JPH0838182A - オプソニン活性を有する新規な蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 オプソニン活性を有する新規なヒト血漿由来
蛋白質、それをコードするＤＮＡ、ヒト血漿をマンナン
に接触させ、Ｎ−アセチルグルコサミン溶液で溶出する
ことを特徴とする当該蛋白質の製造方法、および当該蛋
白質を含有する感染症予防治療剤。 【効果】 本発明の蛋白質は、貪食細胞による病原微生
物の貪食を活性化する作用を有するので、感染症の予防
治療剤として有用である。アミノ酸配列および塩基配列
の解明により、遺伝子工学的手法による本発明蛋白質の
製造が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はオプソニン活性を有する
新規なヒト血漿由来蛋白質、それをコードするＤＮＡ、
当該蛋白質の製造方法、および当該蛋白質を含有する感
染症予防治療剤に関する。

【０００２】

【従来技術】細菌などの病原微生物に付着して、好中
球、単球、マクロファージなどの貪食細胞による貪食作
用を受けやすくする物質をオプソニンと呼び、このよう
な貪食作用を増強する活性をオプソニン活性という。免
疫グロブリンや補体成分であるＣ３ｂはオプソニン活性
を有する。これは貪食細胞の表面にＦｃレセプターやＣ
３ｂレセプターがあるためである。血清蛋白の一つであ
るＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）も肺炎球菌に対してオプソニ
ン活性を有している。

【０００３】オプソニン活性は感染防御機構として特に
重要である。例えば、肺炎球菌の多糖体抗原、サルモネ
ラのＯ抗原、Ｖｉ抗原、レンサ球菌のＭ蛋白に対する特
異抗体は、オプソニン活性が強く、好中球、マクロファ
ージによる貪食を高め、病原体の感染抑制に働くことか
ら感染防御抗体と呼ばれている。菌体表層に貪食作用に
抵抗する莢膜がある場合でも、これらの特異抗体が菌体
に結合することによって貪食細胞による貪食が著しく容
易になる。細菌などの病原微生物による感染症に対して
はオプソニン活性が最も重要な生体防御反応である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、感染
症の予防または治療に有用な、オプソニン活性を有する
新規蛋白質、ならびにその製造方法を提供することにあ
る。また本発明の目的は、この新規蛋白質を遺伝子工学
手法により製造するために、当該蛋白質のアミノ酸配列
を明らかにし、当該蛋白質をコードするＤＮＡを提供す
ることにある。さらに本発明の目的は、新規な感染症予
防治療剤を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】糖鎖に結合する動物レク
チンの中でマンノースとＮ−アセチルグルコサミンを認
識するＣ型レクチンであるマンノース結合蛋白質（ＭＢ
Ｐ）とコングルチニンは、生体防御機構において重要な
働きをしている。これらのレクチンはコラーゲン様構造
を有し、コレクチンと呼ばれるファミリーを形成してい
る。

【０００６】本発明者らは、ＭＢＰの精製過程で、ヒト
血漿中からマンナンに結合し、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンで溶出される新規な蛋白質を見出し、この蛋白質が、
貪食細胞の貪食能を活性化するオプソニン活性を有する
ことを見出した。さらに本発明者らは、当該蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡのクローニングを行い、そのｃＤＮＡ
の塩基配列から当該新規蛋白質のアミノ酸配列を明らか
にした。

【０００７】本発明は、実質的に式（Ｉ）に示されるア
ミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。

【０００８】

【化６】

【０００９】当該蛋白質は、少なくとも式（Ｉ）に示さ
れるアミノ酸配列を含んでいればよい。式（Ｉ）はコラ
ーゲン様ドメインを示す。このコラーゲン様ドメイン
は、Gly −Ｘ−Ｙ（Gly はグリシンを表し、ＸとＹはグ
リシン以外のアミノ酸を表す）で表される繰り返しパタ
ーンを含む。好ましくは当該蛋白質は、式（Ｖ）に示さ
れるコラーゲン様ドメインを含む。

【００１０】

【化７】

【００１１】上記式（Ｖ）のアミノ酸配列は、Gly −Ｘ
−Ｙ（Gly,ＸおよびＹは前記の通り）で表される繰り返
しパターンの間に１つ以上のアミノ酸からなるアミノ酸
配列が挿入されていてもよい。具体的には当該蛋白質
は、式（VI）に示されるコラーゲン様ドメインを含む。

【００１２】

【化８】

【００１３】上記式（VI）のアミノ酸配列には、６アミ
ノ酸（式（VI) 中の下線部分）をはさんで２回と１５回
のGly −Ｘ−Ｙの繰り返しパターンが存在する。

【００１４】本発明は、実質的に式（II）に示されるア
ミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。

【００１５】

【化９】

【００１６】当該蛋白質は、少なくとも式（II）に示さ
れるアミノ酸配列を含んでいればよい。式（II）はフィ
ブリノーゲン様ドメインを示す。このフィブリノーゲン
様ドメイン中には、Ｃａ結合に関与するＥＦｈａｎｄに
類似した配列（式（II）中の破線部分）が含まれてい
る。これは本発明蛋白質がＣａイオンと結合する可能性
を示唆する。

【００１７】本発明は、実質的に上記式（Ｉ）に示され
るアミノ酸配列および実質的に上記式（II）に示される
アミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。（Ｉ）と
（II）の配列の順序は限定されないが、好ましくはＮ末
端側に（Ｉ）の配列を、Ｃ末端側に（II）の配列を含む
蛋白質である。当該蛋白質は（Ｉ）の配列と（II）の配
列の間に１つ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含
んでいてもよい。

【００１８】本発明は、実質的に式（III)に示されるア
ミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。

【００１９】

【化１０】

【００２０】ここで「実質的に」とは、本発明の蛋白質
は式（Ｉ）、（II）又は(III) の各式に示されるアミノ
酸配列を有する蛋白質に限定されず、当該アミノ酸配列
を有する蛋白質と同様な生物学的性質（オプソニン活
性）を有する限り、当該アミノ酸配列中のアミノ酸の幾
つかについて欠失、置換、もしくは付加があってもよい
ことを意味する。

【００２１】本発明の蛋白質は、上記アミノ酸配列を有
してなるポリペプチドにさらに糖が結合したものであっ
てもよい。上記式中で用いた略号は次の意味を有する。 Ａ Ala アラニン Ｒ Arg アルギニン Ｎ Asn アスパラギン Ｄ Asp アスパラギン酸 Ｃ Cys システイン Ｑ Gln グルタミン Ｅ Glu グルタミン酸 Ｇ Gly グリシン Ｈ His ヒスチジン Ｉ Ile イソロイシン Ｌ Leu ロイシン Ｍ Met メチオニン Ｋ Lys リジン Ｆ Phe フェニルアラニン Ｐ Pro プロリン Ｓ Ser セリン Ｔ Thr スレオニン Ｗ Trp トリプトファン Ｙ Tyr チロシン Ｖ Val バリン

【００２２】本発明の蛋白質の好適な例として、次の性
質を有するヒト血漿由来の蛋白質Ｐ３５が挙げられる。 ヒト血漿をマンナンに接触させ、Ｎ−アセチルグルコ
サミン溶液で溶出することにより得ることができる。 還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により測定した分子量が約３５ｋＤａである。 Ｎ末端に式（IV）に示されるアミノ酸配列を有する。

【００２３】

【化１１】

【００２４】等電点：６．３ 蛋白質Ｐ３５は、Ｎ−アセチルグルコサミンと特異的に
結合する。Ｐ３５は、Ｎ−アセチルグルコサミンを介し
て糖と結合すると考えられる。即ち、Ｎ−グリコシド型
糖鎖の高マンノース型には結合せず、複合型、混合型に
は結合する。

【００２５】本発明の新規蛋白質は、ヒト血漿から精製
することにより、あるいは組換えＤＮＡ技術、ポリペプ
チド合成法などの常法によって調製することができる。

【００２６】本発明の蛋白質をヒト血漿から調製する場
合は、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、ゲル
濾過、アフィニティクロマトグラフィー、吸着剤処理、
塩析、等電点沈澱法、ポリエチレングリコール分画法な
どの公知の血漿蛋白質の精製法を適宜組合せることに得
ることができる。好ましくは、ヒト血漿をマンナンに接
触させ、Ｎ−アセチルグルコサミン溶液で溶出すること
により調製することができる。

【００２７】以下に本発明の蛋白質の好適な調製方法を
示す。マンナンに接触させるヒト血漿画分は、ヒト血清
をポリエチレングリコール分画処理した沈澱画分が好ま
しい。詳細には、常法に従ってヒト血漿からフィブリン
を除去して調製したヒト血清に、分子量4000のポリエチ
レングリコールを終濃度７％になるように添加し、沈澱
画分を回収する。このポリエチレングリコール分画処理
は２〜８℃好ましくは４℃付近で行う。

【００２８】得られた沈澱画分を緩衝液に溶解してマン
ナンに接触させる。緩衝液は塩濃度０．１〜２Ｍ、ｐＨ
６〜８が好ましく、具体的には１〜１．５Ｍ塩化ナトリ
ウム含有２０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸またはリン
酸緩衝液（ｐＨ７〜８）が例示される。マンナンは、不
溶性担体にマンナンを結合したものが好適に使用され、
例えばマンナン−セファロース、マンナンアフィゲルな
どのカラムが用いられる。次いで、マンノース溶液でマ
ンノース結合蛋白質を溶出させた後、Ｎ−アセチルグル
コサミン溶液で溶出することにより、本発明蛋白質を含
有する画分が得られる。マンノース溶液は、好ましくは
０．１〜０．５Ｍ、より好ましくは０．３Ｍのマンノー
スを含有する緩衝液であり、緩衝液としては前記のもの
が好適に使用される。Ｎ−アセチルグルコサミン溶液
は、好ましくは０．１〜０．５Ｍ、より好ましくは０．
３ＭのＮ−アセチルグルコサミンを含有する緩衝液であ
り、緩衝液としては前記のものが好適に使用される。本
発明蛋白質を含有する溶出画分は、好ましくは抗Ｉｇ
Ｍ、抗ＩｇＧを不溶性担体に結合させたカラムを通して
不純物成分のＩｇＭ、ＩｇＧを除去する。

【００２９】組換えＤＮＡ技術により本発明の蛋白質を
調製する場合には、常法に従って、本発明蛋白質をコー
ドするＤＮＡ（後述）を含む発現ベクターで形質転換さ
れた宿主細胞を培地中で培養し、該培養物から本発明蛋
白質を採取することによって調製することができる。

【００３０】宿主細胞としては、微生物〔細菌（例え
ば、大腸菌、枯草菌）、酵母（例えば、サッカロミセス
属）〕、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズ
ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、昆虫細胞（例えば、
Ｓ．ｆ．細胞）などが使用できる。

【００３１】ベクターとしては、pBR322, pBR325, pUC1
2, pUC13などの大腸菌由来のプラスミド、pUB110, pTP
5, pC194 などの枯草菌由来のプラスミド、pSH19, pSH1
5などの酵母由来のプラスミド、λファージなどのバク
テリオファージ、バキュロウイルス（核多角体ウイル
ス）などの昆虫ウイルスなど、公知の入手可能なベクタ
ーを使用することができる。

【００３２】本発明はまた、式（Ｉ）に示されるアミノ
酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基
配列を含むＤＮＡに関する。当該ＤＮＡは、上記塩基配
列を含んでいればいかなるＤＮＡであってもよいが、少
なくとも式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡである。式（Ｉ）に示されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列としては、式（Ｉ）に
示されるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列であれば
特に限定されないが、具体的には図２、３に示される塩
基配列中５’末端から数えて塩基番号１６１〜２９５で
示される塩基配列が例示される。

【００３３】本発明は、式（II）に示されるアミノ酸配
列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含むＤＮＡに関する。当該ＤＮＡは、上記塩基配列を
含んでいればいかなるＤＮＡであってもよいが、少なく
とも式（II）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基
配列を有するＤＮＡである。式（II）に示されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列としては、式（II）に示さ
れるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列であれば特に
限定されないが、具体的には図２、３に示される塩基配
列中５’末端から数えて塩基番号２９６〜９４９で示さ
れる塩基配列が例示される。

【００３４】更にまた本発明は、式（Ｉ）に示されるア
ミノ酸配列および式（II）に示されるアミノ酸配列を有
する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む
ＤＮＡに関する。当該ＤＮＡは、上記塩基配列を含んで
いればいかなるＤＮＡであってもよいが、少なくとも式
（Ｉ）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列お
よび式（II）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基
配列を有するＤＮＡである。式（Ｉ）に示されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列または式（II）に示される
アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、上述した
塩基配列が例示される。

【００３５】また、本発明は、式（III)に示されるアミ
ノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を含むＤＮＡに関する。当該ＤＮＡは、上記塩基
配列を含んでいればいかなるＤＮＡであってもよいが、
少なくとも式(III) に示されるアミノ酸配列をコードす
る塩基配列を有するＤＮＡである。式(III) に示される
アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、式(III)
に示されるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列であれ
ば特に限定されないが、具体的には図２、３に示される
塩基配列中５’末端から数えて塩基番号８６〜９４９で
示される塩基配列が例示される。また、当該ＤＮＡは、
その５’末端に、シグナルペプチドをコードする塩基配
列を含有していてもよい。シグナルペプチドの由来は特
に限定されず、マンノース結合蛋白等が例示されるが、
好ましくはヒト血漿のオプソニン活性を有する蛋白質に
由来するものである。具体的には、図２中の下線で示さ
れるアミノ酸配列（アミノ酸番号１〜２５で示される配
列）をコードするＤＮＡであり、より具体的には図２、
３に示される塩基配列中５’末端から数えて塩基番号１
１〜８５で示される塩基配列が例示される。

【００３６】一般に、遺伝子組換えの技術分野では、遺
伝暗号の縮重に従い、遺伝子から産生される蛋白質のア
ミノ酸配列を変えることなくその遺伝子のＤＮＡ配列の
少なくとも一つの塩基を他の塩基に置換することができ
る。従って、本発明のＤＮＡは図２、３に示される塩基
配列に特定されず、当該図２、３で示される塩基配列を
遺伝暗号に基づく置換によって変化させた塩基配列を有
するものをも包含する。

【００３７】また、本発明のＤＮＡは、いかなる方法で
得られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調製
される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調製
されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させて得ら
れるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組み合わせて構
築されるＤＮＡをも全て包含するものである。

【００３８】従って、本発明のＤＮＡは、常法に従って
本発明の蛋白質のｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化す
る方法、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理す
る方法、化学合成する方法等により取得することができ
る。

【００３９】(1) 例えば、本発明蛋白質のｍＲＮＡから
のｃＤＮＡクローニングは、常法（Sambrook, Fritsch
& Maniatis, Molecular Cloning, 2nd Ed. Cold Spring
Harbor Lab. Press, 1989) に従って行うことができ
る。具体的には、以下の方法が例示される。まず、ヒト
肝臓などヒト由来オプソニン活性を有する蛋白質を培養
し、その培養液から該蛋白質をコードするｍＲＮＡを調
製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシア
ネート法〔Chirgwin, J. M. et al., Biochem., 18, 52
94 (1979) 〕、熱フェノール法もしくはＡＧＰＣ法等の
公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）
セルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニテ
ィクロマトグラフィーにかけることによって行うことが
できる。次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば
逆転写酵素を用いる等の公知の方法〔例えばOkayama,H.
らの方法｛Okayama, H. et al., Mol. Cell. Biol., 2,
161 (1982) 及び同誌 3, 280 (1983)｝やGubler,U. と
Hoffman,B.J.の方法｛Gubler, H. and Hoffman, B.J.,
Gene, 25, 263 (1983)｝が例示される。〕でｃＤＮＡ鎖
を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。
このｃＤＮＡをプラスミドベクターもしくはファージベ
クターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはイ
ンビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トラン
スフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作
製する。ここで用いられるプラスミドベクターとして
は、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限され
ず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で
増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるクロ
ーニング用ベクターとしてｐＵＣ１１９，λｇｔ１０，
λｇｔ１１，λＺＡＰ等が例示される。ただし、後述の
免疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内で本発
明蛋白質の遺伝子を発現させうるプロモーターを有した
ベクターであることが好ましい。

【００４０】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えば Maniatis, T. ら, モレキュラークローニ
ング，ア・ラボラトリー・マニュアル (Molecular Clon
ing,A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Labor
atory, p.239 (1982)に記載の方法などが挙げられる。
また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、Hyunh,T. V. らの方法〔Hyunh,T.V., DNA Clonin
g, a practical approach,1,49(1985)｝などが挙げられ
る。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、
宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得
られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細
胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１，ＤＨ５またはＭ
Ｃ１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主に導入する。

【００４１】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、Maniatis, T.らのモレキュラークローニング，ア・
ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A Labo
ratoryManual), Cold Spring Harbor Laboratory, p.23
9 (1982) に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシ
ウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等
が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入す
る方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッケージ
ングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示さ
れる。インビトロパッケージングは、市販のインビトロ
パッケージングキット（例えば、ストラタジーン社製，
アマシャム社製等）を用いることによって簡便に行うこ
とができる。

【００４２】上記の方法によって作製されたｃＤＮＡラ
イブラリーから、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法
を組み合わせることによって行うことができる。例え
ば、別個に本発明蛋白質のアミノ酸配列に対応すると考
えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、これ
を³²Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハ
イブリダイゼーション法〔Crunstein, M. and Hogness,
D.S.: Proc. Natl. Acid. Sci. USA 72, 3961 (1975)
〕またはプラークハイブリダイゼーション法〔Molecul
ar Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r Laboratory, p.239 (1982) 〕により、目的のｃＤＮ
Ａを含有するクローンをスクリーニングする方法、ＰＣ
Ｒプライマーを作製し、本発明の蛋白質の特定領域をＰ
ＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮＡ断片を
有するクローンを選択する方法等が挙げられる。また、
ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例えば、λｇｔ１１フ
ァージベクター）を用いて作製したｃＤＮＡライブラリ
ーを用いる場合には、本発明蛋白質に対する抗体を用い
る抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択する
ことができる。大量にクローンを処理する場合には、Ｐ
ＣＲ法を利用したスクリーニング法を用いることが好ま
しい。

【００４３】この様にして得られたＤＮＡの塩基配列は
マキサム・ギルバート法〔Maxam, A.M. and Gilbert,
W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560 (1977)〕
あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌクレオチ
ド合成鎖停止の方法〔Sanger,f.ら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 74, 5463-5467 (1977) 〕によって決定す
ることができる。本発明のＤＮＡは、その全部または一
部を上記のようにして得られるクローンから制限酵素等
により切り出すことにより取得できる。

【００４４】(2) また、ヒト肝臓のゲノムＤＮＡから本
発明の蛋白質をコードするＤＮＡを単離することによる
調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。ヒ
ト肝臓を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用
いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの
脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはリボヌクレアーゼ
により消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素によ
り部分消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージま
たはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そして
目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識され
たＤＮＡプローブを用いる方法等により検出し、該クロ
ーンから本発明の蛋白質のＤＮＡの全部または一部を制
限酵素等により切り出し取得する。

【００４５】(3) また、化学的合成による本発明のＤＮ
Ａの製造は、図２、３に示される塩基配列をもとにし
て、常法に従って行うことができる。

【００４６】本発明の蛋白質は、オプソニン活性を有し
病原微生物を不活化する作用を有するので、細菌、ウイ
ルス、真菌などの病原微生物による感染症の予防又は治
療に有効である。細菌としては、サルモネラ、大腸菌、
緑膿菌などのグラム陰性菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、
肺炎球菌などのグラム陽性菌、ウイルスとしては、ヘル
ペスウイルス、ＨＩＶなど、真菌としては、カンジダ、
アスペルギルスなどが挙げられる。これらの病原微生物
による感染症としては、急性胃腸炎、食中毒、尿路感染
症、膀胱炎、腎盂炎、肺炎、敗血症、ブドウ球菌症、皮
膚疾患、ヘルペスウイルス感染症、帯状ほう疹、白癬、
カンジダ症などが挙げられる。

【００４７】本発明において、オプソニン活性は貪食細
胞（単球、マクロファージ、好中球など）による病原微
生物の貪食を増加させる作用を意味する。オプソニン活
性は、例えば、貪食細胞により貪食される微生物の数を
測定することにより測定することができる。貪食細胞と
してはヒト由来の単球、マクロファージ、好中球などが
使用できる。

【００４８】本発明の蛋白質は薬理的に許容される添加
剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤など）などの製薬上
必要な成分と適宜混合し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル
剤、注射剤などの形態で医薬組成物として、経口的又は
非経口的（静脈内、筋肉内または局所的）に投与するこ
とができる。好ましくは、生理食塩水、注射用蒸留水、
滅菌精製水などの希釈剤に溶解した、またはそれを凍結
乾燥した注射剤の形態である。投与経路は静脈内投与が
好ましい。

【００４９】当該製剤には、安定化剤を配合してもよ
い。安定化剤は、血漿蛋白製剤の安定化剤として通常使
用されるものであれば特に限定されない。例えばショ
糖、マルトース、グルコース等の糖類、マンニトール、
ソルビトール等の糖アルコール、グリシン、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、塩化ナトリウム、ク
エン酸ナトリウム、リン酸塩等の塩、リン脂質、アルブ
ミン、ゼラチン、クエン酸、リンゴ酸などを用いること
ができる。

【００５０】上記製剤中には、本発明の蛋白質の有効量
が配合される。投与量は投与経路、患者の症状、体重あ
るいは年齢などによっても異なるが、例えば成人患者に
静脈内投与する場合は１０μｇ〜１０ｍｇを１日１〜数
回に分けて投与するのが望ましい。本発明の蛋白質はヒ
ト血漿由来の成分であるため毒性は極めて低く、医薬と
して安全に投与することができる。

【００５１】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。

【００５２】実施例１：Ｐ３５の精製 ヒトクエン酸加血漿に最終濃度１０ｍＭになるように塩
化カルシウムを加えて３７℃、１時間反応させて凝固さ
せた。これを濾過してフィブリンを除き、9,000rpm、２
０分間の遠心により得た上清（血清）にポリエチレング
リコール4,000を終濃度７％となるように加え、４℃で
１時間、反応させた。9,000rpm、２０分間の遠心操作で
沈澱画分を得た。これを５０ｍＭ Tris,１Ｍ塩化ナトリ
ウム, ５０ｍＭ塩化カルシウム含有緩衝液（ｐＨ７．
８）に溶解後、酵母マンナンセファロースカラムにアプ
ライした。前記緩衝液でカラムを洗浄後、０．３Ｍマン
ノースを含有する前記緩衝液でマンノース結合タンパク
を溶出させた。その後、０．１５Ｍ Ｎ−アセチルグル
コサミンを含む前記緩衝液で本発明の蛋白質Ｐ３５を溶
出させた。Ｐ３５含有画分には、不純物成分としてＩｇ
ＭとＩｇＧが含まれていたので、抗ＩｇＭ−セファロー
スカラムと抗ＩｇＧセファロースカラムを用いてそれら
を除いてＰ３５を精製した。得られたＰ３５は、還元下
のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）で３５ｋＤａのバンドとして認められた。
Ｐ３５はＮ末端に次式（IV) で示されるアミノ酸配列を
有していた。

【００５３】

【化１２】

【００５４】実施例２：Ｐ３５のｃＤＮＡクローニング Ｐ３５のｃＤＮＡクローニングは、標準的な方法（Samb
rook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, 2nd E
d. Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に従って行
なった。λＺＡＰおよびλｇｔ１０をベクターとして、
ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを構築した。実施例１で
精製したＰ３５タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に基づ
いて、ライブラリースクリーニングのための２種類のオ
リゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド
をプローブとして、まずλＺＡＰｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングした。プラークを転写したナイロンメ
ンブレンとプローブとのハイブリダイゼーションは、５
×デンハルツ(Denhardts)，４×ＳＳＣ，０．１％ＳＤ
Ｓ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，４０ｍＭ Tris-HCl,ｐＨ７．
５，１００μｇ／ｍｌサケＤＮＡおよび³²Ｐ標識オリゴ
ヌクレオチドを含む溶液中で３７〜４２℃、一昼夜行な
った。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、１×ＳＳＣ
中室温で５０分間、さらに４０〜４３℃で１〜２時間行
なった。２種類のオリゴヌクレオチドプローブの両方に
陽性のクローンを選択した結果、１クローンのＰ３５ｃ
ＤＮＡの断片が得られた。

【００５５】このＰ３５ｃＤＮＡ断片（９７０ｂｐ）を
プローブとして、λＺＡＰおよびλｇｔ１０ｃＤＮＡラ
イブラリーを再びスクリーニングした。この時のハイブ
リダイゼーションは、オリゴヌクレオチドプローブの場
合と同様の溶液中で６０℃、一昼夜行なった。ハイブリ
ダイゼーション後の洗浄は、１×ＳＳＣ中室温で３０分
間、さらに０．１×ＳＳＣ中６５℃で１〜２時間行なっ
た。この結果、約２０万のλＺＡＰおよび約２０万のλ
ｇｔ１０から、それぞれ４クローンと２クローンのＰ３
５ｃＤＮＡが得られた。これらを制限酵素で切断してpB
luescript II KS ⁺ にサブクローニングし、Sangerらの
方法（Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977)
に従って塩基配列を決定した。

【００５６】塩基配列の共通部分を重複させた結果、図
２、３に示すようなＰ３５ｃＤＮＡ配列が得られた。図
１にＰ３５の制限酵素地図を示す。このｃＤＮＡは９３
９ｂｐの長さのＯＲＦ（転写解読枠）を持ち、２５アミ
ノ酸からなるシグナルペプチド（図２中の下線部分）と
これに続く２８８アミノ酸の成熟Ｐ３５蛋白質をコード
していた。成熟Ｐ３５（シグナルペプチドを除く）の分
子量は実施例１で単離されたＰ３５の分子量とほぼ一致
した。

【００５７】図４にＰ３５のドメイン構造を示す。成熟
Ｐ３５のＮ端側にはコラーゲン様構造があり、６個のア
ミノ酸をはさんで２回と１５回のGly −Ｘ−Ｙの繰り返
しが存在する。この構造はＭＢＰのコラーゲン様構造に
類似しており、この部分でオリゴマーを形成していると
推定される。Ｐ３５のＣ端側には、ＭＢＰと異なり、２
１８個のアミノ酸からなるフィブリノーゲン様構造が存
在する。データバンクとのホモロジイ検索の結果、Ｐ３
５はブタ子宮の細胞膜から単離されたFicolinαおよび
βと高いホモロジイをもつことがわかった（参考文献：
Ichijo, H.ら、J. Biol. Chem. 268, 14505-14513 (199
3)）。フィブリノーゲン様構造をもつ蛋白質はこれまで
数種類知られている。これらの蛋白質のフィブリノーゲ
ン様配列から得られたコンセンサス配列とＰ３５を比較
してみると、システインの位置ならびに幾つかのアミノ
酸が完全に保存されていることがわかった。フィブリノ
ーゲン様構造の中にＣａ結合に関与するＥＦｈａｎｄ(T
ufty & Kretsinger, Science, 187, 167, 1975) に類似
した配列が２カ所認められ（図２、３中の破線部分）、
Ｐ３５がＣａイオンと結合する可能性を示唆する。Ｐ３
５はその精製過程からレクチンの一種と考えられるが、
Ｐ３５のアミノ酸配列の中にＭＢＰなどのコレクチンに
認められる糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）と相同の配列は
認められなかった。

【００５８】実施例３：オプソニン活性試験 本発明蛋白質のオプソニン活性を示すために、単球の貪
食能に対する活性化作用を調べた。 (1) 単球の分離 健康成人から単球を分離した。ヘパリン採血後、Ficoll
hypaqueにて単核球の層を取り出し、さらに低張溶菌(h
ypotonic lysis) にて赤血球を除き、リン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。ＲＰＭＩ１６４０＋１
０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）に浮遊させ、１×１０⁷ 個
／ｍｌに調整する。上記のように調製した単球浮遊液を
８-chamber Lab-Tek slideに５００μｌずつ分け、３７
℃のＣＯ₂ インキュベーターで培養した。２４時間後、
付着細胞を０．１％ゼラチンと１０ｍＭ CaCl ₂を含む
ＨＢＳＳ（以下、ＧＨＢＳＳという）にて３回洗浄し、
これを単球として使用した。 (2) 単球によるサルモネラの貪食 サルモネラは、ＧＨＢＳＳ＋１０ｍＭ CaCl ₂に浮遊さ
せ、４×１０⁸ 個／ｍｌに調整する。５０μｌずつ１．
５ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。ＧＨＢＳＳ＋
１０ｍＭ CaCl ₂にて２０μｇ／ｍｌに調整したＰ３５
を５０μｌ加え、４℃で３０分振盪しながら放置する
（Ｐ３５によりサルモネラが凝集するのを防ぐため）。
サルモネラはＧＨＢＳＳ＋１０ｍＭ CaCl ₂で、１３０
０ｇで５分、３回洗浄した。２００μｌのＧＨＢＳＳ＋
１０ｍＭ CaCl ₂を加えてボルテックスミキサーにより
攪拌し、凝集したサルモネラをほぐした。上記のように
調製した単球にサルモネラを加えた。３７℃で５分、１
０分、２０分、４０分培養し、氷冷ＰＢＳを追加して貪
食を終了させ、さらにＰＢＳで３回洗浄した。May-Giem
sa染色し、単球４００個に貪食されているサルモネラを
数えた。 (3) 結果 結果を図５に示す。─■─はコントロール、─□─はＰ
３５の結果を示す。本発明蛋白質Ｐ３５の添加により単
球の貪食能の活性化が認められた。

【００５９】製剤例１（注射剤） 実施例１で得たＰ３５ １ｍｇを滅菌精製水１ｍｌに溶
解し、安定化剤としてヒトアルブミンを加え、ｐＨを
７．５に調整した。除菌濾過後、バイアル瓶に充填し凍
結乾燥して注射剤を調製した。

【００６０】

【発明の効果】本発明の新規蛋白質は、貪食細胞による
病原微生物の貪食を活性化するオプソニン活性を有し、
細菌、ウイルス、真菌などの病原微生物による感染症の
予防又は治療に有用である。また本発明によれば、当該
新規蛋白質をヒト血漿から簡便に、効率よく調製する方
法が提供される。

【００６１】さらに本発明は、当該新規蛋白質のアミノ
酸配列、および当該蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配
列を初めて明らかにするものである。かかるアミノ酸配
列および塩基配列の解明により、遺伝子工学的手法によ
る本発明蛋白質の製造、それに基づく構造活性相関の研
究が可能となる。すなわち、本発明のアミノ酸配列およ
び塩基配列は、当該蛋白質の分子あるいは遺伝子レベル
での物理化学的性状、および生物学的性状の解析に有用
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】蛋白質Ｐ３５のｃＤＮＡの制限酵素地図を示す
図である。

【図２】蛋白質Ｐ３５をコードするｃＤＮＡの塩基配列
およびＰ３５のアミノ酸配列を示す図である（図３に続
く）。

【図３】蛋白質Ｐ３５をコードするｃＤＮＡの塩基配列
およびＰ３５のアミノ酸配列を示す図である。

【図４】蛋白質Ｐ３５のドメイン構造を示す図である。

【図５】単球によるサルモネラの貪食に及ぼす蛋白質Ｐ
３５の影響を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/47 8318−4Ｈ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に式（Ｉ）に示されるアミノ酸配
   列を有してなる蛋白質。 【化１】
2. 【請求項２】 実質的に式（II）に示されるアミノ酸配
   列を有してなる蛋白質。 【化２】
3. 【請求項３】 実質的に式（Ｉ）に示されるアミノ酸配
   列および実質的に式（II）に示されるアミノ酸配列を有
   してなる蛋白質。 【化３】
4. 【請求項４】 実質的に式（III)に示されるアミノ酸配
   列を有してなる蛋白質。 【化４】
5. 【請求項５】 請求項１記載の蛋白質のアミノ酸配列を
   コードする塩基配列を含むＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項２記載の蛋白質のアミノ酸配列を
   コードする塩基配列を含むＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項３記載の蛋白質のアミノ酸配列を
   コードする塩基配列を含むＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項４記載の蛋白質のアミノ酸配列を
   コードする塩基配列を含むＤＮＡ。
9. 【請求項９】 ヒト血漿をマンナンに接触させ、Ｎ−ア
   セチルグルコサミン溶液で溶出することを特徴とする請
   求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質の製造方法。
10. 【請求項１０】 (1) ヒト血漿をマンナンに接触させ、
    Ｎ−アセチルグルコサミン溶液で溶出することにより得
    ることができる物質であり、(2) 還元下のＳＤＳ−ポリ
    アクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量が
    約３５ｋＤａであり、(3) Ｎ末端に式（IV) に示される
    アミノ酸配列を有する蛋白質。 【化５】
11. 【請求項１１】 請求項１〜４および１０のいずれかに
    記載の蛋白質を有効成分とする感染症予防治療剤。