JPH08337599A - Ｉ κＢ αリン酸化抑制ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 I κB αリン酸化抑制ペプチドの提供。 【解決手段】 I κB αリン酸化抑制ペプチド、例えば
下記の配列 Met-Leu-Pro-Glu-Ser-Glu-Asp-Glu-Glu-Ser-Tyr-Asp-Th
r-Glu-Ser-Glu-Phe-Thr-Glu-Phe-Thr-Glu-Asp-Glu-Leu を有するペプチドを有効成分として含有する抗炎症剤ま
たは免疫抑制剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はI κB αのリン酸化
を抑制し得るペプチドに関し、より 詳しくは、抗炎症
剤、免疫抑制剤として有用なペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】抗体κ型軽鎖やヒト免疫不全ウィルス
（HIV ）-1のエンハンサー領域におけるタンパク結合部
位の分析により、κB と呼ばれる、主に10塩基からなる
領域がエンハンサーの一部として遺伝子の転写活性を促
進することが明らかとなった。この領域に転写調節タン
パクであるヌクレアーファクターκB （nuclear factor
κB: NF κB ）が結合するとκB 領域の下流に存在する
遺伝子の転写が促進される（Gilmore, T. & Morin P.J.
Trends in Genetics (1993) 9, 427-432 ）。

【０００３】プレB 細胞系の70Z/3 細胞およびヒーラ
（Hela）細胞を用いた研究により、これらの細胞は細胞
質にDNA 結合活性を有さないNFκB を含んでおり、ホル
ボールエステルの刺激により、DNA 結合活性の抑制が解
除され、核内へ移行することが知られていた（Baeuerl
e, P. A. & Baltimore, D. Cell (1988) 53, 211-217
）。NFκB は、二つのサブユニット（p50 、p65 ）か
らなるヘテロダイメリックあるいはホモダイメリックな
転写因子であり、種々の刺激により誘導される。現在ま
でに、20以上の遺伝子の転写活性化に関与していると推
測されている（Baeuerle, P.A. Biochim. Biophys. Act
a (1991) 1072, 63-80）。

【０００４】NFκB は、インターロイキン-8、インター
ロイキン-1β、腫瘍壊死因子（TNF）- α、インターロ
イキン-6、インターロイキン-2 等のサイトカイン遺伝
子のほか、炎症性のメデイエーターであるアラキドン酸
カスケードの代謝産物の合成系に係わる酵素であるシク
ロオキシジェネース-2（cyclooxygenase-2）（Kujubu,
D. A. et al., J. Biol. Chem. (1991) 266, 12866-128
72）あるいは5-リポキシジェネース（5-lipoxygenase）
（Hoshiko, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. (1990) 87, 9073-9077、Chopra, A. et al., Bioche
m. Biophys. Res. Commun. (1992) 185, 489-495 ）、
さらにELAM-1（endothelial leukocyte adhesion molec
ule-1 ）（Hooft van Huijsduijnen, R. et al., J. Bi
ol. Chem.(1992) 267, 22385-22391 ）VCAM-1（vascula
r cell adhesion molecule-1 ）（Iademarco, M. F. et
al., J. Biol. Chem. (1992) 267, 16323-16329 ）な
どの接着因子の遺伝子の上流にも存在し、これら遺伝子
の転写制御に関与していると考えられる。

【０００５】現在使用されている抗炎症剤であるステロ
イド（Mukaida, N. et al., J. Biol. Chem. (1994) 26
9, 13289-13295）または強力な免疫抑制剤であるFK-506
（Okamoto, S. -i. et al., J. Biol. Chem. (1994) 26
9, 8582-8589）の作用が、少なくともNFκB の活性化抑
制に係わることが示唆されている。 細胞質において、
NFκB は、NFκB の機能を抑制するタンパクI κB αと
結合して活性化が抑制されている（Inoue, J-I. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 4333-433
7 、Hatada, E. et al., EMBO (1993) 12, 2781-278
8）。

【０００６】Zabel, U. らは、ヒト胎盤から37kDa の均
質タンパクとしてI κB αを単離したことを報告し（Ce
ll (1990) 61, 255-265 ）、次いで、ヒトI κB αのcD
NAが単離された（Sporn, S.A. et al., J. Immunol. (1
990) 144, 4434-4441 、Haskill, S. et al., Cell (19
91) 65, 1281-1289 、WO 92-20795 等参照）。I κB α
は、NFκB のDNA に対する結合を抑制するだけでなく、
NFκB の核内への移行も抑制する（Baeuerle, P.A. & B
altimore, B. Science (1988) 242,540-546 ）。I κB
αは、TNF α等の刺激に反応してリン酸化されること
が明らかにされている。

【０００７】このようなI κB αのリン酸化あるいは分
解、またはNFκB の構成タンパクのリン酸化等により、
NFκB は核内へ移行し、DNA 上の結合部位に結合し、次
いで、下流に存在する遺伝子の転写が活性化される（Ba
euerle, P.A. Biochim. Biophys. Acta (1991) 1072, 6
3-80）。 NFκB の活性化に際しては、上記のようなメ
カニズムが知られているが、NFκB 、I κB αを生体内
においてリン酸化する酵素群あるいはリン酸化部位、さ
らにその詳細なメカニズムについては明らかにされてい
なかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】これまで、抗炎症剤と
してはステロイド剤等が使用されている。ステロイド剤
には副作用として易感染性、糖尿病、白内障などを誘発
する危険性がある。免疫抑制剤としては、核酸合成阻害
剤等が使用されているが、核酸合成阻害剤には骨髄機能
抑制、肝障害、易感染性、消化器障害などの副作用があ
る。従って、このような副作用を有さない薬剤の開発が
望まれていた。本発明の目的は、炎症性サイトカイン、
炎症性メデイエーターの遺伝子発現、さらにはそれらの
遺伝子産物の遊離を特異的に抑制するための、I κB α
のリン酸化部位からなる、I κB αのリン酸化抑制作用
を有するペプチドを提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、NFκB の
活性化のメカニズムを研究する過程において、I κBα
の部分欠失変異体および置換変異体を用いることにより
I κB αのリン酸化部位を特定するに至った。さらに、
該リン酸化部位に相当するアミノ酸配列を有するペプチ
ドをI κB αと共存させることにより、I κB αのリン
酸化が抑制され、したがってNFκB の活性化が抑制され
ることを見出した。

【００１０】実施例１（２）から明らかなごとく、I κ
B αのリン酸化部位は、該蛋白質のアミノ酸配列の内、
配列-Ser(288)-Tyr(289)-Asp(290)-Thr(291)-Glu(292)-
Ser(293)-Glu(294)-におけるSer(288), Thr(291)および
Ser(293)であると推定される。従って、本発明におい
て、I κB αのリン酸化部位に対応するアミノ酸配列を
有し、I κB αのリン酸化を阻害することができるペプ
チドは、アミノ酸配列Ser-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser(「コア
ーアミノ酸配列」と称する) から成るもの、またはこの
コアーアミノ酸配列を含んでなるものである。

【００１１】このアミノ酸配列を含んで成る、とは、こ
のアミノ酸配列のＮ−末端側もしくはＣ−末端側、また
はその両方が、アミノ酸またはペプチドにより延長され
たものである。このＮ−末端および／またはＣ−末端を
延長するアミノ酸またはペプチドとしては、それらを含
んで構成されるペプチドがI κB αのリン酸化を阻害す
るものであればいかなるアミノ酸またはペプチドであっ
てもよい。

【００１２】しかしながら、本発明の好ましい態様によ
れば、前記のコアーアミノ酸配列のＮ−末端側および／
またはＣ−末端側を延長するアミノ酸またはペプチド
は、IκB αのアミノ酸配列にあって前記コアーアミノ
酸配列に隣接するものである。このことは、コアーアミ
ノ酸配列とそれを延長する末端アミノ酸またはアミノ酸
配列との全体から構成されるペプチドがI κB αのアミ
ノ酸配列の１部分を成していることを意味する。

【００１３】この様なアミノ酸配列を有するペプチドと
しては、I κB α中のアミノ酸配列をMet(279)-Leu(28
0)-Pro(281)-Glu(282)-Ser(283)-Glu(284)-Asp(285)-Gl
u(286)-Glu(287)-Ser(288)-Tyr(289)-Asp(290)-Thr(29
1)-Glu(292)-Ser(293)-Glu(294)-Phe(295)-Thr(296)-Gl
u(297)-Phe(298)-Thr(299)-Glu(300)-Asp(301)-Glu(30
2)-Leu(303)とすれば、この配列の１部分からなり、次
のＮ−末端とＣ−末端を有するものが挙げられる。

【００１４】Ser(288)-Glu(294), Ser(288)-Phe(295),
Ser(288)-Thr(296), Ser(288)-Glu(297), Ser(288)-Phe
(298), Ser(288)-Thr(299), Ser(288)-Glu(300), Ser(2
88)-Asp(301), Ser(288)-Glu(302), Ser(288)-Leu(30
3),Glu(287)-Glu(294), Glu(287)-Phe(295), Glu(287)-
Thr(296), Glu(287)-Glu(297), Glu(287)-Phe(298), Gl
u(287)-Thr(299), Glu(287)-Glu(300), Glu(287)-Asp(3
01), Glu(287)-Glu(302), Glu(287)-Leu(303),Glu(286)
-Glu(294), Glu(286)-Phe(295), Glu(286)-Thr(296), G
lu(286)-Glu(297), Glu(286)-Phe(298), Glu(286)-Thr
(299), Glu(286)-Glu(300), Glu(286)-Asp(301), Glu(2
86)-Glu(302), Glu(286)-Leu(303),

【００１５】Asp(285)-Glu(294), Asp(285)-Phe(295),
Asp(285)-Thr(296), Asp(285)-Glu(297), Asp(285)-Phe
(298), Asp(285)-Thr(299), Asp(285)-Glu(300), Asp(2
85)-Asp(301), Asp(285)-Glu(302), Asp(285)-Leu(30
3),Glu(284)-Glu(294), Glu(284)-Phe(295), Glu(284)-
Thr(296), Glu(284)-Glu(297), Glu(284)-Phe(298), Gl
u(284)-Thr(299), Glu(284)-Glu(300), Glu(284)-Asp(3
01), Glu(284)-Glu(302), Glu(284)-Leu(303),Ser(283)
-Glu(294), Ser(283)-Phe(295), Ser(283)-Thr(296), S
er(283)-Glu(297), Ser(283)-Phe(298), Ser(283)-Thr
(299), Ser(283)-Glu(300), Ser(283)-Asp(301), Ser(2
83)-Glu(302), Ser(283)-Leu(303),

【００１６】Glu(282)-Glu(294), Glu(282)-Phe(295),
Glu(282)-Thr(296), Glu(282)-Glu(297), Glu(282)-Phe
(298), Glu(282)-Thr(299), Glu(282)-Glu(300), Glu(2
82)-Asp(301), Glu(282)-Glu(302), Glu(282)-Leu(30
3),Pro(281)-Glu(294), Pro(281)-Phe(295), Pro(281)-
Thr(296), Pro(281)-Glu(297), Pro(281)-Phe(298), Pr
o(281)-Thr(299), Pro(281)-Glu(300), Pro(281)-Asp(3
01), Pro(281)-Glu(302), Pro(281)-Leu(303),Leu(280)
-Glu(294), Leu(280)-Phe(295), Leu(280)-Thr(296), L
eu(280)-Glu(297), Leu(280)-Phe(298), Leu(280)-Thr
(299), Leu(280)-Glu(300), Leu(280)-Asp(301), Leu(2
80)-Glu(302), Leu(280)-Leu(303),

【００１７】Met(279)-Glu(294), Met(279)-Phe(295),
Met(279)-Thr(296), Met(279)-Glu(297), Met(279)-Phe
(298), Met(279)-Thr(299), Met(279)-Glu(300), Met(2
79)-Asp(301), Met(279)-Glu(302), Met(279)-Leu(30
3)。上記のごときアミノ酸配列を有するペプチドとし
て、例えば、次のようなペプチドが挙げられる。

【００１８】アミノ酸配列Met-Leu-Pro-Glu-Ser-Glu-As
p-Glu-Glu-Ser-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser-Glu-Phe-Thr-Glu-
Phe-Thr-Glu-Asp-Glu-Leu （配列番号1 ）を含むペプチ
ド アミノ酸配列Met-Leu-Pro-Glu-Ser-Glu-Asp-Glu-Glu-Se
r-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser-Glu-Phe （配列番号2 ）を含む
ペプチド アミノ酸配列Ser-Glu-Asp-Glu-Glu-Ser-Tyr-Asp-Thr-Gl
u-Ser-Glu-Phe （配列番号3 ）を含むペプチド アミノ酸配列Ser-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser （配列番号4 ）
を含むペプチド

【００１９】本発明のペプチドは、そのサイズが短かく
なるに従って、ヒト体内での免疫原性が低下し、また体
内蛋白質分解酵素により分解されにくくなる、等の利点
を有する。上記アミノ酸配列中、Met はメチオニン、Le
u はロイシン、Pro はプロリン、Glu はグルタミン酸、
Ser はセリン、Asp はアスパラギン酸、Tyr はチロシ
ン、Thr はスレオニン、Phe はフェニルアラニンを示
し、かかるアミノ酸はいずれもL 体である。

【００２０】本発明のペプチドは、I κB αのリン酸化
を抑制することができる限り、上記アミノ酸配列の置
換、欠失および／または挿入があってよい。置換、欠失
および／または挿入の対象となるのは、コアー配列中で
は、リン酸化の対象とならないアミノ酸Tyr, Aspおよび
Glu であり、この対象となるアミノ酸数は１〜２個であ
る。しかしながら、このコアー配列内においては置換、
欠失および／または挿入による変更がなされていないこ
とが好ましい。コアー配列以外の部分において、置換、
欠失および／または挿入により変更し得るアミノ酸の数
は、１〜複数個であり、好ましくは、当該ペプチドのコ
アー部分以外の全アミノ酸数の半分以下、さらに好まし
くは30% 以下、より好ましくは20% 以下、例えば10% 以
下である。

【００２１】本発明のペプチドはまた、修飾されていて
もよい。ここで修飾とは、ペプチドを構成するアミノ酸
自体の構造の修飾、ペプチド中の隣接する、または隣接
しないアミノ酸残基間での架橋、ペプチド結合の修飾、
ペプチド基本骨格の修飾、側鎖官能基の導入、環状化、
スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）の導入等である(Giannis,
A. & Kolter, T. Angrew. Chem. Int. Ed. Engl. (199
3)32,1244-1267)。

【００２２】上記ペプチドの塩としては、薬理学上許容
される酸付加塩および塩基付加塩であればいずれであっ
てもよい。酸（無機酸および有機酸）付加塩としては、
例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の無
機酸付加塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン酸塩、フマ
ル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸
塩、メタスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、アスパ
ラギン酸塩、グルタミン酸塩等の有機酸付加塩が含まれ
る。塩基（無機塩基および有機塩基）付加塩としては、
例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、等
の無機塩基付加塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩、
リジン塩等の有機塩基付加塩が含まれる。

【００２３】本発明のペプチドは、ペプチド合成に通常
用いられる方法、例えば、液相法または固相法を使用す
ることができる（Peptide and Protein Drug Delivery,
Lee, V. H. L.編, Marcel Dekker, Inc. 米国、Pharma
ceutical Biotechnology, Borchardt, R. T.ら編、Pren
um Press, New York and London ）。これらの方法を使
用しペプチド結合の任意の位置で二分される2 種のフラ
グメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有す
る原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ
基を有する原料とをカルボジイミド法、活性エステル法
等を用いて縮合させ、生成する縮合物が保護基を有する
場合、その保護基を除去させることによって製造するこ
とができる。

【００２４】この反応工程において反応に関与すべきで
ない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保
護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル、t-ブ
チルオキシカルボニル、p-ビフェニルイソプロピロオキ
シカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
等が挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、例
えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得
る基が挙げられるが、固相法の場合はC 末端のカルボキ
シル基はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、P-アル
コキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合してい
る。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下に
あるいはN-保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活
性エステルを用いることができる。縮合反応終了後、保
護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドの
C 末端と樹脂との結合を切断する。

【００２５】他に、本発明のペプチドは遺伝子工学的手
法を使用して製造することも可能である（上記Peptide
and Protein Drug Delivery およびPharmaceutical Bio
technology参照）。例えば、WO 92-20795 に開示されて
いるI κB αの塩基配列のうち、所望のアミノ酸配列を
コードするオリゴヌクレオチドを常法により合成し、PC
R 法等によりアセンブリした後、これを適当な発現ベク
ターに導入する。次いで、発現ベクターで適当な宿主細
胞を形質転換する。

【００２６】得られた形質転換細胞を適当な条件で培養
することにより、培養液中あるいは宿主細胞中にペプチ
ドが産生される。産生されるペプチドの単離、精製を容
易にし、あるいは安定性を増大させるために本発明のペ
プチドをコードする塩基配列に、FLAGペプチド（WO 88-
04692 参照）やヒト免疫グロブリン定常領域（WO 94-28
027 、Ellison, J. et al., DNA (1981) 1, 11-18 、Kr
awinkel, U. et al.,EMBO J. (1982) 1, 403-407 等参
照）をコードする塩基配列を付加して、これを発現させ
てもよい。

【００２７】本発明のペプチドの製造のために任意の発
現系、真核細胞例えば、動物細胞、例えば樹立された哺
乳類細胞系、真菌細胞、および酵母細胞、並びに原核細
胞例えば、細菌細胞例えば、大腸菌細胞等を使用するこ
とができる。好ましくは、本発明のペプチドは哺乳類細
胞、例えば、COS 細胞、CHO 細胞中で発現される。これ
らの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプ
ロモーターを用いることができる。例えば、ヒトサイト
メガロウィルス前期プロモーター（human cytomegalovi
rus immediate early promoter）を使用することができ
る。

【００２８】その他に本発明のために使用することがで
きる哺乳類細胞における遺伝子発現のプロモーターとし
てはレトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィ
ルス、シミアンウィルス40（SV40）などのウィルスプロ
モーターやヒトポリペプチドエロンゲーションファクタ
-1α（HEF-1 α）などの哺乳動物細胞由来のプロモータ
ーを用いればよい。

【００２９】複製起源としては、SV40、ポリオーマウィ
ルス、アデノウィルス、牛パピローマウィルス等の由来
のものを使用することができ、さらに、宿主細胞中での
遺伝子コピー数を増幅するため、発現ベクターは選択マ
ーカーとしてホスホトランスフェラーゼAPH(3')II ある
いはI （neo ）遺伝子、チミジンカイネース（TK）遺伝
子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素
（DHFR）遺伝子等を含むことができる。

【００３０】本発明のペプチドは通常の方法に従い精製
される。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相
液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等が挙げられる。このようにして得られたペプチ
ドのアミノ酸配列はプロテインシークエンサーにより配
列分析、アミノ酸分析計により酸種分析によって特定で
きる。

【００３１】本発明のペプチドはI κB αリン酸化部位
からなり、I κB αのリン酸化抑制作用を維持する限
り、アミノ酸の置換、欠失、挿入があってもよく、さら
にペプチドの安定性や活性、半減期、細胞膜透過能をよ
り向上させるためにその構造を修飾することも可能であ
る（Giannis, A. & Kolter, T. Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. (1993) 32, 1244-1267 を参照）。ペプチドの修
飾の一つとしては、細胞膜透過能を有するようにするの
が好ましい。

【００３２】例えば、本発明のペプチドの末端にステロ
イド化合物またはベンゼン環を有する化合物等脂溶性の
物質を付加することにより、細胞膜透過能を付与するこ
とができる。さらには、本発明のペプチドの細胞膜透過
のために、本発明のペプチドをリポソームに封入して使
用することができる（上記Peptide and Protein DrugDe
livery 、Pharmaceutical Biotechnology参照）。

【００３３】また、本発明のペプチドのアミノ酸配列を
コードするオリゴヌクレオチドを常法により合成し、こ
れを発現し得る適当な発現ベクターに導入したものを公
知の手法により生体に投与し、生体内で本発明のペプチ
ドを発現させることもできる（WO 94-27643 、WO 92-20
316 、特開平6-303987、US 5166320、WO 92-19749 、WO
92-20316 等参照）。またはex vivo で本発明のペプチ
ドを使用した遺伝子治療も可能である。すなわち、生体
よりリンパ球等の血液細胞を取り出して、上記発現ベク
ターでこの細胞を形質転換し、形質転換された細胞を再
び生体へ戻すことにより、生体内で形質転換細胞に本発
明のペプチドを産生させることができる（特開平6-3295
59参照）。

【００３４】本発明のペプチドは、I κB αのリン酸化
を抑制する作用を有し、炎症性サイトカイン、炎症性メ
ディエーターの遺伝子の発現、さらにはその遺伝子産物
の遊離を抑制すると考えられ、ヒトをはじめとする哺乳
動物の炎症性疾患の治療、予防に有効であり、また、免
疫抑制剤としても使用される。さらに、本発明のペプチ
ドは、細胞内に存在するI κB αのリン酸化抑制を標的
とし、NFκB の活性化抑制を指向することで、その効果
は特異的であると推定される。

【００３５】本発明のペプチドは、抗炎症剤として使用
されることにより、種々の炎症性疾患、例えば、多発性
硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾せ
ん、痛風、腎炎、炎症性大腸炎、心筋梗塞、喘息、地中
海熱、クローン病、成人呼吸促迫症候群、肺気腫、嚢胞
性線維症、過敏性肺炎、結核性胸水、癌性胸水、サルコ
イドーシス、特発性肺線維症、びまん性汎細気管支炎、
食道癌手術後、虚血再灌流障害等の治療に有効である。
また、本発明のペプチドは免疫抑制剤として使用される
ことにより、骨髄移植、臓器移植時等の拒絶反応の抑制
に有効である。

【００３６】本発明のペプチドの投与経路としては、経
口投与、非経口投与のいずれでもよいが、特に、非経口
投与が好ましい。非経口投与としては、注射、直腸内投
与、経皮投与、経肺投与がある。本発明のペプチドの投
与量は、投与方法、患者の症状、年齢等により異なる
が、通常一回0.001-1000mg、好ましくは0.01-10mg を一
日あたり1-4 回に分けて投与することができる。

【００３７】本発明のペプチドは、通常、製剤用の担
体、賦形剤と混合して調製した製剤として投与される
（Remington's Pharmaceutical Science, latest editi
on, MarkPublishing Company, Easton 、米国）。 製
剤用担体、賦形剤としては、医薬品の製剤分野において
常用され、かつ、本発明のペプチドと反応しない物質が
使用される。例えば、注射剤を製造するには、有効成分
である本発明のペプチドの他に、必要に応じ、塩酸、水
酸化ナトリウム、乳酸ナトリウム、乳剤、リン酸一水素
ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのpH調整剤、
塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤とともに注射
用蒸留水に溶解し、無菌漉過してアンプルに充填する
か、更に、マンニトール、デキストリン、シクロデキス
トリン、ゼラチンなどを加えて真空下凍結乾燥し、用事
溶解型の注射剤としてもよい。

【００３８】または、レシチン、ポリソルベトール80、
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳
化せしめ、注射用乳剤とすることができる。 直腸内投
与剤を製造するには、有効成分である本発明のペプチド
の他にカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ、モノグリセリド、
ポリエチレングリコールなどの座剤用基剤とを加湿して
溶解し、型に流し込んで冷却するか、または、ポリエチ
レングリコール、大豆油などに溶解したゼラチン膜で被
覆してもよい。

【００３９】経皮投与剤を製造するには、有効成分であ
る本発明のペプチドの他に白色ワセリン、ミツロウ、流
動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必
要ならば、加湿して練合し、軟膏剤とするか、ロジン、
アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合
した後、ポリエチレンなどの不織布に展延してテープ剤
とする。

【００４０】経肺投与剤を製造するには、有効成分であ
る本発明のペプチドを通常の噴射剤に溶解または分散し
て耐圧容器に充填し、エアゾール剤とする。更に、公知
のリポソーム技術等を使用して、持続性製剤とすること
もできる。また、上記の製剤は対象となる疾患の治療上
有効である他の成分を含有してもよい。以下に実施例を
記載し、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれ
ら実施例に限定されるものではない。

【００４１】

【実施例】参考例1. グルタチオン-Sトランスフェレース（glutat
hione S-tranferase: GST ）-IκB α融合タンパクの調
製 (1) GST-I κB α融合タンパクをコードするDNA の構築 ヒトI κB αのcDNAを単離するために、Haskill, Sらの
報告（Cell (1991) 65, 1281-1289 ）に基づき、I κB
αcDNAの開始コドン、終始コドン近傍の塩基配列に特異
的なプライマーGMD5（配列番号5 ）、GMD3（配列番号6
）を各々オリゴヌクレオチドシンセサイザーにて合成
した。なお、プライマーGMD5の5'側にはEcoRI 、プライ
マーGMD3の5'側にはBamHI による制限酵素切断部位が導
入されるよう設計した。RNA zolB（Biotex Laboratory
、Huston、米国）を使用し、リポポリサッカライド（L
PS ）刺激ヒト末梢血単核球より全RNA を得た。

【００４２】得られた全RNA を鋳型として、上記プライ
マーGMD5およびGMD3を用いて、リバーストランスクリプ
テース（reverse-transcriptase ）-PCR（polymerase c
hainreacton）法を行い、全長ヒトI κB αcDNAを得
た。得られた全長ヒトI κB αcDNAを、グルタチオン-S
トランスフェレース（glutathione S-transferase: GS
T）遺伝子を含有するプラスミドベクターpGENT2（Murak
ami, S.ら、J. Biol. Chem. (1994) 269, 15118-1512
3）のEcoRI およびBamHI 切断部位に導入し、プラスミ
ドpGST-MD を得た。Sanger, F.らの方法（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1977) 74, 5463-5467 ）を用いて全長
ヒトI κB αcDNAの塩基配列を確認した。プラスミドpG
ST-MD の摸式図を図1 に示す。

【００４３】(2) GST-部分欠失I κB α変異体融合タン
パク（deletion mutant ）をコードするDNA の構築 合成プライマーを用い、GST と6 種類のI κB αの部分
欠失変異体との各融合タンパクをコードするDNA を構築
した。各々のプライマーは、各々の欠失部位に相当する
塩基配列を有する。プライマーGMD5（配列番号5 ）およ
びプライマーGMD6（配列番号7 ）は、ヒトI κB αのア
ミノ酸1-242 からなる変異体del-1 をコードするDNA の
各々5'側および3'側を規定するよう設計された。プライ
マーGMD5（配列番号5 ）およびプライマーGMD7（配列番
号8 ）は、ヒトI κB αのアミノ酸1-181 からなる変異
体del-2 をコードするDNA の各々5'側および3'側を規定
するよう設計された。

【００４４】プライマーGMD52 （配列番号9 ）およびプ
ライマーGMD3（配列番号6 ）は、ヒトI κB αのアミノ
酸73 (1st ankirin repeat)-317 からなる変異体del-4
をコードするDNA の各々5'側および3'側を規定するよう
設計された。プライマーGMD53 （配列番号10）およびプ
ライマーGMD3（配列番号6 ）は、ヒトI κB αのアミノ
酸182 (3rd ankirin repeat)-317からなる変異体del-5
をコードするDNA の各々5'側および3'側を規定するよう
設計された。

【００４５】プライマーGMD5（配列番号5 ）およびプラ
イマーGMD9（配列番号11）は、ヒトI κB αのアミノ酸
1-295からなる変異体del-9 をコードするDNA の各々5'
側および3'側を規定するよう設計された。プライマーGM
D5（配列番号5 ）およびプライマーGMD10 （配列番号1
2）は、ヒトI κB αのアミノ酸 1-282からなる変異体d
el-10をコードするDNA の各々5'側および3'側を規定す
るよう設計された。

【００４６】なお、各プライマーは、その5'側にEcoRI
またはBamHI による制限酵素切断部位が導入されるよう
設計した。鋳型として全長ヒトI κB αcDNAを含有する
プラスミドベクターpGENT2を用い、5'側および3'側を規
定する各々のプライマー対を用いて、PCR 法を行った。
得られた各変異体をコードするDNA をプラスミドベクタ
ーpGENT2のEcoRI およびBamHI 切断部位に導入した。上
記Sanger, F.らの方法を用いて各変異体のcDNAの塩基配
列を確認した。各変異体の構造を摸式的に図2に示す。

【００４７】(3) GST-置換I κB α変異体をコードする
DNA の構築 GST とI κB αのC 末端の酸性領域（acidic region ）
にアミノ酸の置換変異を有するI κB α-mutant K （mt
K）との融合タンパクをコードするDNA を構築した。

【００４８】C 末端の酸性領域の283 位のセリン、288
位のセリン、291 位のスレオニン、293 位のセリン、29
6 位のスレオニンおよび298 位のスレオニンが全てアラ
ニンに置換されているI κB α-mt K をコードするDNA
を含有する動物細胞発現ベクターpRC/CMV （Ernst, M.
K. ら、Mol. Cell. Biol. (1995) 872-882 ）を鋳型と
して、I κB αcDNAの開始コドン、終始コドン近傍の塩
基配列に特異的なプライマーGMD5とGMD3を用いてPCR 法
を行った。得られたI κB α置換変異体-mt Kをコード
するDNA はプラスミドベクターpGENT2のEcoRI およびBa
mHI 切断部位に導入した。上記Sanger, F.らの方法を用
いて変異体mt KのcDNAの塩基配列を確認した。I κB α
-mutant K の酸性領域の摸式図を図3 に示す。

【００４９】(4) GST-I κB α融合タンパクの調製 前記(1) 、(2) および(3) で得た各発現ベクターを大腸
菌にて発現させ、GST-I κB α融合タンパクを得た。各
発現ベクターで大腸菌（JM109 ）をトランスフォームし
た後、50μg/mlアンピシリンを含む2xYT培養液（和光純
薬製）中で、培養した。1mM のイソプロピルチオガラク
トシド（IPTG、和光純薬製）を培養液に加え刺激し、2-
3 時間後に集菌した。

【００５０】これを遠心分離した後、その沈殿をPBS(-)
（日水製薬）で洗浄した。1% Triton X-100 （和光純薬
製）を含むPBS(-)中で超音波破砕し、遠心分離して上清
を回収した。その後、各々の融合タンパクを1% Triton
X-100 ｗ含むPBS(-)中でグルタチオンセファロース（Ph
armacia ）に結合させ、同PBS(-)にて5 回洗浄後、5mM
グルタチオン（和光純薬）溶液で溶出した（Smith, D.
B. & Johnson, K. S.Gene (1988) 67, 31-40 ）。

【００５１】参考例2. I κB αリン酸化酵素（カイネ
ース）の部分精製 ヒト単核球細胞株THP-1 より、I κB αをリン酸化する
カイネースを部分精製した。THP-1 細胞を5% ウシ胎児
血清（FCS 、ICN Corp.,豪州 ）、100 U/mlペニシリン
（GIBCO BRL ）、100 μg/mlストレプトマイシン（GIBC
O BRL ）および2mM L-グルタミン（和光純薬）を含むRP
MI-1640 培養液（日水製薬）で、37℃、5%CO2 存在下で
培養した。4x10⁹ 個のTHP-1 細胞を10μg/mlのLPS(E.
coli. O55 B5、DIFCO ）で5 分間刺激し、遠心により集
めた。

【００５２】細胞の沈殿をPBS(-)で2 回洗浄後、1mM EG
TA、1mM ジチオスレイトール（DTT）、0.5mM フェニル
メチルスルホニルフルオリド（PMSF）および各1 μg/ml
のアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタイン（Sigma
製）を含む20mM ヘペス（Hepes ）緩衝液（pH 7.9）で
懸濁し、超音波破砕後、500xg にて10分間遠心した。上
清をさらに18000xg にて35分間、4 ℃で遠心し、その上
清を20mM Tris 緩衝液（pH 7.5）で4 ℃、4 時間透析
し、粗分画を得た。

【００５３】次いで、20mM Tris 緩衝液（pH 7.5）で平
衡化したRed-A セファロースカラム（Red-A Sepharose
column, AMICON、ベッド容積5ml ）にて、 0M、0.5M、
2MのようにNaCl濃度を段階的に上げ溶出分離した。2M N
aCl で溶出する分画を20mM Tris 緩衝液（pH 7.5）で4
℃、4 時間透析した。20mM Tris 緩衝液（pH7.5 ）で平
衡化したジメチルアミノエチル（DEAE）セファセルカラ
ム（DEAE-Sephacel column, Pharmacia 、ベッド容積20
ml）にて、0M、0.1M、0.25M 、0.5M、2MのようにNaCl濃
度を段階的に上げ溶出分離した。0.25M NaClで溶出する
分画を20mM Tris 緩衝液（pH7.5 ）で4 ℃、4 時間透析
した後、20mM Tris 緩衝液（pH7.5 ）で平衡化したDEAE
-HPLC （Bio Gel DEAE-5PW、Bio Rad 社）で1ml/分の速
度で溶出した。

【００５４】溶出開始後10分から70分まで0-0.5M NaCl
の直線濃度勾配をかけ、2ml づつ分画した。得られたカ
イネース（kinase）の活性はGST-I κB αを結合させた
グルタチオンセファロースを用いた固相でのインビトロ
カイネースアッセイ（in vitro kinase assay 、実施例
1(1)参照）により測定した。タンパク量は、Coomassie
Protein Reagent （PIERCE）を用い、ウシ血清アルブミ
ン（BSA ）をスタンダードとして測定した。その結果、
得られたI κB αカイネース部分精製品の精製度は約12
6 倍であった（表1 参照）。

【００５５】

【表１】

【００５６】実施例1. I κB αに対するリン酸化活性
の測定 (1) GST-I κB α融合タンパクを用いた実験 インビトロカイネースアッセイにより、I κB αに対す
るリン酸化活性を測定した。 参考例1 にて作成した各
々の融合タンパクとグルタチオンセファロースビーズ
（Pharmacia 製）を4 ℃、2 時間 にて撹拌することに
より結合させ、1%NP-40（ナカライテスク）を含むPBS
(-)で3 回、PBS(-)で2 回洗浄した後PBS(-)に懸濁し
た。14pmole の融合タンパクを含む20μl のグルタチオ
ンセファロースビーズと上記参考例2 で得た細胞質画分
由来の精製I κB αカイネース2 μl をPBS(-)で400 μ
l に調整し、4 ℃にて3 時間撹拌した。

【００５７】その後、1% NP-40を含むPBS(-)で2 回、PB
S(-)で一回洗い沈殿を得た。この沈殿に5 μCi（185kB
q）［γ-32P］ATP （Amersham Japan、#PB10168、3000C
i/mM）および20μl のカイネース緩衝液（20mM MgCl2、
10mM MnCl2を含む20mM Hepes緩衝液（pH7.4 ））を加
え、30℃で5 分間インキュベートした。 13.5mM EDTA
および1% NP-40を含むPBS(-)を加えて反応を停止させ、
1% NP-40を含むPBS(-)で4 回洗浄して得られた沈殿にソ
ディウムドデシルスルフェート（SDS ）試料緩衝液（0.
0625M Tris-HCl (pH 6.8) 、10%(w/v) グリセロール、
5%(w/v) β- メルカプトエタノール、2.3%(w/v) SDS ）
を5 μl 加えて沸騰水中でタンパクを溶出した。

【００５８】遠心分離後、上清をSDS-ポリアクリルアミ
ド電気泳動（PAGE）にふした。SDS-PAGE終了後、X 線フ
ィルムを用いオートラジオグラフィーを行った（図4 参
照）。この結果、全長I κB α（wild type;wt）、変異
体del-9 、del-5 またはdel-4 のGST との各融合タンパ
クを用いた場合には放射活性が検出されたが、変異体de
l-10またはdel-1 のGST との各融合タンパクを用いた場
合には放射活性が検出されなかった。

【００５９】また、一部の実験ではグルタチオンセファ
ロースビーズを使用せず、14pmoleの融合タンパクとTHP
-1 細胞の細胞質画分由来の部分精製I κB αカイネー
ス2μl に、上記カイネース緩衝液を最終濃度が同等に
なるように加え、液相にて前述のとおりアッセイを行っ
た（図5 参照）。この結果、全長I κB α（wt）および
del-9 のGST との各融合タンパクを用いた場合には放射
活性が検出されたが、変異体del-10、del-1 および置換
変異体（mt-K）のGST との各融合タンパクを用いた場合
には放射活性が検出されなかった。これらのことから、
変異体del-10とdel-9 のアミノ酸配列の相違する領域に
リン酸化部位が存在することおよび置換変異体mt Kに存
在するアミノ酸置換によりI κB αがリン酸化を受けな
くなることが明らかとなった。

【００６０】(2) ペプチドによるリン酸化活性の競合的
阻害 配列番号1 のアミノ酸配列を有するI κB αリン酸化部
位のペプチドをペプチドシンセサイザーにより合成し、
逆相HPLCにより精製、アミノ酸分析装置でその配列を確
認した。このペプチドを用い、I κB αのリン酸化活性
を測定した。GST とI κB α（wt）の融合タンパクを使
用し、これにTHP-1 細胞の細胞質分画由来の上記精製I
κB αカイネースを同量加え、2.7nM のペプチド（モル
比で200 倍）を添加し、上記(1) と同様にアッセイを行
った。その結果を図6 に示す。I κB αリン酸化部位の
ペプチドを添加することにより、I κB αのリン酸化が
抑制された。

【００６１】(3) リン酸化部位の特定 I κB αリン酸化抑制ペプチドのリン酸化部位をさらに
特定するために、実施例１（２）で作成したI κB αの
リン酸化抑制ペプチド（配列番号１）の一つのアミノ酸
残基を置換したペプチドを使用して、インビトロカイネ
ースアッセイを行った。

【００６２】配列番号１のアミノ酸配列を有するI κB
αリン酸化ペプチドのアミノ酸配列においてリン酸化さ
れるアミノ酸残基と予測される283 位のセリン、288 位
のセリン、291 位のスレオニンまたは293 位のセリンを
一つづつアラニンに置換したペプチド（各々、283Ala
（配列番号13）、288Ala（配列番号14）、291Ala（配列
番号15）または293Ala（配列番号16））を各15n mole使
用し、実施例１（２）のインビトロカイネースアッセイ
と同様の条件で液相にてアッセイを行った(n=4)。な
お、コントロールとして、全長I κB α（wt）添加群
（陽性コントロール）とI κB α非添加群（陰性コント
ロール）をおいて比較した。

【００６３】アッセイ後、Tris/Tricine系の緩衝液を使
用して実施例１（１）と同様にSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行った。その結果をイメージアナライザ
ー（BAS1000, Fuji film Co. ltd）で解析、定量した。
その結果を図７に示す。この結果、ペプチド283Alaはリ
ン酸化に影響を及ぼさなかった。一方、ペプチド293Ala
はリン酸化に大きく影響を及ぼした。また、ペプチド28
8Alaおよび291Alaはリン酸化に若干程度の影響を及ぼし
た。

【００６４】以上の結果から、I κB αリン酸化抑制ペ
プチドのアミノ酸配列中の４つのセリンまたはスレオニ
ン残基の内、288 位のセリン、291 位のスレオニンおよ
び293 位のセリンがリン酸化に関与していることが強く
示された。なお、上述の各々のI κB α置換変異体を用
いた際にリン酸化が完全に抑制されないのは、置換した
アミノ酸残基以外のセリンまたはスレオニン残基がリン
酸化されたためと考えられた。

【００６５】実施例2. I κB αリン酸化部位のペプチ
ドによるNFκB 活性に及ぼす影響 I κB αリン酸化部位のペプチドを用いて無細胞系（Is
hikawa, Y. et al., J. Biol. Chem. (1995) 270, 4158
-4164 ）でのNFκB 活性化に及ぼす影響を調べた。無刺
激THP-1 細胞を試験例2 に記載された条件で培養した。
Sadowski, H. B.et al., (Nature (1993) 362, 79-83)
の方法に従い、THP-1 細胞から細胞質分画および細胞膜
に富む分画を調製した。各20μg の両分画をあわせ、15
nMのI κBαリン酸化部位のペプチド、10mMのATP およ
び20μg/mlのLPS を加えて30℃で10分間刺激した。

【００６６】13.5mM EDTA （pH 8.0）を加えて反応停止
後、遠心分離して上清を得た。この上清を6%ポリアクリ
ルアミドゲル（アクリルアミド: ビス=30: 1）を含む0.
25xTBE（最終濃度、1l当たりTris塩（Sigma 製） 13.5
g、硼酸（和光純薬製） 6.9 g、EDTA（和光純薬製） 1.
165g ）において、IL-8κB 領域を含む³²P 標識DNA プ
ローブを用いてゲルシフトアッセイを行った（Mukaida,
N. et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 13289-1329
5）。その後、イメージアナライザー（BAS 1000、Fuji
film Co.ltd. ）で解析、定量した。

【００６７】なお、コントロールとしてLPS 非添加群お
よびペプチドのコントロールとして各々15nMのカゼイン
カイネースII（casein kinase II）基質（Kaengel, E.
A. et al., J. Biol. Chem. (1987) 262, 9136-9140 ）
（配列番号17）およびマップカイネース（MAP kinase）
基質（Dong, Z. et al., J. Exp. Med. (1993) 177,107
1-1077 ）（配列番号18）添加群を設定した。

【００６８】ゲルシフトアッセイの結果を図8 に示す。
LPS で刺激したTHP-1 細胞を用いた系においてI κB α
のリン酸化部位のペプチドを添加した群では、I κB α
のリン酸化が抑制され、その結果、NFκB の活性化が認
められなかった。さらに、イメージアナライザーでの解
析、定量の結果を図9 に示す。I κB αリン酸化部位の
ペプチドを添加した群では、明らかにNFκB の活性化が
抑制された。

【００６９】

【発明の効果】本発明によれば、多発性硬化症や全身性
エリテマトーデスなどの炎症性疾患、骨髄移植、臓器移
植時における拒絶反応等の炎症性サイトカイン、炎症性
メデイエーターが関与する疾患の治療に有効な抗炎症
剤、免疫抑制剤が提供される。本発明により提供される
抗炎症剤、免疫抑制剤はその有効成分として含有される
ペプチドまたはその塩がI κB αのリン酸化を抑制する
ことにより、NFκB による転写活性化作用を阻害するた
め、これを上記疾患の患者に投与することにより、該疾
患を軽減することができる。

【００７０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列： Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu Ser 5 10 15 Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu 20 25

【００７１】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列： Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu Ser 5 10 15 Glu Phe

【００７２】配列番号：３ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列： Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe 5 10

【００７３】配列番号：４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド

【００７４】配列番号：５ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成DNA 配列： GCGAATTCCA TGTTCCAGGC GGCCGAGCG 29

【００７５】配列番号：６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成DNA 配列： GCAGGATCCT CATAACGTCA GACGCTGGC 29

【００７６】配列番号：７ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成DNA 配列： GCAGGATCCT CAATCAGCCC CACACTTCAA CAG 33

【００７７】配列番号：８ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成DNA 配列： GCAGGATCCT CAGTAGTTGG TAGCCTTCAG GAT 33

【００７８】配列番号：９ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成DNA 配列： GCGAATTCCG ACGGGGACTC GTTCCTGCA 29

【００７９】配列番号：１０ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成DNA 配列： GCGAATTCCA ATGGCCACAC GTGTCTACAC 30

【００８０】配列番号：１１ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成DNA 配列： GCAGGATCCT CAGAACTCTG ACTCTGTGTC ATA 33

【００８１】配列番号：１２ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成DNA 配列： GCAGGATCCT CACTCTGGCA GCATCTGAAG GTT 33

【００８２】配列番号：１３ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列： Met Leu Pro Glu Ala Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu Ser 5 10 15 Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu 20 25

【００８３】配列番号：１４ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列： Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ala Tyr Asp Thr Glu Ser 5 10 15 Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu 20 25

【００８４】配列番号：１５ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列： Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Ala Glu Ser 5 10 15 Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu 20 25

【００８５】配列番号：１６ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列： Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Thr Glu Ala 5 10 15 Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu 20 25

【００８６】配列番号：１７ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド

【００８７】配列番号：１８ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】図1 は全長ヒトI κB αをコードするDNA を導
入した、グルタチオン-Sトランスフェレース（GST ）遺
伝子を含有するプラスミドpGST-MD を摸式的に表した図
である。

【図２】図2 は各種の構築した部分欠失I κB α変異体
とGST の融合タンパクを摸式的に表した図である。

【図３】図3 はI κB αおよび置換I κB α変異体のC
末端に存在する酸性領域のアミノ酸配列を摸式的に示し
た図である。各記号は、一文字標記により表されたアミ
ノ酸である。

【図４】図4 は固相において全長I κB α（wt）、変異
体del-9 、del-10、del-1 、del-5 およびdel-4 のGST
との各融合タンパクのリン酸化をインビトロカイネース
アッセイにより調べた電気泳動の図である。

【図５】図5 は液相において全長I κB α（wt）、変異
体del-9 、del-10、del-1 および置換変異体（mt-K）の
GST との各融合タンパクのリン酸化をインビトロカイネ
ースアッセイにより調べた電気泳動の図である。

【図６】図6 はI κB αのリン酸化部位のペプチド（I
κB αカイネース基質）およびコントロールのペプチド
であるカゼインカイネース基質（CKII substrate）とマ
ップカイネース基質（MAPK substrate）を添加した時の
インビトロカイネースアッセイにおけるI κB αのリン
酸化状態を示す図である。コントロール（ペプチド非添
加群）を100%にしたときの各処理群のリン酸化を相対比
で表している（n=3 ）。

【図７】図7 は部分精製したI κB αのリン酸化酵素
（カイネース）による各アミノ酸置換ペプチドのリン酸
化の程度を示した図である。陽性コントロール（全長I
κB α添加群）を100%としたときの各ペプチド添加群の
リン酸化を相対比（％）で表している。

【図８】図8 はI κB αのリン酸化部位のペプチド（I
κB αカイネース基質）およびコントロールのペプチド
であるカゼインカイネース基質（CKII substrate）とマ
ップカイネース基質（MAPK substrate）を添加した時の
ゲルシフトアッセイを示す図である。

【図９】図9 はI κB αのリン酸化部位のペプチド（I
κB αK ）およびコントロールのペプチドであるカゼイ
ンカイネース基質（CKII）とマップカイネース基質（MA
PK）を添加した時のゲルシフトアッセイをイメージアナ
ライザーで解析、定量した図である。LPS(+)/ ペプチド
非添加群を100%としたときの各処理群の相対比を示す
（n=4 ）。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/08 7804−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＢＥ // Ｃ０７Ｋ 19/00 ＡＥＤ Ｃ１２Ｎ 1/21 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 I κB αのリン酸化部位に対応するアミ
   ノ酸配列を有するペプチド、およびその薬理学的に許容
   される塩。
2. 【請求項２】 I κB αがヒトI κB αであることを特
   徴とする請求項1 のペプチド、およびその薬理学的に許
   容される塩。
3. 【請求項３】 I κB αのリン酸化を抑制することを特
   徴とする請求項1 または2 に記載のペプチド、およびそ
   の薬理学的に許容される塩。
4. 【請求項４】 下記のアミノ酸配列： Met-Leu-Pro-Glu-Ser-Glu-Asp-Glu-Glu-Ser-Tyr-Asp-Th
   r-Glu-Ser-Glu-Phe-Thr-Glu-Phe-Thr-Glu-Asp-Glu-Leu
   （配列番号：１） を含むことを特徴とする請求項1 〜3 のいずれか１項に
   記載のペプチド、およびその薬理学的に許容される塩。
5. 【請求項５】 下記のアミノ酸配列： Met-Leu-Pro-Glu-Ser-Glu-Asp-Glu-Glu-Ser-Tyr-Asp-Th
   r-Glu-Ser-Glu-Phe （配列番号：２） を含むことを特徴とする請求項1 〜3 のいずれか１項に
   記載のペプチド、およびその薬理学的に許容される塩。
6. 【請求項６】 下記のアミノ酸配列： Ser-Glu-Asp-Glu-Glu-Ser-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser-Glu-Ph
   e （配列番号：３） を含むことを特徴とする請求項1 〜3 のいずれか１項に
   記載のペプチド、およびその薬理学的に許容される塩。
7. 【請求項７】 下記のアミノ酸配列： Ser-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ser （配列番号：４） を含むことを特徴とする請求項1 〜3 のいずれか１項に
   記載のペプチド、およびその薬理学的に許容される塩。
8. 【請求項８】 請求項４〜７に記載のペプチド中の１又
   は複数個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入に
   より変更されており、且つI κB αのリン酸化を阻害す
   る活性を維持しているペプチド、およびその薬理学的に
   許容される塩。
9. 【請求項９】 I κB αのリン酸化部位のペプチドが修
   飾されていることを特徴とする請求項4 ないし7 に記載
   のペプチドおよびその薬理学的に許容される塩。
10. 【請求項１０】 請求項1 〜9 のいずれか１項に記載の
    ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする抗
    炎症剤。
11. 【請求項１１】 請求項1 〜9 のいずれか１項に記載の
    ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする免
    疫抑制剤。
12. 【請求項１２】 請求項1 〜9 のいずれか１項に記載の
    ペプチドを有効成分として含有することを特徴とするI
    κB αのリン酸化阻害剤。
13. 【請求項１３】 請求項1 〜9 のいずれか１項に記載の
    I κB αのペプチドのアミノ酸配列をコードするオリゴ
    ヌクレオチドを含み、該ペプチドを発現し得る発現ベク
    ター。