JPH0849182A - 白腐れ菌によるピッチ分解法 - Google Patents

白腐れ菌によるピッチ分解法

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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、新規且つ有用な菌フレビア・トレ
メローザ(Phlebia tremellosa)の使用によるセルロース
製品の製造において使用されるパルプ及びパルプ材のピ
ッチ含量の減少方法を提供することを目的とする。 【構成】 本発明に係る菌が十分に長い時間にわたり接
種される場合、本菌はリグニンを分解及び/ 又は修飾す
る能力をも有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、セルロース製品の製造
において使用される材料のピッチ含量の減少における並
びにまたそのリグニンの分解及び/ 又は修飾における特
定の菌種の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】木は、セルロース、ヘミセルロース、リ
グニン及び木エキス又は樹脂状材料であって一般的に"
ピッチ(pitch)"、" 樹脂(resin)"又は" 木樹脂(wood re
sin)"といわれるものから成る複合材料である。ピッチ
の組成は研究されており、そして文献中に広く報告され
ている。例えば、Wood Extractives and Their Signifi
cance to the Pulp and Paper Industry, Chapter 10 "
Wood Resins" by D.B. Mutton; W.E. Hills, Ed, Acade
mic Press, N.Y. (1962)。木パルプからの製品の製造に
おいて、ピッチの存在は不所望である。なぜなら、その
粘度及びテナシティーのために、それがしばしば除去す
ることが困難である沈殿物を形成し、洗浄のための比較
的高頻度の且つ長期間の中断時間を引き起こし、そして
樹脂がストレーナー板、フィルター上に、そして紙加工
装置じゅうに沈殿物として蓄積する傾向があるからであ
る。洗浄前にあまりに長く蓄積に供される場合にピッチ
がパルプを、そしてそれから形成される紙を変色させる
こともできることがよく知られている。他の欠点、例え
ば、排液流汚染が本分野において公知である。
【０００３】Nilsson, et al.,米国特許第3,486,969 号
中、特定の菌が、その木、特にセルロース及びヘミセル
ロースの他成分の分解を最小にしながら、木チップを接
種してその中及びそれからのパルプの樹脂含量を減少さ
せるために使用されることが開示されている。しかしな
がら、その中に開示された菌の種は、明らかにすべて、
その木を変色させるとき、容易に削り落とされることが
できる表面又は表在性の染みを本質的に作り出す糸状菌
型(mold type) 又は表面形成性の菌(fungi) である(J.
S. Boyce, Forest Pathology, 3rd. Ed., 1961, McGraw
-Hill Book Co.at pp.493-512,特に496-497 を参照のこ
と。) 。このような菌は我々の知るかぎり実行的成功を
達成していない。公開された欧州特許出願第EP 03 87 1
87 A2 号中、子嚢菌綱(Ascomycetes) 又は不完全菌綱(D
euteromycetes)として一般的に分類される特定の木- 透
過性の菌をパルプ材(pulpwood)及びパルプに適用してそ
のピッチ含量を減少させることについて記載されてい
る。同様に有用な木- 透過性菌誘導体も、公開された欧
州特許出願第EP 0 470 929 A2 号中に開示されている。
【０００４】英国特許出願第GB 9312226.5中、処理され
た支持体上白色又は無色で成長しながら非常に良好なピ
ッチ分解及び積極的な成長特性を示す好ましい木- 透過
性菌オピオストーマ・ピリフェラム(Ophiostoma pilife
rum)の他株誘導体について記載されている。先に記載し
た好ましく且つ改良された木- 透過性のオピオストーマ
・ピリフェラム(O. piliferum)株の成功は、商業的な能
力が証明され、そして商業的な成功を達成している。ピ
ッチ減少からの実質的な節約に加えて、( より速い機械
速度に翻訳される) より大きな紙強度を初期に示すこ
と、そしておそらくその菌が樹脂管及び維管束内放射柔
組織(ray parenchyma)細胞を実質的に開放する能力のた
めに、特に例えば、化学的パルプ化のために支持体上で
使用されるとき、より大きなパルプ化効率をさらに示す
ことが、確認されている。このような菌が実際に有用で
あるべき能力は、部分的に、その菌が非- 滅菌基質上で
競合的に成長し、そして木源を自然に感染させる他の菌
又は生物により排除され又は占領されない能力に帰され
る。
【０００５】リグニンは、木細胞の3 つの主要な成分の
中の1 つであり、そしてパルプ中で最も不所望な成分で
ある。紙製造における菌及び菌の酵素の潜在的用途の研
究の一般的分野において、担子菌綱(Basidiomycetes)、
特に白腐れ菌(white rot fungi) が、リグニンを分解
し、そしてリグニン分解酵素を生産するそれらの能力に
ついて重要である。" 生物パルプ化(biopulping)" とい
われる根本的概念は、例えば、木チップの形態における
パルプ材を初期処理して、それ自体がパルプ粉砕機内に
入れられる前にパルプ化又はリグニン除去の工程を開始
させるという考えに基づいていた。このような目的に特
に好適と判断された白腐れ菌は、米国開封特許第5,055,
159 号中に記載されているようなセリポリオプシス・サ
ブバーミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora) であ
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、パル
プ及びパルプ材、並びに特に非- 滅菌支持体中のピッチ
の分解において、そしてまたパルプ及びパルプ材、並び
に特に非- 滅菌基質中のリグニンの分解及び/ 又は修飾
において、有用な菌の分野を拡げることである。他の目
的は、所望の性質、例えば、色効果、ピッチ分解及びリ
グニン- 分解-及び/ 又は修飾能力、非- 滅菌基質上で
の良好な成長、操作温度における柔軟性、様々な木種に
対するより大きな作用又は作用の柔軟性、等を有し又は
併合するピッチ分解性及びリグニン分解性及び/ 又は修
飾性の菌を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明に従って、白腐れ
菌種、フレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)が
特に非- 滅菌木基質中のピッチを含む基質のピッチ含量
の減少に特に有用であることが発見された。また本発明
に従って、フレビア・トレメローザ(Phlebia tremellos
a)による処理が好適に長い時間行われる場合に、フレビ
ア・トレメローザが特に非- 滅菌木基質中のリグニンを
含む木基質のリグニン含量の分解及び/又は修飾に特に
有用であることも発見された。従って、本発明は、木、
特にパルプ材又はパルプのピッチ含量を減少させる方法
であって、そのパルプ材又はパルプにフレビア・トレメ
ローザ(Phlebia tremellosa)菌種の接種を適用し、そし
てその後そのパルプ材又はパルプのピッチ含量の減少を
行なわしめるのに十分な時間にわたりその菌の成長を許
容する条件下でその接種されたパルプ材又はパルプを維
持するような方法を提供する。
【０００８】本発明は、木、特にパルプ材又はパルプ中
に含まれるピッチ含量を減少させ且つそのリグニン含量
を分解及び/ 又は修飾する方法であって、そのパルプ材
又はパルプにフレビア・トレメローザ(Phlebia tremell
osa)菌種の接種を適用し、そしてその後そのパルプ材又
はパルプ中に含まれるピッチ含量の減少且つその中に含
まれるリグニンの分解及び/ 又は修飾を行なわしめるの
に十分な時間にわたりその菌の成長を許容する条件下で
その接種されたパルプ材又はパルプを維持するような方
法をも提供する。用語" 樹脂(resin)"又は" ピッチ(pit
ch)"( これらは互換使用される。) は、一般的にピッチ
として知られる木の中の疎水性物質の複雑な混合物であ
って、中性有機溶媒、例えば、塩化メチレン、ジエチル
・エーテル、ベンジル・アルコール、等中で可溶性であ
るものを意味する。これらは、テルペン類、ジテルペン
("樹脂")酸、脂肪酸及びエステル、グリセリド及びワッ
クス、並びにアルコール、炭化水素及びそれに関連する
他の化合物を含む。本発明の目的のために、塩化メチレ
ンを使用する標準的なTappi 抽出分析は本発明の目的で
ある樹脂中の減少を測定するのに十分であろう。しかし
ながら、他の認められた溶媒系、例えば、エタノール/
トルエン又はアセトンも本質的に等しく代表的なもので
ある。
【０００９】樹脂又はピッチは、軟材、例えば、南松(s
outhern pine) 、針葉樹(conifers)及びヒマラヤスギ(c
edars)、及び硬材、例えば、カバノキ(Betula)及びPopu
lusの両方の重要な構成成分であり、そしてそれは、機
械的又は化学的パルプ化工程に送られるフィードの4 重
量% 以上程、一般的に、パルプ化のために使用されるほ
とんどの木について1.5 〜4.0%を占めることができる。
軟材は、一般的に、硬材よりも多くの樹脂を含み、松
は、軟材の中で最も高い樹脂含量をもつ。硬材中、樹脂
は、木がパルプ化されるときその繊維画分のほとんどを
形成する維管束内放射柔組織細胞中に主に位置する。軟
材中、樹脂は、維管束内放射柔組織細胞、そしてまた樹
脂管の両方の中に含まれる。本発明は、一般的に、セル
ロース製品の製造において使用されるパルプ材及びパル
プのピッチ含量を減少させるために適用されることがで
きる。
【００１０】用語" パルプ材(pulpwood)" は、本明細書
中に使用するとき、紙、ダンボール又は他のセルロース
製品、例えば、ビスコース(viscose) の製造においてで
あるがパルプ化の前に使用される木の材料のいずれかの
収穫形態を意味し、そして材木(timber)、丸太(logs)、
木チップ(wood chips)、木屑(sawdust) 、等のような形
態を含む。用語" 精製パルプ材(refine pulpwood)"は、
パルプ化工程に導入されることができる多数の高表面積
の小片、例えば、木チップ及び木屑を得るために丸太の
ような全パルプ材形態に機械的及び/ 又は剪断の力を加
えることから生じたパルプ材を意味する。本発明は、ま
た、パルプとして分類されることができるリグニン- 含
有セルロース材料に適用されることもできる。化学的パ
ルプを含むいずれの種類のパルプをも本発明に従って処
理することができるけれども、処理は、好ましくは、そ
のリグニン含量を有意に減少させ( そして含有ピッチを
放出させ) るのに十分な処理を未だ経験していないパル
プ、特にその元のリグニン含量の60% 以上を未だに保持
するパルプ、例えば、第一段階機械的パルプに対して行
われる。
【００１１】それ故、本発明は、その1 の態様において
は、そのパルプ材又はパルプに上記菌の中の少なくとも
1 の接種を適用し、その接種されたパルプ材又はパルプ
をマスにおいて堆積させ、そして菌によりそのパルプ材
又はパルプの樹脂成分における減少を行わしめるのに十
分な時間にわたりそのマスにおいて菌の成長を許容し又
は促進する条件下でその堆積したマスを維持することに
より、精製パルプ材及びパルプ、好ましくは不完全精製
パルプの樹脂含量を少なくとも部分的に減少させるため
に使用されることができる。本発明は、皮を剥がされて
いない材木の場合においては望ましくは少なくとも部分
的に傷つけられた材木を接種し、その木支持体上及び中
での菌の成長並びにその樹脂成分中での減少の行使に十
分な時間にわたりその材木を維持するすることにより、
未精製パルプ材、例えば、皮を剥がされた又は剥がされ
ていない形態における切断された材木に、適用されるこ
とができる。
【００１２】用語" 接種(inoculum)" 等は、本明細書中
に使用するとき、上記基質に適用されるとき上記菌の成
長をもたらすのに十分に生物活性をもついずれかの菌材
料を意味する。典型的な菌接種は、菌カルチャー又は菌
カルチャー、望ましくは生物学的に純粋なカルチャーか
ら得られた調製物を含む。ほとんどの菌の基本構造単位
は菌糸(fungal filament) 又は" 菌糸(hypha)"である。
集合して、これらの菌糸は、菌体細胞" 菌糸体(myceliu
m)" を構成する。菌は、典型的にはその菌糸体によりつ
くられた分生子(conidia) といわれる胞子により無性生
殖により再生され、厚膜胞子(chlamydiospores) といわ
れる休止構造をもち又は担子胞子(basidiospores) によ
り有性生殖により再生することもできる。すべてのこの
ような形態及び菌要素、例えば、菌糸体及び胞子は、本
発明における接種として好適に使用されることができ
る。接種形態は、幾つかの慣用方法のいずれかにおいて
菌を培養することにより提供されることができる。固体
又は液体培養基、好ましくは液体培地を適宜又は必要に
より使用することができる。普通には、胞子形成にふさ
わしい条件下での菌の培養が、可能なときには好まし
く、そして一般的に好ましい接種は、その菌カルチャー
から生じた多数の胞子を含むであろう。
【００１３】上記接種物は固体又は液体形態にあること
ができる。すべての液体カルチャー又はその部分、例え
ば、菌糸体及び胞子の混合物を使用することができる。
生成物は、その中で胞子が接種後の菌を生成するための
生物活性成分を構成しているような乾燥接種物を得るた
めに凍結乾燥される。適用のために水により希釈される
べき濃縮物の形態における接種物は、一般的には、所望
の生物活性を保存するであろう温度において保存され
る。液体形態は、普通には、凍結されて、典型的には-5
℃〜-80 ℃、より普通には-10 ℃〜-75 ℃の温度におい
て保存される。しかしながら、液体形態は、特定の溶
液、高シュクロース溶液中で調製される場合には室温に
おいて保存されることもできる。乾燥形態も同様に保存
される。但し、作用可能な接種物としての胞子を含む凍
結乾燥形態がしばしばより安定であり、そして反対の液
体形態よりも高い温度において保存されることができ
る。接種組成物は、乾燥工程の特定のタイプにおいて導
入される他の成分、例えば、保存剤及び安定剤又は不活
性担体を含んで成ることができる。
【００１４】接種物を様々なやり方で木基質に適用する
ことができる。典型的には、接種物を、システム的又は
方法論的なやり方で適用する。例えば、接種物を、精製
パルプ材のマス中に断続的に、又は好ましくは規則的な
間隔において、切断材木の外表面に分配する。より好ま
しくは、接種物を、均質的又は均一的なやり方で、すな
わち、精製パルプのマスの実質的に全体に分配する。し
かしながら、それぞれの個々の木チップ、木屑、等が接
種されることは必要とされない。個々の片の10% 以下程
の少量、好ましくは少なくとも約20% 、より好ましくは
少なくとも約50% が接種されることができる。なぜな
ら、非接種片がその接種された片と接して堆積するから
である。成長の間にその感染は非常に容易に拡がるであ
ろう。
【００１５】木チップのマスの完全な又は均一な接種
は、一般的に、その菌がそのマスの実質的に全体に成長
するという事実を反映する。しかしながら、マスの幾つ
かの部分、特に精製木パルプの山(pile)の外層が、それ
が接種されたとしても、そのマスの残りと比べて小さな
成長を示し、又は全く成長を示さないということが起こ
ることができる。1 つの好ましい態様において、接種物
を、それらがその精製操作からされる時であるが山に堆
積される前に、木チップ又は木屑上にスプレーする。例
えば、木チップ装置は、一般的に、新たに調製されたチ
ップを受け取り、そしてその堆積した山にそれらを運ぶ
コンベア手段を備えている。この接種調製物を含むスプ
レー・アプリケーターは、便利には、そのコンベアに、
好ましくは、そのチップが空気輸送、例えば、自由落下
又は転がるとき、上記チップ装置との接続点において、
又はそのコンベアから落下する直前にチップがスプレー
されるようにそのコンベアのまさに端において、接続さ
れることができる。
【００１６】あるいは、接種物を、堆積する山の上でい
くぶん連続的にスプレーすることによりその堆積の経過
中にその木チップの山に適用することができる。パルプ
又は精製パルプ材を処理するとき、適用される投与量
は、幾つかの要因、例えば、処理される木、木の条件又
は齢、成長条件、所望の処理時間、等に依存して変化す
ることができる。一般的には、満足できる結果は、パル
プ又はパルプ材100 グラム当たり0.5 〜10グラムの菌糸
体( 脱水菌糸体の湿重量、実施例1参照) 、好ましくは
処理されるべき基質100 グラム当たり1 〜5 グラムの菌
糸体を含む接種物適用の間に得ることができる。脱水に
先立つこのような菌糸体は、以下の実施例1 又は実施例
A 、好ましくは実施例A 中に記載するように調製される
ことができ、そして胞子を含むことができる。優先的に
又は完全に胞子に基く接種物の投与量は日常的に決定さ
れることができ、そして基質1 キログラム当たり105 〜
1010CFU(コロニー形成単位) 、より普通には106 〜109
CFU/kgのレンジであると示されることができる。同様
に、表された菌糸体投与量を決定し、そして適用するこ
とができる。例えば、菌糸体を例えば、5-10分間均質化
し、そして栄養培地上で成長させたときその断片から形
成されたコロニーの数を、常法により所定の容量につい
てのCFUsを測定するために近づけることができる。
【００１７】この接種投与量は、水- 希釈されたスプレ
ー可能な組成物、例えば、基質1kg 当たり20〜60mlの容
量において適用されるべき組成物において適用されるで
あろう。この菌は、好ましくは、処理まで冷凍又は低温
において保存された新たに切断又は精製されたパルプ材
又は新たに切断された基質、又は滅菌された基質に適用
される。処理前に熟成された非- 滅菌パルプ材、例え
ば、処理約5 日間以上前に製造された木チップに適用さ
れるとき、接種に先立ちその木に自然に感染した菌の背
景成長効果を回避し、抑制し又は克服するために、その
接種物投与量その投与量レンジの上限まで増加させるこ
とが望ましいかもしれない。
【００１８】他の態様においては、本発明に従って先に
接種され、そしてインキュベートされたチップを接種を
有効にし又は強化するために新たなチップ中に分散させ
ることができる。このような接種物は、おそらく生物学
的に純粋ではない。接種後、堆積したマスを、そのマス
の実質的に全体にその菌の成長を許容し又は促進するで
あろう条件下で維持する。本発明がほとんどの場合に開
放空気中で行われ、そしてそれ故そのマスが多種多様な
気象条件に供されるであろうという事実が与えられるの
で、処理期間の全体を通じての理想的条件のいずれかの
所定のセットを維持することは、普通には達成が困難で
あり、そしてしばしば実施することも必要とされない。
一般的には、菌が死ぬところの高い温度を回避しながら
菌が成長するところの温度においてマスを実質的に維持
することで十分である。我々の菌が0 ℃以下においてい
くつかの妥当な成長を示すことができるけれども、一般
的には、少なくとも10℃、例えば、10℃〜45℃、より好
ましくは15℃〜40℃、より好ましくは22℃〜36℃の温度
を保ことがより好適であろう。
【００１９】温和な又は温暖な気象条件においては、そ
の環境温度に影響を及ぼすことは必要とされず、そして
その接種されたマスを、開放空気中で特別な維持を伴わ
ずに放置することができる。チップが冷気象条件におい
て凍結固化している場合、より好適な温度を維持するた
めの手段をその接種されたマスに提供することが望まし
い。これは、その接種されたマスの上又は接して置かれ
た熱- 保持カバー材料、例えば、大きなプラスチック・
シートであることができる。あるいは、接種されたマス
がその上に置かれる地面の基礎に加熱パイプ又は暖い空
気又は蒸気を放出するための複数の開口を提供すること
ができる。同様のやり方で、内部を加熱し、そして輻射
熱を放射することができるコンクリートの" イグルー(i
gloo)"又は類似の構造を、パルプ材の堆積したマスを支
持するために使用することができる。加熱手段を提供す
るとき、過度の乾燥を回避するための湿度条件を制御す
ることも望ましいであろう。この視点において、熱又は
蒸気を換気するための手段が適当であろう。しかしなが
ら、菌の成長及び他の微生物又は自然の効果から堆積し
たマス内で生成した熱のために、多くの冷気象条件下で
の操作は、ほとんど又は全く支援なしに首尾よく進行す
ることができる。
【００２０】接種された精製パルプ材マスが処理される
時間は、所望の程度の樹脂の除去、温度及び湿度条件、
接種の程度、またリグニン分解及び/ 又は修飾のいずれ
が望まれるか否か、等を含む多くの要因に依存してかな
り変化することができる。しかしながら、ピッチ減少の
ための満足いく結果は、一般的に3 〜40日、好ましくは
4 〜30日間にわたる時間の後に獲得されることができ
る。好ましい条件下では、非常に有効な結果、例えば、
約20% 以上のピッチ減少をその接種の4 〜20日後、普通
には5 〜15日後に得ることができる。リグニン分解及び
/ 又は修飾も望まれる場合には、その期間は、接種後
の、少なくとも14日目、例えば、14〜50日のレンジ内、
特に好ましくは少なくとも20日目、例えば、20〜40日の
レンジ内に、あるはずである。非精製パルプ材、例え
ば、切断材木の処理は、普通には精製パルプ材のものよ
りもいくぶん長くなるであろうし、そして2 カ月以上に
延びることができる。しかしながら、上記の菌によるパ
ルプ及びパルプ材の処理は、一般的には、その基質( 単
数又は複数) のセルロース成分に対するいずれかの実質
的な攻撃をもたらすであろう余分な期間を避けながら所
望のピッチ減少並びにリグニン分解及び/又は修飾を行
う期間にわたり、行われなければならない。非精製パル
プ材のための投与量は、精製パルプ材のものと同様であ
ることができ、そして利用可能な表面の10% 〜100%にわ
たり、より普通には利用可能な表面の15% 〜50% にわた
り適用されることができる。
【００２１】本発明の実施において使用される菌は、先
に公知の種に属し、そして公知のやり方、例えば、それ
らが自然に成長する木源からの単離により獲得されるこ
とができる。株中のいくつかの変種が、それらが単離さ
れることができる木源の如き要因に依存することが予想
される得るけれども、我々の菌は、非滅菌Southern Yel
low Pine並びにまた硬材、例えば、カエデ(maple) 及び
シラカンバ(birch) の両方の上での顕著な成長を証明
し、そしてセルロース製品の製造において一般的に使用
される他の木のタイプの上でよく成長することを期待す
ることができる。我々の菌の天然単離物は、それらの同
定種特性を喪失せずに株選択、接合及び突然変異の様々
な公知手段により修飾されることができる。これ故、我
々の好ましい天然単離物は、以下に詳述するようにNort
hern Regional Research Center(NRRL) に寄託された
が、同一のものが修飾されることができること、そして
好ましい菌株がこのような単離物だけでなくいずれかの
寄託された株により所有される滅菌Southern Yellow Pi
ne上でのピッチ分解及び/ 又は成長特性を少なくとも実
質的に有するすべての他の単離物をも含むであろうこと
は、明らかであろう。本発明において使用される菌は、
パルプ材料及びパルプ上で白色又は本質的に無色で成長
するであろう。それらがリグニンを分解及び/ 又は修飾
し、そして非滅菌基質を自然に感染する他のより黒い成
長菌をほとんど又は完全に排除するために使用されるこ
とができるので、本発明に係る菌は、最終紙製品を得る
ためにほとんど漂白を必要としない製品を製造するため
に使用されることができる。
【００２２】寄託 我々は、ブダペスト条約の下、Peoria, Illinois, USA
におけるNorthrn Regional Research Center(NRRL)に、
生物学的に純粋な2 つの単離物の試料を寄託した。その
寄託は、それらの寄託日と共に与えられた以下の寄託番
号を付与された。 菌 寄託番号 寄託日 フレビア・トレメローザ NRRL 21200 1994年2 月17日 (Phlebia tremellosa) BRI-94 フレビア・トレメローザ NRRL 21253 1994年5 月16日 (Phlebia tremellosa) BRI-118 上記の寄託における株を、以下、単離物BRI-94及び単離
物BRI-118 として同定する。
【００２３】上記の寄託物を米国ミネソタ州の枯れた材
木からの天然単離物として得たが、他の単離物を様々な
他の地球上の地域から得ることができる。上記の菌は硬
材から単離された。フレビア・トレメローザ(Phlebia t
remellosa)としての我々の菌の分類は、Ainsworth & Bi
sby's dictionary of the Fungi, 7th Edition, 1983D.
L. Hawksworth, B.C. Sutton, & G.C. Ainsworth, Comm
onwealth Mycological Institute Kew, Surrey UKに従
う。
【００２４】
【実施例】一般的手順: 培養及び接種 : 様々な評価をパルプ材基質に対して行って、ピッチ減少
及び成長を測定した。軟材特性の評価のために、滅菌及
び非- 滅菌Soythern Yellow Pine木チップを使用した。
硬材特性の評価のために、主にシラカンバ及びカエデを
含んで成る非滅菌木チップを使用した。木チップを評価
に先立ち5 ℃において保存した。それぞれの評価を同一
の木種の支持体上及び同一の木チップ源から得られた木
チップ・サンプルに対して行った。それぞれのテストの
ために、木チップの個々のサンプル・ロットを最初に計
量し、その後、滅菌されるべき木チップ・サンプルをオ
ートクレーブ内で121 ℃において約20分間加熱し、そし
てテスト開始前に室温まで冷却に供した。非- 滅菌形態
にあるべき木チップ・サンプルを処理せず、そしてそれ
らの自然条件において使用した。個々のサンプル・ロッ
トを個々の透明プラスチック・バッグに木チップの計量
された量を入れることにより調製した; これらのバック
は、( 密封してシールすることはできないが) それらが
閉じられるのに十分なサイズを有していた。透明バッグ
の使用は、チップの成長の肉眼観察を許容し、そしてさ
らに、評価される木チップのサンプルへの周囲の光の進
入を許容した。
【００２５】YNPD液体培養基を、以下の構成成分を使用
して調製した( 量は製造された液体培養基の1 リッター
当たりのグラム数である。): 10g グルコース 10g 麦芽エキス 2g ペプトン 2g 酵母エキス 2g KH2 PO4 1g アスパラギン 1g MgSO4 ・7 H 2 O これらを、順番に1 リッターの蒸留水に添加し、そして
その後121 ℃において約20分間オートクレーブに供し、
そして室温まで冷却した。その後、1mg のチアミンをそ
の他の構成成分に添加し、その後、このYNPD培地を使用
可能状態にした。
【００２６】先に示したように調製したYNPD培養基を使
用して、それぞれの菌を以下の一般条件下で調製した: (a) 特定の菌のサンプルを先に調製したようなYNPD培養
基を含む滅菌ペトリ皿に接種するために使用し、そして
その皿に蓋をし; (b) 接種されたYNPD培養基を室温( 約20℃) において、
接種された菌が菌糸体マット(mats)の形態においてその
YNPD培養基上でよく成長することが肉眼で識別できるま
で( 約5 日間) 維持し; (c) 良好な成長が観察された後、その菌糸体マットを次
に( ゴム手袋により覆われた) 手でそのペトリ皿から取
り出し、そして本質的に水が全く出なくなるまで手で搾
り、そしてその搾ったマットを" 湿重量(wet weight)"
を測定するために計量した。この搾った又は脱水したマ
ットをきれいな実験室ビーカー内に入れ、そこで次にそ
れを5-10mlの蒸留水の添加により均質化してピペットで
吸い取ることができるようなスラリーを作り、次にそれ
をそのビーカーから取り出し、そして基質を接種するた
めに使用し;
【００２７】(d) ビーカーの内容物を次に目盛り付きシ
リンダーに注ぎ、ピペットで吸い取ることができるスラ
リーの容量を測定し、そして一旦測定したら、その内容
物を上記実験室ビーカーに戻し、そこからそれを、サン
プルの接種のために取り出した。木チップのサンプルの
接種を、木チップの各100 グラムについてその菌糸体マ
ットの2-5 グラムぼ湿重量を含むピペットの内容物を注
射することにより行い、その後、上記バッグの開放端を
折り返し、そしてその接種物と接するようになるチップ
の数を最大化するように、そのバッグの内容物を振と
う、そして混合した。このバッグの折り返し端を2 箇所
で挟んだ。すべての接種木サンプルを次に室温において
それぞれの特定のテストにおいて示される時間にわたり
実験室ベンチ上に置いた。それぞれのテストを、2 〜5
回行い; 本明細書中に報告する菌の成長の報告はこれら
の複数の結果の平均である。
【００２８】ピッチ含量評価:基質のピッチ含量の評価
を標準的なTAPPI Procedure T204 OM-88に従って測定し
た。これは、塩化メチレンである"DCM" により抽出され
た基質の1 グラム当たりのピッチ含量のミリグラムとし
て表されることができる結果を提供する。このTAPPI Pr
ocedure に従って、基質、例えば、木チップ上で使用す
るとき、その処理されたチップを60℃において一夜乾燥
させ、そして次に10- メッシュ篩(10 ゲージ・ワイヤー
篩) をもつThomas-Wiley Mill を使用した木屑に粉砕し
た。3 グラムの乾燥木屑を30mlのDCM と併合し、そして
得られた混合物を室温( 約20℃)において一夜( 約15時
間) 攪拌した。この形態培地をその混合物からピペット
により吸い取り、0.45μm の孔サイズをもつ有機フィル
ターを通して濾過し、そして次にその液体を室温におい
て一夜風袋消去( 前計量した) 皿内で蒸発せしめる。皿
残渣を次に60℃において30分間対流オーブン内で加熱し
ていずれの残DCM をもさらに除去し、その後、その皿を
室温まで冷却に供し、そして再計量し; 残渣、すなわ
ち、残ピッチの重量を、ミリグラム(mg)の単位において
測定且つ表示し、そして評価される元のサンプルの量に
関連付けて、その基質木チップの1 グラム当たりのピッ
チのmg、又はあるいはその基質木チップ・サンプル中に
存在する抽出可能なDCM のパーセントとしての表示を提
供して、その結果を等式で結び、そしてその基質中のピ
ッチのパーセント(%エキス) として得る。
【００２９】ピッチ評価を滅菌及び非- 滅菌基質の両方
に対して行うことができる。滅菌基質の対する評価は、
普通にはその基質に自然に感染する他の生物のいずれか
の可能性のある影響を取り除くであろう。滅菌基質に対
する評価は、一般的には、菌が特定の基質に対してピッ
チを減少させるより客観的な測定を考慮されることがで
きる。しかしながら、滅菌又は非- 滅菌基質のいずれに
対して行われるても、ピッチ減少は、一般的には、その
テスト期間( 非- 滅菌基質評価) の間の冷凍状態におい
て保たれる( 滅菌又は基質テストのための) 滅菌された
非処理対照に対して評価される。一般的には、接種後21
日目までに、好ましくは14日目までに少なくとも20% の
このような対照に対してピッチ減少を達成することが望
ましい。特に、良好な結果が21日目までにピッチが25%
減少されるとき、そして特に14日目までにこのような減
少が達成されるときに、示される。以下の実施例4 中、
エタノール及びトルエンの溶液(2:1重量比) が抽出剤と
して塩化メチレンの代わりに使用されたことに注意のこ
と。
【００３０】カッパ数の測定:カッパ数は、脱リグニン
化の程度を示し、そしてTAPPI Test Methods(Tappi,Atl
anta, Ga.) Vol. 1, 1988 "Kappa number of pulp- T 2
36 cm 85"中に記載されている標準的な方法により測定
される。このカッパ数は、上記の方法において特定され
る条件下で1 グラムの水分- 不含パルプ( オーブン乾燥
パルプ; 乾燥を約105 ℃において2 〜10時間行う。) に
より消費される0.1 N 過マンガン酸カリウム溶液の(ml
における) 容量である。この結果を添加した過マンガン
酸塩の50% 消費に補正する。より低いカッパ数が望まし
い。なぜなら、より少ないリグニン量が存在することを
示すからである。
【００３１】成長評価:菌の成長の評価を、その成長が
測定されるべきいくつかのテストのそれぞれについて評
価される個々のサンプルのすべてについて、可能な限り
均一に且つ可能な限りほとんど同一なやり方で行う。評
価を、無矛盾の基準に基づき適用されるプロトコールに
より単純な肉眼観察を使用して行い、そしてそれぞれの
評価間隔( ここで、中間評価をテストの間に行う。) に
おいて、そしてそれぞれのテストの終わりに、行う。こ
のプロトコールは、正常な読み距離において非援助眼に
よりそれぞれの個々の木チップ又は基質に対して観察し
又は確認されることができる可能性のある菌成長の色カ
テゴリーに基く。基質を滅菌するとき、1 だけの色カテ
ゴリー、本発明の候補のものが認識されるであろうし、
そしてそのプロトコールは、候補菌の肉眼成長を示すチ
ップの数又はパーセンテージを測定するためにすべての
木チップの単純肉眼観察を含む。その成長評価を非- 滅
菌基質上で行うとき、異なる色カテゴリーが、普通に
は、本発明又は接種された菌とその基質に自然に感染し
た菌との間を区別するために、認識されるであろう。
【００３２】この接種された候補、典型的には最も明る
い色が同定されるであろうし、そしてこのような成長を
見えるように示す木チップの数及びパーセンテージが計
数されるであろう。以下の報告結果を、それぞれのテス
ト・ケースにおける我々の所望の菌の成長を示すことが
観察された木チップのパーセンテージに換算して与え
る。処理された非- 滅菌木チップは、他の生物、例え
ば、黒色菌のチップの他の領域内での成長を示すことが
でき、そしてこのような背景成長の色付けは、同様のや
り方で別々に記録されることができる。このような背景
成長は、その接種された菌によるその他の陽性成長結果
を打ち消すもとのとらえてはならないが、より望ましい
菌の候補は、明らかに、このような背景成長を最も良く
抑制し又はこれを上回ってはびこるものである。
【００３３】以下の実施例中、フレビア・トレメローザ
(Phlebia Tremellosa)の2 つの異なる単離物を同定物BR
I-94及びBRI-118 の下で評価する。実施例1 滅菌Southern Yellow Pine上での成長及びピッチ除去 :S
outhern Yellow Pine上でのBRI-118 の菌成長の評価を
滅菌木チップ・サンプル上で行った。このサンプルは、
チッピング後約2 日間熟成され、そして滅菌のときに約
5%の背景成長をもっていた。このサンプルのそれぞれ
は、先に記載したように調製した500 グラムの木チップ
を含んでいた。接種物を先に記載したように調製し、そ
して25グラムの均一化した菌糸体マットのスラリー( 湿
重量) を先に記載したようなやり方で500 グラムのチッ
プのサンプル・ロットを接種するために使用し、これ
は、1.4 x 107 CFU/チップ500gの投与量を示していた。
次にこのバッグを全期間14日間にわたり室温において保
存した。菌成長の評価をそのサンプルの接種後3 、6 及
び14日目に行った。滅菌した南松上でのこの成長の結果
を3 連の平均である以下の表1 中に報告する。ピッチ減
少を水接種対照に対して表2 中に報告する。
【００３４】 表1-滅菌Southern Yellow Pine上での成長 単離物 3 日目成長 6 日目成長 14日目成長 BRI-118 85% 100% 100% 表2-滅菌Southern Yellow Pine上でのピッチ減少 単離物 %DCM % 減少 対照 4.70 -- BRI-118 3.37 28.3
【００３５】実施例2 実施例1 を繰り返した、但し: 1) BRI-94 とBRI-118 の
両方を評価し; そして2) Southern Yellow Pine 木チッ
プはチッピング後2 日目に滅菌され、そしてこれは、滅
菌のときに15% の背景成長をもち、これは他の情報と共
に、その木がチッピング前によく熟成され、そしてその
木チップが菌成長及び/ 又はピッチ分解のために困難な
宿主であるであろうことを示唆するものであった。成長
結果を表3 中に、ピッチ減少を表4 中に報告する。
【００３６】 表3-滅菌Southern Yellow Pine上での成長 単離物 6 日目成長 9 日目成長 14日目成長 BRI-94 10% 100% 100% BRI-118 10% 10% 20% 表4-滅菌Southern Yellow Pine上でのピッチ減少 単離物 %DCM % 減少 対照 2.44 -- BRI-94 1.76 27.9% BRI-118 1.89 22.5%
【００３７】実施例3 非- 滅菌軟材( 松) 中のピッチ除去 BRI-94とBRI-118 と命名されたフレビア・トレメローザ
(Phlebia tremellosa)菌の2 つの別個の単離物を非- 滅
菌Southern Yellow Pine中のピッチ除去におけるそれら
の効力及び他の特徴について評価した。対照サンプルを
も評価して比較表示を提供した。対照サンプルは、その
テスト期間じゅう冷凍して(-20℃) 維持された非- 接種
対照サンプル、及び室温において維持された水接種周囲
対照サンプルを含んでいた。この周囲温度対照を非- 滅
菌木チップ・サンプル上に存在する背景生物のピッチ減
少に対する効果の指標として使用し、そしてその菌単離
物のピッチ除去をその周囲対照のものを下回るパーセン
ト減少として測定した。すべての評価を接種後14日間の
成長の後に非- 滅菌Southern Yelow Pine木チップ・サ
ンプルの500 グラムのサンプル上で行い、それぞれのテ
ストを3 連で走らせ、そてそれらの結果を平均した。木
チップは、齢が知られていなかったが、接種時に20% 青
染色及び2%のYellow染色の背景成長をもっており、これ
は再び、ピッチ除去について困難な挑戦である熟成され
た木源及び基質を示唆するものであった。比較のため
に、テストは、正常には非- 滅菌Southern Yelow Pine
上で非常によく行われる登録商標CARTAPIPR 97下で入手
可能な製品の形態におけるオフィオストーマ・ピリフェ
ラム(Ophiostoma piliferum)の菌種をも含んでいた。
【００３８】サンプルのそれぞれを、TAPPI Procedure
T204 OS-76に記載したプロトコールに従ってDCM 抽出可
能な量について評価した。Klasonリグニンの分析を選択
された木チップ・サンプルの対して行ってそのサンプル
・チップ中のリグニンの分解の表示を提供し; 5 つの基
本的単糖類( グルカン、マンナン、アラビナン、キシラ
ン及びガラクタン) の定量的な測定を絶対基準に基づい
て行ってその木の炭水化物組成を定めた。このKlasonリ
グニン分析を、一般的に、TAPPI T249 cm-85のテスト・
プロトコール "Carbohydrate composition of extracti
ve-free wood and good pulp by gas-liquid chromatog
raphy"(1984; TAPPI) に従って行った。簡単に言えば、
TAPPI T249 cm-85プロトコールに従うKlasonリグニン分
析は以下のようである: サンプルを2 段階技術を使用し
て硫酸により加水分解し; 1 部の加水分解産物を次に中
和し、そしてそのサンプル中に存在する糖をホウ素化水
素ナトリウムによりそのアルジオールに還元し、これを
次に無水酢酸及びピリジンによりアセチル化し、そして
次にその酢酸アルジオールを塩化メチレン中に溶解し、
そして次にそのガス・クロマトグラフィー中へのインジ
ャクションのために使用した。さらに、選択された木サ
ンプルについてその炭水化物の分析を行ってセルロース
及びヘミセルロース分解の程度を評価した。本実施例に
おいて、この接種物は、BRI-94の場合に2.3 x 106 / 均
質化菌糸体マット1gのCFU カウント並びにBRI-118 の場
合に3.5 x 106 / 均質化マット1gのCFU カウントを提示
する15グラムの菌糸体マットを含んでいた。
【００３９】評価されるサンプルの結果、%DCMエキス及
び%Klason リグニンを表5 上に報告し、そして選択され
たサンプルの炭水化物の分析を両方以下の表6 上に報告
する。表5- %DCM エキス及び%Klason リグニン 周囲対照上の 菌 %DCMエキス % ピッチ減少 %Klasonリグニン 非- 接種冷凍対照 2.66 --- 29.4% 非- 接種周囲対照 2.35 --- 29.6% CARTAPIPR 97a) 2.11 10.2% --- BRI-94 1.32 44% --- BRI-118 1.52 35.3% 29.5% a) 5 x 10 8 CFU/チップ500gの投与量は、O.piliferum
についての全胞子カウントに基くコロニー形成単位を表
す( 胞子だけを含む製品) 。
【００４０】 表6- BRI-118チップについての炭水化物分析 サンプル: アラビナン キシラン マンナン ガラクタン グルカン 周囲対照 1.07 5.6 11.5 2.4 40.5 BRI-118 1.06 5.6 11.3 2.5 39.5
【００４１】このKlasonリグニン・テスト結果から分か
るように、本発明に係る菌は、14日間の木チップ上への
接種期間の後にその木チップ・サンプルのリグニン含量
に適当に影響を与えないことが見つかった。しかしなが
ら、実施例5 中に見られるように、それらは、接種のよ
り長い期間の後にそのリグニン含量に影響を及ぼすであ
ろう。驚くべきことに、本発明に係る菌種は、そのサン
プルのピッチ含量における有意な減少を引き起こし、CA
RTAPIPR 97がピッチの有効な分解剤であると認められて
いることが注目される。表6 の結果から分かるように、
その周囲対照サンプルと比較したとき我々の菌により処
理された松木チップのサンプル中の炭水化物の量におけ
る適当な損失は存在しなかった。これ故、セルロース及
び/ 又はヘミセルロースの減少は、本ピッチ減少処理の
結果としては全く示されなかった。上記実施例3 の続き
として行われた成長実験においては、CARTAPIPR 97によ
る12日後でさえ菌の成長を検出することが困難であり、
これは、事実上容易に検出できない成長を示し、BRI-94
はたった20% 、そしてBRI-118 はたった10% を示した。
この現象についての様々な可能性のある説明は、そのチ
ップの熟成状態、それらの菌が無色で成長する傾向並び
に/ 又はその菌による透過及び内部作用を含む。
【００４２】実施例4 非- 滅菌硬材上での成長及びピッチ減少 先の実施例の手順に従って、BRI-118 を、チッピング1
日後に接種され、そして接種時に背景成長を全く示さな
かった非- 滅菌混合硬材木チップの500g上での成長及び
ピッチ減少について評価した。この硬材混合物は、75%
のカエデ、20%の黄シロカンバ及び5%オークを含んでい
た。BRI-118 を8 日間振とうフラッシュ・カルチャーか
ら収穫し、そしてそれぞれの接種物は、7.1 x 105 / マ
ット1gの推定CFU カウントをもつ3gの菌糸体を含んでい
た。処理時間は14日間であった。成長結果を表7 中に、
( 周囲対照に対する) ピッチ減少を表8 中に示す。
【００４３】 表7-非- 滅菌混合硬材上でのBRI-118 の成長 単離物 3 日目成長 14日目成長 BRI-118 50% 90% 表8-非- 滅菌混合硬材上でのBRI-118 によるピッチ減少 % エタノール/ 単離物 トルエン・エキス 周囲対照上の% 減少 冷凍対照 4.12 --- 周囲対照 3.55 --- BRI-118 2.73 23.0% CARTAPIPR 97 2.92 17.7% 表7 は、硬材上での本発明に係る菌の良好な検出可能な
成長を示し、そして表8 は、CARTAPIPR 97を上回る我々
の菌についての優れたピッチ減少を示している。
【００４４】実施例5 非- 滅菌ポプラ(Aspen) 中のピッチ除去及びリグニン分
解 フレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa) BRI-118
を、チッピング3 日後にその菌により接種された先に記
載したように調製された非- 滅菌Aspen 木チップの475g
サンプル上でピッチ減少及びリグニン分解について評価
した。各接種物は、1 x 106 CFU/mlを含む10mlの菌調製
物を含んでいた。次にバッグを全20日間にわたり室温に
おいて保存した。全ピッチ・レベルをアセトン抽出(TAP
PI手順T204 om-88) により測定した。カッパ数は、脱リ
グニン化の程度を示し、そしてTAPPI Test Methods(Tap
pi, Atlanta, Ga.) Vol. 1, 1988 "Kappa number of pu
lp- T 236 cm 85"中に記載されている標準的な方法によ
り測定される。このカッパ数は、上記の方法において特
定される条件下で1 グラムの水分- 不含パルプ( オーブ
ン乾燥パルプ; 乾燥を約105 ℃において2 〜10時間行
う。) により消費される0.1 N 過マンガン酸カリウム溶
液の(ml における) 容量である。この結果を添加した過
マンガン酸塩の50%消費に補正する。より低いカッパ数
が望ましい。なぜなら、より少ないリグニン量が存在す
ることを示すからである。
【００４５】 表9-非滅菌Aspen 上でのBRI-118 によるピッチ減少及びリグニン分解 周囲対照上での 菌 % アセトン・エキス % ピッチ減少 カッパ数 非- 接種 周囲対照 1.79 -- 15.2 BRI-118 1.41 21% 13.2
【００４６】表9 中に示されるように、カッパ数におけ
る有意な減少は、20日間の処理期間後に行われ、一方、
( 結果を示していないが)13 日後に、カッパ数における
ほんの僅かな減少が行われた。これは、BRI-118 だけに
よるリグニン分解/ 修飾が、所定の実験条件( 接種の程
度、温度及び湿度条件) 下で接種の約2 週間後に始まる
ことを示しているようである。これは、なぜ実施例3 に
おいてKlasonリグニンにおける有意な減少が全く見られ
ないかということを説明することができるであろう。
【００４７】実施例A 液体振とうフラスコ培養における菌の成長特性 フレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)(BRI-11
8) を、先( 実験) に記載したように調製した500ml のY
NPD培地を使用して振とう液体培養において成長させ
た。この培地に、活発に成長している麦芽/ 酵母エキス
寒天プレートからの菌糸体の小さなプラグを接種した。
このフラスコを11日間23-25 ℃において200rpmにおいて
振とうし、そしてそれぞれのカルチャーからの1ml の滅
菌サンプルを顕微鏡分析にために取り出した。このカル
チャーは、菌糸体ボールの濃密な成長を示し、そしてそ
のカルチャー・マスは、約0.5 〜1.5%の芽胞子(blastos
pores)を含むことも示された。この生成物は、接種物と
して使用され、又は接種物形態を作るための様々な方
法、例えば、その後の使用のために均質化及び冷凍する
ことにより、加工されることができる。このカルチャー
の胞子含量に本質的に基く接種物を凍結乾燥により調製
することもできる。
フロントページの続き (72)発明者 ロバート エー．ブランチェット アメリカ合衆国，ミネソタ 55126，ショ アビュー，ウエスト カウンティ ロード アイ 975 (72)発明者 ロベルタ エル．ファーレル アメリカ合衆国，マサチューセッツ 01450，グロートン，オールド アイヤー ロード 264

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 パルプ材又はパルプのピッチ含量を減少
    させる方法であって、そのパルプ材又はパルプにフレビ
    ア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)菌の接種を適用
    し、その接種からの菌の成長の間にその接種がそのパル
    プ材又はパルプのピッチ含量を減少させるのに十分な量
    にあり、そしてそのように接種された菌の成長によりそ
    のパルプ材又はパルプのピッチ含量の減少を行なわしめ
    るのに十分な時間にわたりその接種からの菌の成長を許
    容する条件下でその接種されたパルプ材又はパルプを維
    持するような方法。
  2. 【請求項２】 パルプ材又はパルプのピッチ含量を減少
    させ且つパルプ材又はパルプのリグニン含量を分解及び
    / 又は修飾する方法であって、そのパルプ材又はパルプ
    にフレビア・トレメローザ(Phlebia tremellosa)菌の接
    種を適用し、その接種からの菌の成長の間にその接種が
    そのパルプ材又はパルプのピッチ含量を減少させ且つそ
    のリグニン含量を分解及び/ 又は修飾するのに十分な量
    にあり、そしてこのような菌の成長によりそのパルプ材
    又はパルプ中に含まれるピッチ含量の減少且つその中に
    含まれるリグニンの分解及び/ 又は修飾を行なわしめる
    のに十分な時間にわたりその接種からの菌の成長を許容
    する条件下でその接種されたパルプ材又はパルプを維持
    するような方法。
  3. 【請求項３】 パルプが、その元のリグニン含量の少な
    くとも60重量% を保持しているパルプである、請求項１
    又は２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 非- 滅菌パルプ材をそのピッチ含量を減
    少させるために接種する、請求項１又は２に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 皮を剥がされた又は剥がされていない材
    木又は丸太をそのピッチ含量を減少させるために処理す
    る、請求項１、２又は４の中のいずれか１項に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 接種物を生物学的に純粋な菌カルチャー
    から獲得する、先の請求項の中のいずれか１項に記載の
    方法。
  7. 【請求項７】 接種されたパルプ材又はパルプを接種か
    ら4 〜20日の期間にわたり菌成長条件下で維持する、請
    求項１、３又は４の中のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 菌が、NRRL寄託第21200 号の菌である、
    請求項１〜７の中のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 菌が、NRRL寄託第21253 号の菌である、
    請求項１〜７の中のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 処理時間が接種から少なくとも20日間
    である、請求項２に記載の方法。
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