JPH08327631A - 血液凝固活性測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 IX因子の関与する血液凝固活性測定試薬にお
いて、真の生理的な値を測定しえる試薬を提供するにあ
る。 【構成】 Mg²⁺を含有することを特徴とする血液凝固第
IX因子の関与する血液凝固の活性測定試薬およびその方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は血液凝固第IX因子が関与
する血液凝固の活性測定系にMg²⁺を添加することを特徴
とする血液凝固活性測定試薬および測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液は血管内にある時は常に流動的でな
ければならない反面、いったん外傷などで血液が血管外
に出血した場合、直ちに凝固して止血しなければならな
いという相反した機能を持っている。これはヘモスタテ
ィックバランスと呼ばれ、生命機能を維持する上で非常
に重要である。この血液を直ちに凝固せしめるのが血液
凝固系の役目であり、様々な因子や成分がその役目を担
っている。血液凝固反応はセリンプロテアーゼの酵素前
駆体(チモーゲン:zymogen)が特異的アクチベーターによ
って限定分解を受け、活性型のプロテアーゼとなり次の
チモーゲンを活性化するという、いわゆる「カスケー
ド」状の連鎖反応である。血液凝固第IX因子はクリスマ
ス因子とも呼ばれ血液凝固系で中心的役割を果たすプロ
テアーゼ（前駆体）であり、その欠損や異常は血友病Ｂ
として知られる重篤な出血傾向をもたらす。血液凝固に
関与するタンパク質のうちでも、特にその生合成にビタ
ミンＫが必須なビタミンＫ依存性凝固因子（プロトロン
ビン(第II因子)や第VII因子、第IX因子、第X因子および
抗凝固因子であるプロテインＣ）は、Ｎ末端に存在する
γ−カルボキシグルタミン酸(Gla)に富む領域（Gla ド
メイン）をはじめとするいくつかのCa²⁺結合部位を持っ
ており、その機能を発現するために重要な立体構造を維
持する上で強いCa²⁺依存性を示す（Mann, K.G. et al.,
Blood, 76, 1-16,1990）。Ca²⁺は血液凝固因子に結合
し、その立体構造を活性化プロテアーゼが認識しうる形
に変化させることにより、凝固反応を司る。

【０００３】一方Ca²⁺と同じアルカリ土類金属であるMg
²⁺の血液凝固因子への関与についてはほとんど知られて
いない。例えば、Mg²⁺をはじめとするいくつかの多価金
属イオンがビタミンＫ依存性凝固因子のGlaドメイン上
のCa²⁺結合部位に結合することが報告されているが、こ
れらの報告ではタンパク質へのMg²⁺の親和性は大変弱
く、さらにMg²⁺はCa²⁺の作用の代役はできないとされて
いる（Church, W.R. et al., J. Biol. Chem., 264, 17
882-17887, 1989 ; Butenas, S. et al., Biochemistr
y, 33, 3449-3456, 1994 ; Liebman, H.A., Eur. J. Bi
ochem., 212, 339-345, 1993）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、これまでの血
液凝固因子の活性測定系においてはCa²⁺は充分に考慮さ
れ、血液凝固活性測定試薬の構成成分としてCa²⁺が添加
され、反応溶液中でのCa ²⁺の濃度は通常３〜４mMに設定
されている。一方Mg²⁺に関しては全く無視されており、
反応溶液中のMg²⁺はわずかに検体血漿から由来するもの
に限られている。血漿中のMg²⁺濃度は通常0.4〜0.6mMで
あり、測定時には検体血漿は反応試薬溶液により５〜10
倍に希釈されていることから、反応溶液中でのMg²⁺は生
理的濃度より極端に少ない状態で測定されている。この
ことは従来用いられている第IX因子の関与する血液凝固
の活性測定試薬により得られたデータが正確に真の生理
的な条件下で測定して得られたものではないことを意味
する。本発明者らは、血液凝固因子に関し鋭意研究を進
めた結果、血液凝固第IX因子が関与する血液凝固の活性
測定系にMg²⁺を添加することで、生態的条件に近い条件
でより正確に血液凝固第IX因子の血液凝固活性が測定で
きることを見出し本発明を完成した。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、Mg²⁺
を含有することを特徴とする血液凝固第IX因子の関与す
る血液凝固の活性測定試薬、および血液凝固活性を測定
する反応溶液中にMg²⁺を添加することを特徴とする、血
液凝固第IX因子が関与する血液凝固の活性測定方法等に
関する。

【０００６】本発明者らは血液凝固系の研究を進める過
程で、第IX因子および第X因子と結合活性を有する蛇毒
由来の抗凝固蛋白質を単離し、この蛋白質はCa²⁺が結合
した状態の第IX因子および第X因子のGlaドメインの高次
構造を認識することを見出した（Atoda, H. et al., Eu
r. J. Biochem., 224, 703-708, 1994）。次に、蛇毒由
来の抗凝固蛋白質と第IX因子および第X因子との結合に
ついて、Mg²⁺の効果を検討した。その結果、第IX因子の
場合Ca²⁺とMg²⁺の共存によりCa²⁺のみの場合より蛇毒由
来の抗凝固蛋白質との結合が大幅に増加したのに対し、
第X因子の場合はMg²⁺の影響を全く受けなかった。Ca²⁺
の効果は両因子に同じであるのに対し、Mg²⁺の効果は第
IX因子に特異的であること、さらに抗凝固蛋白質上の金
属イオン結合部位とMg²⁺の効果（相互関係）、立体依存
性またはCa²⁺依存性抗第IX因子抗体と第IX因子結合にお
けるMg²⁺の効果などについて種々検討した結果、このMg
²⁺の効果が抗凝固蛋白質に対するものでなく、第IX因子
への効果であることが判明した。この現象をきっかけと
して、Mg²⁺と第IX因子の関係を鋭意研究した結果、これ
まで全く注目されていなかったMg²⁺が第IX因子の構造維
持と生理活性発現にCa²⁺と共に重要な役割を果たすこと
を見出した。さらにGlaを有する他の血液凝固因子、ヒ
トプロトロンビン、ウシ第VII 因子、ウシ第X因子およ
びウシプロティンＣそれぞれに対する立体構造依存性ポ
リクローナル抗体を調製し、各因子と抗体との結合性へ
のMg²⁺の効果を検討した結果、いずれの結合も絶対的な
Ca²⁺依存性を示し、Mg²⁺を共存させても結合の親和性は
ほとんど影響を受けなかった。このようにMg²⁺の効果は
第IX因子に特異的であることを初めて見い出した。この
発明は、血液凝固系におけるMg²⁺の新たな生理的役割を
解明したもので従来使用されている、第IX因子の関与す
る血液凝固活性測定試薬において全く考慮されていない
Mg²⁺の必要性を提示するものである。

【０００７】以下に本発明を詳細に説明する。本発明は
実施例に示される如く、第IX因子の活性化にMg²⁺が充分
量必要であることを開示したものであって、第IX因子が
関与する血液凝固活性を測定する方法および試薬におい
て、生体試料から由来するMg²⁺の他に新たにMg²⁺を添加
することに特徴を有する測定方法および試薬である。新
たに添加するMg²⁺の反応溶液中の濃度としては、0.1mM
程度であっても可能であるが、好ましくは0.3mM以上、
より好ましくは0.5ないし10mM、さらに好ましくは１な
いし５mM、もっとも好ましくは１ないし３mMである。反
応溶液とは、検体である生体試料と試薬成分を混合した
溶液をいい、Mg²⁺の濃度は最終濃度である。本願発明の
測定試薬に含有させるMg²⁺の量は、血液凝固の活性測定
反応液の全容量から計算することができる。いずれにせ
よ、第IX因子が関与する血液凝固の活性測定反応系に、
または試薬にMg²⁺を添加することが本発明である。従っ
て、直接第IX因子のみの活性を測定する場合のみなら
ず、そのほかの凝固因子との総合的凝固活性を測定する
場合も含まれる。例えば第II因子、第VII因子、第X因子
と第IX因子とあわせた凝固活性測定系にMg²⁺を添加する
ことも本発明に含まれる。また、第IX因子が関与しない
と考えられる血液凝固活性測定試薬においても、完全に
第IX因子が含まれない場合は別にして、微量であれ第IX
因子が含まれ活性測定値に影響を及ぼす場合には、この
系にMg²⁺を添加することも本発明に含まれる。ここで血
液凝固活性測定試薬とは、血液の凝固活性を測定するた
めの試薬をいい、例えば血液凝固第IX因子の血液凝固活
性を測定するためには、その試薬中に通常第IX因子を除
いた血液凝固に必要な成分を含んでいる。具体的に血液
凝固の活性測定試薬を例示すれば、トロンボプラスチ
ン、血漿中から特異的に第IX因子を取り除いた血漿（血
液凝固に必須な第II因子、第VII因子、第X因子、リン脂
質、フィブリノーゲン、第V因子、第XIII因子などが含
まれる）、カルシウムなどを含む試薬が挙げられる。Mg
²⁺を添加するとは、Mg²⁺源を加えることをいう。Mg²⁺源
としては、MgF₂，MgCl₂，MgBr₂，MgI₂，(CH₃CO₂)₂Mgな
どのMg²⁺ソースとなりうるものが挙げられる。

【０００８】本発明試薬の具体的態様としては、現在、
いろいろな臨床検査室で広く行われている血液凝固活性
測定における、プロトロンビン時間、部分トロンボプラ
スチン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間な
どの測定に用いられている試薬にMg²⁺、たとえばMgCl₂
として溶解液中に添加すること、単独試薬としてまたは
他の試薬中に添加することでよい。また、血液凝固第IX
因子の活性を向上させることを目的として、第IX因子と
Ca ²⁺の他にMg²⁺を含めた組成物を測定試薬などに利用す
ることも可能である。本願発明によれば血液凝固の活性
測定系にMg²⁺を添加することで、血液凝固第IX因子の構
造を安定化させ、より生態的条件に近い条件でより正確
な血液凝固活性を測定することができる。

【０００９】

【実施例】以下の実施例をもって本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以
下の実施例で使用するヒトおよびウシの第IX因子、第X
因子などは公知の方法に準じて調製するかまたは試薬と
して購入した（Hashimoto, N. et al., J. Biochem., 9
7, 1347-1355, 1985 ; Miletich, J.P. et al., Anal.
Biochem., 105, 340-350, 1980 ; Morita, T., Bioche
m. Biophys. Res. Commun., 130, 841-847, 1985 ）。
各因子のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
は常法により調製した。一般的な試薬、ホスファチジル
コリン、ウシ血清アルブミン、第IX因子欠損血漿などは
試薬として購入した。

【００１０】実施例１ 第IX因子と抗第IX因子抗体との
結合へのMg²⁺の効果 第IX因子と抗第IX因子抗体の結合へのMg²⁺の影響を検討
するにあたり、ウシ第IX因子で感作したウサギの抗血清
より立体構造依存的にウシ第IX因子を認識するポリクロ
ーナル抗体を単離した。また、調製したポリクローナル
抗体およびCa²⁺依存的にヒト第IX因子のGlaドメインを
認識するモノクローナル抗体を用いて、第IX因子との結
合をEnzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)法で観
察した。立体構造依存性抗第IX因子ポリクローナル抗体
はLiebmanらの方法（Liebman,H.A. et al., J. Biol. C
hem., 262, 7605-7612, 1987）の変法で調製した。ウシ
第IX因子で感作したウサギの抗血清を５mM Ca²⁺を含むT
ris-buffered saline(TBS:20mM Tris-HCl,140mM NaCl,p
H7.5)で平衡化したウシ第IX因子のアフィニティカラム
（factor IX-Cellulofine）に添加した。結合のためにC
a²⁺を絶対的に要求する抗体（抗第IX因子・Ca²⁺抗体）
を５mM Mg²⁺を含むTBSで溶出した。次に、Mg²⁺など、Ca
²⁺以外の金属イオン存在下でも第IX因子と結合する抗体
（抗第IX因子・Mg²⁺抗体）および金属イオン非依存的に
第IX因子と結合する抗体を５mM EDTAおよび塩酸グアニ
ジンを含むTBSで順次溶出した。他の凝固因子の立体構
造依存性ポリクローナル抗体も同様にして調製した。

【００１１】各抗体の性質は下記のELISA法により確認
した。TBSで１μg/mlに希釈した第IX因子をマイクロタ
イタープレートに２時間吸着させた後、溶液を除去しTB
S/BSA(TBS+1mg/ml BSA(Bovine serum albumin)) 100μl
で１時間ブロッキングした。各wellをTBS 200μlで３回
洗浄後、各濃度のCa^{2 +}、Mg²⁺を含むTBS/Tween(TBS+0.1%
(v/v)Tween20)で適当な濃度に希釈した各抗体を50μlず
つ添加し、37℃で２時間反応させた。抗体を除去し、同
濃度のCa²⁺、Mg²⁺を含む TBS/Tween 200μlで３回洗浄
した後、同濃度のCa²⁺、Mg²⁺を含むTBS/Tweenで適当な
濃度に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体
（ポリクローナル抗体用）、または抗マウスIgG抗体
（モノクローナル抗体用）を50μlずつ１時間反応させ
た。酵素標識抗体を除去した後、各濃度のCa²⁺、Mg²⁺を
含むTBS/Tween 200μlで５回洗浄した。次に、酵素基質
としてH₂O₂、発色剤としてο−フェニレンジアミンを使
用した反応液（１mg/ml ο−フェニレンジアミンと0.06
％H₂O₂を含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH 5.5））を用いて
50μl ずつ加え、遮光下で30分反応させた。４Ｎ硫酸を
50μlずつ加えて反応を停止させた後、マイクロタイタ
ープレートリーダー（東ソー、MPR-4A）を用いて 492nm
の吸光度を測定した。以上の全操作は室温で行った。す
べての緩衝液はChelex処理したものを使用した。

【００１２】その結果図１に示す如く、抗第IX因子・Ca
²⁺抗体はCa²⁺依存的に第IX因子と結合するが、Mg²⁺のみ
では結合しなかった。Mg²⁺を共存させるとCa²⁺要求性は
低下し、過剰な濃度のCa²⁺存在下でもMg²⁺によって結合
は大幅に増加した。さらにプローブをモノクローナル抗
体に変えて、同様に検討した。用いた二種の抗体は、と
もにCa²⁺が結合した状態のヒト第IX因子のGlaドメイン
を認識するものである。この場合も0.3mMまた３mM Mg²⁺
を共存させることにより結合は大幅に増加し、図１と同
様の結果を得た。以上より第IX因子のGlaドメインの三
次元構造がMg²⁺によって大きく変化していることが明ら
かとなった。つまりCa²⁺、Mg²⁺共存下でのGlaドメイン
の立体構造は、どちらか一方のみ存在する場合とは明ら
かに異なり、第IX因子はCa²⁺のみならずMg²⁺によっても
その立体構造が維持されていると考えられる。

【００１３】参考例１ 他のGla含有凝固タンパク質へ
のMg²⁺の影響 第IX因子以外のGla含有凝固タンパク質へのMg²⁺の影響
の有無を検討するため、各タンパク質、すなわちヒトプ
ロトロンビン、ウシVII因子、ウシ第X因子、ウシプロテ
インＣに対する立体構造依存性ポリクローナル抗体を抗
第IX因子・Ca²⁺抗体と同様の方法で調製し、それぞれの
結合へのMg²⁺の影響を観察した。いずれの結合も絶対的
なCa²⁺依存性を示し、Mg²⁺のみの存在下では結合しなか
った。しかし、第IX因子の場合とは異なり、Ca²⁺にMg²⁺
を共存させても結合の親和性はほとんど変化せず、過剰
のCa²⁺（５〜10mM）存在下ではMg²⁺の影響は全く見られ
なかった。第X因子とプロテインＣにおいては、Mg²⁺に
よるCa²⁺要求性の低下が観察されたが、その変化は第IX
因子の場合に比べて無視できる程度であった。この結果
は第IX因子以外のGla含有凝固タンパク質がMg²⁺の影響
を受けないことを強く示唆する。

【００１４】実施例２ 第IX因子の機能へのMg²⁺の影響 XIa因子を第IX因子アクチベーターとして使用し、Mg²⁺
による第IX因子の立体構造変化に対応した第IX因子活性
化への影響の有無を検討した。実験方法は各濃度のC
a²⁺、Mg²⁺存在下、適当な濃度のヒト第IX因子と2.5ng/m
lヒトXIa因子をTBS/BSA中、37℃で適当な時間反応させ
た。反応後、すべてのサンプル中の総金属イオン濃度が
同じになるようにCa²⁺、Mg²⁺、また金属イオンを完全に
中和できる濃度のEthylenediaminetetraacetic acid(ED
TA)を加えて反応を停止し、第IX因子活性化により生じ
たIXa生成量を以下の凝固アッセイを行い定量した。第I
X因子欠損血漿50μl、上記で調製した溶液50μl 、リン
脂質（ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン
（３：１、W/W ）１mg/ml、TBSで希釈したもの）50μl
を37℃、２分間インキュベートし、そこに20mM Ca²⁺を
含むTBS 50 μl（終濃度５mM）を加えて37℃で凝固を開
始させた。凝固時間の測定は、AmelungCoagulometer KC
4Aを用いた。

【００１５】生成した IXa因子の量は、標準曲線を用い
て算出した。標準曲線は、実際のサンプルと同濃度のCa
²⁺、Mg²⁺、EDTAを含むヒトIXaβ因子精製品で凝固アッ
セイを行い、IXa因子濃度の対数に対して凝固時間の対
数をプロットし作成した。この実験系では、１段階目の
反応でXIa因子をできるだけ低濃度にし、反応時間をか
なり長くとった。この様な条件に設定することによっ
て、２段階目の凝固アッセイを行っている間の二次的な
第IX因子活性化が無視でき、精密なIXa因子生成量の測
定が可能となった。非常に低濃度のIXa因子を定量する
ために、使用する血漿は第IX因子の含量が極めて少ない
ものが好ましい。今回は、先天的に第IX因子が欠損して
いるヒトの血漿およびモノクローナル抗体を用いて含有
する第IX因子を除去した血漿を用いた。速度論的パラメ
ーターの算出は、第IX因子の濃度を0.2〜1.2μMの範囲
で変化させて行った。反応時間は第IX因子活性化の直線
性が保持される範囲内に設定した。得られたデータはEa
die-Hofsteeプロットにより解析した。すべての操作の
緩衝液はChelex処理したものを使用した。

【００１６】その結果図２に示される如く、Ca²⁺にMg²⁺
を共存させるとIXa因子生成量は増加した。一方、Mg²⁺
のみの場合は第IX因子は活性化されなかった。１mMのMg
²⁺が共存するとCa²⁺要求性が一桁低下した。活性化速度
がプラトーに達する過剰なCa ²⁺濃度の場合でさえ、Mg²⁺
によってさらにIXa因子生成量は増加した。ここで得ら
れた図２の曲線の形および要求されるCa²⁺濃度の範囲
は、構造へのMg²⁺の影響の検討より得られた図１と大変
似通っている。このことは、第IX因子の構造がMg ²⁺によ
ってさらに変化した結果に対応してXIa因子に認識され
やすくなったことを示す。Mg²⁺の影響の詳細を明らかに
するため、１mM Mg²⁺存在下、非存在下で第IX因子活性
化の速度論的パラメーターを決定した（表１）。今回得
たMg²⁺非存在下での結果は、以前に異なった方法で求め
られた文献値とほぼ一致する。活性化速度が最大に達す
る濃度（５mM）のCa²⁺が存在するときでさえKm値は0.31
μMであり、第IX因子の血漿中の濃度（約 0.1μM）より
高かった。Mg²⁺を共存させると、Vmax値は変化しなかっ
たが、Km値は0.6倍に減少した。生理的濃度（１mM）のC
a²⁺存在下ではMg²⁺の効果はさらに著しく、Km値は0.91
μMから0.24μMに低下した（図３、表１）。一方kcat値
はMg²⁺によりわずかに（〜20％）低下した。以上の結果
を踏まえて、Michaelis-Mentenの式より生理的条件（血
漿中の第IX因子濃度は0.1μM、遊離のCa²⁺濃度は１mMと
仮定）での活性化の初速度を算出したところ、Mg²⁺の共
存下ではCa²⁺単独の場合より 2.5倍速かった。

【００１７】

【表１】 表中のデータは３回測定した結果の平均±ＳＥ値を示し
た。k_cat値は第XIa因子の活性部位がすべて保持されて
いると仮定して算出した。Sinhaらのデータを参考とし
て併記した(Sinha, D. et al., Biochem.,26,3768-375,
1987)。彼らは第IX因子の³Ｈ標識された活性化ペプチ
ドの遊離量を測定し解析している。

【００１８】実施例３ 第IX因子活性化の経時変化への
Mg²⁺の影響 計算により求めた第IX因子活性化の初速度へのMg²⁺の影
響を考慮に入れて、血漿Mg²⁺の重要性を実証するために
生理的現象のシュミレーション実験を行った。10μg/ml
の第IX因子（血漿中濃度）を１mM Ca²⁺、１mM Mg²⁺（そ
れぞれ生理的遊離濃度の近似値）存在下で活性化し、経
時的に観察した。Mg²⁺存在下（すなわち生理的条件下）
では活性化は効率的に進んだが、Mg²⁺を除くと活性化速
度は大幅に減少した（図４）。この結果はmMのオーダー
で血漿中に存在するMg²⁺が生体内での第IX因子活性化に
大変重要であることを明確に示している。

【００１９】実施例４ 凝固時間へのMg²⁺の影響 実際にMg²⁺の血漿凝固への関与をより生理的な条件下で
検討した。リン脂質、生理的濃度のCa²⁺、Mg²⁺存在下、
TBSに対する透析で含有する金属イオンを除いたヒト血
漿に、Xa因子、IXa因子もしくはXIa因子を加えて凝固を
開始して凝固時間を測定し、トロンビン生成速度へのMg
²⁺の影響を比較した。血漿は、当研究室の人々の提供に
よる血液を用いた。血液をクエン酸採血し、室温で10分
間3000rpmで遠心分離し、乏血小板血漿を得た。金属イ
オンをおよびクエン酸を完全に除くため、血漿をTBS
（２リットル×２）に対して１時間透析した。その後、
直ちに−80℃で保存した。処理した血漿50μl、TBS/BSA
で各濃度に希釈した活性型凝固因子50μl、リン脂質50
μlを37℃、２分間インキュベートした。そこに10mM Ca
²⁺のみ、または４mM Mg²⁺が共存するTBS 50μl（終濃度
はそれぞれ 2.5mM、１mM）を加えて凝固を開始させ、凝
固時間を測定した。その結果図５に示される如く、Xa因
子で凝固を開始した場合はMg²⁺の影響はみられなかっ
た。しかし、IXa因子、XIa因子で開始すると、Mg²⁺の共
存により凝固時間が短縮した。この結果は、Mg²⁺がXIa
因子による第IX因子の活性化はもちろん、IXa因子によ
る第X因子活性化をも促進することを示す。一方、Xa因
子によるプロトロンビン活性化への関与はないと思われ
る。

【００２０】

【図面の簡単な説明】

【図１】 第IX因子と抗第IX因子Ca²⁺抗体との結合に対
するMg²⁺の影響を示す図である。黒丸：Ca²⁺単独、四
角：Ca²⁺＋ 0.3mM Mg²⁺ 、白丸：Ca²⁺＋３mM Mg^{2 +}

【図２】 XIa因子による第IX因子活性化へのMg²⁺の影
響を示す図である。黒丸：Ca²⁺単独、白丸：Ca²⁺＋１mM
Mg²⁺

【図３】 第IX因子活性化へのMg²⁺の影響を示す図であ
る。黒丸：１mM Ca²⁺単独、白丸：１mM Ca²⁺＋１mM Mg
²⁺

【図４】 生理的条件下での第IX因子活性化の経時変化
を示す図である。黒丸：１mM Ca²⁺単独、白丸：１mM Ca
²⁺＋１mM Mg²⁺

【図５】 凝固時間へのMg²⁺の影響を示す図である。黒
丸：2.5mM Ca²⁺単独、白丸：2.5mM Ca²⁺＋１mM Mg²⁺

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Mg²⁺を含有することを特徴とする血液凝
   固第IX因子の関与する血液凝固の活性測定試薬。
2. 【請求項２】 血液凝固活性を測定するための反応溶液
   中に加えたときに少なくとも0.3mM以上の濃度となる量
   のMg²⁺を含有する請求項１記載の血液凝固第IX因子が関
   与する血液凝固の活性測定試薬。
3. 【請求項３】 血液凝固活性を測定するための反応溶液
   中に加えたときに１ないし３mMの濃度となる量のMg²⁺を
   含有する請求項１記載の血液凝固第IX因子が関与する血
   液凝固の活性測定試薬。
4. 【請求項４】 血液凝固活性を測定する反応溶液中にMg
   ²⁺を添加することを特徴とする、血液凝固第IX因子が関
   与する血液凝固の活性測定方法。
5. 【請求項５】 Mg²⁺の濃度が少なくとも0.3mMとなるよ
   うにMg²⁺を添加する請求項４記載の血液凝固第IX因子が
   関与する血液凝固の活性測定方法。
6. 【請求項６】 Mg²⁺の濃度が１ないし３mMとなるように
   Mg²⁺を添加する請求項４記載の血液凝固第IX因子が関与
   する血液凝固の活性測定方法。