JPH0833394B2 - 酵素標識ハプテンの製法 - Google Patents
酵素標識ハプテンの製法Info
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- JPH0833394B2 JPH0833394B2 JP2267188A JP26718890A JPH0833394B2 JP H0833394 B2 JPH0833394 B2 JP H0833394B2 JP 2267188 A JP2267188 A JP 2267188A JP 26718890 A JP26718890 A JP 26718890A JP H0833394 B2 JPH0833394 B2 JP H0833394B2
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵素免疫測定法，ケミルミネッセンス免疫測
定法，蛍光免疫測定法などに利用される酵素標識ハプテ
ンの製法に関する。
定法，蛍光免疫測定法などに利用される酵素標識ハプテ
ンの製法に関する。
（従来の技術） 従来、酵素標識ハプテンの製法として、例えば、過ヨ
ウ素酸酸化法〔クリニカルケミストリー（Clin.Chem.）
24,1801（1978）参照〕やグルタルアルデヒド法〔エン
ドクリノールジャパン（Endocrinol Japan）27,275（19
80）参照〕などが知られている。
ウ素酸酸化法〔クリニカルケミストリー（Clin.Chem.）
24,1801（1978）参照〕やグルタルアルデヒド法〔エン
ドクリノールジャパン（Endocrinol Japan）27,275（19
80）参照〕などが知られている。
（発明が解決しようとする課題） しかしながら、従来の製法では酵素同志のあるいはハ
プテン同志のセルフカップリングによる感度の低下、酵
素活性の低下、安定性の低下など臨床検査薬として重大
な問題を発生させる。
プテン同志のセルフカップリングによる感度の低下、酵
素活性の低下、安定性の低下など臨床検査薬として重大
な問題を発生させる。
（課題を解決するための手段） そこで、本発明者等はセルフカップリングの問題を解
決した酵素標識ハプテンの製法について鋭意検討した結
果、本発明に到達した。すなわち、本発明は、 一般式（Ｉ） の複合体と、一般式（II） の複合体とを反応させることを特徴とする一般式（II
I） で記載される酵素標識ハプテンの製法（式中、Ａはハプ
テンの残基、Ｄは酵素（D-NH2）の残基、Ｒは化学結合
または６員環状炭化水素残基、ｍは２〜５の正数、ｎは
０〜10の正数である。）である。
決した酵素標識ハプテンの製法について鋭意検討した結
果、本発明に到達した。すなわち、本発明は、 一般式（Ｉ） の複合体と、一般式（II） の複合体とを反応させることを特徴とする一般式（II
I） で記載される酵素標識ハプテンの製法（式中、Ａはハプ
テンの残基、Ｄは酵素（D-NH2）の残基、Ｒは化学結合
または６員環状炭化水素残基、ｍは２〜５の正数、ｎは
０〜10の正数である。）である。
本発明において使用されるハプテン（A-NH2）は、ト
リヨードサイロニン（T3），サイロキシン（T4）等の甲
状腺ホルモン、アミノ基を導入したコルチゾール，エス
トラジオール等のステロイドホルモン、アミノ基を導入
したジゴキシン，ジギトキシン，テオフィリン等の薬物
が挙げられる。特にトリヨードサイロニン、サイロキシ
ン等の甲状腺ホルモンは分子中にアミノ基を有している
ので反応に供するのに好ましい。また、本発明において
使用される酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ（PO
D）、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ、グルコアミラーゼ等が挙げられる。酵素標識
ハプテンは、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識トリヨー
ドサイロニン（T3-POD），アルカリホスファターゼ標識
コルチゾール，グルコースオキシダーゼ標識ジゴキシン
等が挙げられる。
リヨードサイロニン（T3），サイロキシン（T4）等の甲
状腺ホルモン、アミノ基を導入したコルチゾール，エス
トラジオール等のステロイドホルモン、アミノ基を導入
したジゴキシン，ジギトキシン，テオフィリン等の薬物
が挙げられる。特にトリヨードサイロニン、サイロキシ
ン等の甲状腺ホルモンは分子中にアミノ基を有している
ので反応に供するのに好ましい。また、本発明において
使用される酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ（PO
D）、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ、グルコアミラーゼ等が挙げられる。酵素標識
ハプテンは、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識トリヨー
ドサイロニン（T3-POD），アルカリホスファターゼ標識
コルチゾール，グルコースオキシダーゼ標識ジゴキシン
等が挙げられる。
一般式（II）中のＲの６員環状炭化水素残基としては
ベンゼン，シクロヘキサン等が挙げられる。
ベンゼン，シクロヘキサン等が挙げられる。
一般式（Ｉ）は、水、N,N−ジメチルホルムアミド（D
MF）、テトラヒドロフラン（THF）、エタノール、アセ
トニトリル等の適当な溶媒中でハプテンと一般式（IV） の化合物とを反応させて得られる。一般式（IV）中のｍ
は２〜５の正数であり、好ましくはｍ＝３（例えばｍ＝
３の時、２−イミノチオラン塩酸塩）である。
MF）、テトラヒドロフラン（THF）、エタノール、アセ
トニトリル等の適当な溶媒中でハプテンと一般式（IV） の化合物とを反応させて得られる。一般式（IV）中のｍ
は２〜５の正数であり、好ましくはｍ＝３（例えばｍ＝
３の時、２−イミノチオラン塩酸塩）である。
ハプテンと一般式（IV）のモル比は通常1:0.1〜20、
好ましくは、1:0.5〜10である。反応温度は通常10〜50
℃、好ましくは、20〜30℃である。反応時間は通常10分
〜24時間、好ましくは、30分〜10時間である。
好ましくは、1:0.5〜10である。反応温度は通常10〜50
℃、好ましくは、20〜30℃である。反応時間は通常10分
〜24時間、好ましくは、30分〜10時間である。
この様にして得られた一般式（Ｉ）はそのまま次の反
応に供してもよいし、溶媒抽出、シリカゲルクロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィー等により精製した後
に次の反応に供することも、勿論可能である。
応に供してもよいし、溶媒抽出、シリカゲルクロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィー等により精製した後
に次の反応に供することも、勿論可能である。
酵素（D-NH2）と一般式（Ｖ） の化合物とを反応させて得られる一般式（II）の複合体
は〔アナリティカル レターズ（ANALYTICAL LETTERS）
15(B2),147〜160（1982）〕に記載の方法で合成するこ
とができる。一般式（Ｖ）中のＲは化学結合または６員
環状炭化水素残基、ｎは０〜10の正数である。この化合
物は、例えば〔ザ ジャーナル オブ バイオケミスト
リー（The Journal of Biochemistry）79,233（197
6），ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミス
トリー（European Journal of biochemistry）101,395
（1979）〕に記載の方法で合成することができるし、ま
た、市販の物（例えばｎ＝１、Ｒ＝シクロヘキサンの
時,4−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル
［４−（N-Male-imidomethyl）cyclohexane-1-carboxyl
ic Acid N-Hydroxysuccinimide ester以下CHMと略記］
を用いることもできる。
は〔アナリティカル レターズ（ANALYTICAL LETTERS）
15(B2),147〜160（1982）〕に記載の方法で合成するこ
とができる。一般式（Ｖ）中のＲは化学結合または６員
環状炭化水素残基、ｎは０〜10の正数である。この化合
物は、例えば〔ザ ジャーナル オブ バイオケミスト
リー（The Journal of Biochemistry）79,233（197
6），ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミス
トリー（European Journal of biochemistry）101,395
（1979）〕に記載の方法で合成することができるし、ま
た、市販の物（例えばｎ＝１、Ｒ＝シクロヘキサンの
時,4−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル
［４−（N-Male-imidomethyl）cyclohexane-1-carboxyl
ic Acid N-Hydroxysuccinimide ester以下CHMと略記］
を用いることもできる。
酵素と一般式（Ｖ）のモル比は通常1:10〜1000、好ま
しくは、1:50〜200である。反応温度は通常10〜50℃、
好ましくは20〜30℃である。反応時間は通常10分〜24時
間、好ましくは、30分〜10時間である。
しくは、1:50〜200である。反応温度は通常10〜50℃、
好ましくは20〜30℃である。反応時間は通常10分〜24時
間、好ましくは、30分〜10時間である。
本発明において、一般式（Ｉ）と一般式（II）を反応
して一般式（III）を得る。一般式（Ｉ）と一般式（I
I）のモル比は通常0.5〜20:1、好ましくは、１〜10:1で
ある。反応温度は通常10〜50℃、好ましくは、20〜30℃
である。反応時間は通常10分〜24時間、好ましくは、30
分〜10時間である。得られた反応物をPH6.0〜9.0のリン
酸バッファー，トリス塩酸バッファー，ほう酸バッファ
ー等の適当なバッファーで平衡化したゲルろ過用カラム
で精製する。
して一般式（III）を得る。一般式（Ｉ）と一般式（I
I）のモル比は通常0.5〜20:1、好ましくは、１〜10:1で
ある。反応温度は通常10〜50℃、好ましくは、20〜30℃
である。反応時間は通常10分〜24時間、好ましくは、30
分〜10時間である。得られた反応物をPH6.0〜9.0のリン
酸バッファー，トリス塩酸バッファー，ほう酸バッファ
ー等の適当なバッファーで平衡化したゲルろ過用カラム
で精製する。
一般式（III）の合成法として一般式（Ｉ）に一般式
（Ｖ）を反応させ次いで酵素を反応させるというような
逐次反応で行う方法も可能である。
（Ｖ）を反応させ次いで酵素を反応させるというような
逐次反応で行う方法も可能である。
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明
はこれに限定されるものではない。
はこれに限定されるものではない。
実施例１ （ａ）T3アミノ基へのSH基の導入 試験管にT3（1mg）を秤量しDMF（1ml）を加え37℃恒
温水槽に５分間浸漬させ溶解した（a-1）。試験管に２
−イミノチオラン塩酸塩（5mg）を秤量し脱イオン水1ml
を加え溶解した（a-2）。（a-1）1mlと（a-2）200μｌ
とを混合し均一な溶液とした後30℃で５時間静置反応さ
せた（a-3）。
温水槽に５分間浸漬させ溶解した（a-1）。試験管に２
−イミノチオラン塩酸塩（5mg）を秤量し脱イオン水1ml
を加え溶解した（a-2）。（a-1）1mlと（a-2）200μｌ
とを混合し均一な溶液とした後30℃で５時間静置反応さ
せた（a-3）。
（ｂ）酵素へのマレイミド基の導入 6mgのPOD（1-C）（東洋紡製）を1mlの0.1モルリン酸
バッファー（PH7.1）に溶解し50μｌのDMFに溶かしたCH
M（4.8mg）を加えて、37℃恒温水槽中で１時間振とう反
応させた。生成した沈澱を遠心分離で除去し上清をセフ
ァデックスG-25のカラム（2.0cm2×70cm,ファルマシア
・ファインケミカル社（スウェーデン）製）に通し、0.
1モルリン酸バッファー（PH6.0）で溶出させた（b-
1）。
バッファー（PH7.1）に溶解し50μｌのDMFに溶かしたCH
M（4.8mg）を加えて、37℃恒温水槽中で１時間振とう反
応させた。生成した沈澱を遠心分離で除去し上清をセフ
ァデックスG-25のカラム（2.0cm2×70cm,ファルマシア
・ファインケミカル社（スウェーデン）製）に通し、0.
1モルリン酸バッファー（PH6.0）で溶出させた（b-
1）。
（ｃ）PODへのT3導入（T3-PODの合成） （a-3）と（b-1）をモル比10:1で混合、均一な溶液と
し30℃で５時間静置反応させた。0.02モルリン酸バッフ
ァー（PH7.0）で平衡化したセファデックスG-25のカラ
ム（2.0cm2×70cm）に反応物をチャージし、1mlづつ溶
出液を分取した。分取した溶出液の酵素活性,T3活性の
測定は、以下の方法で行った。すなわち、T3抗体を結合
したガラス球（以下T3抗体ビーズと略記）と403nmにお
ける吸光度＞0.1である溶出液100μｌを0.1％ウシ血清
アルブミン含有0.02モルリン酸バッファー（PH7.2）300
μ中で37℃,15分間インキュベートした。未反応酵素標
識T3を生理食塩水で洗浄，除去し、発色試薬（ｏ−フェ
ニレンジアミン／H2O2）500μｌを添加し、37℃,15分間
インキュベートした。その後、反応停止液（1.5NH2S
O4）3mlを添加した。492nmにおける吸光度＞0.1を示す
溶出フラクションを、酵素活性,T3活性の両方を有する
画分とし、酵素標識T3を得た。
し30℃で５時間静置反応させた。0.02モルリン酸バッフ
ァー（PH7.0）で平衡化したセファデックスG-25のカラ
ム（2.0cm2×70cm）に反応物をチャージし、1mlづつ溶
出液を分取した。分取した溶出液の酵素活性,T3活性の
測定は、以下の方法で行った。すなわち、T3抗体を結合
したガラス球（以下T3抗体ビーズと略記）と403nmにお
ける吸光度＞0.1である溶出液100μｌを0.1％ウシ血清
アルブミン含有0.02モルリン酸バッファー（PH7.2）300
μ中で37℃,15分間インキュベートした。未反応酵素標
識T3を生理食塩水で洗浄，除去し、発色試薬（ｏ−フェ
ニレンジアミン／H2O2）500μｌを添加し、37℃,15分間
インキュベートした。その後、反応停止液（1.5NH2S
O4）3mlを添加した。492nmにおける吸光度＞0.1を示す
溶出フラクションを、酵素活性,T3活性の両方を有する
画分とし、酵素標識T3を得た。
次に、ウシ血清アルブミン含有リン酸バッファー中に
T3を0ng/dl,800ng/dlになるように添加したもの（以
下、標準T3 0ng/dl,標準T3 800ng/dlと略記）,T3抗体ビ
ーズ,8−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニ
ウム・ウシ血清アルブミン含有バルビタールバッファー
（以下免疫反応用緩衝液と略記），発色液，反応停止液
を用いて、実施例１（本発明の酵素標識ハプテン）と比
較例１（過ヨウ素酸酸化法で得た酵素標識ハプテン），
比較例２（グルタルアルデヒド法で得た酵素標識ハプテ
ン）の性能の比較を行った。酵素標識T3濃度は標準T3 0
ng/dlのアッセイ吸光度＝1.0になるように調製した。ア
ッセイ方法は以下に示す通りである。
T3を0ng/dl,800ng/dlになるように添加したもの（以
下、標準T3 0ng/dl,標準T3 800ng/dlと略記）,T3抗体ビ
ーズ,8−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニ
ウム・ウシ血清アルブミン含有バルビタールバッファー
（以下免疫反応用緩衝液と略記），発色液，反応停止液
を用いて、実施例１（本発明の酵素標識ハプテン）と比
較例１（過ヨウ素酸酸化法で得た酵素標識ハプテン），
比較例２（グルタルアルデヒド法で得た酵素標識ハプテ
ン）の性能の比較を行った。酵素標識T3濃度は標準T3 0
ng/dlのアッセイ吸光度＝1.0になるように調製した。ア
ッセイ方法は以下に示す通りである。
標準T3 100μｌ 免疫反応用緩衝液 300μｌ T3抗体ビーズ １ケ 37℃,15分間インキュベート 生理食塩水で洗浄 酵素標識T3 500μｌ 37℃,15分間インキュベート 生理食塩水で洗浄 発色液 500μｌ 37℃,15分間インキュベート 反応停止液 3ml 表１は実施例１、比較例1,2で得られた酵素標識T3を
用いた時の感度を示す。明かに、感度（標準T3 0ng/dl,
標準T3 800ng/dlのアッセイ吸光度差）は比較例1,2がΔ
＝0.3〜0.4に対し実施例１はΔ＝0.7と約２倍の良好な
感度を示した。
用いた時の感度を示す。明かに、感度（標準T3 0ng/dl,
標準T3 800ng/dlのアッセイ吸光度差）は比較例1,2がΔ
＝0.3〜0.4に対し実施例１はΔ＝0.7と約２倍の良好な
感度を示した。
また酵素活性（比較例1,2の酵素標識T3の希釈倍数を
実施例１の酵素標識T3の希釈倍数50000で割った値）は
表２から明かなごとく実施例１の酵素標識T3は比較例1,
2の酵素標識T3の約10倍であった。
実施例１の酵素標識T3の希釈倍数50000で割った値）は
表２から明かなごとく実施例１の酵素標識T3は比較例1,
2の酵素標識T3の約10倍であった。
実施例１で得られた酵素標識T3の安定性についても表
３から明かなごとく、凍結保存（−40℃〜−20℃）で１
年間安定であった。
３から明かなごとく、凍結保存（−40℃〜−20℃）で１
年間安定であった。
（発明の効果） 本発明の製造法により得られた酵素標識ハプテンは、
ハプテン同志のあるいは酵素同志のセルフカップリング
が起こらないため、感度の低下、酵素活性の低下、安定
性の低下が見られない。よって、本発明の酵素標識ハプ
テンは酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ケミルミネッ
センス免疫測定法等の利用に適している。
ハプテン同志のあるいは酵素同志のセルフカップリング
が起こらないため、感度の低下、酵素活性の低下、安定
性の低下が見られない。よって、本発明の酵素標識ハプ
テンは酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ケミルミネッ
センス免疫測定法等の利用に適している。
Claims (1)
- 【請求項１】一般式（Ｉ） の複合体と、一般式（II） の複合体とを反応させることを特徴とする、一般式（II
I） で記載される酵素標識ハプテンの製法。 （式中、Ａはハプテンの残基、Ｄは酵素（D-NH2）の残
基、Ｒは化学結合または６員環状炭化水素残基、ｍは２
〜５の正数、ｎは０〜10の正数である。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2267188A JPH0833394B2 (ja) | 1990-10-03 | 1990-10-03 | 酵素標識ハプテンの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2267188A JPH0833394B2 (ja) | 1990-10-03 | 1990-10-03 | 酵素標識ハプテンの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04144679A JPH04144679A (ja) | 1992-05-19 |
| JPH0833394B2 true JPH0833394B2 (ja) | 1996-03-29 |
Family
ID=17441341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2267188A Expired - Lifetime JPH0833394B2 (ja) | 1990-10-03 | 1990-10-03 | 酵素標識ハプテンの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0833394B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110174363A (zh) * | 2019-01-09 | 2019-08-27 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途 |
| CN117030997B (zh) * | 2023-08-01 | 2024-06-04 | 美康生物科技股份有限公司 | 一种小分子化合物的均相免疫分析方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4263277A (en) | 1979-06-20 | 1981-04-21 | American Cyanamid Company | Cold permanent wave composition and method containing 2-iminothiolane |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL171930C (nl) * | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
-
1990
- 1990-10-03 JP JP2267188A patent/JPH0833394B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4263277A (en) | 1979-06-20 | 1981-04-21 | American Cyanamid Company | Cold permanent wave composition and method containing 2-iminothiolane |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04144679A (ja) | 1992-05-19 |
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