JPH08500095A - 合成反応カラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は合成工程後に都合よく実行され得る合成反応カラムに向けられている。反応カラムは、接続アダプタを要することなしにシリンジと合成後の試薬容器とに対する容易な接続が可能であるように形状付けられている。１実施例では、反応カラム（17'）が固相の保持体（42）を含む筒状のカラムの形態でありまた一端で伸びる狭い穴の管（18）を有する。管は、合成後の試薬を含む隔膜で密封されたバイアル（60）にアクセスするための突き刺し端として機能する。他の実施例では、反応カラム（17"）が固相の保持体（74）を取り巻く筒状のバレル（70）の形態であり、また、一端にねじが設けられたマウント（80）を有する。ポスト合成工程に関する反応カラムを補足するため、開口に補足的にねじが設けられたマウント（94）を有するバイアル（92）が試薬を収容するために用いられる。このバイアル（92）はアダプタなしにバレル（70）の端部に都合良くねじ込まれる。したがって、合成工程後に都合よく実行され得る。両実施例は、合成工程後と同様、合成工程を実行するための自動装置における試薬分配システムに都合良く接続され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 合成反応カラム 発明の背景 １．発明の分野 本発明は有機合成、特に、固相核酸合成における開裂および脱保護の処理を実 行するための装置および方法に関する。 ２．関連技術の背景 核酸合成（一般には「ＤＮＡ合成」と称されている）は周知である。一般に、 これは、ヌクレオチドの結合すなわちＤＮＡのための塩基性ビルディング・ブロ ック（basic building block）を介して合成単一ストランドのオリゴヌクレオチ ドを形成する方法である。ＤＮＡ合成は、ここに参照により含まれている「ポリ ヌクレオチドを準備するための方法」と題するカルザーらの米国特許第4,458,06 6号に記載されている。ここに記載された方法は、ＤＮＡを合成するいくつかの アプローチの一つ、すなわち固相の保持体上でビルディング・ブロックを結合す るための各合成サイクルにおける非ブロック化（deblocking）／活性化、カップ リング、キャッピング（capping）および酸化の工程を一般に含むいわゆる固相 ホスホアミダイト（phosphoramidite）法を利用して、単一ストランドのオリゴ ヌクレオチドを形成する。さらに、このＤＮＡ合成法の参考文献「オリゴヌクレ オチド合成−実際のアプローチ」M.J.Gait編集，IRLPress,1984があり、これは ここに参照により含まれており、特にその第３章には、トム・アトキンソンおよ びミハエル・スミスにより執筆された「亜リン酸塩−トリエステル法によるオリ ゴデオキシリボヌクレオチドの固相合成」の表題が付けられている。 自動システムでは、システムのコントローラまたはコンピュータ からの指示にしたがって、固相の保持体を含む合成反応カラムに１サイクル中の 予め定められた順序で多数の化学試薬を分配する試薬分配システムにより、種々 の工程が進められる。所望数のサイクルが完了した後、合成されたオリゴヌクレ オチドが反応カラムから分離され、バイアルに集められる。この工程は、一般に 「開裂（cleavage）」と称されている。オリゴヌクレオチドは、さらに、該オリ ゴヌクレオチドの単離を完全にするため、一般に「脱保護（deprotection）」と 称される工程下におかれる。 オリゴヌクレオチドの単離は、開裂および／または脱保護試薬を用いての固体 結合オリゴヌクレオチドの処理を含む。典型的には、この試薬は濃縮されたアン モニア水であるが、適当な塩基、アルコールおよび水の他の同種または異種の溶 液でもよい。前記開裂および脱保護の工程は典型的には２つの段階すなわちステ ップで行なわれる。オリゴヌクレオチドの開裂は、合成オリゴヌクレオチド上の 第２の保護基の分離を生じさせるために持続的な高温度処理のための圧力密封可 能の容器に混合物を注ぐ前、室温で約１時間実行される。この２つのステップの 工程は、最終分離生成物において保持体に関連の汚染の量を減ずる。 濃縮アンモニア水の場合、アンモニア成分は高揮発性であり有毒である。室温 では、アンモニア水の飽和溶液は急速に濃度と力価とを失う。これが、低能率の 開裂および脱保護に導くことがある。こぼれたり移動による損失もまた現在の産 業的工程基準とともに増大する。 従来の合成反応カラムは、次の主として２つの構造またはデザインを有する。 第１のデザインは、カラムの各端部に二重のメス形ルアー（luer）を含む。ルア ー結合部は、常に、合成の間に化学物質で 満たされかつ前記合成における各ステップの後には洗い流されなければならない 過剰の不使用体積を含む。その結果、このデザインは合成ステップおよび洗浄ス テップの双方において、過剰な化学物質を必要とする。合成処理後の間、ユーザ ーはアンモニアを１つのシリンジに回収しこれをカラムに接続することが求めら れる。次に、第２のシリンジが前記カラムの反対側の端部に接続され、開裂を実 行すべく前記アンモニアが一方のシリンジから他方へ推し進められる。開裂の完 了後、ユーザーは再び全てのアンモニアを一方のシリンジに引き寄せ、次いで、 前記アンモニアをバイアルに追い出し、前記バイアルはその後密封され、脱保護 の工程が続く。したがって、前述した工程において非常に巧みな試料の操作が求 められる。 前述した工程に対する変更は、針を合成反応カラムに接続するための雄部−雄 部ルアーの使用を必要とする。 ファルマシア カンパニーにより実用されている第２のタイプのカラムのデザ インは、２つのねじが設けられた管継手の間に載るカセットの形態を有する。こ の形態は、ルアーのマウントのための不要な体積を減らすが、しかし、前記カセ ットから前記オリゴヌクレオチドを開裂させまた脱保護するための複雑で不便な ステップを含む。例えば、他のステップの間で、この工程は、管の中で前記カセ ットを遠心分離することを含む。 発明の概要 本発明は、合成工程後に都合よく実行することができる合成反応カラムに向け られている。この反応カラムは、接続用アダプタを必要とすることなしにシリン ジおよび合成後の試薬容器への容易な接続を可能とする形態を有する。 第１の記載実施例では、前記反応カラムが固相の保持体を含みま た一端で伸びる中空針を有する筒状のカラムの形態を有する。前記針は、突き刺 し端としておよび合成後の試薬を含む隔膜密封バイアルに接続するためのチュー ブとしての機能を有する。このカラムは、シリンジへの取付部である。したかっ て、試薬にアクセスするために前記カラムを接続するために必要されるアダプタ ーは不要である。この実施例は、前記従来のやり方に比べて、合成工程後の便利 な実行を可能にする。 第２の記載実施例では、前記反応カラムが、固相の保持体を取り囲みまた一端 にねじが設けられたマウントを有する筒形のバレルの形態を有する。前記バレル の他端はシリンジに対する取付に適合する。合成工程後のための前記反応カラム を完全にするため、開口に補足的なねじ付きマウントを有するバイアルが試薬を 収容するために用いられる。このバイアルは、アダプターなしに前記バレルの端 部に都合良くねじ込まれる。したがって、合成工程後の実行を都合良くなすこと ができる。 両実施例は、合成工程後と同様、合成工程を実行するための自動合成装置の試 薬分配システムに都合良く接続され得る。 図面の簡単な説明 図１は自動核酸合成装置の単純化した概略図である。 図２は、本発明の１実施例に従う反応カラムの構造を示す断面図てある。 図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、図２の反応カラムを用いる開裂および脱保護 のためのステップを示す。 図４は、本発明の他の実施例に従う反応カラムの構造を示す断面図である。 同５は、図４の反応カラムのフローシステムに対する接続を示 す。 図６は、開裂および脱保護の工程に利用されるバイアルを示す断面図である。 図７Ａおよび図７Ｂは、反応カラムの一端部に螺合ずる試薬バイアルと共同す る、図４の反応カラムの使用を示す。 図示の実施例の説明 次の説明は、本発明を実施する最良の企図モードについてのものである。この 説明は本発明の全体的な原理を示す目的でなされ、制限する意図であると理解さ れるべきではない。本発明の範囲は添付の請求の範囲を参照することにより最良 に決定される。 本発明は核酸合成に関連して述べられているが、本発明は他のタイプの合成、 例えばペプチドおよびたんぱく質合成のために実行することができ、あるいは、 ヌクレオチド化学、例えば蛍光標識付け、合成修飾（modification）後等に関し て固相の保持体を必要とする他のタイプの反応を実行することができることが理 解されよう。 図１は、ＤＮＡを合成するための使用に適する自動化学プロセシング装置の単 純化した概略的配列を示す。これは、本発明の基本概念を示す目的のために単純 化された流体図である。完全な自動装置は、典型的には、もっと多くの試薬容器 と追加的な流れ要素とを含む。ここに参照により既に包含されたカルザー等の米 国特許第4,458,066号の開示に照らして本発明を含む自動ＤＮＡ合成装置を作る 必要な試薬容器および流れ要素を含むことは、当業者の知識の範囲内である。 図１を参照すると、容器１，２，３が、ＤＮＡ合成のための適当な化学試薬、 例えばアセトニトリル、テトラゾール、酸化剤、ホスホアミダイト（phosphoram idite）、キャッピング（capping）活性化 剤、デブロッカ（deblocker）等を含む。管４，５，６が前記試薬に浸された端 部を有し、また、容器１，２，３，からの流体の分配を許しまた止めるバルブ７ ，８，９，に接続されている。バルブ７は通常は閉じられる２ポー卜弁である。 これが動作されるとき、管４から管１３への流動を許す。それが解除されるとき 、それは管４，１３間の流れを妨害する。バルブ８，９は通常閉じられる３ポー ト２路弁である。これらのバルブの一つが動作されると、全てのポートが開かれ 、その結果、任意のポートを経る任意の方向の流れが生じる。前記バルブが解除 されるとき、共同する容器に接続されたポートのみが閉じられる。バルブ７，８ ，９は、コントローラ３０による制御下で動作される電気機械タイプのものであ る。前記バルブが直列に接続されているように示されているが、同様のまたは追 加のバルブ機能を形成するために統合されたバルブを提供することができる。 各容器１，２，３は蓋をされている。管１１ａ−１１ｆがタンク１０からヘリ ウムのような加圧不活性ガスを各容器内の前記試薬のレベルの上方に分配する。 したかって、バルブ（７，８，９）が動作されるとき、前記加圧ガスにより、前 記バルブに接続された容器内の試薬が共同する供給管（４，５，６）に推し進め られ、前記バルブに通される。前記バルブの下流には、所望の合成反応、このケ ースではヌクレオチドの合成を容易にするように設定された固相の支持体または 保持体を含む本発明に従う反応カラム１７がある。さらに、下流には、通過する 流体の流れを監視するための流路１８に沿ってまたはこれに近接して配置された 検出器１９がある。このフローシステム２０の最先端には、前記システムを流れ た使用済みの試薬を集めるために廃物容器２１が設けられ、また／あるいは、 開裂および脱保護のステッブが前記装置により実行される場合の合成オリゴヌク レオチドを集めるために収集装置（図示せず）が設けられる。さもなければ、反 応カラム１７は前記開裂および脱保護のステップの手動での実行のために前記装 置から取り除かれる。反応カラム１７の構造を以下に詳述する。 実際のＤＮＡ合成装置は図１に示すよりより多くの容器およびバルブからなる が、その操作は、本発明を議論する目的のためのこの単純化されたフローシステ ムを参照して十分に説明することができる。 操作上、反応カラム１７で生じるように望まれる特定の化学反応のための所望 の順序において１またはそれ以上のバルブ７，８，９により前記容器内の試薬が 反応カラム１７に分配される。例えば、バルブ７が動作されると容器１から前記 試薬が管４，１３，１４，１５，１６および反応カラム１７を経て流れることが でき、引き続くバルブ１８の動作により容器２から前記試薬が管５，１５，１６ を経て流れ、反応カラム１７に流入することができる。前記試薬の混合物が２ま たはそれ以上のバルブを同時に動作させることにより分配される。バルブ動作の 同期および他のシステムの機能が、プログラムを組むことができるコントローラ ３０により制御される。 図２を参照すると、本発明に従う反応カラムの第１の実施例が示されている。 この反応カラム１７’は、固相の保持体４２を含む筒状のカラム４０を有する。 前記カラムは、核酸合成に使用される試薬に対して化学的に不活性である材料、 例えばポリプロピレンで形成される。カラム４０の他端には中空の金属針４４、 例えば皮下注射針がある。カラム４０の開口４６が、前記装置の管１６（図１） または図２に示すような管１６の端部のアダプタ４８に嵌まり合う ように寸法が設定されている。針４４は管１８（図１）または図２に示すような 管１８の端部のアダプタ５０に嵌まり込むように寸法が設定されている。反応カ ラム４０は、ロード＝アイランドのイースト プロビデンスにあるEFDコーポレ ーションが供給する分配チップ（例えば部品番号5121）から変更可能である。固 相の保持体４２は、核酸合成に適当な材料で製造または処理された微粒子からな るものまたはゲル媒体、例えば、CPGインコーポレーテッドにより製造された、 デリビタイズされ（derivitized）、制御された細孔ガラスである。保持体４２ は、流体の移動を許すフリット（frit）５２，５４または他の仕切り材料によっ てカラム４０内の所定位置に保持されている。適当な仕切りは、２２％の開口面 で、2.54平方cm（１平方インチ）当たり160X160メッシュを有するポリプロピレ ン製の網（カリフォルニア州 ロスアンゼルスのマクマスター−カー サプライ コーポレーションから入手可能の部品番号9275T26）である。反応カラム１７ は、アダプタ４８，５０からカラム１７’を単に抜くことにより前記装置から容 易に取り外すことかできる。 図３Ａ−図３Ｃを参照すると、前記反応カラム内の固相の保持体に結合された 合成オリゴヌクレオチドを開裂および脱保護する手動のステップが示されている 。ステップ１では、反応カラム１７’が前記装置から既に取り除かれ、カラム４ ０の開口に嵌まり込む先端部５８を有する使い捨てのシリンジ５６が準備され、 また、隔膜で密封されたバイアル６０内の濃縮アンモニア溶液のような開裂およ び脱保護の試薬６１が準備される。前記シリンジはアメリカ合衆国 ニュージャ ージー州 ラザフォードのベクトン ディキンソンアンド カンパニーから入手 可能である（部品番号9625）。ステッ ブ２では、カラム４０がシリンジ５６の先端部に嵌め合わされ、金属針４４が隔 膜６２を刺すように強制され、試薬６１が、前記反応カラムを満たしかつオリゴ ヌクレオチドが結合された前記保持体に十分にしみ込ませるに十分な量をバイア ル６０から引き出される。前記試薬は、前記カラムが試薬で完全にしみ込まされ ることを確実にするために固相の保持体中に閉じ込められたエアポケットをばら ばらにすべく前記シリンジの動作により数回前記反応カラムを横切って前後に強 制的に押し込まれる。図３Ｂに示すアセンブリは、開裂工程が１時間で生じる本 質的に密閉ユニットである。ステップ３では、開裂されたオリゴヌクレオチドを 含む試薬６６がカラム４０から前記バイアルへ噴出され、前記突き刺された隔腹 が新たな隔腹６４と取り替えられ、また、前記バイアルが、オリゴヌクレオチド 上の保護基の除去を完全にするために９０分間７０℃に加熱される。脱保護され たオリゴヌクレオチドは、試薬を「濾過（filtering）」または蒸発させること により大部分の前記試薬から取り出される。シリンジ５６および反応カラム１７ ’は廃棄される。 前述した開裂および脱保護のステップは、１つのシリンジ、１つの試薬バイア ルおよび反応カラムを用いて、前記従来の工程における場合の試薬バイアルを反 応カラムに接続するためのアダプターを用いることなしに、都合良く実行するこ とができる。開裂および脱保護のための化学反応および条件は本発明の主題では なく、また、それらは従来の手段で利用されるものに従うことに注意が向けられ る。むしろ、本発明は反応カラムの新しい形状と前記反応カラムを提供する合成 後の試料の巧みな操作のための方法論とに向けられている。 開裂および脱保護の工程の手動アプローチを開示したが、この工程は、合成後 、装置により自動化され得る。適当な開裂および脱保護の試薬が図１に示す流体 分配システムにより前記反応カラムに分配される。開裂および脱保護の工程は、 また、適当な試薬が供給された、供された装置により自動化され得る。 本発明に従う合成反応カラム１７”の他の実施例が図４により示されている。 反応カラム１７”は、固相の保持体７４を取り巻く反応チャンバ７２を規定する 筒状のバレル７０を有する。また、図５を参照すると、バレル７０の一端部が、 管１６の端部または管１６（図１）の端部のアダプタ７８を受け入れるように適 合するキャップ７６を有する。バレル７０は、他端部に、管１８（図１）の端部 の補足的雄ねじが設けられたアダプタ８２を受け入れるように適合された、雌ね じが設けられた伸長部８０を有する。アダプタ８２が代わりに雌ねじを設けられ かつ伸長部８０が雄ねじを設けられ得ることは理解されよう。流体が固相の保持 体７４を横切って前記バレルを通過することができるように、キャップ７６とバ レル７０の伸長部８０とに貫通孔８４，８６が設けられている。固相の保持体７ ４を保持すべく貫通孔８４，８６を横切って網８８，９０が配置されている（プ ラスチック溶接）。固相の保持体７４は、合成のための開始ブロックとしてヌク レオチド（「Ａ」，「Ｃ」，「Ｔ」，「Ｇ」）を固定するためにデリビタイズさ れている（derivitized）。反応チャンバ７２の実際の大きさおよび形状は合成 の規模による。図４に示す反応カラム（ほぼ一定の率で拡大した：バレル７０は 全体に約2.54cm（１インチ）の長さ寸法と、約1.52cm（0.6インチ）の直径とを 有する。）は、オリゴヌクレオチドを２００ｎモルまで合成するのに使用可能で ある。バレル７０およびキャップ７６は、 ポリプロピレンのような不活性のポリマーから成形された別個の部品であり、こ れらの部品は組み立て時に共に圧入または溶接される。反応カラム１７”は、単 にアダプタ７８を抜き取り、ねじを緩めてアダプタ８２からバレル７０を外すこ とにより、図１に示すフローシステムから容易に除去することができることが見 てとれよう。 図６を参照すると、雄ねじが設けられた首部９４を有するバイアル９２が、開 裂／脱保護の試薬９６を収容するために利用される。このバイアルは、雌ねじが 設けられたキャップ９８を有し、該キャップはこれが首部９４に螺合されるとき の密封のためのＯ−リング１００を有する。便宜のため、キャップ９８は、スト リップ１０２と、首部９４の回りに回転可能であるリング１０４とを介して、ね じ付きの首部９４の基部に据えられている。このバイアル９２は米国カリフォル ニア州 ヘイワードのサーステット インコーポレーテッド（特許番号 第72.6 92.100）により供給される。 図７Ａおよび図７Ｂを参照すると、バイアル９２およびねじ付きのカラム１７ ”を使用する開裂および脱保護工程が記載されている。前記フローシステムから の固体結合オリゴヌクレオチドを含む前記反応カラムを除いた後、開裂／脱保護 の試薬９６を含むバイアル９２がバレル７０のねじの端部にねじ込まれる。使い 捨てシリンジ１０６の先端部１０５がキャップ７６に嵌め込まれる。種々の部品 からなる前記アセンブリが図７Ｂに示されている。試薬９６が、前記反応カラム を満たしかつオリゴヌクレオチドが拘束された前記保持体に十分にしみ込むに十 分な量を引き出される。前記試薬は、前記カラムが試薬で完全にしみ込まされて いることを確実にするために前記固相の保持体に閉じ込められたエアポケットを ばらばらに すべく、前記シリンジの動作により数回前記反応カラムを横切って前後に推し出 される。図７Ｂに示す前記アセンブリは、開裂工程が生じる本質的に密封された ユニットである。約１時間後、または、前記固体結合オリゴヌクレオチドの開裂 が完了した後、開裂されたオリゴヌクレオチドを含む前記試薬が前記カラムから 前記バイアルに噴出される。前記バイアルは、前記オリゴヌクレオチドの保護基 の除去を完全にするためにキャップをされ、７０℃で９０分間加熱される。脱保 護されたオリゴヌクレオチドが、濾過または前記試薬の蒸発により、前記試薬の バルクから得られる。シリンジ１０６と反応カラム１７”とは捨て去られる。 先の実施例のケースにおけるように、前述した開裂および脱保護のステップは 、１つのシリンジと反応カラムとを用いて、前記従来技術の工程における場合の 反応カラムに試薬バイアルを接続するためのアダプタの使用を余儀なくされるこ となしに、都合よく実行され得ることが見てとれよう。先の実施例のように、こ のねじ付きの反応カラムは、自動化された一列の開裂および脱保護を実行するた めに使用することができる。 シリンジ１０６と、試薬９６を収容するねじ付きのバイアル９２とは、ユーザ ーの便宜のために開裂および脱保護のキットとしてまとめることができる。 本発明を図示の実施例に関して説明したが、種々の変更および改良が本発明の 範囲および精神から逸脱することなしに成し得ることは当業者に明らかであろう 。したがって、本発明が特別な図示の実施例によってではなく、添付の請求の範 囲の範囲によってのみ制限されることは理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハンナ、エドワード ジー アメリカ合衆国 92686 カリフォルニア 州 ヨーバ リンダ ジーニーン レイン 4611 (72)発明者 マッキニー、カールトン ビー アメリカ合衆国 90041 カリフォルニア 州 ロサンゼルス ダリア ドライヴ 5161 (72)発明者 ランパル、ジャン ビー アメリカ合衆国 92687 カリフォルニア 州 ヨーバ リンダ ビス キャナリアス 20470 (72)発明者 ササキ、グレン シー アメリカ合衆国 92686 カリフォルニア 州 ヨーバ リンダ パーク プレイス 4921 (72)発明者 ワンダリー、スティーヴン ダブリュー アメリカ合衆国 92714 カリフォルニア 州 アーヴィン グリーンキャップ 4972 【要約の続き】 る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 固相の合成保持体を収容するためのチャンバを規定する本体と、合成装置 に連結しまたアダプタを必要とすることなしに合成後に試薬容器に直接に接続す るための、前記本体に取り付けられた連結手段とを含む、合成反応カラム。 ２． 前記連結手段が、密封された容器の隔膜の突き刺しに適する中空針からな る、請求項１に記載のカラム。 ３． 前記チャンバが核酸合成に適する固相の保持体を含む、請求項２に記載の カラム。 ４． 前記連結手段が、補足的にねじが設けられた部分との螺合に適するねじ構 造からなる、請求項１に記載のカラム。 ５． 前記補足的ねじ部分がバイアルの首部である、請求項４に記載のカラム。 ６． 前記チャンバが核酸合成に適する固相の保持体を含む、請求項５に記載の カラム。 ７． ねじが設けられた端部を有する合成反応カラムと共に使用される開裂およ び脱保護のキットであって、先端部を有するシリンジと、ねじが設けられた首部 を有するバイアルとを含み、前記先端部が前記反応カラムの一端に嵌まり込み可 能である寸法に設定され、また、前記ねじが設けられた首部が開裂および脱保護 の工程を行なうための前記反応チャンバのねじが設けられた端部にねじ込み可能 であるように形状付けられている、開裂および脱保護キット。 ８． 前記バイアルが、固体の拘束されたオリゴヌクレオチドの開裂および脱保 護に適する試薬を含む、請求項７に記載のキット。 ９． 合成後の開裂および脱保護のための合成反応カラムおよびバイアルの組み 合わせであって、開裂および脱保護に適する試薬を含 むねじが設けられた首部を有するバイアルと、前記バイアルのねじが設けられた 首部にねじによる接続のためのねじが設けられた端部を有する反応カラムとを含 む、合成反応カラムおよびバイアルの組み合わせ。 １０． 固相の保持体を有する反応カラムを準備すること、前記固相の保持体上 で核酸合成を行なうこと、アダプタを用いることなしに、開裂および脱保護の試 薬を含む容器に前記反応カラムを直接に取り付けること、前記固相の保持体から オリゴヌクレオチドを開裂することを含む、オリゴヌクレオチドを得るための方 法。 １１． 前記反応カラムがねじを設けられた端部を有し、また、前記容器がねじ を設けられた首部を有し、前記カラムおよび前記容器が前記ねじを設けられた端 部および首部で接続される、請求項１０に記載の方法。