JPH0833620A - 生体内グルタミン酸の連続計測法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一方が塞がれた透析膜管11と、透析膜管11の
中を通る２本の細管12と、送液管に連結される太管13と
を備えるとともに、細管12と太管13とを接続する接続手
段を備えた透析膜プローブ１において、前記接続手段
は、間隙が生じないように細管12と太管13とを接続した
ことを特徴とする透析膜プローブ１。 【効果】 ノイズ（脈流）の発生を抑制し、高感度で安
定な連続計測を可能にならしめる透析膜プローブ及び連
結管が安価で容易に得られ、脳内や血中のグルタミン酸
測定、アミノ酸類、神経伝達物質、神経伝達修飾物質等
の細胞外に存在する物質の計測を行う実験生物学や、臨
床検査技術、あるいは無機又は有機化学の反応過程の研
究や、環境状態のモニター等種々の分野に適用すること
ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、計測対象物から経時的
に回収される物質を連続計測することのできる透析膜プ
ローブ及び連結管に関し、特にノイズがなく、安定かつ
高感度な分析を可能にせしめる連続計測用の透析膜プロ
ーブ及び連結管に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、種々の反応を利用して生体内
の物質を計測する方法が行われている。このような計測
法としては、例えば、微少透析法、バイオセンサー法、
ボルタメトリー法等がある。これらの計測法のうち、バ
イオセンサー法は、電気的な計測系に変換しなくてはな
らないため、計測物質が限定され、ボルタメトリー法
は、物質の酸化還元電位を直接計測するため、酸化還元
電位を有さない物質には応用できなく、従って汎用さの
点では、微少透析法が優れている。

【０００３】これらの計測方法においては、通常は計測
対象物を一定時間回収し、回収した物質について分析す
るという方法が取られており、当該計測に使用するプロ
ーブや連結管も、そのような使用方法を前提として設計
されている。しかしながら、物質の計測をリアルタイム
で行うことができれば、上記方法では見出せなかった事
実を発見する可能性が高いことは容易に想像できる。そ
こで、このような連続計測を行うことが提案されたが
（Analytica Chimica Acta,205(1988)53-59 , Brain Re
search,475(1988)58-63 参照）、ノイズ（脈流）の発生
により、安定して感度の高い分析を行うことができなか
った。これは、前述したプローブや連結管が、連続計測
を考慮して設計されておらず、ノイズ源となる空気が溜
まり得る部分（空気滞留部）が存在するからである。

【０００４】図４は、従来の透析プローブを示す断面図
である。この透析プローブ４は、管状の本体部41と、本
体部41の一端に設けられ、先端が塞がれた透析膜管42
と、透析膜管42及び本体部41の中を通る細管43ａと、本
体部の途中まで達している細管43ｂと、細管の外径を大
きくするためにそれぞれの細管43ａ，43ｂに継がれたス
テンレス管44ａ，44ｂと、本体部41、ステンレス管44
ａ，44ｂ及び細管43ａ，43ｂを保持する保持部材45とを
有する。

【０００５】この透析プローブ４における細管43ａ（43
ｂ）とステンレス管44ａ（44ｂ）との接続部を、図５に
示す。接続部は、ステンレス管44ａ（44ｂ）と、ステン
レス管44ａ（44ｂ）に挿入された細管43ａ（43ｂ）との
境界部分を表面上接着部材46ａで固着してなり、細管43
ａ（43ｂ）とステンレス管44ａ（44ｂ）との間には間隙
（空気滞留部）Ｄが存在する。

【０００６】このような空気滞留部Ｄは、細管43ａ（43
ｂ）とステンレス管44ａ（44ｂ）との接続部のみなら
ず、本体部41において透析膜管42を固定している接着部
材46ｂの後端部にも存在する。上記のように空気滞留部
を有する透析プローブでは、計測時に当該空気滞留部に
空気が溜まり、微少な水圧変化にも計測系が応答して流
速の変化が増強され、正確な分析ができない。また、空
気滞留部に溜まっていた空気自体が流れ出してノイズと
なることもある。

【０００７】ノイズを抑制するために、流速を高めると
いう手段もあるが、高流速であるために引き起こされ
る、生体の冷却効果、透析膜での検体回収率低下という
新たな問題が発生し、汎用性、特異性、安定性を保持し
ながら高感度な分析を行うことができない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、計測
対象物質の回収率が高く、かつノイズ（脈流）の発生率
が低く、高感度で安定な分析を行うことができる安価で
汎用な透析膜プローブを提供することである。また、本
発明の別の課題は、ノイズの発生率が低く、高感度で安
定な分析を行うことができる連結管を提供することであ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者は、細管と太管との間に間隙がない透
析膜プローブ又は連結管を作製し、これらを用いて計測
すれば、ノイズの発生率が低く、高感度で安定な分析を
行うことができることを見出し、本発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明は、一方が塞がれた透析
膜管と、前記透析膜管の中を通る２本の細管と、送液管
に連結される太管とを備えるとともに、前記細管と前記
太管とを接続する接続手段を備えた透析膜プローブであ
って、前記接続手段は、間隙が生じないように前記細管
と前記太管とを接続したことを特徴とする透析膜プロー
ブである。

【００１１】また、本発明は、少なくとも２以上の整数
であるｎ本の送液管を流れる液体の流れを、１本の送液
管を流れる液体の流れに、又は１本の送液管を流れる液
体の流れを、少なくとも２以上の整数であるｎ本の送液
管を流れる液体の流れに変換する連結管であって、ｎ本
の細管と、前記ｎ本の細管のそれぞれに接続されたｎ本
の太管と、前記ｎ本の細管の束に接続された太管とを有
し、前記ｎ本の細管と前記（ｎ＋１）本の太管とは、間
隙がない状態で接続されていることを特徴とする連結管
である。

【００１２】以下、図面を参照して本発明を詳細に説明
する。 〔１〕透析膜プローブ 図１は、本発明の透析膜プローブの一例を示す概略図で
ある。本発明の透析膜プローブ１は、封着材14ｂによっ
て一方が塞がれた透析膜管11と、透析膜管11の中を通る
２本の細管12と、送液管に連結できるようにそれぞれの
細管12に外嵌された太管13とを有する。それぞれの細管
12と太管13との間には封着材14ａが充填され、間隙がな
い。このように、細管12と太管13との間の間隙をなくし
たことにより、空気が溜まり得る部分（空気滞留部）が
全くなくなっている。

【００１３】また、本実施例では、透析膜管11の開口部
が封着材14ｂによって、透析膜管11側の太管13の端部及
び透析膜管11と太管13との間における細管12が封着材14
ｃによって封着されており、２本の細管12のうち、一方
の細管12ａは、透析膜管11のほぼ先端まで達しており、
他方の細管12ｂは、透析膜管11の途中まで達している。

【００１４】なお、本発明において「封着」とは、樹脂
等によって、隙間のないように各々の部材を接着・固定
することをいう。従って、透析膜管11における上端部〜
細管12ｂのほぼ下端部分まで（図中Ａ）も、封着材14ｃ
によって充填されている。本発明の透析膜プローブ１に
おける透析膜管11の太さ及び長さは、対象物によって幅
広く変化するが、通常太さは0.1〜0.5mm程度であるのが
好ましく、長さは２〜10mm程度であるのが好ましい。

【００１５】また、透析膜管11を形成する透析膜の材質
は、通常使用されるものであればいかなるものを用いて
もよく、例えば、セルロース系膜、各種濾過膜（ポリス
ルホン、ポリカーボネート等）、焼結フィルター等を用
いることができる。また、透析膜の厚さ及び孔の大きさ
は、計測対象物の種類によって適宜設定すればよく、通
常厚さは、５〜20μｍ程度であり、孔の大きさ（直径）
は0.1〜20μｍ程度である。

【００１６】透析膜管11の先端を塞ぐ封着材14ｂは、い
かなるものからなってもよく、例えば、エポキシ樹脂等
の接着剤、テフロン等の合成樹脂等を用いることができ
る。本発明における細管12ａの下端部は、図１では透析
膜管11のほぼ先端まで達しているが、他方の細管12ｂと
の距離をある程度保持して、灌流液に計測対象物を十分
溶出させることができれば、下端部の位置は特に限定さ
れない。

【００１７】同様に、上記細管12ａとの距離をある程度
保持して、灌流液に計測対象物を十分溶出させることが
できれば、もう一方の細管12ｂの下端部の位置は特に限
定されないが、気泡の滞留を回避するために、封着材14
ｃの下端部に合わせるのが好ましい。細管12ａ，12ｂ
は、配管を容易にするために、透析膜管11の上方におい
て相反する方向へ曲がって、全体としてＹ字状になって
いるのが好ましい。

【００１８】細管12の太さ（内径）は、一般的に0.05〜
0.2mm程度である。また、細管12の材質は、通常使用さ
れるものであればいかなるものを用いてもよく、例え
ば、テフロン、塩化ビニル、ポリイミド樹脂コーティン
グ石英管（P.F.S.）、フューズドシリカ等を用いること
ができる。太管13の上端面は、図１においては、細管12
の上端面と同一平面上にあるが、細管12と太管13との間
に間隙がなく、空気滞留部ができなければ、太管13のみ
が上方に突出していてもよい。通常使用される送液管を
連結させやすいように、太管13の太さ（外径）は、0.2
〜0.8mm程度であるのが好ましく、封着材14ａの外側に
出ている太管13の長さは、３〜10mm程度であるのが好ま
しい。

【００１９】太管13の材質は、送液管とジョイントでき
れば特に限定されないが、耐久性、密着性等を考慮して
ステンレス、テフロン等の合成樹脂等を用いるのが好ま
しい。封着材14ｃが透析膜管11を封着する長さＡは、透
析膜管11と細管12とを十分固定できれば特に限定されな
く、0.5〜５mm程度が好ましい。封着材14ｃの材質は、
隙間のないように各々の部材を接着・固定することがで
きれば、いかなるものを用いてもよく、例えば、エポキ
シ樹脂、デンタルセメント、各種接着剤等を用いること
ができ、また、それらを併用することもできる。

【００２０】本実施例の透析膜プローブ１では、太管13
と細管12との間隙を埋めるために封着材14ａを使用して
いるが、本発明はこれに限定されることなく、例えば、
細管の外径と同一の内径を有する太管を用いれば、封着
材を使用する必要はない。また、本実施例の透析膜プロ
ーブ１では、透析膜管11の開口部、透析膜管11側の太管
13の端部及び透析膜管11と太管13との間における細管12
を、封着材14ｃにより後から封着しているが、本発明は
これに限定されることなく、例えば、透析膜管以外の部
材を一体的に同時に成形し、これと透析膜管とを接着し
てもよい。

【００２１】本発明の透析膜プローブ１を例えば生体に
使用するには、まずそれぞれ太管１３に送液管を連結
し、透析膜部（透析膜管の先端部〜封着材の下端部分ま
で；図中Ｂ）を生体に刺入する。次いで、一方の送液管
から細管１２ａに灌流液を流入させ、透析膜管11の中を
灌流液で満たす。この灌流液中に、透析膜を通って計測
対象物が溶出し、当該灌流液とともにもう一方の細管12
ｂから流出する。

【００２２】このとき、上記のような構造を有する本発
明の透析膜プローブには、空気が溜まり得る部分（空気
滞留部）が全くないため、当該透析膜プローブを使用す
れば、空気滞留部に起因するノイズの発生率が非常に低
く、高感度で安定な連続計測を行うことができる。ま
た、本発明の透析膜プローブは、構造が単純なため、安
価で容易に製造することができる。さらには、灌流液及
び計測対象物は、不活性化された空間を通過し、金属等
と接触することがないため、それら自身の変性のおそれ
がない。

【００２３】本発明の透析膜プローブを用いることによ
り、上記のように生体中の化学物質の連続計測をするこ
とができる。例えば、脳内のグルタミン酸測定、その他
各種のアミノ酸、神経伝達物質、神経伝達修飾物質、糖
代謝関連物質等の細胞外へ漏出される物質の計測を行う
ことができる。また、生体を対象とした実験生物学や、
臨床検査技術に限定されることなく、無機又は有機化学
の反応過程の研究や、環境状態のモニター等種々の分野
に適用することができる。 〔２〕連結管 本発明の連結管は、複数の送液管を流れる液体の流れ
を、１本の送液管を流れる液体の流れに、又は１本の送
液管を流れる液体の流れを、複数の送液管を流れる液体
の流れに変換するための連結管であるが、説明の簡単の
ために、２本の流れの場合を例にとって以下説明する。

【００２４】図２は、本発明の連結管の一例を示す概略
図である。本発明の連結管２は、２本の細管21ａ，21ｂ
と、２本の細管21ａ，21ｂが枝分かれしている方におい
て、細管21ａに外嵌された太管22ａ及び細管21ｂに外嵌
された太管22ｂと、２本の細管21ａ，21ｂが束状になっ
ている方において、２本の細管21ａ，21ｂの束に外嵌さ
れた太管22ｃとを有し、細管21ａと太管22ａ、細管21ｂ
と太管22ｂ、及び細管21ａ，21ｂと太管22ｃとの間には
封着材23ａが充填され、間隙がない。

【００２５】このように、それぞれの細管と太管との間
の間隙をなくしたことにより、空気が溜まり得る部分
（空気滞留部）が全くなくなり、従って、空気滞留部に
起因するノイズの発生率が非常に低く、高感度で安定な
連続計測を行うことができる。本実施例の連結管では、
それぞれの太管22ａ，22ｂ，22ｃの端部同士を連結する
細管21ａ，21ｂと、太管22ａ，22ｂ，22ｃの端部とが封
着材23ｂによって封着されており、それぞれの細管及び
太管が固定されている。

【００２６】細管21ａ，21ｂの太さ（内径）は、一般的
に0.05〜0.2 mm程度であるのが好ましい。また、細管21
ａ，21ｂの材質は、通常使用されるものであればいかな
るものを用いてもよく、例えば、テフロン、塩化ビニ
ル、フューズドシリカ、P.F.S.等を用いることができ
る。太管22ａ，22ｂ，22ｃの端面は、図２においては、
細管21ａ，21ｂの端面と同一平面上にあるが、細管と太
管との間に間隙がなく、空気滞留部ができなければ、太
管のみが突出していてもよい。通常使用される送液管を
連結させやすいように、太管の太さ（外径）は、0.2〜
0.8mm程度であるのが好ましく、封着材の外側に出てい
る太管の長さは、３〜10mm程度であるのが好ましい。

【００２７】太管22ａ，22ｂ，22ｃの材質は、送液管と
連結できれば特に限定されないが、耐久性、密着性等を
考慮してステンレス、テフロン等の合成樹脂等を用いる
のが好ましい。封着材23ａ，23ｂの材質は、各々の部材
を接着・固定することができれば、いかなるものを用い
てもよく、例えば、エポキシ樹脂、デンタルセメント、
各種接着剤等を用いることができ、また、それらを併用
することもできる。

【００２８】本実施例の連結管２では、太管と細管との
間隙を埋めるために封着材23ａを使用しているが、本発
明はこれに限定されることなく、例えば、細管の外径と
同一の内径を有する太管を用いれば、封着材を使用する
必要はない。また、本実施例の連結管では、太管と太管
の間における細管とを、封着材によっで後から封着して
いるが、本発明はこれに限定されることなく、例えば、
太管と細管とを一体的に同時に成形してもよい。 〔３〕透析膜プローブ及び連結管を使用した実験方法 本発明の透析膜プローブ及び連結管を使用した実験方法
の一例を以下説明する。図３は、脳内微少透析法によっ
てラットの脳内におけるグルタミン酸量を連続計測する
方法を示す概略図である。

【００２９】本実験方法では、リンガー溶液及び酵素溶
液を流出させるシリンジポンプ31と、シリンジポンプ31
に設置され、一定速度でリンガー溶液及び酵素溶液を流
出させる注入器32ａ，32ｂと、注入器32ａに接続され、
リンガー溶液が中を流れる送液管33ａと、注入器32ｂに
接続され、酵素溶液が中を流れる送液管33ｂと、送液管
33ａの途中に設けられたループインジェクター34と、ラ
ットに刺入される透析膜プローブ１と、透析膜プローブ
１との間でリンガー溶液を往復させるデュアルシーベル
35と、デュアルシーベル35からの送液管33ａ及び注入器
32ｂからの送液管33ｂを１本の管にまとめる連結管２
と、連結管２によってまとめられた送液管33ｃと、送液
管33ｃの先に接続されたフローセル付蛍光検出器36とを
用いる。

【００３０】具体的には、まず脳地図を参照して透析膜
プローブ１をラットの内側前頭葉皮質に刺入して固定す
る。術後回復約１日後、ラットの自由行動下、注入器32
ａから透析膜プローブ１にリンガー液を灌流させる。通
常使用するリンガー液は、（日本）薬局法に準ずるもの
であるが、他の生物系の緩衝液でもよく、流速は0.5〜
2.5μl ／分程度が好ましい。

【００３１】リンガー液は、ループインジェクター34を
通り、デュアルシーベル35を介して透析膜プローブ１に
達する。このループインジェクター34を用いることによ
り、ノイズ源となる圧変化を減少させることができる。
透析膜を通って溶出したグルタミン酸は、リンガー液と
ともに透析膜プローブ１から流出し、デュアルシーベル
35を介して連結管２へ向かう。一方、これと同時に注入
器32ｂから酵素溶液を連結管２に流し込み、グルタミン
酸を含有するリンガー液と合流させ、一定時間反応させ
る。ここで使用する酵素は、グルタミン酸脱水素酵素で
あり、他に、グルタミン酸酸化酵素を用いることも可能
である。酵素溶液の流速は、リンガー液の流速と同様の
速さとすればよく、0.5〜2.5μl／分程度が好ましい。

【００３２】グルタミン酸と酵素との反応は送液管33ｃ
中で行い、反応時間は、１〜５分程度が好ましい。この
グルタミン酸脱水素反応により、蛍光物質である還元型
β・ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）が生成されるため、このＮＡＤＨの量をフローセル
付蛍光検出器36を用いて連続的に計測することにより、
脳内のグルタミン酸量を測定・分析することができる。
蛍光検出器36における励起波長は、340nm前後が好まし
く、計測波長は、450〜460nm程度が好ましい。また、フ
ローセルの容量は、５μl 以下が好ましい。

【００３３】以上の実験方法において、本発明の透析膜
プローブ及び連結管を使用することにより、ノイズ（脈
流）の発生を防止し、送液（リンガー液，酵素溶液）の
流速を一定に保つことができるため、灌流液の流速の変
化による計測対象物の回収率の変化を抑制するととも
に、反応溶液（計測対象物含有灌流液・酵素溶液）の流
速の変化による各液の混合比の変化を抑制することがで
き、連続計測において信頼性の高い分析を行うことがで
きる。また、ノイズ（脈流）の発生がほとんどないた
め、流速を高める必要がなく、従って感度が高く、特異
性に優れた分析を行うことができる。

【００３４】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何等限定す
るものではない。 （実施例１）本実施例では、図１に示すような透析膜プ
ローブを作製した。

【００３５】全長７mm、外径0.23mmの再生セルロースか
らなる透析膜管（アサヒ化成社製、分子量カット：５
万）の一端を、エポキシ系接着剤（セメダイン社製、ハ
イスーパー５）により塞いだ。透析膜管の他端から内径
0.1 mm、全長20mm及び17mmのフューズドシリカからなる
２本の細管（エイコム社製）を挿入し、図１に示すＡの
部分を、上記エポキシ系接着剤からなる封着材により封
着した。Ａの長さは４mmであった。

【００３６】透析膜管から出ている２本の細管を、それ
ぞれ全長10mm、外径0.55mmのステンレス管（テルモ社
製）に通し、両者の間を上記エポキシ系接着剤により充
填し、はみ出した部分を切り取った。２本の細管及び透
析膜管を、Ｙ字型になるように、上記エポキシ系接着剤
からなる封着材により封着し、その上からデンタルセメ
ント（ＧＣ歯科社製、ユニファスト）により固定した。
封着材から出ているステンレス管の長さは、いずれも約
５mmであった。

【００３７】（実施例２）本実施例では、図２に示すよ
うな連結管を作製した。内径0.1mm、全長25mmのフュー
ズドシリカからなる２本の細管（エイコム社製）を、全
長10mm、外径0.55mmのステンレス管（テルモ社製）に通
し、細管とステンレス管との間をエポキシ系接着剤（セ
メダイン社製、ハイスーパー５）により充填し、はみ出
した部分を切り取った。

【００３８】同様に、ステンレス管から出ている２本の
細管を、それぞれ全長10mm、外径0.55mmのステンレス管
に通し、両者の間を上記エポキシ系接着剤により充填
し、はみ出した部分を切り取った。以上の細管及びステ
ンレス管を、Ｙ字型になるように、上記エポキシ系接着
剤からなる封着材により封着し、その上からデンタルセ
メント（ＧＣ歯科社製、ユニファスト）により固定し
た。封着材から出ているステンレス管の長さは、いずれ
も約５mmであった。

【００３９】（実験例１）本実験例は、図３に示すよう
な構成で行った。実際に実験を始める前に、以下のよう
にして本測定系の検量線を作成した。実施例１で得られ
た透析膜プローブの透析膜管部分を、所定の濃度のグル
タミン酸溶液中に設置し、高速液体クロマトグラフィー
用の注入器（レオダイン社製、モデルNo.9125 ）から透
析膜プローブにリンガー液（大塚薬品社製、リンゲル
液）を2.5μl ／分の流速で灌流させた。なお、シリン
ジポンプとしては、Ｂ．Ａ．Ｓ社製のCMA102マイクロイ
ンジェクションポンプ、送液管としては、エイコム社製
のテフロンチューブ（内径0.1mm）、デュアルシーベル
としては、インステック社製の375/D/22QEを使用した。

【００４０】一方、グルタミン酸脱水素酵素溶液（ベー
リンガーマンハイム社製、127086）を2.5μl ／分の流
速で送液し、上記リンガー液（グルタミン酸含有）と合
流させて３分間反応させ、５μl フローセル付蛍光検出
器（日本分光社製、821FP ）を通過させた。このとき、
励起波長は340nmとし、計測波長は450nmとして行った。

【００４１】溶液中のグルタミン酸の含有量を、１μM
、２μM 、３μM 、４μM 、５μM、３μM 、３μM 、
３μM 、３μM 及び３μM と経時的に10回変化させ、蛍
光検出器で検出した電圧を、蛍光検出器に連結したレコ
ーダによりプリントアウトした。結果を図６に示す。図
６のグラフから明らかなように、３μM グルタミン酸に
ついての測定を複数回行っても、ほとんど同様の結果が
出ており、従って本測定系は非常に精度が高いというこ
とができる。図６のグラフから作成される検量線を、図
７に示す。

【００４２】（実験例２）透析膜プローブを、ラットの
内側前頭葉皮質に刺入して頭蓋部と連結固定した。術後
回復１日後、ラットの自由行動下、リンガー液を2.5μl
／分の流速で灌流させるとともに、グルタミン酸脱水
素酵素溶液を2.5μl ／分の流速で上記リンガー液（脳
内からのグルタミン酸含有）と合流させて３分間反応さ
せた。

【００４３】計測開始60分後に、ラットに興奮剤の１種
であるベラトリジン（ＶＥＲ）（シグマ社製）を12.5μ
l 注射し、計測開始80分後に、神経伝達効率を変化させ
る試薬であるソディウムニトロプルシッド（ＳＮＰ）
（和光社製）及びＶＥＲ12.5μl を注射し、計測開始10
0分後に、再度ＶＥＲのみ12.5μl を注射した。ラット
の脳内で分泌されたグルタミン酸量の経時変化を図８に
示す。

【００４４】（実験例３）実験例２において、２回目の
注射物をＳＮＰ12.5μl のみとする以外、同様にして連
続計測を行った。結果を図８に示す。 （実験例４）実験例２において、２回目の注射物を、煮
沸したＳＮＰ及びＶＥＲ12.5μl とする以外、同様にし
て連続計測を行った。結果を図８に示す。

【００４５】図８のグラフから明らかなように、本発明
の透析膜プローブ及び連結管を用いた連続計測系では、
ノイズ（脈流）の発生がなく、高感度で安定な分析を行
うことができた。 （実験例５）実験例２と同様にして連続計測を行い、電
圧の経時変化を測定した。時間と検出した電圧との関係
を示すグラフを図９に示す。

【００４６】（比較例１）実験例５において、図４に示
す従来の透析プローブを使用する以外、同様にして連続
計測を行った。時間と検出した電圧との関係を示すグラ
フを図10に示す。図９及び図10のグラフから明らかなよ
うに、従来の透析プローブを使用するとノイズ（脈流）
が発生し、正確な測定ができないのに対し、本発明の透
析膜プローブを使用すると、ノイズがほとんどなく、高
感度で安定な分析を行うことができる。

【００４７】

【発明の効果】本発明によれば、ノイズ（脈流）の発生
を抑制し、高感度で安定な連続計測を可能にならしめる
透析膜プローブ及び連結管が安価で容易に得られる。本
発明の透析膜プローブ及び連結管は、脳内や血中のグル
タミン酸測定、アミノ酸類、神経伝達物質、神経伝達修
飾物質等の細胞外に存在する物質の計測を行う実験生物
学や、臨床検査技術、あるいは無機又は有機化学の反応
過程の研究や、環境状態のモニター等種々の分野に適用
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の透析膜プローブを示す概略図であ
る。

【図２】 本発明の連結管を示す概略図である。

【図３】 本発明の透析膜プローブ及び連結管を用いた
連続計測系を示す概略図である。

【図４】 従来の透析プローブを示す断面図である。

【図５】 従来の透析プローブにおける細管とステンレ
ス管との接続部分を示す概略図である。

【図６】 実験例１におけるグルタミン酸量と検出電圧
（経時変化）との関係を示すグラフである。

【図７】 実験例１におけるグルタミン酸量と検出電圧
との関係を示す検量線である。

【図８】 実験例２〜４におけるグルタミン酸量の経時
変化を示すグラフである。

【図９】 実験例５における検出電圧の経時変化を示す
グラフである。

【図10】 比較例１における検出電圧の経時変化を示す
グラフである。

【符号の説明】

１・・・透析膜プローブ 11，42・・・透析膜管 12，12ａ，12ｂ，21ａ，21ｂ，43ａ，43ｂ・・・細管 13，22ａ，22ｂ，22ｃ・・・太管 14ａ，14ｂ，14ｃ，23ａ，23ｂ，23ｃ・・・封着材 ２・・・連結管 31・・・シリンジポンプ 32ａ，32ｂ・・・注入器 33ａ，33ｂ，33ｃ・・・送液管 34・・・ループインジェクター 35・・・デュアルシーベル 36・・・蛍光検出器 ４・・・透析プローブ 41・・・本体部 44ａ，44ｂ・・・ステンレス管 45・・・保持部材 46ａ，46ｂ・・・接着部材

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年６月２０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【書類名】 明細書

【発明の名称】 生体内グルタミン酸の連続計測法

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体内のグルタミン酸
を連続計測する方法に関し、特にノイズがなく、安定か
つ高感度な分折が可能な生体内グルタミン酸の連続計測
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、種々の反応を利用して生体内
の物質を計測する方法が行われている。このような計測
法としては、例えば、微少透析法、バイオセンサー法、
ボルタメトリー法等がある。これらの計測法のうち、バ
イオセンサー法は、電気的な計測系に変換しなくてはな
らないため、計測物質が限定され、ボルタメトリー法
は、物質の酸化還元電位を直接計測するため、酸化還元
電位を有さない物質には応用できなく、従って汎用さの
点では、微少透析法が優れている。

【０００３】これらの計測方法においては、通常は計測
対象物を一定時間回収し、回収した物質について分析す
るという方法が取られており、当該計測に使用するプロ
ーブや連結管も、そのような使用方法を前提として設計
されている。しかしながら、物質の計測をリアルタイム
で行うことができれば、上記方法では見出せなかった事
実を発見する可能性が高いことは容易に想像できる。そ
こで、このような連続計測を行うことが提案されたが
（Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２
０５（１９８８）５３−５９，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，４７５（１９８８）５８−６３参照）、ノイズ
（脈流）の発生により、安定して感度の高い分析を行う
ことができなかった。これは、前述したプローブや連結
管が、連続計測を考慮して設計されておらず、ノイズ源
となる空気が溜まり得る部分（空気滞留部）が存在する
からである。

【０００４】図４は、従来の透析プローブを示す断面図
である。この透析プローブ４は、管状の本体部４１と、
本体部４１の一端に設けられ、先端が塞がれた透析膜管
４２と、透析膜管４２及び本体部４１の中を通る細管４
３ａと、本体部の途中まで達している細管４３ｂと、細
管の外径を大きくするためにそれぞれの細管４３ａ，４
３ｂに継がれたステンレス管４４ａ，４４ｂと、本体部
４１、ステンレス管４４ａ，４４ｂ及び細管４３ａ，４
３ｂを保持する保持部材４５とを有する。

【０００５】この透析プローブ４における細管４３ａ
（４３ｂ）とステンレス管４４ａ（４４ｂ）との接続部
を、図５に示す。接続部は、ステンレス管４４ａ（４４
ｂ）と、ステンレス管４４ａ（４４ｂ）に挿入された細
管４３ａ（４３ｂ）との境界部分を表面上接着部材４６
ａで固着してなり、細管４３ａ（４３ｂ）とステンレス
管４４ａ（４４ｂ）との間には間隙（空気滞留部）Ｄが
存在する。

【０００６】このような空気滞留部Ｄは、細管４３ａ
（４３ｂ）とステンレス管４４ａ（４４ｂ）との接続部
のみならず、本体部４１において透析膜管４２を固定し
ている接着部材４６ｂの後端部にも存在する。上記のよ
うに空気滞留部を有する透析プローブでは、計測時に当
該空気滞留部に空気が溜まり、微少な水圧変化にも計測
系が応答して流速の変化が増強され、正確な分析ができ
ない。また、空気滞留部に溜まっていた空気自体が流れ
出してノイズとなることもある。

【０００７】ノイズを抑制するために、流速を高めると
いう手段もあるが、高流速であるために引き起こされ
る、生体の冷却効果、透析膜での検体回収率低下という
新たな問題が発生し、汎用性、特異性、安定性を保持し
ながら高感度な分析を行うことができない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ノイ
ズ（脈流）の発生率が低く、高感度で安定な分析を行う
ことのできる生体内グルタミン酸の連続計測法を提供す
ることである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者は、細管と太管との間に間隙がない透
析膜プローブ及び連結管を作製し、これらを用いて計測
すれば、ノイズの発生率が低く、高感度で安定な生体内
グルタミン酸の分析を行うことができることを見出し、
本発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明は、リンガー溶液及び酵
素溶液を流出させる装置と、前記装置に設置され、一定
速度でリンガー溶液及び酵素溶液を流出させる第１の注
入器及び第２の注入器と、生体に刺入される透析膜プロ
ーブと、前記第１の注入器及び前記透析膜プローブに接
続され、リンガー溶液が中を流れる第１の送液管と、前
記第２の注入器に接続され、酵素溶液が中を流れる第２
の送液管と、前記透析膜プローブを通じて生体内から得
られたグルタミン酸を含むリンガー液が中を流れる第３
の送液管と、前記第２の送液管及び前記第３の送液管を
１本の管にまとめる連結管と、前記連結管によってまと
められた第４の送液管と、前記第４の送液管の先に接続
された検出器とを用いて生体内のグルタミン酸を連続的
に計測する方法において、前記透析膜プローブが、一方
が塞がれた透析膜管と、前記透析膜管の中を通る２本の
細管と、送液管に連結される太管とを備え、前記細管と
前記太管とが間隙の生じないように接続されている透析
膜プローブであり、前記連結管が、２本の細管と、前記
２本の細管のそれぞれに接続された２本の太管と、前記
２本の細管の束に接続された太管とを有し、前記２本の
細管と前記３本の太管とが、間隙がない状態で接続され
ている連結管であることを特徴とする、生体内グルタミ
ン酸の連続計測法である。

【００１１】以下、図面を参照して本発明を詳細に説明
する。 〔１〕透析膜プローブ 図１は、本発明で使用することのできる透析膜プローブ
の一例を示す概略図である。本発明における透析膜プロ
ーブ１は、封着材１４ｂによって一方が塞がれた透析膜
管１１と、透析膜管１１の中を通る２本の細管１２と、
送液管に連結できるようにそれぞれの細管１２に外嵌さ
れた太管１３とを有する。それぞれの細管１２と太管１
３との間には封着材１４ａが充填され、間隙がない。こ
のように、細管１２と太管１３との間の間隙をなくした
ことにより、空気が溜まり得る部分（空気滞留部）が全
くなくなっている。

【００１２】また、本実施例では、透析膜管１１の開口
部が封着材１４ｂによって、透析膜管１１側の太管１３
の端部及び透析膜管１１と太管１３との間における細管
１２が封着材１４ｃによって封着されており、２本の細
管１２のうち、一方の細管１２ａは、透析膜管１１のほ
ぼ先端まで達しており、他方の細管１２ｂは、透析膜管
１１の途中まで達している。

【００１３】なお、本発明において「封着」とは、樹脂
等によって、隙間のないように各々の部材を接着・固定
することをいう。従って、透析膜管１１における上端部
〜細管１２ｂのほぼ下端部分まで（図中Ａ）も、封着材
１４ｃによって充填されている。本発明で使用する透析
膜プローブ１における透析膜管１１の太さ及び長さは、
対象物によって幅広く変化するが、通常太さは０．１〜
０．５ｍｍ程度であるのが好ましく、長さは２〜１０ｍ
ｍ程度であるのが好ましい。

【００１４】また、透析膜管１１を形成する透析膜の材
質は、通常使用されるものであればいかなるものを用い
てもよく、例えば、セルロース系膜、各種濾過膜（ポリ
スルホン、ポリカーボネート等）、焼結フィルター等を
用いることができる。また、透析膜の厚さ及び孔の大き
さは、計測対象物の種類によって適宜設定すればよく、
通常厚さは、５〜２０μｍ程度であり、孔の大きさ（直
径）は０．１〜２０μｍ程度である。

【００１５】透析膜管１１の先端を塞ぐ封着材１４ｂ
は、いかなるものからなってもよく、例えば、エポキシ
樹脂等の接着剤、テフロン等の合成樹脂等を用いること
ができる。本発明における細管１２ａの下端部は、図１
では透析膜管１１のほぼ先端まで達しているが、他方の
細管１２ｂとの距離をある程度保持して、灌流液に計測
対象物を十分溶出させることができれば、下端部の位置
は特に限定されない。

【００１６】同様に、上記細管１２ａとの距離をある程
度保持して、灌流液に計測対象物を十分溶出させること
ができれば、もう一方の細管１２ｂの下端部の位置は特
に限定されないが、気泡の滞留を回避するために、封着
材１４ｃの下端部に合わせるのが好ましい。細管１２
ａ，１２ｂは、配管を容易にするために、透析膜管１１
の上方において相反する方向へ曲がって、全体としてＹ
字状になっているのが好ましい。

【００１７】細管１２の太さ（内径）は、一般的に０．
０５〜０．２ｍｍ程度である。また、細管１２の材質
は、通常使用されるものであればいかなるものを用いて
もよく、例えば、テフロン、塩化ビニル、ポリイミド樹
脂コーティング石英管（Ｐ．Ｆ．Ｓ．）、フューズドシ
リカ等を用いることができる。太管１３の上端面は、図
１においては、細管１２の上端面と同一平面上にある
が、細管１２と太管１３との間に間隙がなく、空気滞留
部ができなければ、太管１３のみが上方に突出していて
もよい。通常使用される送液管を連結させやすいよう
に、太管１３の太さ（外径）は、０．２〜０．８ｍｍ程
度であるのが好ましく、封着材１４ａの外側に出ている
太管１３の長さは、３〜１０ｍｍ程度であるのが好まし
い。

【００１８】太管１３の材質は、送液管とジョイントで
きれば特に限定されないが、耐久性、密着性等を考慮し
てステンレス、テフロン等の合成樹脂等を用いるのが好
ましい。封着材１４ｃが透析膜管１１を封着する長さＡ
は、透析膜管１１と細管１２とを十分固定できれば特に
限定されなく、０．５〜５ｍｍ程度が好ましい。封着材
１４ｃの材質は、隙間のないように各々の部材を接着・
固定することができれば、いかなるものを用いてもよ
く、例えば、エポキシ樹脂、デンタルセメント、各種接
着剤等を用いることができ、また、それらを併用するこ
ともできる。

【００１９】本実施例の透析膜プローブ１では、太管１
３と細管１２との間隙を埋めるために封着材１４ａを使
用しているが、本発明はこれに限定されることなく、例
えば、細管の外径と同一の内径を有する太管を用いれ
ば、封着材を使用する必要はない。また、本実施例の透
析膜プローブ１では、透析膜管１１の開口部、透析膜管
１１側の太管１３の端部及び透析膜管１１と太管１３と
の間における細管１２を、封着材１４ｃにより後から封
着しているが、本発明はこれに限定されることなく、例
えば、透析膜管以外の部材を一体的に同時に成形し、こ
れと透析膜管とを接着してもよい。

【００２０】上記透析膜プローブ１を生体に使用するに
は、まずそれぞれ太管１３に送液管を連結し、透析膜部
（透析膜管の先端部〜封着材の下端部分まで；図中Ｂ）
を生体に刺入する。次いで、一方の送液管から細管１２
ａに灌流液を流入させ、透析膜管１１の中を灌流液で満
たす。この灌流液中に、透析膜を通って計測対象物が溶
出し、当該灌流液とともにもう一方の細管１２ｂから流
出する。

【００２１】このとき、上記のような構造を有する透析
膜プローブには、空気が溜まり得る部分（空気滞留部）
が全くないため、当該透析膜プローブを使用すれば、空
気滞留部に起因するノイズの発生率が非常に低く、高感
度で安定な連続計測を行うことができる。また、本発明
で使用する透析膜プローブは、構造が単純なため、安価
で容易に製造することができる。さらには、灌流液及び
計測対象物は、不活性化された空間を通過し、金属等と
接触することがないため、それら自身の変性のおそれが
ない。

【００２２】以上説明した透析膜プローブを用いること
により、生体内グルタミン酸の連続計測を高感度で安定
に行うことができる。また、グルタミン酸のみならず、
その他各種のアミノ酸、神経伝達物質、神経伝達修飾物
質、糖代謝関連物質等の細胞外へ漏出される物質の計測
を行うことができ、さらには、生体を対象とした実験生
物学や、臨床検査技術に限定されることなく、無機又は
有機化学の反応過程の研究や、環境状態のモニター等種
々の分野に適用することができる。

【００２３】〔２〕連結管 本発明で使用する連結管は、透析膜プローブ１を通じて
生体内から得られたグルタミン酸を含むリンガー液が中
を流れる送液管と、酵素溶液が中を流れる送液管を１本
の管にまとめるものである。

【００２４】図２は、本発明で使用することのできる連
結管の一例を示す概略図である。本発明における連結管
２は、２本の細管２１ａ，２１ｂと、２本の細管２１
ａ，２１ｂが枝分かれしている方において、細管２１ａ
に外嵌された太管２２ａ及び細管２１ｂに外嵌された太
管２２ｂと、２本の細管２１ａ，２１ｂが束状になって
いる方において、２本の細管２１ａ，２１ｂの束に外嵌
された太管２２ｃとを有し、細管２１ａと太管２２ａ、
細管２１ｂと太管２２ｂ、及び細管２１ａ，２１ｂと太
管２２ｃとの間には封着材２３ａが充填され、間隙がな
い。

【００２５】このように、それぞれの細管と太管との間
の間隙をなくしたことにより、空気が溜まり得る部分
（空気滞留部）が全くなくなり、従って、空気滞留部に
起因するノイズの発生率が非常に低く、高感度で安定な
連続計測を行うことができる。本実施例の連結管では、
それぞれの太管２２ａ，２２ｂ，２２ｃの端部同士を連
結する細管２１ａ，２１ｂと、太管２２ａ，２２ｂ，２
２ｃの端部とが封着材２３ｂによって封着されており、
それぞれの細管及び太管が固定されている。

【００２６】細管２１ａ，２１ｂの太さ（内径）は、一
般的に０．０５〜０．２ｍｍ程度であるのが好ましい。
また、細管２１ａ，２１ｂの材質は、通常使用されるも
のであればいかなるものを用いてもよく、例えば、テフ
ロン、塩化ビニル、フューズドシリカ、Ｐ．Ｆ．Ｓ．等
を用いることができる。

【００２７】太管２２ａ，２２ｂ，２２ｃの端面は、図
２においては、細管２１ａ，２１ｂの端面と同一平面上
にあるが、細管と太管との間に間隙がなく、空気滞留部
ができなければ、太管のみが突出していてもよい。通常
使用される送液管を連結させやすいように、太管の太さ
（外径）は、０．２〜０．８ｍｍ程度であるのが好まし
く、封着材の外側に出ている太管の長さは、３〜１０ｍ
ｍ程度であるのが好ましい。

【００２８】太管２２ａ，２２ｂ，２２ｃの材質は、送
液管と連結できれば特に限定されないが、耐久性、密着
性等を考慮してステンレス、テフロン等の合成樹脂等を
用いるのが好ましい。封着材２３ａ，２３ｂの材質は、
各々の部材を接着・固定することができれば、いかなる
ものを用いてもよく、例えば、エポキシ樹脂、デンタル
セメント、各種接着剤等を用いることができ、また、そ
れらを併用することもできる。

【００２９】本実施例の連結管２では、太管と細管との
間隙を埋めるために封着材２３ａを使用しているが、本
発明はこれに限定されることなく、例えば、細管の外径
と同一の内径を有する太管を用いれば、封着材を使用す
る必要はない。また、本実施例の連結管では、太管と太
管の間における細管とを、封着材によっで後から封着し
ているが、本発明はこれに限定されることなく、例え
ば、太管と細管とを一体的に同時に成形してもよい。

【００３０】以上説明した連結管を用いることにより、
生体内グルタミン酸の連続計測を高感度で安定に行うこ
とができる。また、グルタミン酸のみならず、その他各
種のアミノ酸、神経伝達物質、神経伝達修飾物質、糖代
謝関連物質等の細胞外へ漏出される物質の計測を行うこ
とができ、さらには、生体を対象とした実験生物学や、
臨床検査技術に限定されることなく、無機又は有機化学
の反応過程の研究や、環境状態のモニター等種々の分野
に適用することができる。

【００３１】〔３〕生体内グルタミン酸の連続計測法 本発明の生体内グルタミン酸の連続計測法の一例を以下
説明する。図３は、脳内微少透析法によってラットの脳
内におけるグルタミン酸量を連続計測する方法を示す概
略図である。

【００３２】本実験方法では、リンガー溶液及び酵素溶
液を流出させるシリンジポンプ３１と、シリンジポンプ
３１に設置され、一定速度でリンガー溶液及び酵素溶液
を流出させる注入器３２ａ，３２ｂと、注入器３２ａに
接続され、リンガー溶液が中を流れる送液管３３ａと、
注入器３２ｂに接続され、酵素溶液が中を流れる送液管
３３ｂと、送液管３３ａの途中に設けられたループイン
ジェクター３４と、ラットに刺入される透析膜プローブ
１と、透析膜プローブ１との間でリンガー溶液を往復さ
せるデュアルシーベル３５と、デュアルシーベル３５か
らの送液管３３ａ及び注入器３２ｂからの送液管３３ｂ
を１本の管にまとめる連結管２と、連結管２によってま
とめられた送液管３３ｃと、送液管３３ｃの先に接続さ
れたフローセル付蛍光検出器３６とを用いる。

【００３３】具体的には、まず脳地図を参照して透析膜
プローブ１をラットの内側前頭葉皮質に刺入して固定す
る。術後回復約１日後、ラットの自由行動下、注入器３
２ａから透析膜プローブ１にリンガー液を灌流させる。
通常使用するリンガー液は、（日本）薬局法に準ずるも
のであるが、他の生物系の緩衝液でもよく、流速は０．
５〜２．５μｌ／分程度が好ましい。

【００３４】リンガー液は、ループインジェクター３４
を通り、デュアルシーベル３５を介して透析膜プローブ
１に達する。このループインジェクター３４を用いるこ
とにより、ノイズ源となる圧変化を減少させることがで
きる。透析膜を通って溶出したグルタミン酸は、リンガ
ー液とともに透析膜プローブ１から流出し、デュアルシ
ーベル３５を介して連結管２へ向かう。一方、これと同
時に注入器３２ｂから酵素溶液を連結管２に流し込み、
グルタミン酸を含有するリンガー液と合流させ、一定時
間反応させる。ここで使用する酵素は、グルタミン酸脱
水素酵素であり、他に、グルタミン酸酸化酵素を用いる
ことも可能である。酵素溶液の流速は、リンガー液の流
速と同様の速さとすればよく、０．５〜２．５μｌ／分
程度が好ましい。

【００３５】グルタミン酸と酵素との反応は送液管３３
ｃ中で行い、反応時間は、１〜５分程度が好ましい。こ
のグルタミン酸脱水素反応により、蛍光物質である還元
型β・ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）が生成されるため、このＮＡＤＨの量をフローセル
付蛍光検出器３６を用いて連続的に計測することによ
り、脳内のグルタミン酸量を測定・分析することができ
る。蛍光検出器３６における励起波長は、３４０ｎｍ前
後が好ましく、計測波長は、４５０〜４６０ｎｍ程度が
好ましい。また、フローセルの容量は、５μｌ以下が好
ましい。

【００３６】本発明の連続計測法において、前述した透
析膜プローブ及び連結管を使用することにより、ノイズ
（脈流）の発生を防止し、送液（リンガー液，酵素溶
液）の流速を一定に保つことができるため、灌流液の流
速の変化による計測対象物の回収率の変化を抑制すると
ともに、反応溶液（計測対象物含有灌流液・酵素溶液）
の流速の変化による各液の混合比の変化を抑制すること
ができ、連続計測において信頼性の高い分析を行うこと
ができる。また、ノイズ（脈流）の発生がほとんどない
ため、流速を高める必要がなく、従って感度が高く、特
異性に優れた分析を行うことができる。

【００３７】

【実施例】以下、製造例及び実施例を挙げて本発明を更
に詳細に説明するが、これらの製造例及び実施例は本発
明の範囲を何等限定するものではない。

【００３８】（製造例１）本製造例では、図１に示すよ
うな透析膜プローブを作製した。全長７ｍｍ、外径０．
２３ｍｍの再生セルロースからなる透析膜管（アサヒ化
成社製、分子量カット：５万）の一端を、エポキシ系接
着剤（セメダイン社製、ハイスーパー５）により塞い
だ。透析膜管の他端から内径０．１ｍｍ、全長２０ｍｍ
及び１７ｍｍのフューズドシリカからなる２本の細管
（エイコム社製）を挿入し、図１に示すＡの部分を、上
記エポキシ系接着剤からなる封着材により封着した。Ａ
の長さは４ｍｍであった。

【００３９】透析膜管から出ている２本の細管を、それ
ぞれ全長１０ｍｍ、外径０．５５ｍｍのステンレス管
（テルモ社製）に通し、両者の間を上記エポキシ系接着
剤により充填し、はみ出した部分を切り取った。２本の
細管及び透析膜管を、Ｙ字型になるように、上記エポキ
シ系接着剤からなる封着材により封着し、その上からデ
ンタルセメント（ＧＣ歯科社製、ユニファスト）により
固定した。封着材から出ているステンレス管の長さは、
いずれも約５ｍｍであった。

【００４０】（製造例２）本製造例では、図２に示すよ
うな連結管を作製した。内径０．１ｍｍ、全長２５ｍｍ
のフューズドシリカからなる２本の細管（エイコム社
製）を、全長１０ｍｍ、外径０．５５ｍｍのステンレス
管（テルモ社製）に通し、細管とステンレス管との間を
エポキシ系接着剤（セメダイン社製、ハイスーパー５）
により充填し、はみ出した部分を切り取った。

【００４１】同様に、ステンレス管から出ている２本の
細管を、それぞれ全長１０ｍｍ、外径０．５５ｍｍのス
テンレス管に通し、両者の間を上記エポキシ系接着剤に
より充填し、はみ出した部分を切り取った。以上の細管
及びステンレス管を、Ｙ字型になるように、上記エポキ
シ系接着剤からなる封着材により封着し、その上からデ
ンタルセメント（ＧＣ歯科社製、ユニファスト）により
固定した。封着材から出ているステンレス管の長さは、
いずれも約５ｍｍであった。

【００４２】（実施例１）本実施例は、図３に示すよう
な構成で行った。実際に実験を始める前に、以下のよう
にして本測定系の検量線を作成した。製造例１で得られ
た透析膜プローブの透析膜管部分を、所定の濃度のグル
タミン酸溶液中に設置し、高速液体クロマトグラフィー
用の注入器（レオダイン社製、モデルＮｏ．９１２５）
から透析膜プローブにリンガー液（大塚薬品社製、リン
ゲル液）を２．５μｌ／分の流速で灌流させた。なお、
シリンジポンプとしては、Ｂ．Ａ．Ｓ社製のＣＭＡ１０
２マイクロインジェクションポンプ、送液管としては、
エイコム社製のテフロンチューブ（内径０．１ｍｍ）、
デュアルシーベルとしては、インステック社製の３７５
／Ｄ／２２ＱＥを使用した。

【００４３】一方、グルタミン酸脱水素酵素溶液（ベー
リンガーマンハイム社製、１２７０８６）を２．５μｌ
／分の流速で送液し、上記リンガー液（グルタミン酸含
有）と合流させて３分間反応させ、５μｌフローセル付
蛍光検出器（日本分光社製、８２１ＦＰ）を通過させ
た。このとき、励起波長は３４０ｎｍとし、計測波長は
４５０ｎｍとして行った。溶液中のグルタミン酸の含有
量を、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、３μ
Ｍ、３μＭ、３μＭ、３μＭ及び３μＭと経時的に１０
回変化させ、蛍光検出器で検出した電圧を、蛍光検出器
に連結したレコーダによりプリントアウトした。結果を
図６に示す。

【００４４】図６のグラフから明らかなように、３μＭ
グルタミン酸についての測定を複数回行っても、ほとん
ど同様の結果が出ており、従って本測定系は非常に精度
が高いということができる。図６のグラフから作成され
る検量線を、図７に示す。

【００４５】（実施例２）製造例１で得られた透析膜プ
ローブを、ラットの内側前頭葉皮質に刺入して頭蓋部と
連結固定した。術後回復１日後、ラットの自由行動下、
リンガー液を２．５μｌ／分の流速で灌流させるととも
に、グルタミン酸脱水素酵素溶液を２．５μｌ／分の流
速で上記リンガー液（脳内からのグルタミン酸含有）と
合流させて３分間反応させた。

【００４６】計測開始６０分後に、ラットに興奮剤の１
種であるベラトリジン（ＶＥＲ）（シグマ社製）を１
２．５μｌ注射し、計測開始８０分後に、神経伝達効率
を変化させる試薬であるソディウムニトロプルシッド
（ＳＮＰ）（和光社製）及びＶＥＲ１２．５μｌを注射
し、計測開始１００分後に、再度ＶＥＲのみ１２．５μ
ｌを注射した。ラットの脳内で分泌されたグルタミン酸
量の経時変化を図８に示す。

【００４７】（実施例３）実施例２において、２回目の
注射物をＳＮＰ１２．５μｌのみとする以外、同様にし
て連続計測を行った。結果を図８に示す。

【００４８】（実施例４）実施例２において、２回目の
注射物を、煮沸したＳＮＰ及びＶＥＲ１２．５μｌとす
る以外、同様にして連続計測を行った。結果を図８に示
す。図８のグラフから明らかなように、製造例１及び２
で得られた透析膜プローブ及び連結管を用いた連続計測
系では、ノイズ（脈流）の発生がなく、高感度で安定な
分析を行うことができた。

【００４９】（実施例５）実施例２と同様にして連続計
測を行い、電圧の経時変化を測定した。時間と検出した
電圧との関係を示すグラフを図９に示す。

【００５０】（比較例１）実施例５において、図４に示
す従来の透析プローブを使用する以外、同様にして連続
計測を行った。時間と検出した電圧との関係を示すグラ
フを図１０に示す。図９及び図１０のグラフから明らか
なように、従来の透析プローブを使用するとノイズ（脈
流）が発生し、正確な測定ができないのに対し、製造例
１で得られた透析膜プローブを使用すると、ノイズがほ
とんどなく、高感度で安定な分析を行うことができる。

【００５１】

【発明の効果】本発明によれば、ノイズ（脈流）の発生
を抑制し、高感度で安定な生体内グルタミン酸の連続計
測を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明で使用することのできる透析膜プロー
ブを示す概略図である。

【図２】 本発明で使用することのできる連結管を示す
概略図である。

【図３】 本発明の生体内グルタミン酸の連続計測法を
示す概略図である。

【図４】 従来の透析プローブを示す断面図である。

【図５】 従来の透析プローブにおける細管とステンレ
ス管との接続部分を示す概略図である。

【図６】 実施例１におけるグルタミン酸量と検出電圧
（経時変化）との関係を示すグラフである。

【図７】 実施例１におけるグルタミン酸量と検出電圧
との関係を示す検量線である。

【図８】 実施例２〜４におけるグルタミン酸量の経時
変化を示すグラフである。

【図９】 実施例５における検出電圧の経時変化を示す
グラフである。

【図１０】 比較例１における検出電圧の経時変化を示
すグラフである。

【符号の説明】 １・・・透析膜プローブ １１，４２・・・透析膜管 １２，１２ａ，１２ｂ，２１ａ，２１ｂ，４３ａ，４３
ｂ・・・細管 １３，２２ａ，２２ｂ，２２ｃ・・・太管 １４ａ，１４ｂ，１４ｃ，２３ａ，２３ｂ，２３ｃ・・
・封着材 ２・・・連結管 ３１・・・シリンジポンプ ３２ａ，３２ｂ・・・注入器 ３３ａ，３３ｂ，３３ｃ・・・送液管 ３４・・・ループインジェクター ３５・・・デュアルシーベル ３６・・・蛍光検出器 ４・・・透折プローブ ４１・・・本体部 ４４ａ，４４ｂ・・・ステンレス管 ４５・・・保持部材 ４６ａ，４６ｂ・・・接着部材

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一方が塞がれた透析膜管と、前記透析膜
   管の中を通る２本の細管と、送液管に連結される太管と
   を備えるとともに、前記細管と前記太管とを接続する接
   続手段を備えた透析膜プローブにおいて、前記接続手段
   は、間隙が生じないように前記細管と前記太管とを接続
   したことを特徴とする透析膜プローブ。
2. 【請求項２】 前記透析膜管の開口部、前記透析膜管側
   の前記太管の端部及び前記透析膜管と前記太管との間に
   おける前記細管が封着されていることを特徴とする請求
   項１記載の透析膜プローブ。
3. 【請求項３】 前記一方の細管が、前記透析膜管のほぼ
   先端まで達しており、かつ、前記他方の細管が、前記透
   析膜管の途中まで達していることを特徴とする請求項１
   記載の透析膜プローブ。
4. 【請求項４】 少なくとも２以上の整数であるｎ本の送
   液管を流れる液体の流れを、１本の送液管を流れる液体
   の流れに、又は１本の送液管を流れる液体の流れを、少
   なくとも２以上の整数であるｎ本の送液管を流れる液体
   の流れに変換する連結管において、ｎ本の細管と、前記
   ｎ本の細管のそれぞれに接続されたｎ本の太管と、前記
   ｎ本の細管の束に接続された太管とを有した連結管であ
   って、前記ｎ本の細管と前記（ｎ＋１）本の太管とは、
   間隙がない状態で接続されていることを特徴とする連結
   管。
5. 【請求項５】 前記太管の端部同士を連結する前記細管
   と、前記太管の端部とが封着されていることを特徴とす
   る請求項４記載の連結管。