JPH08500433A - 汚染された組織からのシガトキシンの迅速な抽出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、組織試料からシガトキシンを迅速に抽出する方法に関する。一つの態様によると、組織試料は試料からシガトキシンを溶解して抽出するために第一の溶媒で抽出する。それから第一の溶媒に溶解されず、第一の溶媒からシガトキシンでない混在物を抽出する第二の溶媒を添加する。第一および第二の溶媒によって形成された相を分離し、第一の溶媒相を回収する。第一の溶媒相から第一の溶媒を蒸発乾固して残留物を産生し、第三の溶媒に再懸濁する。第三の溶媒に溶解されず、シガトキシンでない混在物を抽出する第四の溶媒を、第三の溶媒／残留物混合液に添加する。第三および第四の溶媒によって形成された相を分離し、シガトキシンからなる第三の溶媒相を回収する。二つめの態様によると、試料を結合した抗体−樹脂に添加する。結合した抗体−樹脂からシガトキシンでない未結合物質を取り除くために結合した抗体−樹脂を洗浄し、それからシガトキシンを結合した抗体−樹脂から溶出させる。

Description

【発明の詳細な説明】 汚染された組織からのシガトキシンの迅速な抽出方法発明の分野 本発明は、シガトキシンを含む血清または他の試料から迅速にシガトキシンを 抽出する方法に関する。発明の背景 シガテラ毒は、それが混在する魚類を摂取することが原因の独特のタイプの魚 類中毒である。中毒はガンビアデスカス トキシカス（Ｇａｍｂｉｅｒｄｉｓｃ ｕｓ ｔｏｘｉｃｕｓ）を含む熱帯性の渦鞭毛虫よって生産され、引き続き人間 まで食物連鎖により引き渡される毒素の消費に関与している。シガトキシンはポ リエーテルの海産毒素で、およそ２７の異なるシガトキシンが知られていて、そ のおよそ２３は人間に有害である。シガテラ毒素は無臭、無味、熱安定で、そし て一般的に簡単な化学的なテストでは検出されない。 紅藻又は褐藻を食べる際に渦鞭毛虫を摂取する毒性の草食動物を食べることお よび、毒性の草食動物を食べた肉食動物を食べることにより、ヒトはシガテラ毒 に感染しやすい。シガテラ毒の発病率の正確な査定はできない。しかし毎年、熱 帯あるいは亜熱帯地方に住むまたは訪問する１０，０００から５０，０００人の 人々がシガテラ毒に病んでいると見積もられている。さらに、この汚染の恐れは 影響を受けた地域での漁業資源の娯楽的および商業的開発において、莫大な経済 の損失を引き起こす。 シガテラ毒は世界的な健康問題と考えられている。その病気は、太平洋領域同 様、熱帯カリブおよび亜熱帯北大西洋で流行している。過去において、毒発生は 特定の風土に制限されていたが、魚類の地方への輸送が、世界の非熱帯地方での 発生を引き起こす可能性が見られる。 シガテラ毒の発生は、カナダ、エジプト、スリランカ、イタリア、日本、ベネ ゼラ、フランスポリネシア、フランスアンチルス、およびオーストラリアで報告 されている。アメリカ合衆国では、フロリダ、ルイジアナ、テキサス、カンサス 、ハワイ、サモア、バージン諸島、マサチューセッツ、プエルトリコ、ニューヨ ーク、テネシーおよびワシントンＤＣで例が報告されている。ベルモントにおい ては熱帯領域から輸入した毒性のバラキューダ（ｂａｒｒａｃｕｄａ）を供給し た何件かのレストランから、２、３の例が報告されてた。 シガテラ毒の医学的な症状の兆候は、汚染した魚類の消費の後１０分から２４ 時間の間におきる。シガテラ毒は、消化器官系（腹痛、下痢、嘔吐、吐き気を生 じる）、心血管系（徐脈、低血圧、頻脈という結果になる）、神経系（知覚異常 または皮膚知覚過敏という結果になる）に影響する。 その症状の重度は患者によって異なり、ある発生においては１２％もの高さ、 および他の発生においては１０００例に１の割合の死亡率が報告されている。死 亡は普通は呼吸麻痺が原因である。検死解剖では、時折出血を伴う急性の内蔵充 血が示される。 潜伏期間および症状は、同じ魚を消費した人の間でもかなり多様である。ある 個人は全く症状がないが、他はかなり深刻に影響を受けている。殆どの患者にお いて、最初の兆候は唇および舌の回りの知覚異常または痺れおよび手足の痺れま たは痛みである。ある患者では初期の症状は、下痢および嘔吐である。これらの 腹部の症状は普通は数日で解消する。その神経系の症状は、ある個人では数週間 または数カ月も持続する。 知覚異常の存在は、シガテラ毒を他の非魚貝類毒の型またはマイルドな胃腸炎 症と区別すると考えられている、しかしこの症状はまた麻痺性の貝類毒、神経毒 性の貝類の毒および下痢性の貝類毒にも見られる。シガテラ毒は最近の飲食の経 歴によっても区別され、多分唯一の顕著な症状は温度の知覚が逆になるというこ とである。しかしこの症状は神経毒魚類毒についても実証されている。 一般に神経系の症状はおよそ６週間続くが、数カ月または数年後まで問題を抱 えている患者もいる。この長期的な症状は通常、活力の喪失、関節炎（特にひざ 、足首、肩およびひじ）、筋肉痛、頭痛並びに痒みを含む。特徴としては症状は 疑似日周的に変動する。しばしばストレス、病気または栄養失調の期間に症状が 戻るだろう。 初期の中毒は免疫性を与えない。これに反し、毒素への感受性の報告は共通で ある。別の人には症状が出ない魚類を、以前シガテラ毒に犯されたことのある患 者が食べると典型的なシガテラ毒の症状の再発を経験する。毒素の効果は量に関 係しているらしい。再発または多数回のシガテラ毒の攻撃は、初めて病気を経験 した患者に比べると、臨床学的により重い病気を引き起こす。現在シガテラ毒に 対する既知の治療的処理はない。伝統的な応急の救急法は吐くことを促し、毒素 を取り除く事である。これはしかし初期の症状が現れるまで（通常、毒素を含む 魚類が消化されてから時間がかかる）病気の存在が感知されないので、殆ど助け にならない。 成功した処置はかんちょうおよびくえん酸マグネシウム下剤を使って、消化管 （ＧＩ）を徹底的に浄化し、それから魚類貝類もしくはそれらの副産物、ナッツ 類、アルコール類を含まない厳密なダイエットをすることで実行された。 マーシャル諸島では、２４人の急性シガテラ中毒患者は静脈内マンニトールで 処置され、各患者の状況は劇的に向上した。これらの患者の総ての神経および筋 肉の機能悪化は数分で明らかに減少したが、消化管の症状はよりゆっくりと消滅 した。オーストラリアでは、１２人の患者にマンニトール療法を行ったところ、 同じく顕著な向上が見られた。１．０ｇのマニトール／ｋｇをもちいる推薦する 処置は、急性の中毒者の為になると期待されている。この処置の作用機構は十分 に理解されていない。しかしそれは安価および安全であり、従って、重大な明ら かにシガテラの病気にかかっている患者に処置するために考慮されていた。 現在はシガテラ毒にたいして有用な処置がなく、たとえ有用な処置でも正確な 診断がなされた後にだけ効果的である。シガテラ毒に関与した症状が個人で多様 性がありしばしば他のタイプの中毒による症状と類似するので、化学的および動 物実験のテストが正確な診断に必要であった。 魚類におけるシガテラの同定のためにアメリカ合衆国特許４，８１６，３９２ 号に記載されているような免疫学的方法が開発され、同じような免疫学的方法が シガテラに病んでいる可能性のある患者から採取した血清のテストに適用された 。しかしこのテストする方法は、”プラス−マイナス”の結果を与える点で、質 的であり、正確に毒素の検出濃度を提示出来ないだろう。症状を引き起こすのに 必 要な量が個人で違うので、このような患者の血液中のシガテラ毒の量はかなり低 いと考えられる。従って、患者のシガテラ毒に対する感受性が非常に強い場合、 循環する毒素の量は適用する方法の検出限界下であり、その結果この状況では正 確に診断出来ないだろう。 上記の観点から、かなり低いレベルで存在していても量的に検出出来る方法で 汚染した毒素を検出する必要性がある。患者の血液中のシガテラ毒のレベルを定 量し、中毒の重度を予測出来るアッセイ法が好ましい。さらに、魚類または魚類 が生息する環境が汚染されている程度を定量し、該領域由来の魚類の毒素性を予 測する方法が有用である。現在知られている抽出方法は時間を費やすので、この ようなアッセイ方法はテストされる試料から毒素を迅速で再現性をもって抽出出 来る方法の開発に必要である。発明の概要 本発明はシガテラ毒に病んでいる患者の迅速な診断または組織試料の毒素の迅 速な同定を可能にするために、組織試料からシガトキシンを迅速に抽出する方法 に関する。そのような方法の一つは溶媒中での抽出を利用することであり、他の 方法は免疫親和性の樹脂に毒素を結合させ、それに引き続いてこれから毒素を溶 出させることを適用することである。 溶媒抽出方法は、試料からシガトキシンを溶解および抽出するために、第一の 溶媒に組織試料を混ぜることを含む。第一の溶媒に溶解せず、シガトキシンでは ない混在物を抽出する、第二の溶媒を加える。第一の溶媒と第二の溶媒との間で 形成される相を分離し、第一の溶媒相を回収する。第一の溶媒をその相から蒸発 させ、残留物を得て第三の溶媒に再懸濁させる。第三の溶媒に溶解せず、シガト キシンではない混在物を抽出する第四の溶媒を、第三の溶媒と残留物の混合液に 加える。第三の溶媒と第四の溶媒により形成された相を分離し、シガトキシンか らなる第三の溶媒相を回収する。好ましい態様においては、第一の溶媒はクロロ ホルムからなり、第二の溶媒はメタノールおよび水からなり、第三の溶媒は７０ ％ｖ／ｖメタノールおよび３０％ｖ／ｖアセトニトリルからなり、および第四の 溶媒はヘキサンからなる。 免疫親和性樹脂抽出方法は結合した抗体−樹脂へ試料を加え、結合した抗体− 樹脂からシガトキシンでない未結合の物質を除去するために結合した抗体−樹脂 を溶媒で洗浄し、それから結合した抗体−樹脂からシガトキシンを溶出すること からなる。好ましい態様においては、結合した抗体−樹脂をリン酸塩緩衝生理食 塩水で洗浄し、シガトキシンをメタノールを用いて結合した抗体−樹脂から溶出 する。発明の詳細な説明 本発明は、シガトキシンを定量する方法および汚染された組織から毒素を迅速 に抽出する方法に関する。２つの方法が本明細書中に記述され、一つは有機溶媒 から分配される抽出法を採用し、もうひとつの方法は免疫親和性クロマトグラフ ィーを利用する。シガトキシンの迅速な抽出方法 試料中からシガトキシンを抽出するために、組織あるいは血液は高圧滅菌され ることが好ましい。組織の場合、この工程によって、組織が柔らかくより簡単に 破壊されやすくなり、抽出の過程が促進される。人の血液のような、血液の場合 は試料は他のどんな感染因子を含まないように高圧滅菌される。高圧滅菌された 試料の２ｇのうち各々１ｇにたいし、およそ２ｍｌのクロロホルムもしくは第一 の溶媒並びにおよそ４ｍｌのメタノールが加えられ、その混合物は毒素を抽出す るためにおよそ１分間混合される。抽出過程によって脂質およびその他のクロロ ホルムおよびメタノールに溶解する成分も抽出される。第一の抽出工程の最後に クロロホルムの追加量約２ｍｌを加え、その調合物をおよそ１５秒間混合する。 第二の抽出工程の最後に約２ｍｌの蒸留水を加え、その混合物をおよそ１５秒間 混合する。第三の抽出工程の最後に、クロロホルム相とメタノール／水相（第二 の溶媒相）とを分離するために混合物をおよそ２０００ｒｐｍの遠心力で１０秒 間遠心分離する。 遠心分離により形成された上部のメタノール／水相、中間分子相および下部ク ロロホルム相の各相を分離して集める。試料から他の脂質および脂質に溶解する 成分と一緒にシガトキシンがクロロホルム相から抽出される。窒素の蒸気の下で クロロホルムを蒸発し、その残留物をおよそ１ｍｌのおよそ７０％ｖ／ｖメタノ ールおよびおよそ３０％ｖ／ｖアセトニトリルの混合物（第三の溶媒）に再懸濁 する。この混合物におよそ２ｍｌのヘキサン（第四の溶媒）を加え、溶液をおよ そ１５秒間混合する。メタノール／アセトニトリル相およびヘキサン相を、およ そ２０００ｒｐｍの遠心力で１０分間遠心分離する。シガトキシンはメタノール ／アセトニトリル相のなかに分配され、シガトキシンアッセイで交差反応するよ うな他の成分はヘキサン相のなかに分配される。メタノール／アセトニトリル相 を回収し、窒素の気流の下で蒸発乾固する。残留物をＰＢＳに再懸濁する。次に その残留物／ＰＢＳの混合物をシガトキシンの存在についてアッセイする。 上記に記載された迅速な抽出方法は、終結するまで約２０分かかる。これは以 下に記載するような慣習的な抽出方法によりシガトキシンを抽出するのにかかる 時間よりかなり短時間である。そのうえこの方法で調製されたシガトキシンは、 シガトキシンのアッセイ方法で交差反応する物質を含まない。免疫親和性媒体の調製 免疫親和性媒体の調製の為に、抗体を固形の支持体に結合させる。本発明に使 用されるのに適当な抗体は特定のシガトキシン種もしくはそれらの混合物に特異 的な抗原決定基に反応するモノクローナル抗体、総てのシガトキシンに共通な抗 原決定基に反応するモノクロナール抗体またはシガトキシンに対するポリクロナ ール抗体、あるいは抗−シガトキシン抗体を含む。ここで使用されている”シガ トキシンに対する抗体”および”抗−シガトキシン抗体”はシガトキシンの抗原 決定基に結合する抗体を意味し、モノクロナールもしくはポリクロナール抗体を 含むことができる。このような抗体は当該技術分野において周知である慣習的な 方法により調製される。抗体を調製するのに使用される動物は魚の抽出物に含ま れているシガトキシン（”毒素性魚類抽出物”とも称される）もしくはシガトキ シン類似体により免疫される。この抗体の調製は既に米国特許第４，８１６，３ ９２号に記載された。 抗体はファルマシア社、アプサラ、スエーデン製の商業的に入手可能なセファ ロースのような固体支持体あるいは他の適当な固形支持媒体に結合される。固形 支持媒体もしくは樹脂への抗体の結合の便宜的な方法は、スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテイン Ａによっている。プロテインＡはＩｇＧ分子のＦｃ部分と相互作用して大部分の 哺乳類由来のＩｇＧに結合し、さらにその他のクラスの抗体とも結合する。例え ばプロテインＡのＩｇＧとの作用は免疫グロブリンの抗体結合部位を必要として いないので、プロテインＡに結合した抗体は抗原と結合する能力を保持している 。プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂとしてファルマシア社で販売されてい るように固形支持媒体に結合されたこのようなプロテインＡは商業的に入手可能 である。 抗体親和媒体を調製するために、乾燥したプロテインＡ−セファロースをおよ そ９．０にｐＨ調節した０．２Ｍホウ酸ナトリウムのような緩衝液もしくは他の 適当な緩衝液中で水和させる。水和が完了した後、抗−シガトキシン抗体をプロ テインＡ−セファロースに加える。およそ２ｍｇの抗−シガトキシン抗体を各ｍ ｌの水和されたプロテインＡ−セファロースに対して加え、抗体−樹脂を形成さ せる。抗体−樹脂を室温にておよそ１時間、抗体がプロテインＡに結合するよう に持続的に温和な振動でインキュベートする。インキュベートの最後に、およそ ９．０にｐＨ調節した０．２Ｍホウ酸ナトリウムのような緩衝液で抗体−樹脂を 少なくとも２回洗浄し、未結合のタンパク質を除去する。洗浄過程は便宜上およ そ１０倍容量のおよそ９．０にｐＨ調節した０．２Ｍホウ酸ナトリウムのような 緩衝液に抗体−樹脂を再懸濁し、およそ３０００ｘｇで５分間の遠心分離によっ て樹脂を回収することによって行ってもよい。 このように樹脂に結合した抗体は共有結合による結合ではないので、使用して いる間に樹脂から溶離されていく可能性がある。溶離を避けるため抗体をプロテ インＡと共有結合させるのが望ましい。このような共役結合は、抗体−樹脂をジ メチル−ピメリミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）のよ うな共役試薬とインキュベートすることで達成される。共役結合は、共役試薬を 最終濃度およそ２０ｍＭになるように抗体−樹脂に加えることで成し遂げられる 。反応のｐＨは共役結合を促進するためにおよそ８．３に調節される。溶液をお よそ３０分間室温で恒常の振動でインキュベートし、共役した抗体−樹脂を形成 する。インキュベートの最後に、既に記載された０．２Ｍエタノールアミンのよ う な緩衝液で共役結合した抗体−樹脂を洗浄することで共役反応を終止させる。共 役結合した抗体−樹脂を、１３７ｍＭ ＮａＣｌ，１．６ｍＭ ＫＣｌ，８．１ ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄および１．５ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄（ＰＢＳ）に再懸濁し、使用す るまでおよそ４℃で保存する。もし共役結合した抗体−樹脂が長期的な期間保存 されるのなら、共役結合した抗体−樹脂にバクテリアや菌が生育しないようにお よそ０．０１％メルチオレートのような防腐剤もしくは他の適当な防腐剤を加え ることが望ましい。 プロテインＡ−セファロースへ結合および共役結合した抗体の量を決定するた めに、共役結合した抗体−樹脂の調製の間に、洗浄した抗体−樹脂および洗浄し 共役結合した抗体−樹脂の段階からアリコートが回収される。これらの試料はお よそ等しい容量の６２．５ｍＭ トリスｐＨ６．８，２％ ＳＤＳ，１０％グリ セロール、０．００１％ブロモフェニルブルーおよび０．１Ｍ ２−メルカプト エタノール混合物中、１００℃で５分間インキュベートして変性される。その変 性過程でプロテインＡおよび抗体が変性され、抗体−樹脂試料でプロテインＡは セファロースに結合して残っている状態で、２つのタンパク質がお互いから分離 される。しかし共役結合した試料では、抗体およびプロテインＡは相互に共有的 に結合し、変性後でも相互におよびセファロース樹脂に結合したままである。変 性後、ＷｅｂｅｒおよびＯｓｂｏｒｎ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，４ ４０６（１９６９））により記載されＬａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ，２７７， ６８０（１９７０））により一部修正されているように（両文献は参考文献とし て本明細書中に取り込まれる）、試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 する。ゲルはおよそ１０％ｗ／ｖポリアクリルアミドゲルが好ましい。 電気泳動後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルをクマシーブルーで染色する。抗 体のプロテインＡ−セファロースへの結合が成功したことの観察は、共役反応す る前に回収されたアリコートで、およそ５５，０００の分子量をもつ抗体の重鎖 と共に挙動しているかなりの量で染色された物質によって行う。共役反応が成功 した場合、共役反応後回収されたアリコートではそのようなバンドはほとんども しくは全く観察されなかった。免疫親和性媒体でのシガトキシンの単離 上記で記載されたように調製された結合した抗体−樹脂は使用のためにカラム に詰められることが好ましいが、バッチワイズ分離過程にも使用できる。 結合した抗体−樹脂は１ｃｃ皮下注射器もしくは適当な大きさのカラムに詰め られる。結合した抗体−樹脂はおよそ２０ベット容量（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ） のＰＢＳで洗浄する。 解析される試料を結合した抗体−樹脂に接触させ、その溶出物を回収する。そ の溶出物を再び結合した抗体−樹脂に接触させ、その溶出物も再び回収する。試 料の中にある総てのシガトキシン物質が結合した抗体−樹脂に結合されるように この過程を総計３回もしくはそれ以上繰り返すことができる。シガトキシンが結 合した抗体−樹脂に結合した後、未反応の物質が全ておよそ２０ベット容量のＰ ＢＳで洗浄される。結合したシガトキシンを溶出するために、結合した抗体−樹 脂を１００％メタノールで洗浄する。 結合した抗体−樹脂精製方法は、かなりの量のシガトキシンが結合した抗体− 樹脂に結合することを可能にする。従って、シガトキシンの濃度が低い場合は、 多量の既知量の血清を結合した抗体−樹脂に接触させることができる。シガトキ シンの濃縮物をそれから既知の量の少量のメタノール中に溶出し、シガトキシン について分析することができる。濃度が高い場合は、アッセイ可能なシガトキシ ン試料を得るためにより少量の既知量の血清を結合した抗体−樹脂に接触させる ことができる。このように結合した抗体−樹脂の使用によって、シガトキシンが 血清等の試料中に高い濃度で存在しても、低い濃度で存在してもその検出を行う ことができる。抽出のための慣用されている調製方法 毒性または非毒性の凍結魚類もしくは他の組織からの抽出物を、およそ２５０ ｇの組織を測り分けることによって調製する。この組織を骨抜きを容易にし抽出 物の調製を助け、さらにこの組織試料を滅菌するために、所望によりおよそ１０ 分間高圧滅菌する。この組織をブレンダーで高速、およそ１０分間ホモジナイズ する。ホモジナイズされた組織をアセトンで５０％ｗ／ｖに希釈し、その混合物 をさらに約５分間混ぜ合わせる。相を分離するために混合物をおよそ２０００ｒ ｐｍでおよそ１５分間４℃で遠心分離する。上部のアセトン相をデカントして回 収し、そのアセトン抽出工程を残渣／水溶相に対し３回以上繰り返す。抽出物は −１８℃でおよそ１０から２０時間も保存される。その溶液を冷却ブフナー漏斗 （ｃｏｌｄ Ｂｕｃｈｎｅｒ ｆｕｎｎｅｌ）で濾過し、残留物はすべて捨てる 。アセトンは非揮発性物質から回転蒸発で除去する。 ２容量のメタノールを回転蒸発後残っている非揮発性物質に加え、溶液を混合 する。その混合物はおよそ１／３容量のヘキサンで３回抽出される。ヘキサン相 はメタノールを含む相から分離され捨てられる。メタノールは非揮発性物質から 回転蒸留で除去する。 ほぼ等量のクロロホルムを非揮発性物質に加え、その混合物を撹拌して非揮発 性物質を抽出する。次にクロロホルム相を回収する。このクロロホルム抽出を２ 回以上繰り返し、各クロロホルム抽出物を一緒にし、蒸気バスでクロロホルムを 蒸発させる。クロロホルムの後に残った残留物を粗抽出物として蒸発させる。 粗抽出物は更にシリカゲルＴＬＣプレート上での薄層クロマトグラフィー（Ｔ ＬＣ）またはカラムクロマトグラフィーにより精製される。 薄層クロマトグラフィーのプレートをクロロホルム／メタノール混合物（８： ２の割合）で展開する。粗抽出物の成分を分離するためにＴＬＣプレートを泳動 した後、ＴＬＣプレートのポリエーテル分画を含む部分からＴＬＣ媒体を容器中 に削り取り、ＴＬＣプレートからシガトキシン画分を再生する。回収したＴＬＣ 媒体からクロロホルム／メタノール（９５：５）で精製抽出物を溶出する。該溶 出物を蒸発乾固し、約５％のトウイーン６０（Ｔｗｅｅｎ ６０）に再懸濁する 。 粗抽出物のさらなる精製にカラムクロマトグラフィーを使用する場合、クロマ トグラフィーの媒体として珪酸（ｓｉｌｉｃｉｃ ａｃｉｄ）（Ｍａｌｌｉｃｒ ｏｄｔ社製）が使用される。１００メッシュの珪酸を使用し、かつ使用前に１０ ０℃で１時間活性化させることが好ましい。使用の際、珪酸をおよそ２ｃｍ×５ ｃｍのカラムに充填する。クロマトグラフィー媒体は、カラムのクロマトグラフ ィー媒体の上におよそ１ｃｍの層で無水Ｎａ₂ＳＯ₄を加え、およびクロロホルム でクロマトグラフィー媒体を平衡化させることによって調製する。粗抽出物をク ロロホルムにおよそ４０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、クロマトグラフィー媒体に 接触させる。クロマトグラフィー媒体からトリグリセリド、脂肪酸、コレステロ ー ル、およびその他の非極性の化合物を溶出するために、２０ｍｌのクロロホルム でクロマトグラフィー媒体を洗浄する。シガトキシンおよび他のポリエーテルを 、クロロホルムとメタノールとの混合物（９５：５）で溶出する。該溶出物を蒸 発乾固し、約５％のトウイーン６０（Ｔｗｅｅｎ ６０）に再懸濁する。シガトキシン アッセイ法 アメリカ合衆国特許第４，８１６，３９２に記載しているように、魚類中のシ ガトキシンをアッセイする方法は汚染した魚類の肉からシガトキシンを吸着する ため回収液（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆｌｕｉｄ）でコートされた枝（スティッ ク）が使用された。該枝を挿入し魚類の肉に接触させることで、魚類に存在して いる可能性のあるシガトキシンの試料が回収液に吸着される。回収液に吸着され たシガトキシンは、前もってホースラデッシュ ペルオキシダーゼに結合されて いるシガトキシンにたいする抗体に結合される。 他のアッセイ方法はシガトキシンに対する抗体でコートされた色のついたラテ ックスビーズから成る”免疫ビーズ”を使用する。適当なビーズはＳｅｒａｄｙ ｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｄ．（インデアナポリス、ＩＮ）により製造されているような、直径およそ ０．３からおよそ０．４μｍの青色のラテックスビーズから作られている。しか し他のサイズのラテックスビーズも使用できる。 テスト支持体にシガトキシンを結合させることで魚類を予備選択する。適当な 支持体は竹の枝であり、これは櫂状の支持体または膜支持体を形成するために有 機塩基溶媒回収液（例えば、Ｐｅｎｔｅｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ社（Ｔｏｒｒ ａｎｃｅ，ＣＡ）のＬＩＱＩＤ ＰＡＰＥＲ等）でコート されている。膜支持 体は、”計量棒（ディップスティック）”に付いている膜材料（例えば、Ｍｉｌ ｌｉｐｏｒｅ社（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の”ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＩＭＭＯＢ ＩＬＯＮ−Ｐ ＭＥＮＢＲＡＮＥ ♯ＩＰＶＨ，”）からなる。ポリスチレン製 のストリップが計量棒として使用するのに適当である。膜は”３Ｍ ＭＥＤＩＣ ＡＬ ＧＲＡＤＥ ＡＤＨＥＳＩＶ ＃３０４４”のような粘着性物質または他 の適当な付着物をもちいて計量棒に付けられる。 支持体を魚類の組織もしくは抽出物に接触させた後、免疫ビーズに接触させる 。 もしシガトキシンがその魚類に存在すれば、抗体は支持体上でシガトキシンに結 合する。抗体は着色されたラテックスビーズにも結合しているので、着色された ラッテクスビーズが支持体上でシガトキシンに結合することになる。従って、魚 類組織中のシガトキシンの存在を示す陽性の結果が、支持体に結合された着色さ れたラッテクスビーズによって起きる支持体の色調の変化で観察される。 抗体−ホースラデイッシュ ペルオキシダーゼ アッセイ方法が使用される場合 、陽性の結果は酵素アッセイからの産出蓄積物により観察される。 使用においては、上記で記載されたアッセイ反応は陰性または陽性のコントロ ールと比較される。陰性のコントロールはシガトキシン又はその類似体にさらさ れていないテスト支持体である。陽性のコントロールはシガトキシンに汚染され ている魚類由来の既知の濃度の抽出物またはオカダ酸（ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉ ｄ）のようなシガトキシン類似体にさらされているテスト支持体である。実施例１ 免疫ビーズ アッセイを用いる毒素性の魚類抽出物のアッセイ 膜支持体を種々の濃度の毒性のＰｏ’ｏｕ魚（Ｗｒａｓｓｅ ｆｉｓｈ）由来 の魚類抽出物にさらした。膜支持体の膜の部分を１、５、１０もしくは２５ｍｇ ／ｍｌの魚類抽出物を含んでいる溶液に挿入した。膜支持体は取り出し、およそ ５分間または膜が乾燥されるまで空気乾燥した。 およそ１秒間無水メタノール中に膜を浸して膜支持体を固定した。膜支持体を 再びおよそ５分間空気乾燥した。各膜支持体を各々０．５ｍｌの免疫ビーズ懸濁 液に浸し、免疫ビーズ懸濁液中におよそ５分間放置した。５分後、膜支持体を免 疫ビーズ懸濁液から取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した 。過剰な液体は全てペーパータオルで支持体を吸いとって除去した。 テスト膜支持体の上に現れる色を評価し、その結果を記録した。 色の強さは抽出物の濃度が増加すると増加した。実施例２ 免疫親和性媒体の調製 ６０ｇの乾燥したプロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（Ｕｐ ｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により提供された）に３．０ｍｌの０．２Ｍホウ酸 ナトリウム、ｐＨ９．０を混合し、膨潤させておいた。実施例１に記載したよう に調製された０．４ｍｇの抗−シガトキシンモノクロナール抗体をプロテインＡ −セファロースのウエット ベット容量１ｍｌ当たり加えた。本実施例の場合、 ２ｍｇの抗−シガトキシンモノクロナール抗体を抗体−樹脂を形成するように加 えた。抗体−樹脂を室温で１時間恒常的に穏やかに振動しながらインキュベート した。インキュベートの最後に、０．２Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ９．０の１０ベ ット容量に抗体−樹脂を再懸濁し、３０００ｇで５分間遠心分離して抗体−樹脂 を回収することにより抗体−樹脂を２回洗浄した。洗浄された抗体−樹脂を１０ ベット容量の０．２Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０に再懸濁し、抗体−樹脂の １０μｌアリコートを取り出した。 共役試薬、ジメチル−ピメリジデートを最終濃度が２０ｍＭになるように加え 、ｐＨをおよそ８．３に調節した。その溶液を結合した抗体−樹脂を形成するよ うに、３０分間室温で恒常的な振動でインキュベートした。１０μｌのアリコー トの混合物を取り出した。インキュベート後、既に記載したように、結合した抗 体−樹脂を０．２Ｍエタノールアミンのなかで１回洗浄することにより共役反応 を停止した。結合した抗体−樹脂をＰＢＳに再懸濁した。実施例３ 抗体の樹脂への結合の効率の決定 親和性媒体の調製の間に回収されたアリコートをＳＤＳゲル電気泳動によって 解析した。そのアッセイは、結合していないモノクロナール抗体は簡単に変性さ れ、ゲルのなかで移動する分画として検出されるという事実に基づいている。 １０μｌの６５．５ｍＭ トリス、ｐＨ６．８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロ ール、０．００１％ブロモフェノールブルーおよび０．１Ｍ ２−メルカプト− エタノールをアリコートに加え、該試料を５分間、１００℃でインキュベートし て変性させた。変性した試料の１μｌおよび９μｌをＷｅｂｅｒおよびＯｓｂｏ ｒｎ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４、前記）により記載され、前記にＬａ ｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ，２７７、前記）により修正された方法で調製された １０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。 電気泳動後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルをクマシーブルーで染色した。結 合前に回収されたアリコート中には抗体の重鎖と共に移動するかなりの量の染色 された物質（分子量５５．０００）が検出されたが、結合反応後に回収されたア リコートにはこのようなバンドが検出されなかったことにより、抗体の樹脂への 共役の成功が観察された。実施例４ 免疫親和性カラムを用いたシガトキシンの単離 実施例２で記載されたように調製された結合した抗体−樹脂”を１ｃｃ皮下注 射器のカラム”に詰め、２０ベット容量のＰＢＳで洗浄した。シガトキシンを含 むと考えられる血清を、１００，０００ｘｇの遠心力で３０分間遠心分離し、そ の上清を回収した。その上清を結合した抗体−樹脂に接触させ、溶出物を回収し 、さらに再接触させた。再びその溶出物は回収し、結合した抗体−樹脂に再接触 させた。未結合の物質を全て、結合した抗体−樹脂から２０ベット容量のＰＢＳ で洗い流した。その溶出物を回収した。 次に、結合した抗体−樹脂を１０ベット容量の０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ６ ．８で洗浄した。結合した抗体−樹脂に結合された物質を０．５ベット容量の１ ００ｍＭグリシンｐＨ２．５で溶出した。溶出物を回収し、１／２０ベッド容量 の０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７．７を加えて中性ｐＨにした。 結合した抗体−樹脂から回収された溶出物を実施例１に記載する方法でアッセ イした。その結果はシガトキシンは結合した抗体−樹脂から溶出されないことを 示す。実施例５ 免疫親和性カラムを用いたシガトキシンの単離 結合した抗体−樹脂を順番に２ｍｌ ＰＢＳ；１ｍｌ ０．１Ｍリン酸 ｐＨ ６．８；２ｍｌ １００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５；および２ｍｌ ＰＢＳで溶 出する事を除き、実施例４で記載した手順を繰り返した。各溶出物を分離して回 収した。 抗体−樹脂上にクロマトグラフされなかった試料を加えた溶出物を、実施例１ に記載しているようにシガトキシン含有量について３回テストした。溶出した試 料のどれもが陽性でなかった。この結果はシガトキシンは結合した抗体−樹脂か ら溶出されないことを示す。実施例６ 免疫親和性カラムを用いたシガトキシンの単離 １μｇ／ｍｌのオカダ酸（メタノール１００μｌ中）を窒素気流下で蒸発し、 １ｍｌ血清中に再懸濁し、結合した抗体−樹脂に接触させることを除き、実施例 ４で記載した手順を繰り返した。親和性媒体を、２ｍｌ ＰＢＳ；２ｍｌ ０． １Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ６．８；０．５ｍｌ １００ｍＭグリシン、ｐＨ２． ５で４回；２ｍｌ ＰＢＳ；２ｍｌ ３０％ｖ／ｖメタノール；２ｍｌ ８０％ ｖ／ｖメタノールおよび２ｍｌ １００％メタノールで洗浄した。各試料を別々 に回収し、実施例１に記載するようにシガトキシンについて分析した。 総ての溶出物が陰性であることがわかり、オカダ酸が結合した抗体−樹脂から 溶出されないか、またはアッセイの方法で検出される濃度では溶出されない事を 示した。実施例７ 免疫親和性カラムを用いたシガトキシンの単離 親和性媒体を２ｍｌ ＰＢＳ、１ｍｌ １００ｍｌメタノールおよび１ｍｌ ＰＢＳで溶出することを事を除き、実施例６で記載した手順を繰り返した。溶出 物を別々に回収し、実施例１に記載されたようにアッセイした。メタノール溶出 物はシガトキシンに対し陽性であることがわかり，ＰＢＳ溶出物は陰性であるこ とがわかった。実施例８ 血清試料からのシガトキシンの迅速な抽出 シガトキシン中毒もしくは慢性の疲労症候（シガトキシンに敏感な物質が生産 される）と疑われる患者由来の１０の血清試料をオートクレーブによって高圧滅 菌した。１．５ｇのオートクレーブされた血清にクロロホルム（２ｍｌ）および メタノール（４ｍｌ）を加えて１分間混合し、クロロホルム（２ｍｌ）を加えて １５秒間混合し、さらに蒸留水（２ｍｌ）を加えて１５秒間混合した。この混合 物を２０００回転１０分間遠心分離した。上層のメタノール相、中間の粒子相お よび下のクロロホルム相をそれぞれ別々に回収した。クロロホルムをクロロホル ム相から窒素蒸気下で蒸発させ、試料を１ｍｌのメタノールに再懸濁した。 試料を実施例１に記載した方法でシガトキシンもしくはシガトキシン反応性の 交差反応物質に対しテストした。その結果を表１に示す。 １．結果は、０は反応が見られない事を示し、６は強い反応が見られること を示すように任意の尺度で表現されている。 この結果はシガトキシンまたはシガトキシン交差反応物質がクロロホル ム相の中に抽出されたことを示す。実施例９ 血清試料からのシガトキシンの迅速な抽出方法 クロロホルム相からの残留物を１ｍｌの８０％ｖ／ｖメタノール／水に再懸濁 し、それから２ｍｌのヘキサンと混合することを除き、実施例８の手順を繰り返 した。メタノール相とヘキサン相を分離し、実施例１に記載した方法で各相をシ ガトキシンの分析のためテストした。結果を表２に示す。 １． 結果は、０は反応が見られない事を示し、６は強い反応が見られること を示すように任意の尺度で表現されている。 ヘキサン抽出を行う目的は、クロロホルム相からの残留物から総ての非極性成 分を取り除くことであった。しかし、結果はシガトキシンが予想どうりには区画 して分離していないことを示す。実施例１０ 血清試料からのシガトキシンの迅速な抽出方法 水中の種々の濃度のメタノール（例えば１００％ｖ／ｖ；９９％ｖ／ｖ；９５ ％ｖ／ｖ；９０％ｖ／ｖおよび８０％ｖ／ｖ）を使用する以外は、実施例９の手 順を繰り返した。結果を表３に示す。 この結果はシガトキシン交差反応物質がメタノール／水相およびヘキサン相の 双方に含まれている事を示す。実施例１１ 血清試料からのシガトキシンの迅速な抽出方法 クロロホルム相からの残留物を１ｍｌのメタノール／アセトニトリルもしくは メタノール／水の混合物に再懸濁する以外は、実施例９の手順が繰り返された。 各試料はヘキサンの中に区画し分離された。結果を表４に示す。 １． 結果は、０は反応が見られない事を示し、６は強い反応が見られること を示すように任意の尺度で表現されている。 ２． このテストのバックグランド表示は２と定めた。 この結果は７０％メタノールおよび３０％アセトニトリルが非毒素試料に陰性 の結果および毒素試料に陽性の結果を与え、交差反応物質から離れてシガトキシ ンを区画するのに適していることを示す。 動物の血液からシガトキシンを分離することに関する上述の実施態様の記載は 、説明を目的とする。当業者にとって明らかな変形があり、本発明は上記に記載 された特定の態様に限定されることを意図するものではない。さらに、本明細書 中 に開示された発明は、発明の明細書に具体的に開示されていない要素が存在しな い場合にも実施することが可能である。本発明の範囲は以下の請求にしたがって 限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ｃ０７Ｄ 493/22 9165−4Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組織試料からシガトキシンを溶解して抽出するために組織試料を第一の溶 媒と混合し； 第一の溶媒に溶解せず、第一の溶媒からシガトキシンでない混在物を抽出 する第二の溶媒を添加し； 第一および第二の溶媒によって形成される相を分離し； 第一の溶媒相を回収し； 第一の溶媒相から第一の溶媒を蒸発乾固して残留物を産生し； 第三の溶媒へ残留物を再懸濁し； 第三の溶媒に溶解せず、第三の溶媒からシガトキシンでない混在物を抽出 する第四の溶媒を添加し； 第三および第四の溶媒によって形成される相を分離し；そして 第三の溶媒相を回収する ことからなる、組織からシガトキシンを迅速に抽出するための方法。 ２ 第一の溶媒がクロロホルムからなる請求項１記載の方法。 ３．第二の溶媒がメタノールからなる請求項１記載の方法。 ４．第二の溶媒が更に水を含む請求項１記載の方法。 ５．第三の溶媒がメタノールからなる請求項１記載の方法。 ６．第三の溶媒が更にアセトニトリルを含む請求項１記載の方法。 ７．第三の溶媒が７０％ｖ／ｖメタノールおよび３０％ｖ／ｖアセトニトリル からなる請求項１記載の方法。 ８．第四の溶媒がヘキサンからなる請求項１記載の方法。 ９．組織試料からシガトキシンを溶解して抽出するためにクロロホルムに組織 試料を混合し； メタノール／水を添加し； クロロホルムおよびメタノール／水により形成される相を分離し； クロロホルム相を回収し； クロロホルムを蒸発乾固して残留物を産生し； 残留物をメタノール／アクリロニトリルヘ再懸濁し； ヘキサンを添加し； メタノール／アクリルニトリルおよびヘキサンによって形成される相を分 離し；そして メタノール／アクリルニトリル相を回収する ことからなる、組織からシガトキシンを迅速に抽出するための方法。 １０．メタノールが７０％ｖ／ｖの濃度で存在しアセトニトリルが３０％の濃度 で存在する請求項９記載の方法。 １１．結合した抗体−樹脂へ試料を接触させ； 結合した抗体−樹脂からシガトキシンでない未結合の物質を除去するため に溶媒で結合した抗体−樹脂を洗浄し；そして 結合した抗体−樹脂からシガトキシンを溶出させる ことからなる、組織からシガトキシンを迅速に抽出するための方法。 １２．結合した抗体−樹脂が、プロテインＡからなるクロマトグラフィー媒体に 共役的に結合したシガトキシンに対する抗体からなる請求項１１記載の方法。 １３．結合した抗体−樹脂をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する、請求項１１記載 の方法。 １４．シガトキシンを結合した抗体−樹脂からメタノールで溶出する請求項１１ 記載の方法。 １５．結合した抗体−樹脂へ試料を添加し； 結合した抗体−樹脂をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し；そして 結合した抗体−樹脂からメタノールでシガトキシンを溶出させる、 ことからなる、組織からシガトキシンを迅速に抽出するための方法。