 夫々２５mlを得た。

【００２９】ここで得られた固定化αグルコシルトラン
スフェラーゼＡ^* 〜Ｇ^* 夫々２０mlを直径１０mm×高さ
３０cmのカラムに充填し、これの夫々に、ｐＨ５．６の
４２％蔗糖（グラニュー糖）水溶液を、２５℃に調製し
てポンプにより１２．６ml/hr の流速でカラム上部より
供給し、カラム下部から出てくる反応溶液を初期より一
定間隔でサンプリングして、反応液中のパラチノースお
よびトレハルロースの含有量を測定し、パラチノースお
よびトレハルロースの含有量が反応初期の半分になるま
でこの反応を行った。このときまでに要した日数を半減
期とすると共に、半減期までに生成したパラチノースお
よびトレハルロースの総計を、測定した含有量から算出
した。

【００３０】更にここで半減期に達した固定化α−グル
コシルトランスフェラーゼＡ^* 〜Ｇ^* に、夫々０．５Ｎ
の水酸化ナトリウム溶液１００mlを加え、７０℃に加温
して４時間処理した後、再度同様の固定化方法で未使用
のα−グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化し
た。これらを再度上述のカラムに充填し、上述の蔗糖溶
液を供給し、カラム下部から出てくる初期の反応溶液を
サンプリングして、反応溶液中のパラチノースおよびト
レハルロースの含有量を測定した。ここで測定したパラ
チノースおよびトレハルロースの含有量が再生固定化の
前の初期の含有量と較べた割合を再生率として算出し
た。その結果を表２示す。

【００３１】

【表２】

【００３２】表２から明らかなように、本発明の方法
は、パラチノースおよびトレハルロースの生成量が多
く、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼの活性の
持続性や再生処理も極めて良好であり、蔗糖溶液からパ
ラチノースおよびトレハルロースを効率良く生産でき
た。

【００３３】（実施例２）実施例１で得られた粒状多孔
質キトサンを１，５００ml秤量し、含有する水をイソプ
ロピルアルコールで十分に置換除去した。表３に示した
如く、所定量のフェニルグリシジルエーテルを夫々イソ
プロピルアルコール１００mlに加えて溶解し、該溶解液
に粒状多孔質キトサン各１００mlを加え、７０℃で４時
間反応させた。

【００３４】反応終了後、反応残液を除去しイソプロピ
ルアルコールで洗浄後、水洗した。次いで夫々水１００
mlにエチレングリコールジグリシジルエーテル０．５ｇ
を加えて溶解し、該溶解液に、フェニルグリシジルエー
テルを所定量反応させた粒状多孔質キトサンを入れ、８
０℃で２時間反応させた。反応終了後、十分水洗し酵素
固定化用担体（担体Ｈ〜Ｍ）各９７mlを得た。

【００３５】

【表３】

【００３６】担体Ｈ〜Ｍを夫々２５ml秤量し３．０％の
グルタルアルデヒド水溶液２０mlに加えて２５℃で２時
間処理した後、水洗し、未反応のグルタルアルデヒドを
十分除去した。ついでグルタルアルデヒド処理した各酵
素固定化用担体を、実施例１で得たプロタミノバクター
・ルブルム（Protaminobacter rubrum）ＣＢＳ５７４．
７７由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有す
る酵素溶液各８８mlに、温度２５℃にて３時間攪拌した
後、水洗して固定化α−グルコシルトランスフェラーゼ
Ｈ^* 〜Ｍ^* 夫々２５mlを得た。

【００３７】ここで得られた固定化α−グルコシルトラ
ンスフェラーゼＨ^* 〜Ｍ^* 夫々２０mlを直径１０mm×高
さ３０cmのカラムに充填し、これの夫々に、実施例１と
同様の方法でｐＨ５．６の４２％蔗糖水溶液を通液し、
実施例１と同様の方法で半減期、半減期までに生成した
パラチノースおよびトレハルロースの総計を測定または
算出した。更にここで半減期に達した固定化α−グルコ
シルトランスフェラーゼＨ^* 〜Ｍ^* を、実施例１と同様
の方法で水酸化ナトリウム溶液処理後、再度未使用のα
−グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化し、再度
上述のカラムに充填して上述の蔗糖溶液を供給し、反応
溶液をサンプリングして再生率を算出した。その結果を
表４示す。

【００３８】

【表４】

【００３９】表４から明らかなように、本発明の方法
は、パラチノースおよびトレハルロースの生成量が多
く、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼの活性の
持続性や再生処理も極めて良好であり、蔗糖溶液からパ
ラチノースおよびトレハルロースを効率良く生産でき
た。

【００４０】（実施例３） (1) 蔗糖３７５ｇ、ペプトン１５０ｇ、肉エキス４５
ｇ、酵母エキス７５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２
水３０ｇおよび塩化ナトリウム４５ｇからなるｐＨ７の
培地１５Ｌを３０Ｌのジャーファーメンターに入れて殺
菌し、セラチア・ブリムチカ（Serratia plymuthica ）
ＡＴＣＣ１５９２８を接種して、温度２８℃、通気量
７．５Ｌ／min ，攪拌速度４００ｒ．ｐ．ｍで１６時間
培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い
培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトランスフェ
ラーゼを含有する微生物菌体のスラリー２．５Ｌを得
た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理してセ
ラチア・ブリムチカ由来のα−グルコシルトランスフェ
ラーゼを含有する酵素溶液２．３Ｌを得た（酵素液
１）。

【００４１】(2) 蔗糖６０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキ
ス１ｇ、酵母エキス１ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１
２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌ
とし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調
製した培地をジャーファーメンターに入れて殺菌し、ア
グロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium ra
diobacter ）ＭＸ−２３２を接種して、温度２８℃、通
気量０．２５Ｌ／min ，攪拌速度４６０ｒ．ｐ．ｍで４
８時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性
の高い培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトラン
スフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー０．２０
Ｌを得た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理
してアグロバクテリウム・ラジオバクター由来のα−グ
ルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液０．１
８Ｌを得た（酵素液２）。

【００４２】(3) 蔗糖１００ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エ
キス３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・
１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１
Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に
調製した培地をジャーファーメンターに入れて殺菌し、
シュードモナス・メソアシドフィラ（Pseudomonas meso
acidophila）ＭＸ−４５を接種して、温度２８℃、通気
量１．２Ｌ／min ，攪拌速度４３０ｒ．ｐ．ｍで６０時
間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高
い培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトランスフ
ェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー０．１５Ｌを
得た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理して
シュードモナス・メソアシドフィラ由来のα−グルコシ
ルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液０．１４Ｌを
得た（酵素液３）。

【００４３】(4) 蔗糖５０ｇ、コーンスチープリカー３
０ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２
水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌと
し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製
した培地をジャーファーメンターに入れて殺菌し、クレ
ブシェラ・テリゲナ（Klebsiella terrigena）ＡＴＣＣ
３３２５７を接種して、温度２８℃、通気量１．０Ｌ／
min ，攪拌速度１４０ｒ．ｐ．ｍで２４時間培養してα
−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を
得、遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを
含有する微生物菌体のスラリー０．２５Ｌを得た。次に
該スラリーの全量をホモジナイザー処理してクレブシェ
ラ・テリゲナ由来のα−グルコシルトランスフェラーゼ
を含有する酵素溶液０．２０Ｌを得た（酵素液４）。

【００４４】実施例１で得られた酵素固定化用担体Ｄと
実施例２で得られた酵素固定化用担体Ｊを夫々２５ml秤
量し、これらを上述の方法で得た酵素液１〜４夫々１０
０mlに加え、室温で２時間攪拌し後、吸着後の残留酵素
液を除去した。次いで２．５％グルタルアルデヒド水溶
液各２５０mlに入れ１時間処理後、充分に水洗して固定
化α−グルコシルトランスフェラーゼＤ１，Ｄ２，Ｄ
３，Ｄ４およびＪ１，Ｊ２，Ｊ３，Ｊ４夫々２５mlを得
た。

【００４５】ここで得られた固定化α−グルコシルトラ
ンスフェラーゼＤ１〜Ｄ４、Ｊ１〜Ｊ４夫々２０mlを直
径１０mm×高さ３０cmのカラムに充填し、これの夫々
に、実施例１と同様の方法でｐＨ５．６の４２％蔗糖水
溶液を通液し、実施例１と同様の方法で半減期、半減期
までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総
計を測定または算出した。更にここで半減期に達した固
定化α−グルコシルトランスフェラーゼＤ１〜Ｄ４、Ｊ
１〜Ｊ４を、実施例１と同様の方法で水酸化ナトリウム
溶液処理後、再度未使用のα−グルコシルトランスフェ
ラーゼを夫々固定化し、再度上述のカラムに充填して上
述の蔗糖溶液を供給し、反応溶液をサンプリングして再
生率を算出した。その結果を表５示す。

【００４６】

【表５】

【００４７】表５から明らかなように、本発明の方法で
得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼはい
ずれの微生物由来のα−グルコシルトランスフェラーゼ
に対しても、パラチノースおよびトレハルロースの生成
量が多く、活性の持続性や再生処理も極めて良好であ
り、蔗糖溶液からパラチノースおよびトレハルロースを
効率良く生産できた。

【００４８】（比較例１）実施例１と同様の酵素固定化
用担体の製造方法において、フェニルグリシジルエーテ
ルを反応させなかったもの（担体Ｏ）と、ＤＥＡＥ−セ
ルロース（担体Ｐ）を用い、実施例１で得られた酵素液
を実施例１と同様の方法で固定化し、固定化α−グルコ
シルトランスフェラーゼＯ^* 、Ｐ^* を得た。

【００４９】得られた固定化α−グルコシルトランスフ
ェラーゼＯ^* 、Ｐ^* 夫々２０mlを直径１０mm×高さ３０
cmのカラムに充填し、これらの夫々に、実施例１と同様
の方法でｐＨ５．６の４２％蔗糖水溶液を通液し、実施
例１と同様の方法で半減期、半減期までに生成したパラ
チノースおよびトレハルロースの総計を測定または算出
した。更に、ここで半減期に達した固定化α−グルコシ
ルトランスフェラーゼＯ^* 、Ｐ^* を、実施例１と同様の
方法で水酸化ナトリウム溶液処理後、再度未使用のα−
グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化し、再度上
述のカラムに充填して上述の蔗糖溶液を供給し、反応溶
液をサンプリングして再生率を算出した。その結果を表
６示す。

【００５０】

【表６】

【００５１】表６から明らかなように、固定化α−グル
コシルトランスフェラーゼＯ^* 、Ｐ^* を用いた本発明以
外の方法は、パラチノースおよびトレハルロースの生産
性が実施例１，２と比較して低く、活性の持続性や再生
処理も劣るものであった。

【００５２】（比較例２）蔗糖３０ｇ、ペプトン１０
ｇ、肉エキス３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナト
リウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇに水を溶
解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜
７．０に調製した培地１５Ｌを３０Ｌのジャーファーメ
ンターに入れて殺菌し、プロタミノバクター・ルブルム
（Protaminobacter rubrum）ＣＢＳ５７４７７を接種し
て、温度２８℃、通気量１３．０Ｌ／min ，攪拌速度３
５０ｒ．ｐ．ｍで１６時間培養してα−グルコシルトラ
ンスフェラーゼ活性の高い培養液を得た。遠心分離して
α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌
体のスラリー３．６Ｌを得た後、該スラリーの全量をホ
モジナイザーで粉砕処理し、プロタミノバクター・ルブ
ルム由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有す
る酵素溶液３．３Ｌを得た。

【００５３】ここで得たα−グルコシルトランスフェラ
ーゼを含有する微生物菌体の破砕物溶液２．５Ｌを、
２．５Ｌの４％アルギン酸ナトリウム水溶液と混合し、
直径０．６mmの細孔を多数有するダイスを取り付けた円
筒形の押し出し機に入れ、空気圧をかけて混合溶液を細
孔より下方へ押し出した。押し出し機の下方には、０．
１５Ｍ塩化カルシウム溶液１０Ｌを入れた２０Ｌ容の容
器を置き、攪拌機によって溶液を攪拌しておき、上方か
ら落下する混合溶液の液滴を受けた。１０分で混合溶液
を押し出し、そのまま塩化カルシウム溶液を２時間攪拌
して、微生物菌体破砕物含有アルギン酸ゲル４kgを得
た。

【００５４】次に３０％ポリエチレンイミン２７０ｇを
約３Ｌの水で希釈してから、希塩酸で中和してｐＨ５．
５に調製し、総量を４kgとした後、先に調製した微生物
菌体破砕物含有アルギン酸ゲル４kgを投入し、１０分間
ゆるやかに攪拌した後、瀘過してゲルを回収し、０．５
％グルタルアルデヒド溶液１０Ｌにゲルを加えて３０分
間攪拌後、水洗してアルギン酸ゲルに微生物菌体破砕物
が包括された固定化α−グルコシルトランスフェラーゼ
３．３kgを得た。

【００５５】これを実施例１と同様の方法でＰＨ５．６
の４２％蔗糖水溶液を通液し、実施例１と同様の方法で
半減期，半減期までに生成したパラチノースおよびトレ
ハルロースの総計を測定または算出したところ、半減期
が２１０日，半減期までに生成したパラチノースおよび
トレハルロースの総計は１２．５ｋｇであった。

【００５６】この様に従来技術の方法は、本発明の方法
に較べると、パラチノースおよびトレハルロースの生産
性が低く、活性の持続性も劣るものであった。また、こ
の固定化方法では再生ができない為、失活した固定化α
−グルコシルトランスフェラーゼは廃棄せざるを得なか
った。

【００５７】

【発明の効果】本発明の方法は、物理的強度に優れた粒
状多孔質キトサンに脂肪族ポリアルコールのジグリシジ
ルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させて
得られた酵素固定化用担体を用い、これにα−グルコシ
ルトランスフェラーゼを固定化させることにより、初期
活性と活性の持続性に優れ、再生による繰り返し使用が
可能な固定化α−グルコシルトランスフェラーゼが得ら
れ、該固定化−αグルコシルトランスフェラーゼに蔗糖
溶液を接触させることによって、パラチノースおよびト
レハルロースを効率良く生産することができるという優
れた効果を発揮する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川村 佳秀 静岡県駿東郡小山町小山89−５ (72)発明者 篠永 正晃 静岡県駿東郡小山町藤曲142−３ (72)発明者 宮澤 文雄 神奈川県横浜市金沢区六浦町2065

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 粒状多孔質キトサンに脂肪族ポリアルコ
   ールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエー
   テルを反応させて得られた酵素固定化用担体に、α−グ
   ルコシルトランスフェラーゼを固定化し、ここで得られ
   た固定化α−グルコシルトランスフェラーゼに蔗糖溶液
   を接触させることを特徴とするパラチノースおよびトレ
   ハルロースの製造方法。