JPH08500437A - 哺乳動物の血液の検体の抗原に対するアレルギー誘発応答を決定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗原、典型的には食物抗原に対する哺乳動物の血液の検体のアレルギー誘発応答を決定するために一方法が提供されている。本法には、インキュベートされた抗原不含の対照と比較して検体中の１つ以上の顆粒球集団の脱顆粒の量を決定するために、抗原とインキュベートした後血液検体を精査することが含まれる。典型的には、好中球集団が精査される。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳動物の血液の検体の抗原に対する アレルギー誘発応答を決定する方法 本発明は、抗原、特に食物抗原に対する咄乳動物の血液の検体のアレルギー誘 発応答を決定する方法に関する。本発明は、また、患者における抗原に対するア レルギー誘発応答を決定するためのin vitroにおける診断の方法も含む。 ある患者は特定の食物に対してアレルギーである。この特定の食物は、患者に よって異なる。そして、食物アレルゲンに対するアレルギー誘発応答の機序は完 全には理解されていないが、食物に対するアレルギー誘発反応は、ある患者にお いて、少くとも一部は、片頭痛、喘息、湿疹ならびに関節炎のような広範な症状 の原因となっていると考えられている。 食物過敏症が関与している可能性がある特殊な疾患は、肥満である。ある患者 においては、肥満は、体液が保持される結果である。ある患者においては、ある 食物に対するアレルギー誘発応答は、彼等の毛細血管の透過性の増加を起し、毛 細血管が漏洩性となり、血管中の水分が、毛細血管に隣接した組織に逸出する。 その結果、該患者は、喉が乾き、埋合せのために常人よりも多くの水を飲むと考 えられる。しかし、さらに消費された液体も結局は毛細血管から逸出し、患者は 「液体保持性」となり、体重が増加する。 ある患者において、一度特定の食物に対するアレルギー誘発応答が診断された ならば、効果的な治療法は、患者の献立からその食物を除くことである。しかし 、典型的な日常の献立は、多数の異なる種類の食物を含んでいるので、特定の患 者において、アレルギー応答をひき起す食物、したがって避けなければならない 食物を決定することは、相当に難かしいことになる。 その上、医学の専門家および公共的に同様な人々のなかでは、上に述べた症状 とアレルギー性過敏症の間の原因的関連の認識に対しては、一般的な偏見がある 。 その結果、これまで食物の過敏症についての試験は、主流である一般的医学手 順からはずれたものに限られ、科学的根據が首尾よく説明されていない技術を含 んでいた。 食物の過敏症に対する試験は、慣習的に、患者を小量の食物抗原をになってい る無菌の針先で突き刺すことからなる「皮膚の突き刺し」試験によって行われた 。食物抗原に対する患者の応答は、目視によってモニターされ、過敏症が顕現さ れるか否かが決定される。患者は、異なる皮膚の部位において、複数の突き刺し にかけることによって、５つ以上の抗原に対して同時に過敏症の試験にかけるこ とができるけれども、「突き剌し」試験は時間がかかり、一人の患者に対する数 十の食物を試験するのに何週間もかかることがある。突き剌し試験は、また、目 視によるモニターリングが必要であるという不利をこうむる。したがって、そし て／または、一過性の反応は見逃されることがある。 アレルギー誘発反応を示す患者に対して、検体を抗原でチャレンジするならば 、患者からの血液の検体中の白血球の総数は減少することが観察された。 ＵＳ−Ａ−４，６１４，７２２には、懸念されたアレルゲンと血液検体の間の 反応の程度を決定するための方法と装置が開示されている。該方法は、懸念され たアレルゲンとの反応の前後における検体中に存在する白血球の総数を比較する ことからなる。 １患者における１つ以上の食物に対するアレルギー誘発応答から生ずると思わ れる種々の症状は、患者の血流への顆粒球の１つ以上の集団、典型的には、好中 球からの顆粒の放出によって生ずることが考えられる。特にある種の食物アレル ゲンは、患者の血液中の顆粒球と相互作用し、顆粒球の一部を破裂させ、血流中 へ顆粒を放出すると考えられる。本技術分野に熟達した人々によって、原形質中 の顆粒球の顆粒によって、正常の場合に放出される化学物質は、患者の血流に直 接放出されるならは、炎症や、もしくは組織に対する破壊をひき起し、順次、食 物に対する過敏症によって起ると考えられる医学的状態に関連した症状へと導か れることが認識されるであろう。 したがって、本発明の１面によれば、抗原に対する哺乳動物の血液の検体のア レルギー誘発応答を決定する方法が提供される。該方法は、以下からなる：すな わち、 ａ）血液検体中において、白血球に対してチャレンジを行うために、血液検体 に対して抗原を添加する； ｂ）血液検体／抗原の混合物をインキュベートする； ｃ）その後、インキュベートした抗原を加えない対照血液検体と比較して、上 記血液検体中の１つ以上の顆粒球の脱顆粒の量を決定するために、該混合物を精 査する；そして、 ｄ）複数の他の血液の検体を試験することによって導かれた統計的平均脱顆粒 と脱顆粒の量を比較し、そうすることによって、該平均脱顆粒と比較して脱顆粒 の量が有意であるかどうかを決定する。 本発明はまた、患者におけるアレルギーを診断するin vitroの方法も含み、該 方法は、患者から血液検体を採取し、本発明にしたがった方法を利用して、抗原 に対する検体のアレルギー誘発応答を決定することからなる。 本発明の別の面においては、咄乳動物の血液検体の抗体に対するアレルギー誘 発応答を決定するための装置も提供されている。 該装置は、血液検体に対して抗原を加える手段； 抗原の存在しない対照血液検体と比較した血液検体中の１つ以上の顆粒球の集 団の脱顆粒の量を決定するために、検体／抗原の混合物を精査するための手段； 及び、 複数の他の血液検体から導かれた統計的平均脱顆粒と該脱顆粒を比較し、そう することによって、該顆粒の量が、該平均脱顆粒の量に較べて有意であるか否か を決定する手段からなる。 典型的には、検体／抗体混合物は、脱顆粒の量を、好中球の集団において決定 すべく精査されることがある。 ある態様においては、脱顆粒の量は、検体中の顆粒球から血漿中に漏洩した顆 粒の数を直接測定することによって決定されることもある。もしくは、脱顆粒の 量は、検体中の顆粒の喪失を測定することによって、間接的に決定することがあ る。 ある態様においては、脱顆粒の量は、ヘマトロジーアナライザーを使用して決 定することができる。ヘマトロジーアナライザーは、無線周波数の交流と直流の 組合せを使用して血液検体の白血球の集団を精査することができる。典型的には 、 Messrs. 東亜、日本から商品名、ＳＹＳＭＥＸ ＮＥ８０００の下に市販されて いる型のヘマトロジーアナライザーを使用することができる。このヘマトロジー アナライザーの原理と操作法は、東亜から入手できる付属マニュアル、参照コー ドＮＥ−８０００／１１．８８（改訂、０８．８９，１２．８９）中に分り易く 記述されている；とりわけ、第４節、「操作の原理」を参照のこと。 血液の検体は、複数の部分に分けることができる。最初の部分は、白血球を除 き、その中のすべての細胞を溶解させるため溶解剤で処理することができる。２ 番目の部分は、好塩基球を除くすべての細胞を溶解させるために、溶解剤で処理 することができる。そして３番目の部分は、好酸球を除くすべての細胞を溶解す るために、溶解剤で処理することができる。各部分を電解質希釈剤中に懸濁させ 、トランスデューサーチェンバーを２つの領域に分ける仕切りがついたトランス デューサー室中に配置された。仕切りは、２つの領域の間に、そこを通って広が っている小さい開口部をもつことができる。各領域には電極が用意してある。開 口部の大きさは、血液の検体中の白血球と同程度の大きさにすることができる； 電解質の希釈剤は、該白血球とは有意に異なる電気伝導度をもつように選択され ることができる。 各部分における白血球細胞は、開口部を通って、トランスデューサーチェンバ ーの１つの領域から他の領域に吸引されることができる。実質的に一定の電流を 電極から電極へ加えることができる。白血球細胞が開口部を通過するときに、電 極の間の電圧は、一過性に検出できる量だけ変化することができる。該電圧を、 細胞の吸引中に連続的にモニターすることができ、開口部を通過している細胞数 を計測することができる。 ２番目と３番目の部分の場合においては、適用された電流は一定の直流であっ てよい；開口部を通過する各細胞の全容積は該電圧の一過性の変化に比例すると 考えられる。このようにして、２番目と３番目の部分における好塩基球と好酸球 の数は、それぞれ計数できると考えられる。 最初の部分における白血球を吸引する際に、一定の直流と一定の無線周波数の 交流を電極間に適用することができる；前の如く、ｄ．ｃ．シグナルにおける一 過性の変化は、白血球細胞が開口部を通過するとき白血球細胞の全容量に比例す ると考えられる。細胞の全核と細胞質の顆粒の容量は、それが、開口部を通過す るとき、ｒ．ｆ．シグナルにおける一過性の変化に比例していると考えられる。 したがって、開口部を通過する各白血球の位置が（ｉ）全細胞容量軸（ｄ．ｃ． パルス）と（ii）核と顆粒の容量軸（ｒ．ｆ．パルス）に対してプロットされる 最初の部分の吸引から分散グラムを生ずる。無傷のリンパ球、顆粒球、単球が、 それらの全体の容量の核／顆粒容積に対する比が異なる結果として分散グラムの 異なる領域に出現することは、本技術分野に熟達した人々によって評価されるで あろう。したがって、経験に基いて分散グラム中の「リンパ球」、「顆粒球」、 および「単球」の領域を、計算された「弁別」線を適用することによって描くこ とができる。各領域を代表する全細胞数を次に計数することができる。 血液検体中の明らかな好中球の集団は、最初の部分における計算された明らか な顆粒球集団から、２番目と３番目の部分における好塩基球と好酸球の計数を差 し引くことによって計算できる。 本発明にしたがって、脱顆粒された顆粒球が、ｄ．ｃ．とｒ．ｆ．分析の下で は、上に記述したように、「単球」または「リンパ球」として現れるということ が評価されるであろう。したがって、本発明の１つの面においては、血液検体中 の１つ以上の顆粒球の集団における脱顆粒は、単球、またはリンパ球の数の明ら かな増加、そして典型的には好中球である顆粒球の数の明らかな減少として検出 できると考えられる。 分散グラムにおいては、これは、リンパ球集団の「顆粒球」の領域からの単球 の領域への明らかなシフトとして現れると考えられる。 抗原を含まない対照検体を精査することができ、抗原でチャレンジされた血液 検体中の脱顆粒の量を対照と比較した単球／リンパ球および顆粒球の集団におけ る明らかな増加、または減少を、それぞれ計算することによって決定することが できる。 典型的には、複数の血液検体を調製し、各血液検体を異なる抗原でチャレンジ することができる。 本発明の特別な面では、該抗原は食物抗原であってよい。 ある態様においては、完全な、バランスのとれた献立を構成する十分な食物を 含む複数の食物抗原が選択されてよい。 食物抗原は、血液検体に対して懸濁物として提供される。懸濁媒体は、グリセ ロールまたはベンゾイル溶媒である。１つの態様においては、Messrs. Dome／Ho llister-Stierから得た食品の抗原が使用されることがある。抗原の懸濁液は、 因襲的な「皮膚突き剌し」試験において典型的に使用される型である。 食物抗原／グリセロール懸濁物はさらに希釈されることがある。希釈剤は、典 型的には、食塩水ＢＰである食塩水を用いることがある。 食物抗原懸濁物には、小量のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれているこ とがある；約０．０１％から０．０５％のＨＳＡが使用されることがあるが、典 型的には０．０３％である。 Messrs. Hollister-Stierから得られた食物抗原が使用される場合では、グリ セロール懸濁物が、約１：９の比率で食塩水ＢＰで希釈されることがあるが、本 発明は、Hollister-Stier食物抗原の食塩水に対する希釈比の、１：５から１： １５の範囲を含むことが理解されるであろう。 グリセロール中の希釈食物抗原が、非希釈の血液検体に加えられることがある 。食物抗原に対する血液の適切な比が重要であると考えられる。血液の使用量が 少なすぎると、分折は特異性がなくなることがある。ある態様においては、Mess rs. Hollister-Stierから得られた食物抗原は、９部の食塩水ＢＰで希釈され、 ０．０３％のＨＳＡを含み、非希釈の血液と５０：５０の比で混合する。この食 物抗原の希釈グリセロール懸濁物を使用するとき、血液に対する抗原の比は、４ ０：６０から６０：４０が成功すると考えられる。 血液検体へ食物抗原の導入の後、混合物をインキュベートする。首尾よい結果 を得るためには、インキュベーションの期間が重要であると考えられる。混合物 があまりにも長くインキュベートされると、食物抗原に対する顆粒球の反応は非 特異的になる。混合物は、３０分から９０分の範囲で、典型的には６０分間イン キュベートすることができる。 与えられた食物抗原についての血液検体のそれぞれ明らかな単球／リンパ球の 集団の増加と、顆粒球集団の減少が、複数血液検体から得られたそれぞれの平均 増加と減少と比較されることができる。得られた平均値を背景として比較して、 それぞれ有意な増加と減少は、懸念された抗原に対する過敏症を示唆すると考え られる。それぞれ、単球／リンパ球集団の平均の上昇および顆粒球集団の減少は 、食物抗原から食物抗原へと変動することがあるが、典型的には、例えば好中球 の集団における約５％から１０％の減少は、過敏症を示唆すると考えられる。 一度び特定の食物抗原に対する過敏症が、与えられた血液検体について決定さ れたならば、患者の治療は、彼または彼女の献立からその食物を除くように忠告 することによって行うことができる。 さもなければ、本発明の１つの面にしたがって、患者は、彼または彼女の食事 を、明らかにアレルギー誘発反応を引き起さない食物に限ることができる。試験 されていない食物は、献立に１つずつ、ある期間にわたって再導入し、患者の経 時的反応に注意する。 本発明は、１つ以上の食物抗原に対してのアレルギー誘発反応について、血液 の検体を試験する方法を提供する。本法は、ヘマトロジーアナライザーと結果を 解析するためのマイクロプロセッサーを使用して、実質的に自動化することがで きる。多数の抗原を、比較的短い期間に旧来の技術において知られている「皮膚 −突き刺し」試験と比較して、短期間に試験することができる。本発明は、食物 抗原によるチャレンジに応答した白血球集団における比較的小さい変化を測定す る方法を提供し、また、該変化を複数の試験に基いた平均応答と比較する手段を 提供する。したがって、本発明は、特定の抗原に対する与えられた血液検体のア レルギー誘発応答を決定するためのより正確な、そしてより感度の高い方法を提 供することができる。 以下は、例をあげるということのみのために、そして、本発明を効果的に行う 方法の添付した図を参照とした記載である。図の簡単な説明 図１は、抗原が存在しない対照血液検体の分散グラムである。 図２は、図１の血液検体のヒストグラムである。 図３は、図１の検体と同じ供血者からの食物抗原でチャレンジした後の血液検 体の分散グラムである。 図４は、図３における分散グラムに相当するヒストグラムである。 図５は、その異なる検体が、異なる食物抗原でチャレンジされた図１と３と同 じ供血者からの異なる血液の検体の分散グラムである。 図６は、図５の分散グラムに相当するヒストグラムである。 旧来法の「皮膚−突き刺し」食物過敏症の試験に使用するのに適当な種類の食 物抗原は、Messrs. Dome／Hollisterから得られた。各食物抗原は、グリセロー ル懸濁物として供給され、その後、９部の食塩水ＢＰと０．０３％のヒトアルブ ミン（ＨＳＡ）で希釈した。食物抗原は以下の通りである：− 血液の検体を患者から採取し、１００の部分に分けた。それぞれの部分を食物 抗原混合物の１つと１部の血液対１部の抗原混合物の比で混合した。１部の血液 を、１部のグリセロール、９部の食塩水ＢＰを０．０３％ＨＳＡを含む抗原不在 の混合物と混合して対照とした。 次に血液／食物抗原と対照検体を室温で約１時間インキュベートした。 対照と血液食物抗原混合物をMessrs. 東亜、日本から得られたＳＹＳＭＥＸＮ Ｅ８０００の商品名のヘマトロジーアナライザーを使用して分析した。 ヘマトロジーアナライザーは、血液検体を複数の部分にわけ、最初の部分を、 白血球細胞を除く、部分中の実質的にすべての細胞を溶解させるために溶解剤で 処理し、２番目の部分は、好塩基球を除く実質上すべての細胞を溶解させるため に溶解剤で処理し、３番目の部分を好酸球を除く実質的にすべての細胞を溶解さ せるために溶解剤で処理する。次に各部分を、白血球細胞とは電導度が有意に異 なる電解質希釈剤中に懸濁させ、トランスデューサーチェンバーの最初の領域中 に配置される。細胞は、次にチェンバー中の仕切り中に作られた小さな開口部を 通って、チェンバーの第２の領域に吸引され、そして、実質的に一定な電流が、 トランスデューサーチェンバーの最初と２番目の領域にそれぞれ配置された最初 と２番目の電極の間に適用される。開口部は、該部分における白血球細胞と同程 度の大きさの直径をもっている。したがって、血球細胞が開口部を通過するとき 、チェンバー中の電極の間の電気的通路の抵抗が有意に増加する。その結果、電 極間の電圧の低下は検出できる量だけ一過性に増加する。 ２番目と３番目の部分を吸引するときに、実質的に一定の直流（ｄ．ｃ．）が 電極間に適用され、血球細胞が開口部を通過するときのｄ．ｃ．電圧の一過性の 変化は、全細胞の容量に比例している。最初の部分を吸引するときには、実質上 一定な直流と実質的に一定の無線周波数の交流（ｒ．ｆ．）が適用される。白血 球か開口部を通過するときのｒ．ｆ．電圧の一過性の変化は、全核および原形質 性顆粒と白血球の密度に比例している。 最初の部分において吸引された白血球の位置が添付されている図のうち、図１ 、３と５において示されている型の分散グラム上に最初のｄ．ｃ．パルス（全細 胞容量）軸と第２のｒ．ｆ．パルス（全核および顆粒容量）軸に対してプロット される。無傷の顆粒球、単球およびリンパ球は、それらの異なる全容量および核 ／顆粒の組成が異なる結果として分散グラムの異なる領域に表れる。そのため、 分散グラムは、計算された「弁別」線を分散グラムに対して用いることによって 、「顆粒球」、「単球」および「リンパ球」の領域に分けることができ、各領域 においてプロットされた全細胞数を次に計算することができる。図１を参照して 、顆粒球は、一般的に１０と印された領域に現れ、単球はボックス１２に示され る。 血液検体の明らかな好中球集団は、最初の部分において計数された明らかな全 顆粒球の集団から、２番目と３番目の部分を吸入するときに計数された好塩基球 と好酸球の数を差し引くことによって計算できる。束亜から得たヘマトロジーア ナライザーも、各細胞集団中において計数されたか／計算された白血球細胞の相 対的な数を示すヒストグラム（例えば、これまでの図のうち図２、４と６を参照 のこと）を生ずる。 食物抗原が存在しない対照検体をヘマトロジーアナライザーに供給し、対照に おけるそれぞれの白血球集団の相対的濃度は、下記の表に示してある。 対照血液検体についての相当する分散グラムとヒストグラムは、それぞれ図１ と２に示してある。 各血液／食物抗原の混合物を、順次ヘマトロジーアナライザーにかけ、食物抗 原のうちの２つに対する結果が、それぞれ図３と４および図５と６に相当する表 ２と３に示されている。 表１と図１と２を、それぞれ表２と図３と４とを比較するとき、それぞれの白 血球集団の相対濃度において、明らかな変化は殆んどないことが分る。しかし、 表３と図５と６においても、好中球の集団の明らかな減少と単球の集団における 明らかな増加が検出できる。 理諭によって規定されているわけではないが、単球の数の明らかな増加と、好 中球数の明らかな減少、および同時に起る白血球細胞の分散グラムの顆粒球領域 から単球領域（ボックス１２）への明らかなシフトは、好中球を含む顆粒球の脱 顆粒によって生ずる。その結果、破裂した顆粒球は、最初の部分を吸引するとき 、顆粒を含まない単球、またはリンパ球として分散グラムに現れる。血清中に放 出される顆粒それ自体は、in vivoで体内に輸送され、例えば、偏頭痛やリュー マチのようなアレルギー症状をひき起す。他方、表２および図３と図４の結果は 、明らかな反応がないことを示し、該患者は、その特定の食物抗原に対して有意 に過敏でないことが示唆される。 血液中の種々の白血球集団は、自然に経時的に変化するということが認識され るであろう。したがって、血液／食物抗原混合物と対照混合物は、ヘマトロジー アナライザーを使用して、可能な限り同時に近い状態で精査することが重要であ る。その上、食物抗原と使用された懸濁媒体の濃度に依存して、顆粒球／単球集 団における小さな変化が、いずれの食物抗原についても検出されることがある。 したがって、どの変化が特定の食物抗原に対して陽性反応を示すかを決定するこ とが重要である。したがって、ある患者について得られた結果を、異なる患者か ら採取した複数の血液検体から導かれた特定の食物抗原についての平均白血球集 団の変化と比較する。各食物抗原について、平均値と比較して、白血球集団の１ つにおける著しい変化があれば、食物抗原に対する過敏症を示唆する可能性があ る。したがって、例えば、与えられた食物抗原に応答した患者についての好中球 集団におけるその抗原についての平均値と比較しての統計的に有意な減少は、同 じ抗原に対する過敏症を示唆するものと考えられる。 上に概略を述べた方法を使用して、与えられた食物抗原に対する過敏症が示唆 される場合には、患者は勇気づけられて、明らかに反応なしが示唆されている食 物のみを含む献立を使用することになる。試験に含まれていない食物は、患者の 食事に１つずつある期間にわたって民すことができる。 例えば、ＳＹＳＭＥＸ ＮＥ８０００商標下に手に入るヘマトロジーアナライ ザーを使用して、患者は、４５分プラス約１時間のインキュベーション時間で９ ９の食物物質に対する過敏症について試験することができる。したがって、本発 明の方法は、例えば「皮膚突き刺し」試験のような従来の技術において知られて いる方法と比較して複数の食物抗原に対する血液検体のアレルギー誘発応答を試 験するためのかなりより早い方法を提供する。 本発明のある態様においては、ヘマトロジーアナライザーからのデータのアウ トプットの分析手順をさらに自動化するためにコンピューターによって処理でき るということは、本技術分野に熟達した人によって評価されるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年７月１９日 【補正内容】３４条補正明細書 フランス特許明細書No.２４６７４０１には、脱顆粒剤の作用を受けた血液好 塩基性顆粒球の差別計数のための過程が開示されている。その過程には、Alcian Blueで染色した後、フローサイトメトリーの方法にしたがって作業するためのサ イトグラフの使用が含まれる。本発明は、血漿と赤血球の溶解物から血液中の白 血球の集団を分離することを特徴とする。 本過程は、血液の好塩基集団が小さく、明細から明らかなように、各試験には 多量の血液を必要とするという不利をこうむっている。その上、血液の他の成分 から白血球集団を分離することの必要性は、少くとも一部には、やはり偶然的な 結果の不確かさに寄与している試験にとってかなり厄介である。 したがって、血液検体から白血球を分離しないで、また染色の使用に頼らない で脱顆粒を明確に示す試験が必要である。 本出願者は、食物不耐性原に関する限り、血液検体の好中球集団の変化の測定 からよりよい結果か得られることが見出された。 本発明の１つの面においては、白血球細胞が好中球であり、抗原が血液検体に 加えられることを特徴とする懸念された抗原との反応の前後に、血液検体中に存 在する白血球細胞の数、および／または大きさの分布を比較することにより、哺 乳動物の血液の検体の抗原に対する不耐性誘発応答を決定する方法が提供されて いる。検体／抗原混合物をインキュベートし、結果を抗原不含の対照検体と比較 することによって明らかな好中球集団を決定するために精査する。その場合、明 らかな好中球の集団の大きさにおける対照と較べて有意な変化は抗原に対する不 耐性誘発応答を示唆する。 本発明の別の面からは、ある患者に対して不耐性原を含まない食事を決定する 方法が提供されている。その方法は、患者の血液の検体を複数の部分に分け、そ の複数の食物試料がバランスのとれた食事を構成する複数の食物試料を調製し、 血液の部分に各食物試料の測定した量を加え、材料／部分の混合物をインキュべ ートし、明らかな好中球集団を決定するために、各混合物をヘマトロジーアナラ イザーで分折し、そして、食物不含の対照の明らかな好中球の集団と比較する。 この際、混合物と対照の間の明らかな好中球の差は、その特定の食物試料が、そ の患者に対して不耐性誘発反応を有することを示唆する。 本発明のさらなる一面において、本発明は、ある患者において、アレルギーを 診断するin vitroの方法を含んでいる。本方法は、その患者から血液の検体を採 取し、本発明にしたがった方法を利用して、抗原に対する検体のアレルギー誘発 応答を決定することからなる。 本発明の別の面においては、抗原に対する哺乳動物の血液のアレルギー誘発反 応を決定するための装置が提供されており、その装置は、以下の手段からなる： すなわち、 血液検体に対して抗原を加える手段； 抗原不含の対照血液検体と比較して、血液検体中の脱顆粒の量を決定するため に、血液検体／抗原混合物を精査する手段、そして、 脱顆粒の量を、複数の他の血液検体から導かれた統計的平均脱顆粒と比較し、 脱顆粒の量が、該平均脱顆粒と比較して有意であるか否かを決定する手段。 もっと具体的な面において、抗原に対する哺乳動物の血液の検体の不耐性誘発 応答を決定するための装置が提供されていて、その装置は以下を含む。すなわち 、 血液検体に対して抗原を加え、混合するための混合手段 該検体を細別するための手段 該検体の該細別からの血液細胞群を選択的に溶解するための手段 該検体の各々の細分において溶解しない明らかな集団を決定するための精査手 段、および検体中の明らかな溶解しない細胞集団を抗原不含の対照と比較するた めの手段、 検体中の明らかな細胞集団を、抗原不含対照物のそれと共に計算するための計 算手段、その場合、検体と対照の間の好中球細胞集団における有意差は、抗原に 対する不耐性誘発応答を示唆する。 脱顆粒の量は、ある態様においては、検体中の好中球から血漿中に漏洩した顆 粒の数を直接測定することによって決定することができる。さもなければ、脱顆 粒の量は、検体中の好中球顆粒の喪失を測定することによって間接的に決定する ことができる。 ある態様においては、脱顆粒の量は、ヘマトロジーアナライザーを使用して決 定することができる。ヘマトロジーアナライザーは、無線周波数交流と直流の組 み合せを使用して、血液の検体の白血球集団を精査することができる。典型的に は、Messrs. 東亜、日本から商品名ＳＹＳＭＥＸ ＮＥ８０００の下に市販され ている型のヘマトロジーアナライザーを使用することができる。このヘマトロジ ーアナライザーの原理と操作法は、東亜から参照番号ＮＥ−８０００／１１．８ ８の下に入手できるその添付マニュアル（改訂、０８．８９，１２．８９）にわ かりやすく記述されている。特に、第４節「操作の原理」を参照のこと。３４条補正クレーム 請求の範囲 １．白血球細胞が好中球であり、該抗原が血液検体に加えられることを特徴と する懸念されている抗原との反応の前後の血液検体中に存在する白血球細胞の数 、そして／または、大きさの分布を比較することによる哺乳動物の血液の検体の 抗原に対する不耐性誘発応答を決定する方法であって、検体／抗原混合物をイン キュベートし、明らかな好中球集団を決定するために精査し、そして、次に、そ の結果を、抗原を含まない対照検体と比較し、その際、対照に較べて、明らかな 好中球集団の大きさにおける有意な変化は、該抗原に対する不耐性誘発応答を示 唆する上記方法。 ２．患者の血液の検体を、複数の部分に分け、複数の食物の試料が、バランス のとれた食事を構成する複数の食物の試料を調製し、測定した量の各食物の試料 を血液の部分に加え、試料／検体の部分をインキュベートし、明らかな好中球集 団を決定するために、ヘマトロジーアナライザーで分析し、そして、食物を含ま ない対照の好中球の明らかな集団と比較することを含む患者についての不耐性原 性のない食事を決定する方法であって、比較の際、混合物と対照の間の明らかな 好中球集団における差は、該特定の食物試料が、その患者に対する不耐性誘発反 応を生じたことを示唆する上記方法。 ３．明らかな好中球の集団の決定が、以下によって行なわれることを特徴とす る請求項１または２に記載の方法、すなわち、 インキュベートした各試料／検体の部分の混合物を多数の小試料に分ける、 白血球を除くすべての細胞を溶解させるために、最初の小試料をある溶解剤で 処理する、 好酸球を除くすべての細胞を溶解させるために、２番目の小試料をある溶解剤 で処理する、 好塩基球を除くすべての細胞を溶解するために、３番目の小試料をある溶解剤 て処理する、 その際、明らかな好中球集団を決定するために、明らかな細胞集団を決定する ために、各小試料を精査する。 ４．明らかな好中球集団の精査に、ヘマトロジーアナライザーが使用される検 体の分折を含むことを特徴とするすべての先行請求項に記載の方法。 ５．ヘマトロジーアナライザーが、Messrs. 東亜、日本から入手できるSismex ＮＥ８０００であることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．不耐性原が全血液検体に添加されるすべての先行請求項に記載の方法。 ７．混合物が、無線周波数交流電流と直流電流の組み合せを使用して精査され るすべての先行請求項に記載の方法。 ８．各血液検体が、検体の白血球と有意に異なる電気伝導度を有する電解質の 希釈剤中に懸濁されることがある請求項５から７のいずれか１つに記載の方法。 ９．各検体が、小さい開口部を有する仕切りによってへだてられた少くとも２ つの領域をもつトランスデューサーチェンバー中に配置され、該開口部の大きさ は、該細胞がその開口部を通って１つの領域から他の領域へと通過することがで きるように、白血球細胞の大きさに近いことを特徴とする請求項８に記載の方法 。 10．電極が各領域に用意され、該電極間に事実上一定の電流が適用され、該電 極間の電圧をモニターする手段が提供され、検体の１つのチェンバーから他のチ ェンバーへの吸引は、各細胞が、該開口部を通過するときに、電圧の変化を生じ 、その経時的変化の数は、検体の明らかな細胞集団を示唆している請求項９に記 載の方法。 11．懸濁状態にある血液検体に対して不耐性原が提出されることを特徴とする すべての先行請求項に記載の方法。 12．懸濁媒体がグリセロール、またはベンゾイル溶剤であることを特徴とする 請求項１１に記載の方法。 13．不耐性原の懸濁物が、さらに希釈剤及び／又はヒト血清アルブミンの比率 を、重量に基いて０．０１％から０．０５％含むことを特徴とする請求項１２に 記載の方法。 14．希釈剤が、食塩水ＢＰであり、そして重量に基いて１：５から１：１５の 量比で使用されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。 15．不耐性原の懸濁物の非希釈血液検体に対する比率が４０：６０から６０： ４０の範囲にあるすべての先行請求項に記載の方法。 16．インキュベーション期間か環境温度において３０分から９０分であるすべ ての先行請求項に記載の方法。 17．哺乳動物の血液検定の抗原に対する不耐性誘発応答を決定するための装置 であって、 以下を含む装置： 不耐性原を血液検体に加え、混合するための混合手段、 該検体を細分する手段、 該検体の該細分からの血液細胞の群を選択的に溶解するための溶解手段、 該検体の各細分部分における溶解されない細胞の明らかな集団を決定するため の精査手段、 検体中の好中球の明らかな細胞集団を計算するための計算手段、そして、 検体中の好中球の明らかな細胞集団を不耐性原不含のそれと比較するための比 較手段、その際、検体と対照の間の細胞集団における有意差は、すべて、不耐性 原による不耐性誘発反応を示唆する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，Ｊ Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ， ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 プライス，トマス ガードナー イギリス国アールエイチ３ ７エイチエイ チ サーレー，ベッチワース，ウエル ホ ール レーン，キーパーズ コッティッジ （番地なし) (72)発明者 ストエイクス，イアン イギリス国ジーユー５ ９キューエイチ サーレー，シアー，フック レーン，シア ー コート ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の工程を含む哺乳動物の血液の検体の抗原に対するアレルギー誘発応 答を決定する方法、すなわち ａ）血液検体において、白血球細胞をチャレンジするために、血液細胞に抗原 を加える； ｂ）血液検体／抗原の混合物をインキュベートする； ｃ）その後、抗原が存在しないインキュベートした対照血液検体と比較した血 液検体中の１つ以上の顆粒球集団の脱顆粒の量を決定するために該混合物を精査 する、そして、 ｄ）脱顆粒の量を、複数の他の血液検体の試験から導かれた統計的平均脱顆粒 と比較し、そうすることにより、脱顆粒の量が、該平均脱顆粒と比較して有意で あるかどうかを決定する。 ２．血液検体／抗原混合物が検体の好中球集団の脱顆粒の量を決定するために 精査される請求項１に記載の方法。 ３．脱顆粒の量が、検体中の顆粒球から血漿中に漏洩された顆粒の数を直接測 定することによって決定される請求項１または２に記載の方法。 ４．脱顆粒の量が、検体中の顆粒球中の顆粒の喪失を測定することによって間 接的に決定される請求項１または２に記載の方法。 ５．無線周波数交流電流と直流電流の組み合せを使用して血液検体の白血球を 精査するヘマトロジーアナライザーを使用して脱顆粒の量が決定されるすべての 先行請求項に記載の方法。 ６．Messrs. 東亜、日本のＳＹＳＭＥＸ ＮＥ８０００の商標の下に市販され ている型のヘマトロジーアナライザーが使用される請求項５に記載の方法。 ７．脱顆粒の量が、対照と比較して、血液検体の単球／リンパ球および顆粒球 の集団におけるそれぞれ明らかな増加または減少を計算することによって決定さ れるすべての先行請求項に記載の方法。 ８．複数の血液検体の各々が異なる抗原で試験されるすべての先行請求項に記 載の方法。 ９．該抗原が食物抗原であるすべての先行請求項に記載の方法。 10．複数の食物抗原が、完全かつバランスのとれた食事を構成するのに十分な 食物を含むように選択されるすべての先行請求項に記載の方法。 11．患者において、アレルギーを診断するin vitroの方法であって、患者から 血液の検体を採取し、すべての先行請求項に記載の方法を利用して、検体の抗原 に対するアレルギー誘発応答を決定する方法を含む上記方法。 12．哺乳動物の血液の検体の抗原に対するアレルギー誘発応答を決定するため の装置であって、以下の手段を含む装置： 血液検体に対する抗原を加えるための手段、 抗原を含まない対照血液試料と比較して、血液検体中の１つ以上の顆粒球集団の 脱顆粒の量を決定するために、血液検体／抗原混合物を精査する手段、そして 該平均脱顆粒と比較して、脱顆粒の量が有意であるかどうかを決定するために、 脱顆粒の量を、複数の他の血液検体を試験することから導かれる統計的平均脱顆 粒と比較する手段。