JPH08501060A

JPH08501060A - ヘルペスウィルス感染症の治療

Info

Publication number: JPH08501060A
Application number: JP5518785A
Authority: JP
Inventors: トゥイスト，マイケル; ダヴリュ．バーネット，リチャード; − スミス，マーティンサムナー; エス．レイド，ロールネ
Original assignee: アレリックスバイオファーマスーティカルスインコーポレーテッド
Priority date: 1992-04-23
Filing date: 1993-04-21
Publication date: 1996-02-06
Also published as: EP0637247B1; EP0637247A1; ATE169822T1; CA2134119A1; AU4037793A; WO1993021941A1; DE69320469D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗ヘルペスウィルス活性を有するオリゴペプチド化合物に関する。本化合物は式Ｒ１−（Ａ）ｙ−［Ｘ］−（Ｂ）ｚ−Ｒ２［式中Ｘは実質的にＤ−型塩基性アミノ酸からなり、正味の正荷電を有する、Ｒ１はＮ末端保護基であり、Ｒ２はＣ末端保護基でありＡ、Ｂは抗ヘルペス活性を保持できる１つ以上のアミノ酸を表す。］で表され、インビトロ、インビボで抗ヘルペスウイルス活性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】ヘルペスウイルス感染症の治療発明の分野本発明は抗ウイルス化合物に関する。より詳細には、本発明は、ヘルペスウイルスの感染の治療のためぺプチドをベースとした抗ウイルス剤を使用することに関する。発明の背景ヘルペスウイルスは、ライフサイクル、宿主範囲、ポリペプチド組成、ゲノム構造などの多くの基準により分類されるヒトの病原体の１科をなす。ヘルペスウイルス科は、以下の３つの亜科に分けられる。α−ヘルペス科は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（その１型は口唇ヘルペスを引き起こし、２型は性器ヘルペスを起こす）、シュードラビスウイルス(pseudorabies virus)、ウマ流産ウイルス及び感染性ウシリノトラケイティス(bovine rhinotracheitis)ウイルスを包含する。β−ヘルペスウイルス科は、ヒト及びネズミのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を包含する。γ−ヘルペスウイルス亜科は、感染性単核症の原因となるＥＢウイルス(Epstein-Barr virus)（ＥＢＶ）を包含する。更にヘルペスウイルス科には、水痘の原因となる帯状ヘルペスウイルス(Varicella Zoster virus)（ＶＺＶ）及び最近発見されたヒトのウイルスＨＨＶ−６とＨＨＶ−７が含まれる。最近のヘルペス治療の総説には、「抗ウイルス薬：薬力学、副作用及び治療的使用」(M.C.Nahata,J.Pharm.Technol.,1987,3:100)がある。最近の抗ヘルペス剤には、アシクロビル、及び構造的に関連しているヌクレオシドアナログがある。米国特許第４，８４５，１９５号においてＣｏｌｏｎｎｏ等はペンタペプチドの Val-Val-Asn-Asp-Leu及び種々のアナログの抗ヘルペス活性について記載している（米国特許第４，８３７，３０４号も参照のこと）。ヘルペスウイルスの治療は顕著に進歩しているが、効果的で安全なヘルペス感染症の治療薬の必要性は依然として存在する。本発明の全体的な目的は、哺啼乳類において有用なヘルペス感染症の治療法を提供することである。更に特定すると本発明の目的は単純ヘルペスウイルス(herpes simplex virus) （ＨＳＶ）感染の治療に有用な方法を提供することである。本発明の別の目的はヘルペスウイルスの感染症の治療に有用な医薬組成物を提供することである。本発明のもう一つの目的は、ヘルペスウイルスの複製を阻害するのに有用な化合物を提供することである。発明の概要性質として実質的に塩基性である、即ち実質的に正の正味荷電を有するオリゴペプチドはヘルペスウイルスの複製の阻害剤として特に効果的であることが見いだされた。更にこのようなペプチドの抗へルペス活性は、その構成アミノ酸が血清中でより安定なＤ型アミノ酸であっても活性がそれほど低下しないことが見いだされた。本発明の第１の発明は、ヘルペスウイルスの複製を阻害できる以下の式で表される化合物及びその医薬的に許容される塩を提供するものである。Ｒ１−（Ａ）ｙ−［Ｘ」−（Ｂ）ｚ−Ｒ２［式中、Ｒ１はＨあるいはＮ末端保護基であり；Ｒ２はＯＨあるいはＣ末端保護基である；Ｘはｎ個のアミノ酸からなり、ｎ、ｎ−１、ｎ−２から選択される正味の正荷電を有するポリペプチド、ここでｎは６−１２の整数である；ｙは０または１であり；ｚは０または１である；Ａ及びＢは独立に全体として抗ヘルペス性を保つように選択された１またはそれ以上のアミノ酸残基を表す］本発明の態様の１つによれば、上の式におけるＸは、少なくとも１つのＤ−アミノ酸、より好ましくは基本的に複数のＤ−アミノ酸からなるものである。本発明の好ましい化合物は、９個のＤ−アルギニン残基からなりＮ末端、Ｃ末端の両端に保護基を有するものである。本発明の第２の発明は、本発明の抗ヘルペス化合物の有効量と生理的に許容される担体とからなる医薬組成物を提供するものである。本発明の態様として、医薬組成物は局所または全身投与に適した形で提供される。本発明の第３の発明は、ヘルペスウイルスに感染した患者の治療方法を提供するものである。この治療法は患者に本発明の抗ヘルペス化合物の有効量を投与することからなる。本発明の実施態様において、抗ヘルペス化合物はヒトのヘルペスウイルス感染を治療するため、あるいは獣医学的目的、特に家畜を治療するために投与される。本発明は以下、図面を参照しながらより詳細に説明される。図面の簡単な説明図１及び図２は代表的な化合物の組織分布を示すものである。図１は静脈(i.v .）投与後、図２は皮下(s.c.)投与後のものである。図３はin vivoにおける代表的な一化合物の抗ヘルペス効果を示すものである。発明の詳細な説明と好ましい実施態様本発明は、ヘルペスウイルス感染を治療するのに用いる、抗ヘルペス活性を有するオリゴヌクレオチドをベースとした化合物を提供する。オリゴヌクレオチドという用語はポリペプチドという用語と同義に用いられ、６個から約１００個またはそれ以上のα−アミノ酸残基がアミド結合で連結された化合物を指す。上述したように、ヘルペスウイルスという用語はヘルペスウイルス科の種々のウイルスを包含するものであって、ここでは特に断らないかぎりひとまとめにＨＳＶ− ＩやＨＳＶ−２のような型をすべて含めた単純ヘルペスウイルス属、帯状ヘルペスウイルス、及びＥＢ−ウイルスを指す。「抗ヘルペス」という用語はその化合物がヘルペスウイルス科の少なくとも１種のウイルス複製を阻害できる能力を指す。この複製阻害は当業界で通常用いられ完成度の高いプラーク減少アッセイなどの細胞培養アッセイで決定される。例えば、プラーク減少アッセイでは、ある化合物の抗ヘルペス性はウイルス感染後にその化合物で処理した細胞のプラーク数の減少度を、ウイルス感染のみで薬剤処理しない対照と比較することによって示される。本発明の１つにおいて、下記式の抗ヘルペス性オリゴヌクレオチドベースの化合物の１群が提供される。Ｒ１−（Ａ）ｙ−［Ｘ」−（Ｂ）ｚ−Ｒ２［式中、Ｒ１はＨあるいはＮ末端保護基であり；Ｒ２はＯＨあるいはＣ末端保護基である；Ｘはｎ個のアミノ酸からなり、ｎ、ｎ−１、ｎ−２から選択される正味の正荷電を有するポリペプチド、ここでｎは６−１２の整数である；ｙは０または１であり；ｚは０または１である；Ａ及びＢはそれぞれ１から３０またはそれ以上の独立に選択されたアミノ酸を表し、これらのアミノ酸は化合物の抗へルペス性を保つように選択される。実施態様の１つは、式（Ｉａ）で表される本発明の化合物の一群に属する。Ｒ１−［Ｘ］−Ｒ２（Ｉａ）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｘは上に述べたとおりである。好ましいのは、式（Ｉａ）の化合物でＲ１とＲ２の少なくとも１つが保護基であるものである。特に好ましい化合物群は式（Ｉｂ）で表されるものである。Ｎｐ−［Ｘ］−Ｃｐ（Ｉｂ）式中Ｘは上に定義した通りであり、ＮｐはＮ末端の保護基を表し、ＣｐはＣ末端の保護基を表す。Ｎ末端保護基という用語は窒素原子に付加され、オリゴペプチドのアミノ末端を望ましくない生化学的な攻撃から保護するのに役立つラジカルを指す。Ｃ末端保護基とは末端カルボキシ基の酸素または炭素原子を介してオリゴペプチドのＣ末端に付加され、オリゴペプチドのカルボキシ末端を望ましくない生化学的な攻撃から保護するのに役立つラジカルを指す。本発明の化合物は上記式Ｉ、Ｉａ、ＩｂにおいてＸとして表されたコアオリゴペプチドを含んでいる。オリゴペプチドＸは、例えばアミド結合でつながった６から１２個のアミノ酸からなる。Ｘは７個から１１個のアミノ酸からなることが望ましく、好ましくは８個から１０個のアミノ酸からなる。オリゴペプチドＸの構成アミノ酸はオリゴペプチドに正の正味荷電を与えるように選択されるが、この正荷電はオリゴペプチドＸに組み込まれたアミノ酸の数をｎとした場合に、ｎ、ｎ−１、ｎ−２のいずれかから選択される。言い換えると、Ｘは全部が正荷電のアミノ酸から構成される（正味の正荷電がｎである場合）、あるいはほとんど全部が正荷電のアミノ酸からなる（この場合正荷電がｎ−１またはｎ−２の場合）オリゴペプチドである。正味荷電という用語は全体としてのオリゴペプチドＸ上の荷電を指し、オリゴペプチドＸ中に存在する正荷電のアミノ酸の数を足し合わせ、その合計からオリゴペプチド中に存在する正に荷電していないアミノ酸の数を差し引いて簡単に算出したものである。例えばただ一つのアミノ酸を除いて正に荷電したアミノ酸からなるオリゴペプチドＸは、その一つのアミノ酸が中性荷電を有する場合正味の正荷電がｎ−１となり、そのアミノ酸が負荷電を有する場合、正味荷電はｎ−２となる。正荷電を有するアミノ酸中に中性荷電を有するアミノ酸が２個存在する場合もｎ−２という荷電になる。正味の正荷電を計算する際の正荷電を有するとは、アミノ酸が、中性ｐＨ水溶液中でカチオン性である側鎖、β炭素鎖であってもよいが通常はα炭素側鎖、を有することを指す。負荷電を有するとは、アミノ酸が、中性ｐＨ水溶液中でアニオン性である側鎖、β炭素鎖であってもよいが通常はα炭素側鎖、を有することを指す。中性荷電を有するとは、アミノ酸が、中性ｐＨ水溶液中で荷電のない側鎖（例えぱアラニン）または正／負荷電両方を示す側鎖（たとえばグルタミン）を有することを指す。好ましい化合物はオリゴペプチド上の正味の正荷電がｎまたはｎ−１であるものである。ここでアミノ酸という用語とα−アミノ酸という用語は互換性を持って用いられており、天然及び合成のＤ−またはＬ型のアミノ酸を指す。特に断らない限り、アミノ酸は天然にあるＬ−アミノ酸である。特に断らない限りここに含まれるのは、（１）中性荷電を有するアミノ酸；グリシン、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン、プロリンの様な脂肪族α−側鎖を有するアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンのような芳香族α側鎖を有するアミノ酸、（２）負荷電を有するアミノ酸：アスパラギン酸のような酸性α側鎖を有するアミノ酸、セリン、ホモセリン、ヒドロキシノルバリン、ヒドヒドロキシプロリン、スレオニンのようなヒドロキシ基を含む側鎖を有するアミノ酸、システイン、メチオニンのようなＳを含むα−側鎖を有するアミノ酸、グルタミン、アスパラギンのようなアミド基を含む側鎖を有するアミノ酸、（３）正荷電を有するアミノ酸：リシン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチンなどの塩基性α−側鎖を有するアミノ酸（ここでは塩基性アミノ酸ということもある）本発明の好ましいアスペクトでは、Ｘは少なくとも１つのＤ−型のアミノ酸を含む。オリゴペプチドＸは、例えぱ交互に並ぶＬ−型とＤ−型のアミノ酸から構成される。もっともこのましいのはほとんどがＤ−型アミノ酸からなるオリゴペプチドである。本発明の特定の態様においては、上記式Ｉ、Ｉａ、ＩｂにおけるオリゴペプチドＸは下記ｉ）およびｉｉ）群から選択される配列を有する。ｉ）６から１１の塩基性アミノ酸と、塩基性以外のアミノ酸１個から構成されるオリゴペプチドであって、各塩基性アミノ酸は独立にアルギニン、リシン、ヒスチジンおよびオルニチンからなる群から選択され、非塩基性アミノ酸はグルタミン、セリン、ヒスチジン、アスパラギン及びホモグルタミンからなる群から選択されるもの。特に好適なオリゴペプチドは塩基性アミノ酸がアルギニンとリシンからなる群から独立に選択され、非塩基性アミノ酸がグルタミンである。ｉｉ）ほとんどが７−１２個の塩基性アミノ酸から構成されるオリゴペプチドであって、各塩基性アミノ酸はアルギニン及びリシンから独立に選択されるもの。本発明の特定の態様では、Ｘは以下からなる群から選択されるオリゴペプチドを表す。ｉ）下記順序に並んだアミノ酸からなるオリゴペプチド：Ａｒｇ−Ｙ２−Ｙ３−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｙ４−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡｒｇここでＹ２、Ｙ３、Ｙ４はそれぞれ塩基性アミノ酸であり、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４の少なくとも１つはアルギニンである。ｉｉ）６−１１個のアルギニンと１個のグルタミンとからなるオリゴペプチド。ｉｉｉ）７−１２個のアルギニンからなるオリゴペプチドホモポリマー。本発明の好ましい態様では、上記式Ｉ、Ｉａ、ＩｂにおけるＸは好ましくはほとんどがＤ−型アミノ酸からなるオリゴペプチドを表し、下記から選択されるアミノ酸配列を有する。本発明の特に好ましい化合物は、式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂのオリゴペプチドであって、式中のＸが、８個、９個または１０個のＤ−アルギニンがアミド結合でつながったＤ−アルギニンホモポリマーであるか、少なくとも１個のＤ−Ｇｌｎ残基と７、８、あるいは９個のＤ−Ａｒｇ残基とからなるものである。現在のところ最も好ましい化合物は上記式Ｉ、Ｉａ、ＩｂのＸがほとんどＤ−アミノ酸からなり下記から選択される配列を有するものである。すでに述べたように、本発明の化合物は、以下の式（Ｉｂ）であるものが望ましい。Ｎｐ−［Ｘ］−Ｃｐ（Ｉｂ）［式中、Ｘは上で定義したオリゴペプチドであり、ＮｐはＮ末端保護基であり、Ｃｐはカルボキシ末端保護基である。ペプチドの末端を望ましくない化学的攻撃から保護できる基であるならば何でも用いることができる。ペプチド合成において従来業界で用いられているカルボキシ末端保護基及びＮ末端保護基が本発明の化合物に組み込むのに最も望ましいものてある。有用なＮ末端保護基としては、例えば、式Ｒ−Ｃ（Ｏ）−で表される低級アルカノイル基（Ｒは直鎖あるいは分岐の炭素数１−５の低級アルキル）がある。好ましいＮ末端保護基は、アセチル、ＣＨ₃Ｃ（Ｏ）−である。アミノ官能基を欠いたアミノ酸アナログもＮ末端保護基として有用である。好ましいＣ末端保護基も同様にペプチド合成業界で従来から用いられるものである。カルボキシ末端保護の方法としては、カルボキシ基の炭素原子を介して、たとえばケトンやアミドを形成する、またはカルボキシ基の酸素原子を介してエステルを形成して保護基を組み込んでもよい。従って有用なカルボキシ末端保護基としては、例えばエステルを形成するアルキル基、中でもメチル、エチル、プロピルのような低級アルキル基や、アミドを形成する１級アミン（−ＮＨ２）、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノなどのモノアルキルアミノ及びジアルキルアミノ等のアミノ官能基がある。Ｃ末端保護はＣ末端アミノ酸としてアグマチンのような脱カルボキシ化したアミノ酸アナログを組み込んでもよい。いうまでもなく必要があれば、もっと複雑な構造のＮ−及びＣ末端保護基を組み込んでもよい。本発明で特に好ましい式（Ｉｂ）の化合物は、アセチル−［Ｄ−（Ａｒｇ）₉ ］−ＮＨ₂；アセチル−（Ｄ−Ａｒｇ）₃−（Ｄ−Ｇｌｎ）−（Ｄ−Ａｒｇ）₅− ＮＨ₂；及びアセチル−［Ｄ−（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）］−ＮＨ₂である。オリゴペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端のどちらかに別のアミノ酸を結合させても、後述のアッセイで測定されるオリゴペプチドの抗へルペス活性は必ずしも損なわれるものでないことは認識されよう。従って、本発明は更にここに述べたオリゴペプチドを組み込んで以下の一般式をなす抗ヘルペスポリペプチドをも包含する。Ｒ１−（Ａ）ｙ−［Ｘ］−（Ｂ）ｚ−Ｒ２（Ｉ）［式中、ｙ及びｚのうち少なくとも１つは１であり、Ａ及びＢは独立に１つまたはそれ以上のアミド結合したアミノ酸であり、Ｒ１、Ｒ２及びＸは上に定義したとおりである。望ましくは、Ｒ１はＮ末端保護基Ｎｐを表わし、Ｒ２はカルボキシ末端保護基Ｃｐを表す。ここでＮｐ及びＣｐはすでに定義した通りである。］特に意図される式（Ｉ）の化合物は、オリゴペプチドＸがＣ末端及び／またはＮ末端において他のオリゴペプチドユニットに隣接している抗ヘルペス化合物である。オリゴペプチドＸの繰り返し単位はアミド結合で直接連結されてもよく、１から１０個のアミノ酸からなるペプチドリンカーを介してもよい。本発明の化合物は、標準的な確立されたペプチド固相合成法（ＳＰＰＳ）を用いて容易に製造することができる。ペプチド固相合成法の一般的な説明は、例えば、J.M Stewert & J.D.Young著「固相ぺプチド合成」第２版（１９８４）(Pier ce Chemical Company,Rockford, Illinois)、M.Bodansky & A.Bodansky著「ペプチド合成の実際」（１９８４）(Springer-Verlag,New York)、ApｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａユーザーマニュアル（１９８７）(ABI Inc., F oster City, California)にある。一般に、適当に保護されたアミノ酸をそのカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を介して誘導休化した不溶性のポリマー支持体（架橋ポリスチレンまたはポリアミド樹脂）に結合させる。「適当に保護された」とはアミノ酸のαアミノ基（α−ＮＨ₂₎ 及び側鎖の官能基（もしあれば）に保護基がついていることをさす。合成は、ついでα−ＮＨ₂保護基を除去し、活性アミノ酸を自由になったα−ＮＨ₂に一個連結することにより、段階的循環的に進行する。次に来るアミノ酸の−ＣＯＯＨ基の活性化は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）の様なカルボジイミドとする、あるいは対称の酸無水物を形成する、またはヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ペンタフルオロフェニル、パラ−ニトロフェニルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような「活性エステル」を形成することによって直接行うことができる。適当な側鎖保護基とは、通常合成中に使用される試薬、溶媒、実験条件のすべてに対して安定であり、しかも最終的ペプチド標品を損なわない条件下で取り除くことができるものである。好ましいペプチド固相合成の２つの方法はＢＯＣ法とＦＭＯＣ法である。これらはそれぞれがアミノ酸のα−ＮＨ₂基を保護するためにtert−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を用いるところからそう呼ばれる。より確立されているＢＯＣ法においては、酸に感受性のＢＯＣ基が利用されてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてこれを除去する。好ましいアミノ酸側鎖保護基（その例は後出の表１参照）は弱酸（例えばＴＦＡ）中では比較的安定である。大部分はフッ化水素酸（ＨＦＡ）あるいはトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）の様な非常に強い酸により開裂する。２、３の側鎖保護基、例えばＨｉｓ（Ｄｎｐ）やＭｅｔ（Ｏ）などは別個の脱保護工程、たとえば前者にはチオフェノールまたはアンモノリシス、後者にはメルカプトピリジンまたはメルカプトエタノール処理が必要となることがある。合成後、ぺプチドは通常樹脂から切り離されると同時にＨＦ処理により低温（ｅ．ｇ．０℃）で脱保護される。より最近開発されたＦＭＯＣ法は塩基に感受性のＦＭＯＣ基をピペリジンのような穏和な有機性塩基を用いて除去するので、ＴＦＡの様な穏和な酸に感受性の側鎖保護基も用いることができる（表２参照）。ＨＭＰ（パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン）樹脂のような酸感受性エーテル樹脂を固相支持体として用い、ＴＦＡ中での同時の開裂／脱保護を可能にする。適切に保護され及び／または活性化済みのＤ−及びＬ−アミノ酸、誘導休化され及び／または充填済みの樹脂、ＢＯＣまたはＦＭＯＣペプチド合成に必要な補助的試薬全部がいくつかの業者から市販されている。更に最適化されプログラム化されたＢＯＣ及び／またはＦＭＯＣ合成サイクルを登載した全自動ペプチドシンセサイザーが数多く市販されている。Ｎ−および／またはＣ−保護基の組み込みも、固相ペプチド合成法でよく用いられるプロトコルを用いて行うことができる。たとえばＣ−末端保護基を組み込むには、ペプチドを樹脂から開裂させるとペプチドに目的のＣ−末端保護基が付加されるような化学修飾がされた担体樹脂を固相として用いて目的とするペプチドの合成を行うのが代表的である。Ｃ−末端が１級アミノ保護基をを有するペプチドを製造するには、例えば、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＮＨＡ）樹脂を用いて合成を行うと、ペプチド合成終了後にフッ化水素酸で処理することによって目的のＣ−末端がアミノ化されたペプチドが得られる。同様に、Ｃ−末端にＮ−メチルアミン保護基を付加するには、Ｎ−メチルアミノエチルで誘導体化したＤＶＢ樹脂を用いるとＨＦ処理でＮ−メチルアミノ化されたＣ−末端を有するペプチドが開裂されてくる。Ｃ−末端をエステル化により保護することも従来法をもちいてできるが、そのためには樹脂から側鎖が保護されたペプチドを遊離させ、ついで望ましいアルコールと反応させてエステル基を形成するのに適した樹脂／保護基の組み合わせを使用することになる。メトキシアルコキシベンジルアルコールあるいは相当するリンカーで誘導体化したＤＶＢ樹脂と組み合わせたＦＭＯＣ保護基はこの目的のために用いることができ、担体からの開裂は、ジクロロメタン中のＴＦＡで行なうことができる。ＤＣＣ等で適当に活性化したカルボキシ基は希望のアルコールを加えてエステル化することができ、次いで脱保護し、エステル化されたペプチドを単離する。Ｎ−末端保護基の付加は、合成されたペプチドがまだ樹脂についている段階で適当な無水物とニトリルで処理することにより行うことができる。例えばＮ−末端にアセチルを保護基として付けるには、樹脂に結合した状態のペプチドを２０％酢酸無水物を含むアセトニトリル液で処理する。次いでＮ−末端が保護されたペプチドを樹脂から切り出し、脱保護してから単離する。望みのペプチド配列が合成され、樹脂から切り離され、完全に脱保護されたのち、選択されたアミノ酸配列を持つ単一のオリゴペプチドを回収するために精製を行う。精製は標準的な方法であれば何を用いてもよい。アルキル化シリカカラム、例えばＣ₄、Ｃ₈、Ｃ₁₈−シリカを用いる逆相高速液体クロマトグラフィを用いてもよい。このようなカラムによる分画は一般に直線的濃度勾配を用いて行う。例えばアセトニトリルのような有機溶媒を、０．１％程度の少量のＴＦＡを含む水性緩衝液中で０−５０％増加させるなどである。あるいは、イオン交換クロマトグラフィを用いてペプチドをその荷電特性にもとずいて分離することもできる。カラム分画をとり、望みの／必要な純度のペプチドを含む分画をプールする。ついで通常、開裂に用いた酸（例ＴＦＡ）を医薬的に許容される酸（酢酸、塩酸、リン酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸など）に置換して、ペプチドの水溶性塩とする処理を行う。精製後、更にオリゴペプチドを分析して、その化学的正確さと純度を確実なものにすることが望ましい。それにはアミノ酸分析を行うのが最も便利である。アミノ酸組成を分析するには、精製されたオリゴペプチドのサンプルを塩酸のような水溶性酸中で完全に加水分解し、できたアミノ酸混合物をWa ters Pico-TaqのようなＨＰＬＣ、あるいはBeckmann 6300アミノ酸アナライザーのような自動分析機を用いて分離同定する。正確さを更に確実に決定するにはペプチドの全配列を解析することである。ペプチドを順次分解しアミノ酸の直線的順序を決めるタンパク質シークエネーターが数種市販されており、この目的のために用いることができる。高分解能マススペクトル法を用いて正確な分子量に関する情報を得ることもできる。ヒトを治療するのに用いるためには、本発明のオリゴペプチド化合物の純度が医薬グレードであることが望ましい。これはオリゴペプチド標品がＨＰＬＣで単一ピークとして移動し、均一で正確なアミノ酸組成と配列を示し、その他医薬品の品質を管理する各種国家機関が設定した基準に合うオリゴペプチド製品を指す。獣医学分野で本発明の化合物や組成物を用いる場合には、厳しい純度基準は必要ないことは理解されよう。本発明はまた、医薬的に許容される担体と本発明の抗ヘルペス化合物の有効量とからなる抗ヘルペス性組成物を提供する。ここで「有効量」という用語は標的ウイルスの複製を減少させることができる化合物の量を指す。この様な減少は治療の前後に患者から採取された血清サンプル中のウイルスタイターをアッセイすると最もよくわかる。ヘルペスウイルスに感染した人を治療するためには、医薬グレードの純度の化合物を医薬的に許容される担体と一緒にして投与に適した組成物とする。製薬業界で従来から使用されている担体、特にぺプチド性薬品に使用される希釈剤、賦形剤などの担休ならば何を使用してもよい。製剤一般に関しては、「レミントンの薬品化学」第１７版(Mack Publishing Company,Easton,Penn., 1985)を参照。発明の１態様では、本化合物は皮下または静脈内注射による投与用に調剤され、従って無菌で発熱物質を含まず、場合によっては緩衝され等張にした水溶液として提供される。本化合物は蒸留水、より好ましくは食塩水または５％デキストロース溶液に溶かした形で投与される。ここで好ましいとされる化合物は本質的に水溶性である。必要ならばヨウ化または塩化セチルトリメチルアンモニウムブロミドなどの溶解性増強剤を加えて本発明のこれらの化合物の溶解性を増強することもできる。マニトール、スクロース、ラクトースのような分散保護剤(lyoprot ectant)、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などのバッファーシステムも調剤中に含めることができる。血清アルブミンのような増量剤を含んでもよい。あるいは本発明の化合物は注射以外の経路で投与するように調剤してもよい。クリーム、ローション、軟膏などの局所用組成物も使用できるし、吸入用エアロゾルも使用できる。標準的製薬慣行にしたがって調剤された錠剤、カプセルなどの経口投与用剤型も用いることができる。クリーム、ローション、軟膏の処方はウイルスによる皮膚損傷に適用するのに特に有用である。適当なトリグリセリド基剤やゲルがクリームや軟膏の製造に使用でき、これまでどおり界面活性剤や殺菌剤を入れてもよい。本発明はまた、ヘルペスウイルスに感染したヒトを含む哺乳動物の治療方法を提供する。その治療方法とは哺乳動物に本発明の抗ヘルペス化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することからなる。発明の１態様によれば、この方法はヒトの患者を治療するのに用いられる。発明の特定の態様によれば患者は単純ヘルペスウイルス、中でもＨＳＶ−１に感染したと診断されたものである。本発明の別の態様では、哺乳動物はウシ、ブタ、ヒツジ、その他の家畜でヘルペスウイルスに感染したものである。ふさわしい治療方法とは、望みの箇所、感染した組織や、局所的皮膚表面に、ヘルペスウイルスの増殖をコントロールできる量の本化合物を保持することである。治療に適した正確な用量は、適切にコントロールした試行により容易に決定することができる。ヘルペスウイルスに感染した患者の有効な治療法が、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇから約１０ｍｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を全身投与することを含むことは予測できる。しかしながら有効な用量が投与経路や投与の頻度により変わることは理解されよう。例えば、感染箇所に限定されてとどまる局所調剤は、投与頻度が少なくて済む。適切な局所用調剤は抗へルペス化合物を約０．１−５０ｍｇ／ｍｌ、たとえば約１−１０ｍｇ／ｍｌ含んでいることが期待される。実施例１以下に示したシリーズ１のオリゴベプチドを固相ペプチド合成法を用いて、従来のプロトコールに従って合成した。特に、合成は固相支持体としてクロロメチルーポリスチレン、Ｂｏｃを含むプロトコール及び保護基を使用してべックマン９９０合成機により行い、以下の化合物を製造した。以下に示したシリーズ２のオリゴペプチドもＢＯＣ化学により合成し、従来手法を使用して精製し、以下の化合物の酢酸塩を製造した。Ｌ−Ａｒｇノナマ−の合成及び評価も行った。ノナ−Ｌ−アルギニン（Ｌ− Ａｒｇ）₉はＢＯＣ固相合成法により合成した。合成はべックマン９９０合成機及び固相支持体としてのクロロメチルボリスチレン樹脂を使用しアメリカンペプチドカンパニー (The American Peptide Company)により行った。ｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ）は合成の間Ｌ−アルギニンのａ−ＮＨ₂官能基の保護に使用した。グアニジノ官能基はパラートルエンスルホニル基（Ｔｏｓ）で保護した。カップリングは過剰のＢＯＣ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）のヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ）活性エステルを使用して行った。各々のサイクル後のＢＯＣ保護基の除去はＴＦＡの使用が効果的であった。最終ペプチド（Ｌ−Ａｒｇ）₉をポリマー樹脂から離し、Ｔｏｓ保護基は標準ＨＦ処理を経て除去した。ＨＦ除去後、ペプチド及び樹脂混合物をジエチルエーテルで洗浄し、酢酸水溶液により抽出した。粗製ペプチドを凍結乾燥し、次いでＣ₁₈シリカカラムのＲＰ−ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＨＦ中のアセトニトリルを２〜４０％の勾配で使用して、分別した。画分を集め、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによりチェックした。主要生成物を９５％以上含有する画分を合わせた。高分解能マススペクトルは予想したＬ−（Ａｒｇ）₉である生成物を示した。実施例２多数のＤ−アミノ酸含有化合物も解析のために合成した。以下にその概要を示す。 4A)D-(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) ４Ａに示すＤ−ペプチドと命名したものはＦＭＯＣ固相合成法及び自動合成機、例えばアプライドバイオシステム(Applied Biosystems)4 3 O Aにより容易に製造される。Ｄ−アミノ酸のα−アミノ基は塩基性不安定なフルオレニルメチルオキシカルボニル基（ＦＭＯＣ）で保護される。リジン及びアルギニン側鎖は酸性不安定な保護基、例えばＢＯＣメトキシトリメチルベンゼンスルホニル（ＭｔＲ）を経てそれぞれ保護される。Ｃ末端ＦＭＯＣ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）残基は、対称無水物を経て、適当に誘導されたポリスチレン樹脂、例えばＨＭＰ−ポリスチレン、にダブルカップルさせる。ＦＭＯＣ基の除去は２０％ピベリジン中で行う。ぺプチド−樹脂へのアミノ酸残基の付加はそれらの活性Ｈ０Ｂｔエステルを経るのが効果的である。最終ペプチドの開裂及び脱保護はＴＦＡの処理により行う。粗製ペプチドはＲＰ−あるいはイオン交換ＨＰＬＣにより精製する。精製した生成物は標準アミノ酸分析及び／またはマススペクトル及び／またはシークエンス解析により特徴づけられる。 4C)アセチル−[D-Arg]₉-NH₂ 化合物４Ｃと示した表題化合物は固相支持体としてのｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）を使用して合成し、得られるペプチドのＣ−末端を保護したアミンとして得た。合成はアミノ官能基をｔ−ＢＯＣ基で保護したＤ−アルギニン残基を使用して進行させ、グアニジノ官能基はＴｏｓ基で保護した。カップリングサイクル及び脱保護はＬ−Ａｒｇノナマ−で記載した方法を行った。カップリングサイクル完了時に、樹脂に結合したペプチドをアセトニトリル中の２０％無水酢酸で処理し、そのＮ末端にアセチル保護基を導入した。樹脂からのペブチドの遊離及びＴｏｓ基の除去は、Ｃ−末端アミデート化した表題化合物を生成する、フッ化水素酸で処理することにより行った。フッ化水素酸除去後、樹脂／ペプチド混合物をジエチルエーテルで洗浄し、酢酸水溶液で抽出した。この粗製ペプチドを凍結乾燥し、次いでＬ−Ａｒｇノナマ−で記載した様にＲＰ−ＨＰＬＣ分別により精製した。高分解能マススペクトルは所望の化合物である生成物を示した。アミデート化したＣ−末端及びアセチル化したＮ−末端を導入するために、化合物４Ｃの合成で記載した合成プロトコールを使用して、以下の本質的にＤ−アミノ酸からなるオリゴペプチドをさらに合成し、ＨＩＶ阻害アッセイでの試験のために精製した。実施例３：ＨＳＶ複製の阻害選択した化合物を細胞外(in vitro)及び細胞培養手法のために、まず水中の１０ｍＭストックとして処方した。次いで、このストックを特定のアッセイに使用する緩衝液、あるいは細胞培養培地中で希釈する。動物試験のためにはペプチドをりん酸緩衝生理食塩水中で希釈する。化合物のＨＳＶの複製に対する阻害効果を決定するために以下の手法を使用した。まず、２４穴細胞培養プレート中のベロ細胞(Vero cell)（アフリカングリーンモンキーに由来する連続継代培養セルライン）の集密単層を特定な濃度のペプチドで２５時間処理した。これはストックペプチド溶液を単層を覆うために使用した成長培地、すなわちダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）中の１０％ウシ胎児血清及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有成長培地、中に希釈することにより達成された。ペプチド前処理後、単層を、ｌｏｇ₁₀希釈濃度が１０^-1〜１０^-6の範囲であるウイルス（ＨＳＶ−１Ｆ）０．１ｍｌで重層させた。次いでウイルスを３７℃ １時間吸着さぜた。余分なウイルス接種物を取り除き、単層を２％ＦＢＳ、１０ μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び特定な濃度のペプチドを含有するＤＭＥＭで覆った。次に、プラークが良く形成されていると判断されるまで２〜３日間ウイルスを複製させ、次いで単層を固定し、１％ホルムアルデヒド、７０％エタノール中の１％クリスタルバイオレットの溶液で染色した。最終的に、プラーク（単一可視ビリオンをそれぞれ表す）をカウントし、顕微鏡下でチェックした。ＩＣ₅₀により表した、種々のペプチドを使用して行ったプラーク減少アッセイの結果を以下に表として示す。結果は、２〜５０μＭ濃度でのオリゴペプチドの細胞取り込みがヘルペスウイルスの複製を有意に減少させることを示している。試験した濃度での宿主細胞の複製の阻害は明らかでなかった。別の実験において、１００μＭ濃度のペプチド４Ｃ（保護したＤ−アルギニンノナマー）は、５００μＭではいくらかの減少を示したが、細胞複製に対しては有意な有害効果を有していないことが判明した。このことは４Ｃは治療的、無毒な用量で処方及び使用できることを示している。代表的な処方剤は、中性りん酸緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）に溶解させた選択した化合物１．７０ｍｇからなり、１０ｍｌ溶液中の１７ｍｇの化合物（１．７ｍｇ／ｍｌ）を含有するよう滅菌したバイアル中に詰め込むことからなる。実施例４：ぺプチドの組織内分布代表的化合物、Ｎ−α−［¹⁴Ｃ−アセチル］−ノナ−Ｄ−アルギニン酢酸アミド（化合物４Ｃの放射標識化したもの）の分布及び局在は、以下の静注及び皮下注射による投与により決定した。１０ｍｌＰＢＳ中の２６μｇの¹⁴Ｃラベル化化合物の溶液０．２５ｍｌを１０匹のマウスの尾血管に静注し、また同量を１０匹のマウスの腹部に皮下注射した。夫々のグループの１匹を図１及び２に示した時間で殺し、そこに示した臓器の重量を計測し、シンチレーションカウンター用に均質に消化させた。カウントを測りその量を計算に使用して各々の臓器内の薬物濃度を測定した。ロガリズムスケールでプロットした結果を図１(i.v.)及び図２(s.c.)に示す。i.v.及びs.c.注人の両者とも薬物の組織への急速な分布をもたらすことが理解されるであろう。最高で、最も持続したレベルは肝臓、続いて腎臓及び牌臓において達成されている。５３μｇ用量のラベル化化合物の単回皮下投与から得られるマウスにおける血中レベルも評価した。血中レベル約１μｇ／ｍｌに近いピークは注人後５分で到達されることを示していた。ピークレベルは約２０分持続した。４０分及び２時間では血中レベルはピーク値の約８０％にまで減少した。引き続く血中レベルの急速な減少は、４時間ではピークの約１０％となり、更に、８時間及び２４時間では検出の限界値にまで血中レベルは減少した。明かに、化合物４Ｃは急速に血流に到達する。ピーク値に近いレベルは２０〜１２０分間持続し、続いて薬剤は血中から急速に消失した。実施例５：細胞内( in vivo)効果４Ｃで示した代表的なペプチドの効果を以下のin vivoで評価した。図３に示した用量で、ＰＢＳ中のペプチド４Ｃをマウスの３本のフットパッドに１週間注入し前処理を行った。前処理後、左フットパッドにＩＭＮａＣｌの約５μＬを注入し炎症を起させた。約６時間後、同じフットパッドをすり傷をつけ、ＨＳＶ −ＩＦ株（２Ｘ１０³ ｐｆｕ／ｍｌ）を１滴、炎症を起させたフットパッド上に滴下沈着させた。実験終了まで毎週３回ペプチド４Ｃによる処理を続けた。その結果を図３に示し、特に、５及び５０μｇ／マウスの用量で抗ヘルペス効果を明瞭に示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＵＳ (72)発明者バーネット，リチャードダヴリュ. カナダ国，エル４テー３ピー５，オンタリオミッシソウガ，ブリストールロードイースト 45，ユニット 22 (72)発明者サムナー − スミス，マーティンカナダ国，エル０ピー１エー０，オンタリオ，ボルトン，ホワイトヘッドクレッセント 332 (72)発明者レイド，ロールネエス. カナダ国，エム６ジー２ティー１，オンタリオトロント，ユークリッドアヴェニュー 479エー【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】 1. 製薬的に許容出来る担体及び、ヘルペスウイルス感染を治療するのに有効な量で式：Ｒ１−（Ａ）ｙ−［Ｘ］−（Ｂ）ｚ−Ｒ２（ここで、Ｒ１はＨまたはＮ−末端保護基、Ｒ２はＯＨまたはＣ−末端保護基、Ｘは｀ｎ´アミノ酸からなりｎ≧２の正味正電荷を有する抗ヘルベス性オリゴペプチドを表わすが、ここでｎは６乃至１２の整数である。ｙは０または１であり、Ｚは０または１であり、そしてＡ及びＢはそれぞれ独立に、オリゴベプチドＸの抗ヘルペス活性を保有する独立に選択されたアミノ酸１乃至２０を表わす。）の化合物を含んで成る、ヘルペスウイルス感染を治療するのに有用な薬学組成物。 2. 該化合物が、ｙ及びＺが共に０であるものである、請求項１記載の薬学組成物。 3. 該化合物が、Ｒ１がＮ−末端保護基でありＲ２がＣ−末端保護基である、請求項２記載の薬学組成物。 4. 該化合物が、Ｘが少なくとも一つのＤ−アミノ酸を含んで成るオリゴペプチドを表わしているものである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の薬学組成物。 5. 該化合物が、ＸがＤ−アミノ酸から成るオリゴペブチドを表わしているものである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の薬学組成物。 6. 該化合物が、Ｘが（ｉ）塩基性アミノ酸７乃至９と塩基性アミノ酸以外の一つのアミノ酸から成るオリゴペプチド、及び（ｉｉ）塩基性アミノ酸８乃至１０から本質的に成るオリゴペプチドから構成される群の中から選択されるオリゴペプチドであるものである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の薬学組成物。 7. 該化合物が、ＸがＤ−アルギニン残基８乃至１０から成るオリゴペプチドであるものである、請求項６の薬学組成物。 8. 該化合物がアセチルー［（Ｄ−Ａｒｇ）₉］−ＮＨ₂、アセチルー（Ｄ−Ａｒｇ）₃−（Ｄ−Ｇｌｎ）−（Ｄ−Ａｒｇ）₃−ＮＨ₂、及びアセチル−［Ｄ−（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−ＡΓｇ−Ａｒｇ）］ −ＮＨ₂から選択される、請求項１記載の薬学組成物。 9. 該化合物がアセチル−［（Ｄ−Ａｒｇ）₉］−ＮＨ₂である、請求項８記載のヘルペスウイルス複製を阻害するのに有用な薬学組成物。 10. 局所投与に好適な形態の、請求項１乃至９のいずれか１項に記載のヘルペスウイルス複製を阻害するのに有用な薬学組成物。 11. 該化合物がアセチル−［（Ｄ−Ａｒｇ）₉］−ＮＨ₂である、請求項１０記載のヘルペスウイルス複製を阻害するのに有用な薬学組成物。 12. 注射に好適な形態の、請求項１乃至９のいずれか１項に記載のヘルペスウイルス複製を阻害するのに有用な薬学組成物。 13. 該化合物がアセチル−［（Ｄ−Ａｒｇ）₉］−ＮＨ₂である、請求項１２記載のヘルペスウイルス複製を阻害するのに有用な薬学組成物。 14. 先述の請求項のいずれかに規定されるような薬学組成物をヘルペスウイルス感染を有する哺咄乳動物に投与する過程を含んで成る、ヘルペスウイルス感染を有する咄乳動物を治療するための方法。 15. 該組成物がヘルペスウイルス−誘発された皮膚病変に局所的に投与される、請求項１４記載のヘルペスウイルス感染を有する哺咄乳動物を治療するための方法。 16. 該組成物が化合物アセチル−［（Ｄ−Ａｒｇ）₉］−ＮＨ₂を含んで成る、請求項１７記載のヘルペスウイルス感染を有する咄乳動物を治療するための方法。 17. 該組成物がヘルペスウイルス−誘発された皮膚病変に局所的に投与されそして該組成物は化合物アセチル−［（Ｄ−Ａｒｇ）₉］−ＮＨ₂を含んで成る、請求項１４記載のヘルペスウイルス感染を有する哺咄乳動物を治療するための方法。 18. 単純ヘルペスウイルス感染を有するヒトに生理学上許容できる担体及び化合物アセチル−［（Ｄ−Ａｒｇ）₉］−ＮＨ₂の抗ヘルペス量を含んで成る組成物を投与する過程を含んで成る、単純ヘルペスウイルス感染を有するヒトを治療する方法。 19. 該単純ヘルペスウイルス感染は１型単純ヘルペスウイルス感染である、請求項１８記載の方法。 20. ヘルペスウイルス感染の治療のための先述の請求項のいずれかに記載の組成物の使用。