JPH0834801A - 硫酸化多糖類及びその製造法 - Google Patents
硫酸化多糖類及びその製造法Info
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- JPH0834801A JPH0834801A JP17120894A JP17120894A JPH0834801A JP H0834801 A JPH0834801 A JP H0834801A JP 17120894 A JP17120894 A JP 17120894A JP 17120894 A JP17120894 A JP 17120894A JP H0834801 A JPH0834801 A JP H0834801A
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- heparin
- sulfated polysaccharide
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 肝実質細胞増殖因子に親和性を有する少なく
とも８糖以上の構造単位部分を含有する硫酸化多糖類お
よびその製造法。 【効果】 本発明の硫酸化多糖類は、ＨＧＦに対して特
異的に結合する性質を有することから、ＨＧＦを安定化
させたり、その増殖活性を向上させることができる。ま
た既知の硫酸化多糖類は、ＨＧＦ等のヘパリン結合性増
殖因子の分解を抑制することが知られているので、本発
明の硫酸化多糖類にも同様の効果が期待でき、例えば組
換えＤＮＡ技術によりヘパリン結合性増殖因子を生産す
る際の培養液中に本発明の硫酸化多糖類を添加すること
により、その培養上清からかかるヘパリン結合性増殖因
子を効率良く高生産できる。
とも８糖以上の構造単位部分を含有する硫酸化多糖類お
よびその製造法。 【効果】 本発明の硫酸化多糖類は、ＨＧＦに対して特
異的に結合する性質を有することから、ＨＧＦを安定化
させたり、その増殖活性を向上させることができる。ま
た既知の硫酸化多糖類は、ＨＧＦ等のヘパリン結合性増
殖因子の分解を抑制することが知られているので、本発
明の硫酸化多糖類にも同様の効果が期待でき、例えば組
換えＤＮＡ技術によりヘパリン結合性増殖因子を生産す
る際の培養液中に本発明の硫酸化多糖類を添加すること
により、その培養上清からかかるヘパリン結合性増殖因
子を効率良く高生産できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、肝実質細胞増殖因子
（以下、「ＨＧＦ」と略記する）に対して特異的に親和
性を有する硫酸化多糖類に関するものである。
（以下、「ＨＧＦ」と略記する）に対して特異的に親和
性を有する硫酸化多糖類に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ＨＧ
Ｆは、肝臓の特異的機能をつかさどる肝実質細胞に対
し、わずか数ｎｇ／ｍｌの濃度で増殖促進作用を示す蛋
白性増殖因子である。このＨＧＦは肝実質細胞の増殖の
みならず、血清アルブミンなど肝で特異的に生産される
蛋白質の合成を亢進する作用を有している。さらにＨＧ
Ｆは生体の発生や分化・組織構築に重要な働きを示すこ
とが明らかとなっている。興味深いことに、ＨＧＦは癌
細胞に対して傷害活性を有する因子（Ｔｕｍｏｒ Ｃｙ
ｔｏｔｏｘｉｃ Ｆａｃｔｏｒ：ＴＣＦ）と同一分子で
あることが明らかとなっている。これらのことは、ＨＧ
Ｆが生体内で様々なサイトカインとして作用することを
示している。
Ｆは、肝臓の特異的機能をつかさどる肝実質細胞に対
し、わずか数ｎｇ／ｍｌの濃度で増殖促進作用を示す蛋
白性増殖因子である。このＨＧＦは肝実質細胞の増殖の
みならず、血清アルブミンなど肝で特異的に生産される
蛋白質の合成を亢進する作用を有している。さらにＨＧ
Ｆは生体の発生や分化・組織構築に重要な働きを示すこ
とが明らかとなっている。興味深いことに、ＨＧＦは癌
細胞に対して傷害活性を有する因子（Ｔｕｍｏｒ Ｃｙ
ｔｏｔｏｘｉｃ Ｆａｃｔｏｒ：ＴＣＦ）と同一分子で
あることが明らかとなっている。これらのことは、ＨＧ
Ｆが生体内で様々なサイトカインとして作用することを
示している。
【０００３】近年、ＨＧＦを使用してｉｎ ｖｉｖｏに
おける薬理効果が検証されている。その結果、ＨＧＦを
使用することにより、切除された肝組織の再生率が向上
すること、さらに各種肝機能および腎機能障害の改善等
が報告されている。ところでＨＧＦはヘパリンカラムで
精製されることから、ヘパリンに親和性を有する増殖因
子として知られている。一方、細胞表層上にはヘパリン
と構造が類似したヘパラン硫酸が多数存在し、ＨＧＦに
対する一種の低親和性レセプターとして、ＨＧＦを細胞
表層上に捕捉している。さらにこれらのレセプターに結
合したＨＧＦは急速に細胞内へ移行し、分解されて細胞
外へ放出される。このためｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＧ
Ｆの血中半減期はきわめて短く、ＨＧＦの薬理効果が充
分に得られないのが現状であった。
おける薬理効果が検証されている。その結果、ＨＧＦを
使用することにより、切除された肝組織の再生率が向上
すること、さらに各種肝機能および腎機能障害の改善等
が報告されている。ところでＨＧＦはヘパリンカラムで
精製されることから、ヘパリンに親和性を有する増殖因
子として知られている。一方、細胞表層上にはヘパリン
と構造が類似したヘパラン硫酸が多数存在し、ＨＧＦに
対する一種の低親和性レセプターとして、ＨＧＦを細胞
表層上に捕捉している。さらにこれらのレセプターに結
合したＨＧＦは急速に細胞内へ移行し、分解されて細胞
外へ放出される。このためｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＧ
Ｆの血中半減期はきわめて短く、ＨＧＦの薬理効果が充
分に得られないのが現状であった。
【０００４】そこで、細胞表層に存在するヘパラン硫酸
に対し、構造が類似している各種硫酸化多糖類（ヘパリ
ン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸等）をＨＧ
Ｆと混合する試みがなされた。添加した硫酸化多糖類
は、ＨＧＦと結合することにより、細胞表層に存在する
ヘパラン硫酸とＨＧＦとの結合を抑制する。この結果、
ＨＧＦの分解が顕著に抑制され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにお
けるＨＧＦの活性およびｉｎ ｖｉｖｏにおける薬理効
果が向上することが判明している（特開平５−３０１８
２４号公報）。
に対し、構造が類似している各種硫酸化多糖類（ヘパリ
ン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸等）をＨＧ
Ｆと混合する試みがなされた。添加した硫酸化多糖類
は、ＨＧＦと結合することにより、細胞表層に存在する
ヘパラン硫酸とＨＧＦとの結合を抑制する。この結果、
ＨＧＦの分解が顕著に抑制され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにお
けるＨＧＦの活性およびｉｎ ｖｉｖｏにおける薬理効
果が向上することが判明している（特開平５−３０１８
２４号公報）。
【０００５】一方、生体内の硫酸化多糖類の内、最も構
造的多様性を有し、様々な細胞活動に大きな影響を与え
る物質の一つがグリコサミノグリカンである。例えばこ
の分子として、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチ
ン硫酸、デルマタン硫酸等が挙げられる。ヘパリンおよ
びヘパラン硫酸は、ウロン酸残基とグルコサミン残基を
含んだ、二糖単位の繰り返し構造によって出来ている。
ウロン酸はＣ−５の立体配置により、α−Ｄ−グルクロ
ン酸（ＧｌｃＵＡ）とβ−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）
とに区別され、ＩｄｏＡの一部は２−Ｏ−硫酸基（Ｉｄ
ｏＡ（２Ｓ））を有する。グルコサミン残基は、Ｎ−ア
セチル基（ＧｌｃＮＡｃ）あるいはＮ−硫酸基（Ｇｌｃ
ＮＳ）を有する。グルコサミン残基は、Ｃ−６に硫酸基
を有しているものもある。これらに比較して、含量は低
いが２−Ｏ−硫酸化 α−Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＵ
Ａ（２Ｓ））および３−Ｏ−硫酸化ＧｌｃＮＳ（Ｇｌｃ
ＮＳ（３Ｓ））あるいは３−Ｏ，６−Ｏ−ジ硫酸化Ｇｌ
ｃＮＳ（ＧｌｃＮＳ（３，６Ｓ）が存在する。これらの
残基から構成される数十から数百からを越える二糖の繰
り返し構造を、ヘパリンおよびヘパラン硫酸は有してい
る。従って、上記の様々な二糖単位の組合せにより、ヘ
パリンおよびヘパラン硫酸の構造的多様性が形成されて
いる。
造的多様性を有し、様々な細胞活動に大きな影響を与え
る物質の一つがグリコサミノグリカンである。例えばこ
の分子として、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチ
ン硫酸、デルマタン硫酸等が挙げられる。ヘパリンおよ
びヘパラン硫酸は、ウロン酸残基とグルコサミン残基を
含んだ、二糖単位の繰り返し構造によって出来ている。
ウロン酸はＣ−５の立体配置により、α−Ｄ−グルクロ
ン酸（ＧｌｃＵＡ）とβ−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）
とに区別され、ＩｄｏＡの一部は２−Ｏ−硫酸基（Ｉｄ
ｏＡ（２Ｓ））を有する。グルコサミン残基は、Ｎ−ア
セチル基（ＧｌｃＮＡｃ）あるいはＮ−硫酸基（Ｇｌｃ
ＮＳ）を有する。グルコサミン残基は、Ｃ−６に硫酸基
を有しているものもある。これらに比較して、含量は低
いが２−Ｏ−硫酸化 α−Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＵ
Ａ（２Ｓ））および３−Ｏ−硫酸化ＧｌｃＮＳ（Ｇｌｃ
ＮＳ（３Ｓ））あるいは３−Ｏ，６−Ｏ−ジ硫酸化Ｇｌ
ｃＮＳ（ＧｌｃＮＳ（３，６Ｓ）が存在する。これらの
残基から構成される数十から数百からを越える二糖の繰
り返し構造を、ヘパリンおよびヘパラン硫酸は有してい
る。従って、上記の様々な二糖単位の組合せにより、ヘ
パリンおよびヘパラン硫酸の構造的多様性が形成されて
いる。
【０００６】グリコサミノグリカンは、細胞外マトリッ
クスの物理的・化学的環境に強い影響を及ぼすことが知
られている。例えば、グリコサミノグリカンはその特異
的な構造を利用して、細胞基底膜へのさまざまな分子の
浸透性を調節したり、増殖因子、ホルモン、あるいは神
経伝達物質のような重要な調節因子の細胞表面への接近
を制御することができる。さらに、ヘパリンを始めとす
るグリコサミノグリカンは、ＨＧＦに対して親和性を有
することが知られている。しかしながら、ＨＧＦと親和
性を示すグリコサミノグリカンの特異的構造は、現在ま
で全く判っていなかった。
クスの物理的・化学的環境に強い影響を及ぼすことが知
られている。例えば、グリコサミノグリカンはその特異
的な構造を利用して、細胞基底膜へのさまざまな分子の
浸透性を調節したり、増殖因子、ホルモン、あるいは神
経伝達物質のような重要な調節因子の細胞表面への接近
を制御することができる。さらに、ヘパリンを始めとす
るグリコサミノグリカンは、ＨＧＦに対して親和性を有
することが知られている。しかしながら、ＨＧＦと親和
性を示すグリコサミノグリカンの特異的構造は、現在ま
で全く判っていなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＧＦア
フィニテイーカラムを用いることにより、ＨＧＦとヘパ
リンもしくはヘパラン硫酸の結合を解析した。すなわ
ち、ヘパリンもしくはヘパラン硫酸を断片化したオリゴ
糖とＨＧＦアフィニテイーカラムの結合を解析した結
果、各オリゴ糖はサイズ依存的にＨＧＦアフィニテイー
カラムへ結合すること、さらに、ＨＧＦアフィニテイー
カラムに対する各オリゴ糖の結合率は、８糖から構成さ
れるオリゴ糖から急激に増加すること、またそのような
オリゴ糖は糖の特定位置が硫酸化されたものであること
を初めて見い出し、本発明を完成するに至った。
フィニテイーカラムを用いることにより、ＨＧＦとヘパ
リンもしくはヘパラン硫酸の結合を解析した。すなわ
ち、ヘパリンもしくはヘパラン硫酸を断片化したオリゴ
糖とＨＧＦアフィニテイーカラムの結合を解析した結
果、各オリゴ糖はサイズ依存的にＨＧＦアフィニテイー
カラムへ結合すること、さらに、ＨＧＦアフィニテイー
カラムに対する各オリゴ糖の結合率は、８糖から構成さ
れるオリゴ糖から急激に増加すること、またそのような
オリゴ糖は糖の特定位置が硫酸化されたものであること
を初めて見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明の要旨は、肝実質細胞増殖
因子に親和性を有し、少なくとも８糖以上の構成糖から
なる硫酸化多糖類に存する。以下、本発明につき詳細に
説明する。本発明で使用するＨＧＦは、ヒトを始めとす
る哺乳動物由来で、肝実質細胞の増殖を促進する活性を
有する蛋白性因子である限りにおいては特に制限されな
い。例えばＨＧＦは、血漿等から精製して得たもの、お
よび遺伝子組換え法によりそのｃＤＮＡを発現させて得
られたもののいずれのものでも使用し得る。具体的に
は、特開昭６３−２２５２６号公報に記載された方法に
従い、劇症肝炎患者血漿から蛋白化学的に分離精製する
ことによって、あるいは特開平３−２８５６９３号公報
に記載された方法に従い、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライ
ブラリーから得たＨＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発
現ベクターを構築し、ＣＨＯ細胞等の宿主中で発現させ
ることによっても得られる。
因子に親和性を有し、少なくとも８糖以上の構成糖から
なる硫酸化多糖類に存する。以下、本発明につき詳細に
説明する。本発明で使用するＨＧＦは、ヒトを始めとす
る哺乳動物由来で、肝実質細胞の増殖を促進する活性を
有する蛋白性因子である限りにおいては特に制限されな
い。例えばＨＧＦは、血漿等から精製して得たもの、お
よび遺伝子組換え法によりそのｃＤＮＡを発現させて得
られたもののいずれのものでも使用し得る。具体的に
は、特開昭６３−２２５２６号公報に記載された方法に
従い、劇症肝炎患者血漿から蛋白化学的に分離精製する
ことによって、あるいは特開平３−２８５６９３号公報
に記載された方法に従い、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライ
ブラリーから得たＨＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発
現ベクターを構築し、ＣＨＯ細胞等の宿主中で発現させ
ることによっても得られる。
【０００９】ヒト由来のＨＧＦは、非還元下でのＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動）によって分子量約７６，０００−９
２，０００にバンドを与える。また、還元下でのＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって、分子量約５６，０００−６５，０
００のバンドを与えるラージサブユニットと、分子量約
３２，０００−３５，０００のバンドを与えるスモール
サブユニットに分離される。そして、このＨＧＦは８０
℃、１０分の熱処理によって、あるいはトリプシンやキ
モトリプシン消化によって肝実質細胞の増殖を促進する
活性が失われる性質を有する。また、該ＨＧＦはヘパリ
ンに強い親和性を有する。一般に、本発明で使用するＨ
ＧＦは、約０．５−２ｎｇ／ｍｌの濃度で肝実質細胞の
増殖活性を示し始め、約５−１０ｎｇ／ｍｌの濃度で良
好な増殖活性を示す。
−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動）によって分子量約７６，０００−９
２，０００にバンドを与える。また、還元下でのＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって、分子量約５６，０００−６５，０
００のバンドを与えるラージサブユニットと、分子量約
３２，０００−３５，０００のバンドを与えるスモール
サブユニットに分離される。そして、このＨＧＦは８０
℃、１０分の熱処理によって、あるいはトリプシンやキ
モトリプシン消化によって肝実質細胞の増殖を促進する
活性が失われる性質を有する。また、該ＨＧＦはヘパリ
ンに強い親和性を有する。一般に、本発明で使用するＨ
ＧＦは、約０．５−２ｎｇ／ｍｌの濃度で肝実質細胞の
増殖活性を示し始め、約５−１０ｎｇ／ｍｌの濃度で良
好な増殖活性を示す。
【００１０】本発明において「多糖類」とは、狭義の多
糖のほか、単糖が数個からなる「オリゴ糖」も包含する
ものとして定義される。本発明の硫酸化多糖類は、例え
ば以下のようにして得ることができる。まず、ヘパリ
ン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫
酸等の既知の硫酸化多糖類を酵素、亜硝酸等を用いて分
解し、各種分子量のオリゴ糖（部分分解物または限定分
解物）とする。一方、ヘパリン等の存在下でＨＧＦを接
触させた後、該ＨＧＦを担体と結合させ、次いで該ヘパ
リン等を除いてＨＧＦアフィニティーカラムを調製す
る。このカラムに、前記した各種のオリゴ糖を添加す
る。そして同カラムと各オリゴ糖との結合率の高いも
の、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上の
結合率のものを選別することにより、ＨＧＦとの親和性
が高い構造単位部分を含有する本発明の硫酸化多糖類を
得ることができる。
糖のほか、単糖が数個からなる「オリゴ糖」も包含する
ものとして定義される。本発明の硫酸化多糖類は、例え
ば以下のようにして得ることができる。まず、ヘパリ
ン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫
酸等の既知の硫酸化多糖類を酵素、亜硝酸等を用いて分
解し、各種分子量のオリゴ糖（部分分解物または限定分
解物）とする。一方、ヘパリン等の存在下でＨＧＦを接
触させた後、該ＨＧＦを担体と結合させ、次いで該ヘパ
リン等を除いてＨＧＦアフィニティーカラムを調製す
る。このカラムに、前記した各種のオリゴ糖を添加す
る。そして同カラムと各オリゴ糖との結合率の高いも
の、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上の
結合率のものを選別することにより、ＨＧＦとの親和性
が高い構造単位部分を含有する本発明の硫酸化多糖類を
得ることができる。
【００１１】本発明の硫酸化多糖類は、このような構造
単位部分を含み、ＨＧＦに親和性を示す限り、上記分解
物だけでなく、分解前の硫酸化多糖類で該構造単位部分
を多く含有するものをも包含する。さらに、ＨＧＦアフ
ィニテイーカラムに結合可能なオリゴ糖を陰イオン交換
カラムクロマトグラフィーで精製し、各オリゴ糖に特異
的な酵素（例えば、ヘパリチナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ
等）で分解して二糖単位とし、その二糖組成をポリアミ
ンカラム等で分画して各画分の硫酸基結合位置および結
合数を解析することにより、ＨＧＦアフィニテイーカラ
ムに対して特異的に結合するオリゴ糖、すなわち硫酸化
多糖類を構成する糖構造を求めることができる。その結
果、得られた硫酸化多糖類が、ヘキスロン酸とヘキソサ
ミンとの二糖単位構造の４単位からなり、該二糖単位構
造のうち、２−Ｏ−硫酸化ヘキスロン酸と６−Ｏ，２−
Ｎ−ジ硫酸化ヘキソサミンとの二糖単位構造が前記４単
位中、約１．５〜２．５単位であり、肝実質細胞増殖因
子に親和性を有する構造単位部分を含有する、本発明の
硫酸化多糖類であることを確認することができる。
単位部分を含み、ＨＧＦに親和性を示す限り、上記分解
物だけでなく、分解前の硫酸化多糖類で該構造単位部分
を多く含有するものをも包含する。さらに、ＨＧＦアフ
ィニテイーカラムに結合可能なオリゴ糖を陰イオン交換
カラムクロマトグラフィーで精製し、各オリゴ糖に特異
的な酵素（例えば、ヘパリチナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ
等）で分解して二糖単位とし、その二糖組成をポリアミ
ンカラム等で分画して各画分の硫酸基結合位置および結
合数を解析することにより、ＨＧＦアフィニテイーカラ
ムに対して特異的に結合するオリゴ糖、すなわち硫酸化
多糖類を構成する糖構造を求めることができる。その結
果、得られた硫酸化多糖類が、ヘキスロン酸とヘキソサ
ミンとの二糖単位構造の４単位からなり、該二糖単位構
造のうち、２−Ｏ−硫酸化ヘキスロン酸と６−Ｏ，２−
Ｎ−ジ硫酸化ヘキソサミンとの二糖単位構造が前記４単
位中、約１．５〜２．５単位であり、肝実質細胞増殖因
子に親和性を有する構造単位部分を含有する、本発明の
硫酸化多糖類であることを確認することができる。
【００１２】本発明の硫酸化多糖類は、前記したＨＧＦ
と組み合わせて使用することが出来る。例えば、ＨＧＦ
１モルに対して、本発明の硫酸化多糖類を０．１〜１０
5 モルの範囲で添加することにより、かかる硫酸化多糖
類は効果的にＨＧＦへ結合する。その結果、細胞表層に
存在するヘパラン硫酸とＨＧＦの結合が抑制され、ＨＧ
Ｆの分解が顕著に抑制される。さらにｉｎ ｖｉｔｒｏ
におけるＨＧＦの活性およびｉｎ ｖｉｖｏにおける薬
理効果が向上する。
と組み合わせて使用することが出来る。例えば、ＨＧＦ
１モルに対して、本発明の硫酸化多糖類を０．１〜１０
5 モルの範囲で添加することにより、かかる硫酸化多糖
類は効果的にＨＧＦへ結合する。その結果、細胞表層に
存在するヘパラン硫酸とＨＧＦの結合が抑制され、ＨＧ
Ｆの分解が顕著に抑制される。さらにｉｎ ｖｉｔｒｏ
におけるＨＧＦの活性およびｉｎ ｖｉｖｏにおける薬
理効果が向上する。
【００１３】
【発明の効果】本発明の硫酸化多糖類は、ＨＧＦに対し
て特異的に結合する性質を有することから、ＨＧＦを安
定化させたり、その増殖活性を向上させることができ
る。また既知の硫酸化多糖類は、ＨＧＦ等のヘパリン結
合性増殖因子の分解を抑制することが知られているの
で、本発明の硫酸化多糖類にも同様の効果が期待でき、
例えば組換えＤＮＡ技術によりヘパリン結合性増殖因子
を生産する際の培養液中に本発明の硫酸化多糖類を添加
することにより、その培養上清からかかるヘパリン結合
性増殖因子を効率良く高生産できる。
て特異的に結合する性質を有することから、ＨＧＦを安
定化させたり、その増殖活性を向上させることができ
る。また既知の硫酸化多糖類は、ＨＧＦ等のヘパリン結
合性増殖因子の分解を抑制することが知られているの
で、本発明の硫酸化多糖類にも同様の効果が期待でき、
例えば組換えＤＮＡ技術によりヘパリン結合性増殖因子
を生産する際の培養液中に本発明の硫酸化多糖類を添加
することにより、その培養上清からかかるヘパリン結合
性増殖因子を効率良く高生産できる。
【００１４】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に
限定されるものではない。なお以下の実施例において、
ＨＧＦは特開平３−２８５６９３号公報に記載の方法に
従い、遺伝子組換え法により調製した「組換えヒトＨＧ
Ｆ」を使用した。 実施例１ ＨＧＦへ結合可能なヘパリンオリゴ糖サイズ ヘパリン（生化学工業（株））に対して亜硝酸分解を行
い、ヘパリンの限定分解を行った。得られたヘパリンオ
リゴ糖０．５ｍｇを［ 3Ｈ］ＮａＢＨ4 によりトリチウ
ム標識した。この放射標識したヘパリンオリゴ糖を、Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘＧ−５０（ファルマシア社）カラム
（１．２ｃｍ×１２７ｃｍ）に添加後０．２Ｍ 酢酸ア
ンモニウムで溶出し、溶出液について放射活性測定とウ
ロン酸測定とからオリゴ糖のピーク位置を求め、それぞ
れのピークを分画した。一番最初に溶出したピークを２
糖サイズのオリゴ糖のピークと仮定し、さらに順次溶出
されるピークを４、６、８、１０、１２糖サイズのオリ
ゴ糖のピークと仮定した。分画した各オリゴ糖の大きさ
とそのおおよその分子量とを、表１に示す。
説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に
限定されるものではない。なお以下の実施例において、
ＨＧＦは特開平３−２８５６９３号公報に記載の方法に
従い、遺伝子組換え法により調製した「組換えヒトＨＧ
Ｆ」を使用した。 実施例１ ＨＧＦへ結合可能なヘパリンオリゴ糖サイズ ヘパリン（生化学工業（株））に対して亜硝酸分解を行
い、ヘパリンの限定分解を行った。得られたヘパリンオ
リゴ糖０．５ｍｇを［ 3Ｈ］ＮａＢＨ4 によりトリチウ
ム標識した。この放射標識したヘパリンオリゴ糖を、Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘＧ−５０（ファルマシア社）カラム
（１．２ｃｍ×１２７ｃｍ）に添加後０．２Ｍ 酢酸ア
ンモニウムで溶出し、溶出液について放射活性測定とウ
ロン酸測定とからオリゴ糖のピーク位置を求め、それぞ
れのピークを分画した。一番最初に溶出したピークを２
糖サイズのオリゴ糖のピークと仮定し、さらに順次溶出
されるピークを４、６、８、１０、１２糖サイズのオリ
ゴ糖のピークと仮定した。分画した各オリゴ糖の大きさ
とそのおおよその分子量とを、表１に示す。
【００１５】
【表１】 表１ ──────────────────── ヘパリンオリゴ糖に おおよそ おける構成糖の数 の分子量 ──────────────────── ４（Ｈｅｐ ４） １３００ ６（Ｈｅｐ ６） ２０００ ８（Ｈｅｐ ８） ２６００ １０（Ｈｅｐ１０） ３３００ １２（Ｈｅｐ１２） ４０００ ────────────────────
【００１６】一方、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ファルマシア社）１．２ｍｌ
をカップリング緩衝液（０．４Ｍ ＮａＣｌを含む０．
１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．３））に懸濁し、アセチル
化したヘパリンと接触させた組換えヒトＨＧＦ（１ｍｇ
／ｍｌ）溶液を加え、４℃で一夜穏やかに振とうした。
得られたゲルをカップリング緩衝液で十分洗浄後、０．
１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、４
℃で一夜穏やかに振とうした。このゲルをカラムにつ
め、２Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．２）で洗浄し、さらにアフィニティークロ
マトグラフィーで使用する緩衝液で洗浄することでＨＧ
Ｆアフィニテイーカラムを作成した。
ｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ファルマシア社）１．２ｍｌ
をカップリング緩衝液（０．４Ｍ ＮａＣｌを含む０．
１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．３））に懸濁し、アセチル
化したヘパリンと接触させた組換えヒトＨＧＦ（１ｍｇ
／ｍｌ）溶液を加え、４℃で一夜穏やかに振とうした。
得られたゲルをカップリング緩衝液で十分洗浄後、０．
１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、４
℃で一夜穏やかに振とうした。このゲルをカラムにつ
め、２Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．２）で洗浄し、さらにアフィニティークロ
マトグラフィーで使用する緩衝液で洗浄することでＨＧ
Ｆアフィニテイーカラムを作成した。
【００１７】このカラムに対し、放射標識した各サイズ
（４糖、６糖、８糖、１０糖および１２糖）のヘパリン
オリゴ糖４ｎｍｏｌを含む緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2 および０．２ｍｇ／ｍｌ
コンドロイチン硫酸（ＣＳＡ）を含む、１０ｍＭ トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２））を添加し、４℃下で１
時間反応させた。この後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．
９ｍＭ ＣａＣｌ2 、および０．２ｍｇ／ｍｌ ＣＳＡ
を含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で
洗浄を行い、さらにＨＧＦアフィニテイーカラムに結合
したヘパリンオリゴ糖を、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１
０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出し
た。この溶出されたヘパリンオリゴ糖の放射活性を測定
することにより、各ヘパリンオリゴ糖とＨＧＦアフィニ
テイーカラムの結合率を算出した。図１に、ヘパリンオ
リゴ糖のＨＧＦアフィニテイーカラムへの結合率を示
す。図１が示すように、ＨＧＦとヘパリンオリゴ糖の結
合には、ヘパリンオリゴ糖のサイズが８糖以上必要なこ
とが判った。
（４糖、６糖、８糖、１０糖および１２糖）のヘパリン
オリゴ糖４ｎｍｏｌを含む緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2 および０．２ｍｇ／ｍｌ
コンドロイチン硫酸（ＣＳＡ）を含む、１０ｍＭ トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２））を添加し、４℃下で１
時間反応させた。この後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．
９ｍＭ ＣａＣｌ2 、および０．２ｍｇ／ｍｌ ＣＳＡ
を含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で
洗浄を行い、さらにＨＧＦアフィニテイーカラムに結合
したヘパリンオリゴ糖を、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１
０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出し
た。この溶出されたヘパリンオリゴ糖の放射活性を測定
することにより、各ヘパリンオリゴ糖とＨＧＦアフィニ
テイーカラムの結合率を算出した。図１に、ヘパリンオ
リゴ糖のＨＧＦアフィニテイーカラムへの結合率を示
す。図１が示すように、ＨＧＦとヘパリンオリゴ糖の結
合には、ヘパリンオリゴ糖のサイズが８糖以上必要なこ
とが判った。
【００１８】実施例２ ＨＧＦへ結合可能なヘパラン硫
酸オリゴ糖サイズ ウシ肝臓由来の低硫酸化ヘパラン硫酸（ＣＬＨＳ）５０
０ｍｇを水５ｍｌに溶解し、コンドロイチナーゼＡＢＣ
２５ｍ ｕｎｉｔを使用して、混入しているコンドロ
イチン硫酸およびデルマタン硫酸を消化した。さらにこ
の画分に対してエタノール沈澱を行った。このウロン酸
を定量した結果、処理したＣＬＨＳの約５０％がコンド
ロイチナーゼＡＢＣ抵抗性画分に存在することが判っ
た。この画分をＤＥＡＥ−セファクリルカラムにかけた
後、０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．０２Ｍ トリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．２）から１．０Ｍ ＮａＣｌ，０．０２
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）の直線濃度勾配に
より溶出を行い、ＣＬＨＳＩ、ＣＬＨＳ ＩＩおよびＣ
ＬＨＳ ＩＩＩの画分に分画した。得られた低硫酸含量
画分であるＣＬＨＳ Ｉ画分に対してヘパチリナーゼＩ
を加え、３７℃１時間の酵素反応を行った後、３分間の
煮沸により反応を停止させた。得られたヘパラン硫酸オ
リゴ糖０．５ｍｇを［ 3Ｈ］ＮａＢＨ4 によりトリチウ
ム標識した。この放射標識したヘパラン硫酸オリゴ糖
を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム（１．２ｃｍ×
１２７ｃｍ）に添加後０．２Ｍ 酢酸アンモニウムで溶
出し、そのおおよその分子量（８００、１３００、１７
００、２１００、２６００、３０００）に従って分画し
た。分子量と溶出位置との関係は、既知の分子量スタン
ダードとなるオリゴ糖（ΔＤｉ−６Ｓ（不飽和ＧＡＧ二
糖キット（ＨＰＬＣ用）、生化学工業（株））、放射性
同位元素標識した、コンドロイチンの４、６および８糖
（いずれもコンドロイチンをヒアルロニダーゼで消化
し、ゲルろ過で分離精製後、［ 3Ｈ］ＮａＢＨ4 で還元
して得た））を同じ条件で溶出して、予め求めておいた
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８５，８０５−８１３（１
９９２））。また得られた分画のおおよその分子量と、
イズロン酸および２−Ｎ−硫酸化グルコサミンからなる
二糖単位構造の分子量とから、各オリゴ糖の大きさを仮
定した。各オリゴ糖の分画パターンを図２に、また分画
した各オリゴ糖の大きさ（前記により仮定された構成糖
の数）とそのおおよその分子量とを、表２に示す。
酸オリゴ糖サイズ ウシ肝臓由来の低硫酸化ヘパラン硫酸（ＣＬＨＳ）５０
０ｍｇを水５ｍｌに溶解し、コンドロイチナーゼＡＢＣ
２５ｍ ｕｎｉｔを使用して、混入しているコンドロ
イチン硫酸およびデルマタン硫酸を消化した。さらにこ
の画分に対してエタノール沈澱を行った。このウロン酸
を定量した結果、処理したＣＬＨＳの約５０％がコンド
ロイチナーゼＡＢＣ抵抗性画分に存在することが判っ
た。この画分をＤＥＡＥ−セファクリルカラムにかけた
後、０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．０２Ｍ トリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．２）から１．０Ｍ ＮａＣｌ，０．０２
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）の直線濃度勾配に
より溶出を行い、ＣＬＨＳＩ、ＣＬＨＳ ＩＩおよびＣ
ＬＨＳ ＩＩＩの画分に分画した。得られた低硫酸含量
画分であるＣＬＨＳ Ｉ画分に対してヘパチリナーゼＩ
を加え、３７℃１時間の酵素反応を行った後、３分間の
煮沸により反応を停止させた。得られたヘパラン硫酸オ
リゴ糖０．５ｍｇを［ 3Ｈ］ＮａＢＨ4 によりトリチウ
ム標識した。この放射標識したヘパラン硫酸オリゴ糖
を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム（１．２ｃｍ×
１２７ｃｍ）に添加後０．２Ｍ 酢酸アンモニウムで溶
出し、そのおおよその分子量（８００、１３００、１７
００、２１００、２６００、３０００）に従って分画し
た。分子量と溶出位置との関係は、既知の分子量スタン
ダードとなるオリゴ糖（ΔＤｉ−６Ｓ（不飽和ＧＡＧ二
糖キット（ＨＰＬＣ用）、生化学工業（株））、放射性
同位元素標識した、コンドロイチンの４、６および８糖
（いずれもコンドロイチンをヒアルロニダーゼで消化
し、ゲルろ過で分離精製後、［ 3Ｈ］ＮａＢＨ4 で還元
して得た））を同じ条件で溶出して、予め求めておいた
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８５，８０５−８１３（１
９９２））。また得られた分画のおおよその分子量と、
イズロン酸および２−Ｎ−硫酸化グルコサミンからなる
二糖単位構造の分子量とから、各オリゴ糖の大きさを仮
定した。各オリゴ糖の分画パターンを図２に、また分画
した各オリゴ糖の大きさ（前記により仮定された構成糖
の数）とそのおおよその分子量とを、表２に示す。
【００１９】
【表２】 表２ ───────────────────── ヘパラン硫酸オリゴ糖 おおよそ における構成糖の数 の分子量 ───────────────────── ４（ＣＬＨＳ ４） ８００ ６（ＣＬＨＳ ６） １３００ ８（ＣＬＨＳ ８） １７００ １０（ＣＬＨＳ１０） ２１００ １２（ＣＬＨＳ１２） ２６００ １４（ＣＬＨＳ１４） ３０００ ─────────────────────
【００２０】さらに、実施例１で調製したＨＧＦアフィ
ニテイーカラムに対して、放射性同位元素標識した各サ
イズのオリゴ糖４ｎｍｏｌを含む緩衝液（０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2 および０．２ｍｇ／
ｍｌ ＣＳＡを含む、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．２））を添加し、４℃下で１時間反応させ
た。この後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．９ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 、および０．２ｍｇ／ｍｌ ＣＳＡを含む１０ｍ
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄を行い、
さらにＨＧＦアフィテイーカラムに結合したヘパラン硫
酸オリゴ糖を、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出した。この溶出
されたヘパラン硫酸オリゴ糖の放射活性を測定すること
により、各ヘパラン硫酸オリゴ糖とＨＧＦアフィニテイ
ーカラムの結合率を算出した。図３に、ヘパラン硫酸オ
リゴ糖のＨＧＦアフィニテイーカラムへの結合率を示
す。図３が示すように、ＨＧＦとヘパラン硫酸オリゴ糖
の結合には、ヘパラン硫酸オリゴ糖のサイズが８糖以
上、より好ましくは１０糖以上必要なことが判った。
ニテイーカラムに対して、放射性同位元素標識した各サ
イズのオリゴ糖４ｎｍｏｌを含む緩衝液（０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2 および０．２ｍｇ／
ｍｌ ＣＳＡを含む、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．２））を添加し、４℃下で１時間反応させ
た。この後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．９ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 、および０．２ｍｇ／ｍｌ ＣＳＡを含む１０ｍ
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄を行い、
さらにＨＧＦアフィテイーカラムに結合したヘパラン硫
酸オリゴ糖を、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出した。この溶出
されたヘパラン硫酸オリゴ糖の放射活性を測定すること
により、各ヘパラン硫酸オリゴ糖とＨＧＦアフィニテイ
ーカラムの結合率を算出した。図３に、ヘパラン硫酸オ
リゴ糖のＨＧＦアフィニテイーカラムへの結合率を示
す。図３が示すように、ＨＧＦとヘパラン硫酸オリゴ糖
の結合には、ヘパラン硫酸オリゴ糖のサイズが８糖以
上、より好ましくは１０糖以上必要なことが判った。
【００２１】実施例３ ＨＧＦへ結合可能なヘパラン硫
酸オリゴ糖およびＨＧＦへ結合不可能なヘパラン硫酸オ
リゴ糖の構造 実施例２で調製した、ＣＬＨＳ Ｉ由来でヘパラン硫酸
オリゴ糖が１０糖のサイズのもの（ＣＬＨＳ１０）もし
くは１２糖のもの（ＣＬＨＳ１２）を、それぞれ実施例
１で示した方法でＨＧＦアフィニテイーカラムに添加し
て４℃下で１時間反応させた後、このカラムに結合した
画分および非結合画分を分離した。すなわち、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2 、および０．２
ｍｇ／ｍｌ ＣＳＡを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．２）で洗浄を行い（非結合画分）、さらに
２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．２）で溶出を行った（結合画分）。
酸オリゴ糖およびＨＧＦへ結合不可能なヘパラン硫酸オ
リゴ糖の構造 実施例２で調製した、ＣＬＨＳ Ｉ由来でヘパラン硫酸
オリゴ糖が１０糖のサイズのもの（ＣＬＨＳ１０）もし
くは１２糖のもの（ＣＬＨＳ１２）を、それぞれ実施例
１で示した方法でＨＧＦアフィニテイーカラムに添加し
て４℃下で１時間反応させた後、このカラムに結合した
画分および非結合画分を分離した。すなわち、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2 、および０．２
ｍｇ／ｍｌ ＣＳＡを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．２）で洗浄を行い（非結合画分）、さらに
２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．２）で溶出を行った（結合画分）。
【００２２】ＨＧＦアフィニテイーカラムに対するＣＬ
ＨＳ１０の吸着画分、非吸着画分をそれぞれＭｏｎｏＱ
カラム（ファルマシア社）に添加し、０Ｍ ＮａＣｌ，
０．０５Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）から
１．０Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．２）の直線濃度勾配により溶出操作を行っ
た。この後、さらに２Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出を行った。
ＨＳ１０の吸着画分、非吸着画分をそれぞれＭｏｎｏＱ
カラム（ファルマシア社）に添加し、０Ｍ ＮａＣｌ，
０．０５Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）から
１．０Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．２）の直線濃度勾配により溶出操作を行っ
た。この後、さらに２Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出を行った。
【００２３】その結果を図４に示す。図４（Ａ）にはＣ
ＬＨＳ１０のＨＧＦアフィニテイーカラム吸着画分を添
加した場合のクロマトグラフィーを示しており、図４
（Ａ）に示したＢ−ＩＩＩ画分を回収した。一方、図４
（Ｂ）にはＣＬＨＳ１０のＨＧＦアフィニテイーカラム
非吸着画分を添加した場合のクロマトグラフィーを示し
ており、図４（Ｂ）に示したＵＢ−Ｉ、ＵＢ−ＩＩおよ
びＵＢ−ＩＩＩ画分を回収した。
ＬＨＳ１０のＨＧＦアフィニテイーカラム吸着画分を添
加した場合のクロマトグラフィーを示しており、図４
（Ａ）に示したＢ−ＩＩＩ画分を回収した。一方、図４
（Ｂ）にはＣＬＨＳ１０のＨＧＦアフィニテイーカラム
非吸着画分を添加した場合のクロマトグラフィーを示し
ており、図４（Ｂ）に示したＵＢ−Ｉ、ＵＢ−ＩＩおよ
びＵＢ−ＩＩＩ画分を回収した。
【００２４】次に、得られたＢ−ＩＩＩ、ＵＢ−Ｉ、Ｕ
Ｂ−ＩＩおよびＵＢ−ＩＩＩ画分に対して、ヘパリチナ
ーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩで酵素消化して不飽和二糖に分解
し、各画分の不飽和二糖組成をポリアミンカラムで分析
した（新生化学実験講座３，糖質ＩＩ，ｐ４９−６２
（東京化学同人社））。不飽和二糖の表記について、図
５に示す。
Ｂ−ＩＩおよびＵＢ−ＩＩＩ画分に対して、ヘパリチナ
ーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩで酵素消化して不飽和二糖に分解
し、各画分の不飽和二糖組成をポリアミンカラムで分析
した（新生化学実験講座３，糖質ＩＩ，ｐ４９−６２
（東京化学同人社））。不飽和二糖の表記について、図
５に示す。
【００２５】図６に分析した不飽和二糖組成を％で示
す。Ｂ−ＩＩＩの硫酸化度（二糖単位構造に存在する硫
酸基の数）から、このオリゴ糖は８つの構成糖からなる
ことが判った。ここで、構成糖の数を求めた方法を以下
に示す。図６のＣＬＨＳ（１０）−Ｂ−ＩＩＩの硫酸化
度、すなわちＳＯ4 ／Δ二量体の値、２．４１は、Ｂ−
ＩＩＩを上記酵素消化して得られた不飽和二糖の硫酸化
度の平均値である。得られた硫酸化度の値が平均値であ
るので、実際には、確率論から、硫酸化度２の不飽和二
糖が６０％、硫酸化度３の不飽和二糖が４０％存在して
いる。上記酵素消化する前の、硫酸化度２の二糖単位構
造は、２−Ｏ−硫酸化イズロン酸と２−Ｎ−硫酸化グル
コサミンまたはイズロン酸と６−Ｏ，２−Ｎ−ジ硫酸化
グルコサミンであり、硫酸化度３の二糖単位構造は、２
−Ｏ−硫酸化イズロン酸と６−Ｏ，２−Ｎ−ジ硫酸化グ
ルコサミンであり、それぞれの分子量は、５２９と６２
５である。ゆえに、上記存在割合にそれぞれの分子量を
乗じた値、５６７が上記硫酸化度２．４１の二糖単位構
造の分子量となる。上記の表２より、ＣＬＨＳ１０のお
およその分子量は２１００なので、これを５６７で除し
て、ＣＬＨＳ１０には二糖単位構造が３．７単位存在す
ることがわかる。二糖単位構造が３．７単位存在するこ
とから、ＣＬＨＳ１０は７．４糖であることになるが、
実際には６−８糖であると考えられ、また先にＨＧＦと
ヘパラン硫酸オリゴ糖の結合には、該オリゴ糖のサイズ
が８糖以上必要であることがわかったので、ＣＬＨＳ１
０は８つの構成糖からなるとした。従って、図６の（）
内には該構成糖（２糖の繰り返し構造を１ユニットとし
た場合、４ユニット）に対する、硫酸化の位置および硫
酸化度の異なる各種不飽和二糖単位のユニット数を示し
た。
す。Ｂ−ＩＩＩの硫酸化度（二糖単位構造に存在する硫
酸基の数）から、このオリゴ糖は８つの構成糖からなる
ことが判った。ここで、構成糖の数を求めた方法を以下
に示す。図６のＣＬＨＳ（１０）−Ｂ−ＩＩＩの硫酸化
度、すなわちＳＯ4 ／Δ二量体の値、２．４１は、Ｂ−
ＩＩＩを上記酵素消化して得られた不飽和二糖の硫酸化
度の平均値である。得られた硫酸化度の値が平均値であ
るので、実際には、確率論から、硫酸化度２の不飽和二
糖が６０％、硫酸化度３の不飽和二糖が４０％存在して
いる。上記酵素消化する前の、硫酸化度２の二糖単位構
造は、２−Ｏ−硫酸化イズロン酸と２−Ｎ−硫酸化グル
コサミンまたはイズロン酸と６−Ｏ，２−Ｎ−ジ硫酸化
グルコサミンであり、硫酸化度３の二糖単位構造は、２
−Ｏ−硫酸化イズロン酸と６−Ｏ，２−Ｎ−ジ硫酸化グ
ルコサミンであり、それぞれの分子量は、５２９と６２
５である。ゆえに、上記存在割合にそれぞれの分子量を
乗じた値、５６７が上記硫酸化度２．４１の二糖単位構
造の分子量となる。上記の表２より、ＣＬＨＳ１０のお
およその分子量は２１００なので、これを５６７で除し
て、ＣＬＨＳ１０には二糖単位構造が３．７単位存在す
ることがわかる。二糖単位構造が３．７単位存在するこ
とから、ＣＬＨＳ１０は７．４糖であることになるが、
実際には６−８糖であると考えられ、また先にＨＧＦと
ヘパラン硫酸オリゴ糖の結合には、該オリゴ糖のサイズ
が８糖以上必要であることがわかったので、ＣＬＨＳ１
０は８つの構成糖からなるとした。従って、図６の（）
内には該構成糖（２糖の繰り返し構造を１ユニットとし
た場合、４ユニット）に対する、硫酸化の位置および硫
酸化度の異なる各種不飽和二糖単位のユニット数を示し
た。
【００２６】ＨＧＦに吸着可能なＢ−ＩＩＩ画分と、Ｈ
ＧＦに対して非吸着画分であるＵＢ−Ｉ、ＵＢ−ＩＩお
よびＵＢ−ＩＩＩ画分の不飽和二糖組成を比較すると、
ＨＧＦ吸着画分であるＢ−ＩＩＩの不飽和二糖組成にお
いて、ΔＤｉ−ｔｒｉＳ、ΔＤｉ−ｄｉ（Ｎ，６）Ｓの
割合が高いことが判った。特に、ＨＧＦに対して結合可
能なＢ−ＩＩＩ画分では、オリゴ糖４ユニットの内ほぼ
２ユニットがΔＤｉ−ｔｒｉＳで占められることが判っ
た。これらの結果から、２ユニットのＩｄｏＡ（２Ｓ）
−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）がＨＧＦの結合に重要であること
が判った（ΔＤｉ−ｔｒｉＳは、ＩｄｏＡ（２Ｓ）−Ｇ
ｌｃＮＳ（６Ｓ）を酵素消化して得られる不飽和二糖で
ある）。
ＧＦに対して非吸着画分であるＵＢ−Ｉ、ＵＢ−ＩＩお
よびＵＢ−ＩＩＩ画分の不飽和二糖組成を比較すると、
ＨＧＦ吸着画分であるＢ−ＩＩＩの不飽和二糖組成にお
いて、ΔＤｉ−ｔｒｉＳ、ΔＤｉ−ｄｉ（Ｎ，６）Ｓの
割合が高いことが判った。特に、ＨＧＦに対して結合可
能なＢ−ＩＩＩ画分では、オリゴ糖４ユニットの内ほぼ
２ユニットがΔＤｉ−ｔｒｉＳで占められることが判っ
た。これらの結果から、２ユニットのＩｄｏＡ（２Ｓ）
−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）がＨＧＦの結合に重要であること
が判った（ΔＤｉ−ｔｒｉＳは、ＩｄｏＡ（２Ｓ）−Ｇ
ｌｃＮＳ（６Ｓ）を酵素消化して得られる不飽和二糖で
ある）。
【００２７】同様に、ＣＬＨＳ Ｉ由来で１２糖の構成
糖よりなるヘパラン硫酸オリゴ糖（ＣＬＨＳ１２）をＨ
ＧＦアフィニテイーカラムに添加し、その結合画分およ
び非結合画分を回収した。さらに、ＣＬＨＳ１２のＨＧ
Ｆアフィニテイーカラムに対する吸着画分、非吸着画分
をそれぞれＭｏｎｏＱカラム（ファルマシア社）に添加
し、０Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．２）から１．０Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）の直線濃度勾配によ
り溶出を行い、さらに２．０Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出を行った。
糖よりなるヘパラン硫酸オリゴ糖（ＣＬＨＳ１２）をＨ
ＧＦアフィニテイーカラムに添加し、その結合画分およ
び非結合画分を回収した。さらに、ＣＬＨＳ１２のＨＧ
Ｆアフィニテイーカラムに対する吸着画分、非吸着画分
をそれぞれＭｏｎｏＱカラム（ファルマシア社）に添加
し、０Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．２）から１．０Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）の直線濃度勾配によ
り溶出を行い、さらに２．０Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出を行った。
【００２８】結果を図７に示す。図７（Ａ）にはＣＬＨ
Ｓ１２のＨＧＦアフィニテイーカラム吸着画分を添加し
た場合のクロマトグラフィーを示しており、図７（Ａ）
に示すＢ−Ｉ画分を回収した。一方、図７（Ｂ）にはＣ
ＬＨＳ１２のＨＧＦアフィニテイーカラム非吸着画分を
添加した場合のクロマトグラフィーを示しており、図７
（Ｂ）に示すＵＢ−ＩおよびＵＢ−ＩＩ画分を回収し
た。
Ｓ１２のＨＧＦアフィニテイーカラム吸着画分を添加し
た場合のクロマトグラフィーを示しており、図７（Ａ）
に示すＢ−Ｉ画分を回収した。一方、図７（Ｂ）にはＣ
ＬＨＳ１２のＨＧＦアフィニテイーカラム非吸着画分を
添加した場合のクロマトグラフィーを示しており、図７
（Ｂ）に示すＵＢ−ＩおよびＵＢ−ＩＩ画分を回収し
た。
【００２９】次に、得られたＢ−Ｉ、ＵＢ−ＩおよびＵ
Ｂ−ＩＩ画分に対して、ヘパリチナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩ
Ｉで酵素消化して不飽和二糖に分解し、各画分の不飽和
二糖組成をポリアミンカラムで分析した。図８に分析し
た不飽和二糖組成を％で示す。Ｂ−Ｉの硫酸化度から、
このオリゴ糖は８〜１０の構成糖からなることが判っ
た。図８の（）内には、該構成糖（２糖の繰り返し構造
を１ユニットとした場合、４ユニット）に対する、硫酸
化の位置および硫酸化度の異なる各種不飽和二糖単位の
ユニット数を示した。
Ｂ−ＩＩ画分に対して、ヘパリチナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩ
Ｉで酵素消化して不飽和二糖に分解し、各画分の不飽和
二糖組成をポリアミンカラムで分析した。図８に分析し
た不飽和二糖組成を％で示す。Ｂ−Ｉの硫酸化度から、
このオリゴ糖は８〜１０の構成糖からなることが判っ
た。図８の（）内には、該構成糖（２糖の繰り返し構造
を１ユニットとした場合、４ユニット）に対する、硫酸
化の位置および硫酸化度の異なる各種不飽和二糖単位の
ユニット数を示した。
【００３０】その結果、ＨＧＦ吸着画分であるＢ−Ｉの
不飽和二糖組成において、オリゴ糖４ユニットの内ほぼ
２ユニットがΔＤｉ−ｔｒｉＳで占められることが判っ
た。これらの結果から、２ユニットのＩｄｏＡ（２Ｓ）
−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）がＨＧＦの結合に重要であること
が確認された（ΔＤｉ−ｔｒｉＳは、ＩｄｏＡ（２Ｓ）
−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）を酵素消化して得られる不飽和二
糖である）。
不飽和二糖組成において、オリゴ糖４ユニットの内ほぼ
２ユニットがΔＤｉ−ｔｒｉＳで占められることが判っ
た。これらの結果から、２ユニットのＩｄｏＡ（２Ｓ）
−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）がＨＧＦの結合に重要であること
が確認された（ΔＤｉ−ｔｒｉＳは、ＩｄｏＡ（２Ｓ）
−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）を酵素消化して得られる不飽和二
糖である）。
【００３１】実施例４ ラットプロテオグリカンに結合
したＨＧＦのヘパラン硫酸オリゴ糖による遊離活性 ラット肝臓から調製したヘパラン硫酸プロテオグリカン
でコートしたウェルへ、ジゴキシゲニン−ＨＧＦ ２０
ｎｇ／ウェルを０．２ｍｇ／ｍｌ ＣＳＡおよび０．９
ｍＭ ＣａＣｌ2 を含むブロッキングバッファーで結合
させた後、１ｎｇ〜１０μｇ／ｍｌのヘパラン硫酸オリ
ゴ糖を含むＰＢＳに交換し、プレートにう結合したＨＧ
Ｆを遊離させた。遊離活性は、プレートにコートしたヘ
パラン硫酸プロテオグリカンに結合したＨＧＦを５０％
遊離させた濃度として求めた。結果を表３に示す。
したＨＧＦのヘパラン硫酸オリゴ糖による遊離活性 ラット肝臓から調製したヘパラン硫酸プロテオグリカン
でコートしたウェルへ、ジゴキシゲニン−ＨＧＦ ２０
ｎｇ／ウェルを０．２ｍｇ／ｍｌ ＣＳＡおよび０．９
ｍＭ ＣａＣｌ2 を含むブロッキングバッファーで結合
させた後、１ｎｇ〜１０μｇ／ｍｌのヘパラン硫酸オリ
ゴ糖を含むＰＢＳに交換し、プレートにう結合したＨＧ
Ｆを遊離させた。遊離活性は、プレートにコートしたヘ
パラン硫酸プロテオグリカンに結合したＨＧＦを５０％
遊離させた濃度として求めた。結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】 表３ ────────────────────────── ヘパラン硫酸オリゴ糖 遊離活性（ｎｇ／ｍｌ） ────────────────────────── ＣＬＨＳ ８ ３３６０ ＣＬＨＳ１０ ３５０ ＣＬＨＳ１２ １００ ＣＬＨＳ１２−Ｂ ３．５ ＣＬＨＳ１２−ＵＢ ４２３０ ─────────────────────── ヘパリン １．０ ──────────────────────────
【００３３】上記の結果から明らかなように、ヘパラン
硫酸オリゴ糖はサイズ依存的に遊離活性が高くなった。
また非結合性のヘパラン硫酸１２糖画分（ＣＬＨＳ１２
−ＵＢ）の遊離活性は４２３０ｎｇ／ｍｌであるのに対
し、結合性ヘパラン硫酸１２糖画分（ＣＬＨＳ１２−
Ｂ）の遊離活性は３．５ｎｇ／ｍｌと、活性に１０００
倍以上の開きが認められた。またＣＬＨＳ１２−Ｂの活
性は、ヘパリンと比較しても約１／３程度であり、強い
活性を有していることがわかる。
硫酸オリゴ糖はサイズ依存的に遊離活性が高くなった。
また非結合性のヘパラン硫酸１２糖画分（ＣＬＨＳ１２
−ＵＢ）の遊離活性は４２３０ｎｇ／ｍｌであるのに対
し、結合性ヘパラン硫酸１２糖画分（ＣＬＨＳ１２−
Ｂ）の遊離活性は３．５ｎｇ／ｍｌと、活性に１０００
倍以上の開きが認められた。またＣＬＨＳ１２−Ｂの活
性は、ヘパリンと比較しても約１／３程度であり、強い
活性を有していることがわかる。
【００３４】従って、ＨＧＦ結合性ヘパラン硫酸は細胞
表層に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンへのＨＧ
Ｆの結合を強く阻害し、その分解を抑制することが期待
され、その結果としてＨＧＦの薬理作用の向上を引き起
こすことが期待される。
表層に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンへのＨＧ
Ｆの結合を強く阻害し、その分解を抑制することが期待
され、その結果としてＨＧＦの薬理作用の向上を引き起
こすことが期待される。
【図１】ヘパリンオリゴ糖とＨＧＦアフィニテイーカラ
ムとの結合率を表す図面である。
ムとの結合率を表す図面である。
【図２】ヘパラン硫酸オリゴ糖をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
−５０カラムに添加し、そのオリゴ糖サイズで分画した
結果を表す図面である。
−５０カラムに添加し、そのオリゴ糖サイズで分画した
結果を表す図面である。
【図３】ＣＬＨＳ Ｉ由来のヘパラン硫酸オリゴ糖とＨ
ＧＦアフィニテイーカラムとの結合率を表す図面であ
る。
ＧＦアフィニテイーカラムとの結合率を表す図面であ
る。
【図４】ＣＬＨＳ１０のＨＧＦアフィニテイーカラム吸
着・非吸着画分をＭｏｎｏＱカラムへ添加した場合のク
ロマトグラフィーを表す図面である。図中、（Ａ）はＨ
ＧＦアフィニテイーカラム吸着画分を、（Ｂ）はＨＧＦ
アフィニテイーカラム非吸着画分をそれぞれ表す。
着・非吸着画分をＭｏｎｏＱカラムへ添加した場合のク
ロマトグラフィーを表す図面である。図中、（Ａ）はＨ
ＧＦアフィニテイーカラム吸着画分を、（Ｂ）はＨＧＦ
アフィニテイーカラム非吸着画分をそれぞれ表す。
【図５】硫酸化多糖類を酵素消化することによって生成
する各種不飽和二糖の構造とその略称との関係を示した
ものである。
する各種不飽和二糖の構造とその略称との関係を示した
ものである。
【図６】ＣＬＨＳ１０と、そのＨＧＦアフィニティーカ
ラムによる分画物であるＢ−ＩＩＩ、ＵＢ−Ｉ、ＵＢ−
ＩＩおよびＵＢ−ＩＩＩ画分の不飽和二糖組成を示した
表である。
ラムによる分画物であるＢ−ＩＩＩ、ＵＢ−Ｉ、ＵＢ−
ＩＩおよびＵＢ−ＩＩＩ画分の不飽和二糖組成を示した
表である。
【図７】ＣＬＨＳ１２のＨＧＦアフィニテイーカラム吸
着・非吸着画分をＭｏｎｏＱカラムへ添加した場合のク
ロマトグラフィーを表す図面である。図中、（Ａ）はＨ
ＧＦアフィニテイーカラム吸着画分を、（Ｂ）はＨＧＦ
アフィニテイーカラム非吸着画分をそれぞれ表す。
着・非吸着画分をＭｏｎｏＱカラムへ添加した場合のク
ロマトグラフィーを表す図面である。図中、（Ａ）はＨ
ＧＦアフィニテイーカラム吸着画分を、（Ｂ）はＨＧＦ
アフィニテイーカラム非吸着画分をそれぞれ表す。
【図８】ＣＬＨＳ１２、Ｂ−Ｉ、ＵＢ−ＩおよびＵＢ−
ＩＩ画分の不飽和二糖組成を示した表である。
ＩＩ画分の不飽和二糖組成を示した表である。
Claims (7)
- 【請求項１】 肝実質細胞増殖因子に親和性を有する少
なくとも８糖以上の構造単位部分を含有する硫酸化多糖
類。 - 【請求項２】 構造単位部分が、ヘキスロン酸およびヘ
キソサミンまたはそのＮ−アセチル置換体とからなり、
硫酸基を含む二糖単位構造を４単位以上含有するもので
あることを特徴とする請求項１記載の硫酸化多糖類。 - 【請求項３】 ヘキスロン酸がＬ−イズロン酸またはＤ
−グルクロン酸であり、ヘキソサミンがＤ−グルコサミ
ンまたはＤ−ガラクトサミンあるいはそのＮ−アセチル
置換体であることを特徴とする請求項２記載の硫酸化多
糖類。 - 【請求項４】 ヘパリンまたはヘパラン硫酸の部分分解
物または限定分解物であることを特徴とする請求項１〜
３に記載の硫酸化多糖類。 - 【請求項５】 ヘキスロン酸とヘキソサミンとの二糖単
位構造の４単位からなり、該二糖単位構造のうち、２−
Ｏ−硫酸化ヘキスロン酸と６−Ｏ，２−Ｎ−ジ硫酸化ヘ
キソサミンとの二糖単位構造が前記４単位中、約１．５
〜２．５単位であり、肝実質細胞増殖因子に親和性を有
する構造単位部分を含有する硫酸化多糖類。 - 【請求項６】 ヘパリンもしくはヘパラン硫酸、または
これらの部分分解物もしくは限定分解物の混合物を、リ
ガンドとして肝実質細胞増殖因子を結合したアフィニテ
ィー担体と接触させ、肝実質細胞増殖因子に親和性を有
する画分と該因子に親和性を有さない画分に分別するこ
とを特徴とする硫酸化多糖類の製造法。 - 【請求項７】 アフィニティー担体との接触をコンドロ
イチン硫酸共存下で行い、分画後、必要に応じて肝実質
細胞増殖因子に親和性を有する画分からコンドロイチン
硫酸を分離除去することを特徴とする請求項６記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17120894A JPH0834801A (ja) | 1994-07-22 | 1994-07-22 | 硫酸化多糖類及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17120894A JPH0834801A (ja) | 1994-07-22 | 1994-07-22 | 硫酸化多糖類及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0834801A true JPH0834801A (ja) | 1996-02-06 |
Family
ID=15919042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17120894A Pending JPH0834801A (ja) | 1994-07-22 | 1994-07-22 | 硫酸化多糖類及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0834801A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002003384A (ja) * | 2000-06-22 | 2002-01-09 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 成長因子誘導剤 |
| JP2002327002A (ja) * | 2000-08-07 | 2002-11-15 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 硫酸基を有するオリゴ糖 |
| WO2005092348A1 (ja) * | 2004-03-29 | 2005-10-06 | Kringle Pharma Inc. | ヘパリン様オリゴ糖含有ｈｇｆ産生促進薬剤 |
-
1994
- 1994-07-22 JP JP17120894A patent/JPH0834801A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002003384A (ja) * | 2000-06-22 | 2002-01-09 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 成長因子誘導剤 |
| JP2002327002A (ja) * | 2000-08-07 | 2002-11-15 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 硫酸基を有するオリゴ糖 |
| WO2005092348A1 (ja) * | 2004-03-29 | 2005-10-06 | Kringle Pharma Inc. | ヘパリン様オリゴ糖含有ｈｇｆ産生促進薬剤 |
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040907 |
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| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041105 |
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Effective date: 20070410 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
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| A521 | Written amendment |
Effective date: 20070608 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070724 |